Faz 95c

Crecimiento de Bacillus pumilus Productor de la
Auxina Ácido Indolacético, Como Base para

Formular un Biofertilizante en Polvo
Memoria presentada
para optar al título de
Ingeniero en Alimentos
Olga Maribel Zúñiga Bravo

Valdivia – Chile
2009
PROFESOR PATROCINANTE:
______________________________________
Sra. Marcia Costa Lobo
Ingeniero Civil Bioquímico
Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos
PROFESOR INFORMANTE
______________________________________
Sr. Luigi Ciampi Panno
Ingeniero Agrónomo, M.Sc. Ph. D.
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal
PROFESOR INFORMANTE
______________________________________
Sra. Renate Schöbitz Twele
Tecnólogo Médico, Ms. Sci.
Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos
Agradecimientos
Quisiera agradecer en primer lugar a Dios por darme la fortaleza para terminar esta
hermosa etapa en mi vida, por ser mi guía y mi luz en mi camino.
A todos mis seres queridos, a mi papá, hermano, familiares, compañeros y amigos, en

especial a mi querida amiga Nayarette por estar siempre conmigo en los buenos y malos
momentos, no puedo dejar de mencionar a los tíos Vilma, Nelly y Raúl, por brindarme
siempre su amor apoyo y comprensión.
También agradecer el infinito apoyo y dedicación de la profesora Marcia Costa que fue un
gran pilar en la realización de ésta memoria.
A todas las personas que trabajan en el laboratorio del ICYTAL, profesores auxiliares y
tesistas por su apoyo y buena disposición, en especial a Alexandra por su buena
disposición y compañerismo.
Finalmente tengo que agradecer a la persona a la que le debo todo lo que soy, mi
querida abuelita por estar siempre presente apoyándome y brindándome todo su amor.
"Pide y recibirás. Busca y encontrarás. Llama y la

