Universidad Austral De Chile

Facultad de Medicina
Escuela de Medicina
ESME020-015 Módulo de Bioquímica

Profesor: Dr. Juan Carlos Slebe

Clase N°14

CINETICA ENZIMATICA

¿Como se distribuye la enzima en el sistema?

Cuando no hay sustrato todo se considera como enzima total, si se coloca algo de sustrato,
algo de complejo ES se obtendrá, si hay una cantidad de sustrato saturante pues toda la
enzima se encontrara como complejo ES, es decir:

𝑬𝒕 = 𝑬𝑺
y reemplazando tenemos que:

𝑽𝒎𝒂𝒙 = 𝑲𝒄𝒂𝒕 𝒙 𝑬𝒕
alcanzando su máximo rendimiento catalítico, también quiere decir que aunque se agregue
más sustrato, la velocidad se mantendrá constante porque no hay enzima libre disponible.
¿Qué es la velocidad?

∆𝑷
𝑽= Variación de producto en el tiempo.
∆𝒕
Esta es una ecuación que se complica a la hora de comparar velocidades en las enzimas, ya
que la concentración de sustrato baja a través del tiempo (se transforma en producto),
afectando directamente a la velocidad. Por ello es necesario medir la velocidad cuando el
sustrato se puede considerar constante, es decir, en la velocidad inicial V0 (momentos muy
cortos donde no desaparece mas allá del 5% del sustrato).

Entonces tenemos que La V0 depende de la concentración de sustrato; a mayor

concentración de sustrato mayor velocidad inicial, siempre en condiciones estándar como pH,
temperatura y concentración del enzima.

➢ Variación de concentración de enzimas:

A mayor concentración, mayor velocidad. Manteniendo constante la concentración de

sustrato a niveles saturados.

Existe una complicación, a medida que aumenta la cantidad de producto la reacción reversa

(P E + S) provoca que la velocidad disminuya. Para evitar esto se debe medir en

tiempos cortos o en la V inicial, en estas 2 variables la reacción reversa se desprecia.

V = k [ES] Complejo enzima-sustrato.

Velocidad máxima. Constante de formación de producto.

NO UTILIZAMOS ESTA ECUACIÓN PORQUE NO DA CUENTA DE UNA HIPÉRBOLA SINO DE UNA RECTA

𝑉 [𝑆]
MIDE VELOCIDAD DE REACCION A
Utilizamos la siguiente ecuación: = 𝐾𝑑 +[𝑆] DISTINTAS CONCENTRACIONES DE
𝑉𝑚𝑎𝑥
SUSTRATO
 ➢ La velocidad de la reacción disminuye a medida que pasa el tiempo, hasta que la
velocidad es igual a 0. Esto se produce porque hay un equilibrio entre producto
formado y la reacción reversa.

➢ Cuando la velocidad depende de la [S] se habla de una reacción de 1º orden (bajas

concentraciones de sustrato). Y cuando es independiente de la [S] es una reacción de
orden 0 (saturación de sustrato). En el intermedio de una reacción hay reacciones
tanto de primer orden como orden 0.

➢ Concepto de Vmax: se representa con una asíntota a la hipérbola, se alcanza con

concentraciones de sustrato infinitas, teóricamente.

Para que la velocidad de la reacción sea considerada como Vmax se debe tener una
concentración de sustrato 100 veces mayor a la constante de Michaelis (Km).
Entonces para tener experimentalmente Vmax y saturación se requiere una
concentración de sustrato 100 veces mayor a la Km. (ESTO SE DEBE DEMOSTRAR)

➢ Hay un error experimental del 5%, el cual se considera dentro de los márgenes
aceptables. Ej.: 95% de la Vmax es aceptable.