puerta se abrirá. Porque quien pide recibe; quien
busca encuentra; y a quien llama se le abre la puerta".
(Jesús de Nazaret, Mateo 7, 7-8)
INDICE DE MATERIAS
Capítulo Página
RESUMEN 1
SUMMARY 2
1. INTRODUCCIÓN 3
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4
2.1 Bacterias promotoras del crecimiento 4
2.2 Reguladores del crecimiento vegetal 5
2.2.1 Auxinas 5
2.2.2 Ácido indolacético 6
2.3 Producción de ácido indol acético (AIA) 7
2.4 Producción de ácido indol acético (AIA) 7
2.4.1 Bacillus pumilus 7
2.4.2 Bacillus pumilus como regulador del crecimiento en el trigo 7
2.5 Sistemas de cultivos de microorganismos 8
2.6 Nutrición de los microorganismos 9
2.6.1 Macronutrientes 9
2.6.2 Micronutrientes 10
2.6.3 Factores de crecimiento 10
2.6.4 Producción de una alta cantidad de biomasa 10
2.7 Detección calorimétrica de auxinas: Reactivo de Salkowsky 11
Conservación de microorganismos del género Bacillus
2.8 11
mediante secado
3 MATERIAL Y MÉTODO 14
3.1 Determinación ácido indolacético (AIA) 14
3.1.1 Preparación curva calibración de (AIA) 14
3.1.2 Medición de (AIA) producida por la cepa C26 14
3.2 Material biológico 15
3.3 Medios de cultivos utilizados 15
3.4 Estudio crecimiento de Bacillus pumilus 15
3.4.1 Preparación del inóculo 15
3.4.2 Confección de curvas de crecimiento cepa C26 15
3.4.3 Modificación de medios de cultivos 15
3.4.4 Crecimiento de B. pumilus en medios de cultivo modificados 16
3.6 Cultivo batch en fermentador con medio modificado 18
3.7 Secado Spray de Bacillus pumilus 18
4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS 21
4.1 Estudio de crecimiento Bacillus pumilus 21
4.1.1 Crecimiento a 25 ºC, pH 5, 5 a 8,0. 21
4.1.2 Curvas de crecimiento a 30 ºC, pH 5,5 a 8 24
4.1.3 Análisis de varianza para curvas de crecimiento 27
4.2 Producción ácido indolacético de Bacillus pumilus 29
Crecimiento de Bacillus pumilus en medios modificados en su
4.3 33
fuente de nitrógeno y carbono
Producción de AIA en medios modificados en su fuente de C y
4.3.1 34
N
Cultivo batch de Bacillus pumilus en fermentador con medio
4.4 35
modificado
4.4.1 Recuentos 36
Producción de AIA durante el proceso de fermentación de la
4.4.2 36
cepa C26
4.4.3 Secado spray 37
4.4.3.1 Recuento después del secado. 37
4.4.3.2 Recuento después de 3 meses del secado 37
5 CONCLUSIONES 39
6 BIBLIOGRAFÍA 40
ANEXOS 43
INDICE DE CUADROS
CUADRO Nº Página
1 Composición medios de cultivos modificados (g/L) 16
Valores de las pendientes de las curvas de crecimiento
2 28
en CST
3 Producción en ppm de AIA a 25 ºC en un rango de pH
3 39
de 5,5 - 8,0
3 Producción en ppm de AIA a 30 ºC en un rango de pH
4 39
de 5,5 - 8,0
Recuentos de ufc/ml en medios modificados en su
5 32
fuente de C y N
Producción de AIA medios modificados en su fuente de
6 34
CyN
Recuento microbiológico del desarrollo en medio
7 35
liquido de la cepa C26
Concentraciones en ppm de AIA durante el proceso de
8 36
fermentación
INDICE DE FIGURAS
FIGURA Nº Página
1 Curva de crecimiento batch para una población bacteriana 9
2 Aspecto de los medios de cultivos modificados 16
3 Esquema de preparación del medio de cultivo modificado 17
Línea flujo elaboración de un formulado en polvo a partir de
4 19
una cepa de Bacillus pumilus
5 Fotografía del secador spray Niro Minor 20
Curva crecimiento cepa C26 en medio (CST), pH 5,5, 25 ºC y
6 21
180 rpm
7 22
180 rpm
8 22
180 rpm
9 23
180 rpm
10 23
180 rpm
11 24
180 rpm
12 24
180 rpm
Curva crecimiento cepa C26 en medio (CST), pH 6,0, 30º C y
13 25
180 rpm
14 25
180 rpm
15 26
180 rpm
16 26
180 rpm
17 27
180 rpm
18 Curva calibración AIA 28
19 Producción AIA a 25º C en caldo soya tripticasa 30
20 Producción AIA a 30º C en caldo soya tripticasa 30
21 Crecimiento Bacillus Pumilus en medios modificados 33
22 Producción de AIA en medios modificados 34
23 Tinción de Gram de la cepa C26 Bacillus pumilus 35
24 Formulado en polvo de Bacillus pumilus 37
Placa del recuento microbiológico del secado después de 3
25 37
meses
INDICE DE ANEXOS
ANEXO Nº Página
1 Análisis de la Varianza para pendiente 44
Contraste Múltiple de Rangos para pendiente según
2 44
temperatura
3 Determinación AIA medición de absorbancia 530 nm 45
4 Análisis de la Varianza para AIA 46
5 Contraste Múltiple de Rangos para AIA según pH 47
6 Tabla de Medias por mínimos cuadrados para AIA 48
7 Análisis de la Varianza para Recuento según Medios 48
8 Contraste Múltiple de Rango para Recuento según Medios 49
9 Análisis de la Varianza para producción de AIA a las 24 h 50
Contraste Múltiple de Rangos para Producción de AIA a las
10 51
24 h
1
RESUMEN
La finalidad de esta investigación fue estudiar las cinética de crecimiento y la

producción de la auxina ácido indol acético (AIA) de la cepa C26 Bacillus pumilus
promotora del crecimiento vegetal, en medio de cultivo caldo soya tripticasa ( CST) a
temperaturas de 25ºC y 30ºC con 6 pHs diferentes, para luego remplazar la fuente de
carbono y nitrógeno del medio, por concentraciones de melaza u combinaciones
melaza/sacarosa, y proteína de lupino hidrolizada y sin hidrolizar respectivamente, con
el propósito de obtener un medio de cultivo en el cual se obtenga una gran cantidad de
biomasa y producción AIA. Se elaboraron 6 medios diferentes en los cuales se estudio
el crecimiento de la cepa y la liberación de la auxina, escogiendo el medio en donde
se obtuvieron los mayores niveles de AIA y los mayores recuentos de unidades
fomadoras de colonias al cabo de 24 horas.
Se realizo en duplicado un cultivo batch en fermentador con capacidad de 5 litros
controlando temperatura, pH, agitación y aireación, para finalmente someter el
concentrado celular a deshidratación en un proceso de secado Spray. Se realizaron
recuentos microbiológicos en placa para determinar la viabilidad del biofertilizante al
cabo de 90 días del proceso de secado. Los resultados obtenidos en cada etapa fueron
analizados estadísticamente aplicándose análisis de varianza y test de rangos
múltiples, en la elección de los parámetros de crecimiento (pH y Tº), en el estudio de la
liberación de AIA y en la elección del medio modificado en su fuente de C y N.
Palabras claves: Bacillus pumilus, Ácido Indolacético (AIA), Biofertilizante en

Polvo.
2
SUMMARY
The purpose of this research was to study the kinetic’s growth and the production of the
auxin indol acetic acid (IAA) of the strain C26 Bacillus pumilus promoter of the plant
growth, in soybean tripticase broth (CST) at temperatures of 25ºC and 30°C and 6
differents pHs. Followed by the replacement of the carbon and nitrogen source in the
medium, by concentrations of molasses or molasses / sucrose combinations, and
hydrolyzed lupine protein and without hydrolyse respectively, all that to obtain an
alternative medium to produce a large biomass and IAA. There were elaborated 6
different mediums in which was studied the growth of the strain and the auxin’s
liberation, choosing the medium in which extracted the highest levels of IAA and higher
counts of producing units of colonies after 24 hours. All the experiments were made in
duplicate and also a batch culture in a fermenter with a capacity of 5 liters controlling
temperature, pH, aeration and agitation, and finally subjecting the concentrated cellular
to dehydration in a spray drying process. Microbiological counts were realized in plate
to determine the viability of the biofertilizer after 90 days of the dried process. The
results obtained in every stage were statistically analyzed applying analysis of variance
and multiple range test, the choice of growth parameters (pH and T °), in the study of
IAA´s liberation and in the choice of the modified medium in its source of C and N.
Key words: Bacillus pumilus, Indolacético acid (IAA), Biofertilizers powder.

3
1. INTRODUCCION
Hoy en día existe una gran preocupación en la productividad agrícola y el manejo

sostenible, es por esto que el uso de biofertilizantes ha ido en aumento en los últimos
años, para mejorar la calidad del suelo y aumentar el rendimiento de los cultivos.
En la actualidad los biofertilizantes son considerados como componentes del manejo

integrado de la nutrición vegetal son definidos como sustancias que contienen
microorganismos vivos que, al aplicarse a las semillas, suelos o superficie de las
plantas, colonizan la rizósfera y promueven el crecimiento de diversos cultivos de
cereales y hortalizas.
El estudio de microorganismos promotores del crecimiento vegetal representa una

opción para el manejo sostenible de esos agrosistemas. Es así como, se hace
interesante estudiar el crecimiento de cepa C26 de Bacillus pumilus productora de la
auxina ácido indolacético, la cual fue aislada en el Instituto de Producción y Sanidad
Vegetal de la Universidad Austral de Chile, que muestra un efecto positivo frente a
ciertos cultivares de trigo.
Hipótesis
Si Bacillus pumilus crece en un medio de cultivo caldo soya tripticasa (CST) con
producción de auxinas (AIA) también crecerá en un medio de cultivo modificando las
fuentes de carbono y nitrógeno, siendo posible formular un preparado en polvo viable.
Objetivo General
Estudiar el crecimiento de la cepa C26 de Bacillus pumilus en un medio de cultivo

(CST) modificando su fuente de carbono y nitrógeno, para formular un biofertilizante en
polvo
Objetivos específicos
• Evaluar el crecimiento y la liberación de AIA de la cepa en caldo ST en pHs de

5,5 a 8,0 a dos temperaturas.
• Evaluar el crecimiento y la producción de AIA, en las mejores condiciones
logradas, modificando el medio de cultivo en sus fuentes de carbono y de
nitrógeno.
• Con la biomasa obtenida con el medio modificado formular un prototipo de
biofertilizante el polvo mediante secado spray.
• Determinar la viabilidad remanente de la biomasa en el formulado seco.
4
2. REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1 Bacterias promotoras del crecimiento
El termino PGPR (Plant Growt Promoting Rhizobacteria) fue introducido por primera
vez por Klopper y Schroth 1979, para describir las rizobacterias que inducen el
incremento del crecimiento en las plantas, mostrando ser organismos altamente
eficaces en la promoción del crecimiento de las plantas e incrementar su tolerancia a
otros microorganismos causantes de enfermedades. Un gran número de especies
bacterianas, la mayoría de ellas asociadas a la rizósfera pueden ejercer un efecto
benéfico sobre el crecimiento de la planta, este grupo denominado como bacterias
promotoras del crecimiento vegetal PGPR, algunas de ellas son bacterias
solubilizadoras de fósforo (PSB), actualmente están siendo utilizadas como
bioinoculantes para el mejoramiento de actividades agrícolas (Loredo et al., 2004.
citado por MANTILLA (2007).
En los últimos años el estudio de nuevos sistemas y prácticas alternativas que