➢ ¿Qué pasa si Km = [S]? Se obtiene lo siguiente:

𝑉 𝐾𝑚 𝑉 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥
= ⇒ = ⇒𝑉 =
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑚 + 𝐾𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 2 (𝐾𝑚) 2

𝑉𝑚𝑎𝑥
Cuando la [S] = Km entonces la velocidad de la reacción =
2

𝑉𝑚𝑎𝑥
Es INCORRECTO decir que 𝐾𝑚 =
2
Ecuación de Michaelis-Menten

¿Como definimos la constante de

Michaelis? La concentración de
sustrato necesaria para que la reacción
sea equivalente a ½ de la velocidad
máxima.

¿Qué quiere decir? usted puede colocar

cualquier valor de S con respecto al valor
de Km y calcular cuánto porcentaje de la
velocidad máxima se obtiene en esas
condiciones.
Al probar en la ecuación si la concentración de sustrato es NOTA: Hacer ejercicios con
10 veces la Km, 20 veces la Km, 50 veces la Km, 100 veces
esto para manejar la ecuación
la Km, etc. Van a tener el porcentaje de la velocidad
máxima que tiene esa reacción. de forma “casi inmediata”.

Lo que estamos diciendo es:

“A una [S] equivalente al valor de Km, la velocidad de la reacción va a ser ½ de la
velocidad máxima”.
En 1913 Michaelis y Menten desarrollan
su teoría en la que proponen este
mecanismo.
¿Por qué proponen este mecanismo?
Era la única forma de explicar que una
curva de velocidad en función de
concentración de reactante fuera
hipérbola y no lineal, como ocurre en una
reacción química. Por eso propusieron
que la enzima se une al sustrato y le
genera un mecanismo que logra disminuir
la energía de activación. Por eso la enzima
es una “restricción”.
¿Cuál es la restricción? Que cuando no
hay enzima libre, aunque usted agregue
más sustrato, la reacción es independiente
de la [S] y por lo tanto se comienza a hablar
de velocidad máxima (Vmáx).
Históricamente Michaelis y Menten no
consideraron esta etapa (liberación de
producto), porque trabajaron con enzimas de
MUY baja actividad molecular (también
llamada número de recambio, constante
catalítica).

Vimos una TABLA (6-7), donde hay enzimas con constante catalítica muy
Actividad molecular:
pequeñas, así como hay otras muy grandes; existen distintas eficiencias,
distinta actividad molecular. Número de moléculas de
sustrato transformadas en
Si k3 es MUY pequeño respecto a k2 y k1, es indudable que rápidamente
se forma un equilibrio entre E, S y ES. Primero se disocia ES en este producto, por molécula de
sentido antes que comenzar a disociarse en el otro sentido (hacia donde enzima.
iría k3).

Eso le paso a Michaelis y Menten que trabajaron con enzimas de actividad molecular muy baja,
entonces desecharon esa etapa (de k3). Años después se descubrió que las enzimas de mayor
actividad molecular no siguen exactamente lo propuesto por ellos, ya que al ser la etapa k3 de
considerable magnitud (similar a k1 y k2), se vuelve necesario tomarla en cuenta.

Se tiene el esquema general del mecanismo:

• Velocidad con que E y S se transforman en ES: v1= k1[E][S]

• Velocidad de disociación (izquierda): v2= k2[ES]
• Velocidad de disociación (derecha): v3= k3[ES]

¿Qué pasa en estado estacionario?

• La velocidad de formación (v1) es
igual a la velocidad de disociación
(v2+v3).
• La velocidad de formación de
productos es constante:

𝑣0 = 𝑣3 = 𝑘3 [𝐸𝑆] = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒
Uno puede escribir que:
[E] = [Et] - [ES]
(enzima libre es igual a enzima total menos concentración de complejo enzima-sustrato).
y reemplazando [E] en v1 se obtiene:
¿Por qué se busca eliminar [E]?
v1 = k1[S] ([Et] - [ES]) Porque es difícil medir la
v1= k1 [S] [Et] - k1[S] [ES] concentración de enzima libre,
entonces se expresa todo como
complejo enzima-sustrato [ES].
con [ES]=constante (por hipótesis de estado Luego, se trata de eliminar [ES].
estacionario) se puede expresar:

Se factoriza resolviendo (despejando) para [ES]:

𝑘2+𝑘3 𝑘2+𝑘3
(queda abajo lo que equivale a la constante de Michaelis 𝐾𝑚 = )
𝑘1 𝑘1
𝑉0
Nuevamente, por hipótesis de estado estacionario: [𝐸𝑆] =
𝑘3
Reemplazando:
𝑉0 [𝐸𝑡][𝑆] 𝑘3 [𝐸𝑡][𝑆]
= 𝑉0 =
𝑘3 𝐾𝑚+[𝑆] 𝐾𝑚+[𝑆]

𝑘3 [𝐸𝑡][𝑆]
Cuando [S]>>>Km: 𝑉0 = → 𝑉0 = 𝑘3[𝐸𝑡] → 𝑉𝑚á𝑥 = 𝑘3[𝐸𝑡] Se considera como
𝐾𝑚+[𝑆] Vmáx porque
(Km en el denominador se elimina, [S] arriba y abajo se cancelan). corresponde a la
velocidad
esto se reemplaza en la ecuación anterior, entonces:
alcanzada cuando
toda la enzima está
unida a sustrato, es
𝑉𝑚á𝑥[𝑆]
𝑉0 = decir, está saturada
𝐾𝑚 + [𝑆]
([ES]=[Et]).

Se obtiene la ecuación de Michaelis-Menten.

Entonces en las reacciones enzimáticas en que la enzima tiene una alta actividad
catalítica/molecular no se puede evitar tomar en cuenta esta ecuación.
Tendremos situaciones o mecanismos en los cuales:

• KM es igual a la Kd (k2/k3) cuando k3<< k2

• KM> Kd cuando k3 es del orden de magnitud
que k1 y k2
• KM<Kd si hay intermediarios después del
complejo ES →

Estas relaciones entre KM y Kd, dependen del mecanismo, de los valores de las constantes de
velocidad y de cuantas etapas hay en el mecanismo.

Siempre la KM mide la afinidad que tiene la enzima por un determinado sustrato

• Si la Km es grande, entonces k2 >> k1, la tendencia es hacia la disociación del complejo.

• Km grande, baja afinidad. Km pequeño, alta afinidad.
• En aquellos casos en que la constante catalítica es muy baja, es exactamente esa la afinidad
de la enzima por el sustrato.
• KM es una relación de constantes de velocidad que se dan en el estado estacionario, puede
ser muy simple o compleja dependiendo del mecanismo (k 2/k1, (k2 + k3)/k1, etc.).
También corresponde a la concentración de sustrato necesaria para que se alcance la mitad
de la velocidad máxima. Se expresa en las unidades que se encuentra expresada la
concentración del sustrato.

¿Qué se hace siempre? Medir la velocidad de la reacción a distintas concentraciones de sustrato,

dejando fija la concentración de enzima, pH, T°.

Los parámetros cinéticos que se miden son Vmáx y KM. Otra cosa que se puede medir es el Coeficiente
de Hill, (si este equivale a 1 la gráfica es una hipérbole rectangular, si es mayor o menor que 1 existe
cooperatividad positiva y negativa respectivamente).

A bajas concentraciones de sustrato, sigue una cinética de primer orden y a altas concentraciones de
sustrato es de orden 0. Al medio de la gráfica se sigue una cinética mixta entre 1 y 0.

Por lo tanto, describe una curva hiperbólica rectangular en la que la velocidad inicial (a bajas
concentraciones de sustrato) depende se la concentración de sustrato (orden 1), se llega a V máx que
no depende de la concentración de sustrato (orden 0), ya que se la enzima se encuentra saturada,
este efecto de saturación es el responsable se la meseta observada en el gráfico.