promuevan una producción agropecuaria más acorde con el medio ambiente ha ido en
aumento. Estas nuevas formas son menos contaminantes y más económicas. Una de
ellas, es la utilización y aplicación a situaciones productivas de bacterias promotoras
del crecimiento vegetal.
Las bacterias edáficas beneficiosas de vida libre se denominadas Plant Growt

Promoting Rhizobacteria, (literalmente rizobacterias promotoras del crecimiento de las
plantas) (KLOEPPER et al., 1989), también son nombradas por otros autores como
bacterias que aumentan el rendimiento o por su acrónimo, YIB (Yield Increasing
Bacteria) (PIAO et al., 1992; TANG, 1994). Sin embargo, BASHAN y HOLGUIN, (1998)
proponen que el término PGPR debería actualizarse, ya que muchas bacterias que
ejercen efectos beneficiosos en las plantas pueden desarrollarse fuera del sistema
rizosférico, siendo ese término restrictivo. El término PGPR se acuñó cuando este
campo de investigación estaba aún poco desarrollado, y actualmente es un tema
ampliamente discutido (BASHAN et al., 1993; TUZUN y KLOEPPER, 1994). Dada la
enorme expansión en el estudio de estas bacterias, actualmente se propone la
separación en dos grupos, las PGPB (Plant Growth-promoting Bacteria, Bacterias
promotoras del crecimiento de las plantas), que afectan estrictamente al crecimiento
vegetal, y las “biocontrol-PGPR”, cuando se refiere a bacterias que controlan
fitopatógenos, ya sea produciendo sustancias inhibitorias o incrementando la
resistencia natural de las plantas.
Las bacterias promotoras del crecimiento se definen como bacterias habitantes de la

rizósfera que estimulan significativamente el crecimiento de plantas. En años recientes,
se ha retomado el interés de de utilizar bacterias promotoras de crecimiento en la
producción de cultivos. Estas bacterias se han aplicado a semillas, tubérculos o raíz, y
son capaces de colonizar las raíces de las plantas y estimular el crecimiento y
5
rendimiento de cultivos (Agrios, 2004, citado por MANTILLA, 2007). Los mecanismos
que generan los efectos de estas bacterias promotoras del crecimiento no son bien
comprendidos, sin embrago, ha surgido un amplio rango de posibilidades que incluye
efectos directos e indirectos. El efecto directo consiste en un aumento en la
inmovilización de nutrientes solubles, seguido por el mejoramiento de absorción de las
plantas, el aumento de la fijación de N2 y la producción de fitohormonas (auxinas,
giberelinas y citoquinas) (Ahmad et al., 2005, citado por MANTILLA, 2007). Los efectos
indirectos incluyen la producción de sideróforos, la producción de antibióticos contra
hongos, bacterias y virus, mejorar el número de nódulos de la raíz y el aumento de la
actividad nitrogenasa, los cuales inducen resistencia a la planta. La acción de PGPR,
ocurre en el suelo usualmente cuando sus concentraciones son suficientes para
competir con otras bacterias comúnmente establecidas en la rizósfera. La acción de
estas bacterias sólo puede suceder cuando su concentración alcanza valores que
permitan competir con las comunidades establecidas en la rizósfera. Por lo tanto, para
la utilidad agronómica, la inoculación de las plantas con microorganismos “blanco” en
una concentración mucho más alta de la encontrada en microorganismos nativos, es
necesaria para aprovechar las características benéficas para el realce de la producción
de la planta (Igual et al., 2001, citado por MANTILLA, 2007)
2.2 Reguladores del crecimiento vegetal
Se denomina hormona a cualquier sustancia orgánica específica, efectiva a bajas

concentraciones, y que es elaborada por las células en una parte del organismo y
transportada a otra parte del mismo, donde ejerce su acción produciendo un efecto
fisiológico específico.
El comportamiento de ciertas sustancias vegetales parecía ser lo suficientemente

similar a las hormonas animales como para justificar el uso del término hormona
vegetal o fitohormona. Numerosos fisiólogos vegetales utilizan la denominación
reguladores de crecimiento o fitorregulador de manera de incluir tanto los compuestos
naturales (de origen endógeno), como los sintéticos, que modifican el crecimiento y
desarrollo vegetal.
TIEN et al. (1979) sugirieron que las fitohormonas podrían ser las responsables del
mejor crecimiento de la raíz y de la parte aérea de las plantas. Esto se debe a que los
efectos de la inoculación son similares a los que se observan cuando las plantas son
tratadas con estas sustancias.
2.2.1 Auxinas. Estas hormonas son un grupo de compuestos que estimulan la

elongación de la planta. El ácido indólacetico (AIA) es una auxina que realiza la acción
directa sobre la elongación y es la forma predominante, sin embargo, existe evidencia
reciente que sugiere la existencia de otras auxinas indólitas naturales en plantas. Su
función principal radica en determinar el crecimiento de la planta y favorecer la
maduración del fruto. Las auxinas se sintetizan principalmente en el apéndice del tallo,
en las yemas, las ramas jóvenes y en general, en los meristemos a partir del
aminoácido triptófano. Ayudan a que los tallos débiles se desarrollen y que formen
raíces adicionales de soporte para completar el sistema radicular (SALISBURI, 1994;
SOMMERS et al., 2005).
6
Una característica sorprendente de la auxina es la fuerte polaridad exhibida en su

transporte a través de la planta. La auxina es transportada por medio de un mecanismo
dependiente de energía, alejándose en forma basipétala desde el punto apical de la
planta hacia su base. Este flujo de auxina reprime el desarrollo de brotes axilares
laterales a lo largo del tallo, manteniendo de esta forma la dominancia apical. El
movimiento de la auxina fuera de la lámina foliar hacia la base del pecíolo parece
también prevenir la abscisión (Raisman 2006, citado por MANTILLA 2007).
La auxina ha sido relacionada en la regulación de diferentes procesos fisiológicos,

entre los que se incluyen promoción del crecimiento y diferenciación celular, y por lo
tanto en el crecimiento en longitud de la planta; estimulación del crecimiento y
maduración de frutas, floración, senectud, geotropismo; la auxina se dirige a la zona
oscura de la planta, produciendo que las células de esa zona crezcan más que las
correspondientes células que se encuentran en la zona clara de la planta; retardar la
caída de las hojas, flores y frutos jóvenes; y dominancia apical (Aguirre 2006, citado
por MANTILLA, 2007)
Por otra parte, las aplicaciones de auxinas deben realizarse de manera metódica, ya
que se ha observado que un exceso en la aplicación de auxinas como AIA pueden
producir efectos tóxicos o inhibitorios frenando el desarrollo de nuevas raíces,
presentando un efecto negativo sobre el crecimiento de ápices caulinares y coleóptilos
(ANWAR, 2000; Lee et al., 2004, AGUIRRE, 2006).
2.2.2 Ácido indolacético (AIA). El ácido indolacético (AIA) es una auxina natural
presente en la mayoría de las plantas. Las auxinas son hormonas vegetales que
regulan diversos procesos del desarrollo vegetal, por lo que su aplicación en
Agricultura es muy frecuente. Frente a la actual utilización de auxinas obtenidas por
síntesis química, la síntesis microbiológica de estas sustancias resulta de gran
importancia ya que la aplicación de caldos de fermentación que contienen auxinas,
puede constituir una alternativa viable en el contexto de una agricultura ecológica
(CASTILLO et al., 2005).
El mecanismo estudiado con mayor amplitud ha sido la producción de auxinas,

especialmente de ácido indolacético. Jain y Petriquin, 1985 citado por BAR y OKON
(1992). Este compuesto es producido por las bacterias logrando un aumento en el
contenido de fitohormonas de las plantas produciendo la estimulación del crecimiento
(BAR y OKON, 1992).
El ácido indolacético es catalogado como una fitohormona, y asimismo, es la auxina