• Cuando K cat << K2 se establece un equilibrio rápido entre E, S y ES y por tanto la KM = Kd

• Cuando K3 es del orden de magnitud de K2 y K1 se aplica estado estacionario, en el que la
velocidad de formación es igual a la velocidad de disociación.

Hidrolisis de un péptido por quimotripsina (proteasa):

Sigue una ecuación cinética de ping pong, se liberan dos

productos. Cuando se libera el primero la enzima queda
acetilada y cuando se libera el segundo producto, la enzima
recupera su estado normal para seguir catalizando.

Cuando una enzima tiene más de un sitio activo, su ecuación será igual siempre y cuando no presente
cooperatividad, es decir que los sitios y sus afinidades por los sustratos, sean independientes entre sí.
En general, la Km para sustratos naturales es menor que para los sustratos análogos. Normalmente,
en la célula, las concentraciones de sustrato se encuentran alrededor de los valores de la Km que tiene
la enzima por el sustrato. V0 (µmolar/min) [S] (mM)
10 1
Cuando una enzima es afín a dos sustratos (por ej; la alcohol
deshidrogenasa, con sus sustratos metanol y etanol, o la 20 2
hexoquinasa con sus sustratos glucosa y fructosa), la mayor 40 4
afinidad que tenga la ésta por uno de sus dos sustratos 100 8
dependerá de la Km (una Km distinta para cada sustrato)
1000 10
Tres enzimas que utilizan el mismo sustrato → ¿Qué vía va a ser privilegiada? Depende de la Km,
aquella enzima que tiene una Km más pequeña por el sustrato, se va a saturar a menores
concentraciones de sustrato, y por lo tanto va a estar trabajando a velocidad máxima. Luego será la
intermedia y posteriormente, la que tenga una Km más alta. Eso siempre y cuando, no se esté en
saturación. Si hay exceso de sustrato, las tres enzimas estarán saturadas y, por lo tanto, las tres
reacciones estarán ocurriendo a V. máx. (entonces ahí no será válido cuál es la que tiene menor Km).

Ej: Hexoquinasa del cerebro, que fosforila glucosa y fructosa, tendrá una Km distinta para cada
sustrato. Si no se está saturado, la hexoquinasa va a saturarse por el sustrato cuya Km sea menor.

¿Por qué, cuando hay saturación, no depende de la Km? Porque se está en velocidad máxima, y V.
máx. depende solo de la concentración de enzima y no del valor de la Km.

La Km puede tener un error experimental.

Esto debido a que el cálculo de la velocidad
máxima puede tener un error experimental.
Para no tener este problema, se transforma la
ecuación de Michaelis-Menten en una línea
recta.

Se invierte esta ecuación y se desglosa en la ec. de Lineweaver-Burk

La ec. de Lineweaver-Burk representa le ecuación de una recta (y=mx+n), donde la pendiente

corresponde a Km/V. máx.

1. Cuando 1/[S] (que representa la X de la ecuación y = mx + n) es 0, el valor de 1/V0 (representa

Y) es igual al valor de 1/Vmáx (representa n).
2. Cuando decimos que 1/V0 es 0, despejamos 1/[S] y obtenemos que el resultado es -1/Km.

Teniendo una tabla con valores para V0 y [S] (inventados por el profesor):

Se calcula 1/V0, usando los valores de V0, y 1/[S], usando los valores de [S]. Es decir, se obtienen los
recíprocos.
Ej: V0 = 10 → 1/V0= 0.1 y [S] = 1 → 1/[S] = 1
Los recíprocos son 0.1 y 1, los cuales se grafican, al igual que el resto de los valores, y se obtienen los
valores experimentales.

Estimación de Km y Vmáx

Mirando la gráfica de la hipérbola, se puede estimar el valor de la Km.

Pero un camino “más seguro” es tomar dos puntos, por ej: V0 = 10 y V0 = 20, reemplazarlos en la
ecuación de Michaelis-Menten, y se obtendrán dos ecuaciones con dos incógnitas cada una.
Resolviendo, se obtienen los valores de Km y V máx.