más activa, se considera una con formula molecular C10H9NO2 y masa molecular
175.19 Da. El AIA estimula el crecimiento vegetal, observándose sobre el crecimiento
de biomasa, altura de los tallos, crecimiento del vástago principal y reduce el
crecimiento de ramas laterales (KOSHIBA, 1993).
Se piensa que el AIA es sintetizado del triptófano, sin embargo, existe un debate
considerable acerca del o de los intermediarios necesarios para su síntesis, se ha
propuesto que el ácido 3-indolpirúvico, triptamina, indol 3-acetaldoxima, indol
acetamida o indol acetaldehído pueden funcionar como intermediarios en la síntesis del
7
AIA. Estudios realizados en frijol con marcadores reactivos indican que el AIA es
sintetizado a partir del triptófano (BIALEK et al., 1992).
2.3 Producción de ácido indol acético (AIA)
Las bacterias PGPR sintetizan AIA. Esta importante auxina secretada por bacterias
contribuiría al “pool” endógeno de hormonas de la planta, imitando el efecto de la
aplicación de AIA exógeno. De esta forma, el AIA bacteriano estimularía el desarrollo
del sistema radical y el crecimiento general de la planta huésped. Al mismo tiempo, el
consecuente incremento en la producción de metabolitos vegetales, utilizados por las
bacterias para su propio crecimiento, pondría de manifiesto un beneficio recíproco en la
relación planta-bacteria (PATTEN y GLICK, 2002).
Estas bacterias (PGPB) se encuentran entre los principales grupos microbianos

estudiados, destacándose por sus beneficios tanto para la planta como para el
ecosistema (HERNÁNDEZ et al., 2003). En este sentido se han demostrado la
presencia abundante especialmente de Bacillus (HEBBAR et al., 1998; PICARD et al.,
2000; RIVES et al., 2003).
La promoción de crecimiento radical es uno de los principales factores por los cuales
se evalúa el efecto benéfico de las distintas PGPR. En este sentido, la producción
bacteriana de AIA y la alta sensibilidad de las raíces a dicha hormona sería
fundamental en la respuesta a la inoculación. Bacterias que secretan bajos niveles de
AIA (10- 9 a 10- 12 M) estimularían la elongación de raíces, mientras que bacterias
altamente productoras de auxinas promoverían la formación de raíces laterales o el
desarrollo de pelos absorbentes (GLICK et al., 1999).
2.4 Del género Bacillus
El género Bacillus spp. comprende en un gran número de diversas formas de bastón,

gram positivo, oxidasa y catalasa positiva. Son bacterias móviles por flagelos perítricos
y aeróbios estrictos en su mayoría (SNEATH, 1989). En los medios de cultivo líquidos
crecen formando un “velo” en la superficie (WILSON, 2000). Miembros de este género
son capaces de producir endosporas, las que resisten altas temperaturas y factores
físicos perjudiciales como la desecación, la radiación, los ácidos y los desinfectantes
químicos (SNEATH, 1989).
2.4.1 Bacillus pumilus. Esta bacteria es considerada un organismo promotor del

crecimiento, que produce hormonas en el medio de cultivo y tiene influencia en el
desarrollo de diversas gramíneas (GUTIERREZ MAÑERO et al., 1996). Se ha
encontrado que cuando se asocia a la rizósfera puede modificar la actividad fisiológica
de las plantas mejorando el crecimiento de éstas (PERRY et al., 1987; BASHAN et al.,
1996).
2.4.2 Bacillus pumilus como regulador del crecimiento en el trigo. De la rizósfera y

de las raíces de plantas de moras, que presentaron un crecimiento exagerado, se
obtuvieron 50 cepas bacterianas, que se desarrollaron en un medio de cultivo APD,
8
todas estas cepas fueron estudiadas, aisladas e identificadas taxonómicamente

(SILVA, 2008).
De los aislamientos efectuados por SILVA (2008), una de las cepas identificadas (cepa
C26) corresponde a Bacillus pumilus y corresponde a una bacteria promotora del
crecimiento vegetal, pues posee la capacidad de fijar nitrógeno y producir compuestos
indólicos. Este autor evaluó el efecto promotor de 5 cepas entre ellas C26 (Bacillus
pumilus) como fijadora de nitrógeno y productora de fitohormonas en 3 estados
fenológicos del trigo, tres hojas, floración, y grano. Comprobando así que la cepa C26
tiene efectos positivos sobre el área radical en los tres estados fenológicos. En el
estado de tres hojas la cepa JS c26 fue mayor a los demás, siendo esta diferencia
significativa superando al testigo en un 23,34 %, en el estado de floración nuevamente
la cepa JS c26 fue superior con un valor de 12,85 cm2, superando al testigo en un
49,42 %, al igual que en los estados fenológicos anteriores, en grano la cepa JS c26
fue superior a todos con un valor de 19,49 cm2, siendo la única cepa que superó al
testigo (15,21 cm2) en un 21,96%.
En cuanto a la longitud radical analizada aplicando las 5 cepas estudiadas, entre ellas
la C26, al igual que los resultados anteriores se observó que en el estado de tres hojas
la cepa C26 superó al testigo en 12,97%. En floración no se presentaron diferencias
significativas, pero las cepas JS c26 nuevamente fue mayor al testigo en un 37,74% y
lo mismo ocurrió en el estado de grano, pero la cepa C 26 fue la única que superó al
testigo en un 27,54% (SILVA, 2008).
De la misma forma que en el parámetro anterior el efecto promotor se debería a que

las cepas fueron capaces de producir fitohormonas. Según SALANTUR et al., (2005) y
SILVA (2008) estas fitohormonas producen una mayor elongación de raíces, un mayor
número de raíces secundarias y un mayor números de pelos radicales. Todo lo cual
permite que la longitud radical total sea mayor.
2.5 Sistemas de cultivos de microorganismos
Se han desarrollado varias técnicas para el cultivo de microorganismos, a saber, cultivo

batch, cultivo por lote alimentado (CLA) y cultivo continuo (CC), los primeros de amplio
uso industrial y el último como herramienta de alto uso para estudios de laboratorio.
El cultivo batch o discontinuo ocurre cuando al ser inoculado un cultivo de

microorganismos en un medio, los nutrientes se convierten en biomasa y en el instante
que el sustrato se agota, el batch finaliza. Por lo tanto, no existe renovación de los
nutrientes (SHULER y KARGI, 2002). La curva de crecimiento de un cultivo batch en
un medio de cultivo con una única fuente de carbono limitante del crecimiento tiene
aspecto sigmoidal y permite diferenciar varias fases de crecimiento: fase de latencia (1)
(o lag), fase exponencial (2) (logarítmica), fase estacionaria (3) y fase de muerte(4).
En la fase exponencial las bacterias crecen a su máximo potencial haciendo uso de los
nutrientes disponibles bajo condiciones ambientales fijas (pH, temperatura, agitación,
aireación, etc.), lo que permite modelar matemáticamente su crecimiento y definir los
parámetros velocidad específica de crecimiento (µ) y el tiempo de duplicación celular
9
(td), necesarios para diseñar y establecer los procesos productivos bacterianos ya sea
de biomasa o de sus productos metabólicos.
Ln, Crecimiento celular
3 4
2
1 5
Tiempo (h)
FIGURA 1 Curva de crecimiento batch para una población bacteriana.

FUENTE: SHULER y KARGI, 2002.
2.6 Nutrición de los microorganismos
La condición mínima es que en el medio de cultivo deben de estar presente todos los
elementos constituyentes del material celular y para que puedan formar parte de una
nueva célula deben estar en forma de compuestos utilizables (SCHLEGEL, 1997).
Es así como, para ser frente a sus necesidades de crecimiento y mantenimiento, los
microorganismos necesitan captar todos aquellos nutrientes que precisan; los cuales
se deben de encontrar en cantidad suficiente en los medios de cultivos; además de
contar con carbono nitrógeno, oxígeno e hidrógeno, los microorganismos requieren de
fósforo, azufre, potasio, magnesio, hierro entre otros (GIR, 1964).
No basta que el medio de cultivo elegido para el desarrollo de un organismo o de un

grupo de los mismos tenga una composición química adecuada y suficiente, es
necesario que se cumplan una serie de condiciones físicas o fisicoquímica
indispensables, como son la humedad, temperatura de incubación, potencial de oxido-
reducción, pH del medio, etc. (GIR, 1964).
2.6.1 Macronutrientes. Según BROCK et al. (1998) carbono, oxígeno, hidrógeno y

nitrógeno son los cuatro elementos que constituyen el esqueleto de las
macromoléculas así como las moléculas orgánicas pequeñas.
10
Macronutrientes, son aquellos requeridos en grandes cantidades, estando en mayor

proporción carbono y nitrógeno. En peso seco, una célula típica consta de
aproximadamente 50% de carbono y a su vez éste es el elemento mayoritario de las
macromoléculas. Después del carbono el siguiente elemento más abundante es el
nitrógeno, el cual corresponde a un 12% en peso seco de una célula típica y a su vez
el nitrógeno es un componente mayoritario de proteínas, ácidos nucleicos y otros
constituyentes celulares (BROCK et al, 1998).
Existen otros macronutrientes como el azufre, fósforo, calcio, potasio, sodio, magnesio
y hierro, los cuales están contenidos en todos los microorganismos (SCHLEGEL,
1997).
2.6.2 Micronutrientes. Aunque los micronutrientes son requeridos en muy pequeñas

cantidades son tan importantes como los macronutrientes para la función celular. Los
micronutrientes son metales, muchos de los cuales forman parte de, enzimas. Debido a
que el requerimiento de micronutrientes es muy pequeño, para el cultivo de
microorganismo en el laboratorio se hace innecesaria su adición al medio. Sin
embargo, si un medio contiene compuestos químicos altamente purificados y disueltos
en agua destilada de alta pureza, puede ocurrir una deficiencia de elementos traza. En
tales caso se añade una pequeña cantidad de estos metales (BROCK et al, 1998).
Algunos de los microelementos más comunes se encuentra: manganeso, molibdeno,

zinc, cobre, níquel, vanadio, boro, cloro, selenio, silicio, wolframio entre otros, que no
los necesitan todos los organismos. La mayoría de los elementos se añaden al medio
de cultivo en forma de sales (SCHLEGEL, 1997).
2.6.3 Factores de crecimiento. Los factores de crecimiento son compuestos

orgánicos que, como los micronutrientes, son requeridos en muy pequeñas cantidades
y sólo por algunas células. Los factores de crecimiento incluyen vitaminas,
aminoácidos, purinas y pirimidinas. Aunque la mayoría de los microorganismos son
capaces de sintetizar estos compuestos, otros requieren tomar uno o más preformados
del medio ambiente
Las vitaminas son los factores de crecimiento más comúnmente necesitados y la

mayor parte de éstas, funcionan como coenzimas. Muchos microorganismos son
capaces de sintetizar todos los componentes de sus coenzimas, pero algunos son
incapaces de hacerlo, debiendo ser suplementados con ciertas partes de estos
coenzimas en forma de vitaminas (BROCK et al, 1998).
2.6.4 Producción de una alta cantidad de biomasa Los componentes empleados en

la industria de fermentación son generalmente complejos, siendo importante considerar
diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad, la estabilidad en su
composición química, el tipo de fermentación, rendimiento del producto final y los
costos adicionales de otros compuestos nutritivos requeridos por los microorganismos.
Respecto al costo de los nutrientes, estos pueden llegar a representar entre el 10 y el
60% del costo total de muchos productos obtenidos mediante procesos de
fermentación, por lo que se hace prioritaria la incorporación de constituyentes baratos
(Dale y Linden 1984 citado, por REHM et al., 1993)
11
Las principales materias primas utilizadas en los procesos de fermentación son los
carbohidratos, los que usualmente constituyen la fuente de energía y la base para la
síntesis de macromoléculas de muchos microorganismos. Dentro de las fuentes de
carbono encontramos a los azucares puros como, la glucosa y la sucrosa, sin
embargo, estos son demasiado costosos para ser usados industrialmente, por lo que
usualmente es necesario encontrar otras fuentes más baratas (Rivière, 1977 citado por
REHM et al., 1993). Al respecto, las materias primas que se utilizan con mayor
frecuencia en la formulación de medios a nivel industria son, los granos, melaza,
celulosa y suero de queso, entre otras. (ORTEGA, 1998; SHULER, y KARGI, 2002). La
melaza tiene un alto valor nutritivo, aportando un 50,46% de azúcares fermentables y
un 53,83% de azúcares reductores, dentro de los cuales encontramos la glucosa,
rafinosa y sacarosa, siendo esta última la que se encuentra en mayor concentración
(~45%). La melaza, además de ser una buena fuente de carbono de fácil asimilación
para el microorganismo, es un alimento rico en vitaminas del grupo B, contiene
aminoácidos esenciales y minerales como calcio, sodio, cloro, magnesio, potasio,
hierro y cobre (Bronn, 1985 citado por REHM et al., 1993).
2.7. Detección colorimétrica de auxinas: Reactivo de Salkowsky
El reactivo de Salkowsky, ha sido ampliamente utilizado para establecer la presencia

de grupos indol, en solución de tejidos vegetales y extractos de cultivos microbianos,
entre otros. Es un método netamente colorimétrico basado en la oxidación que produce
el ácido perclórico a las moléculas de indol presumibles como compuestos auxinicos.
(GLIKMAN y DESAUX, 1995, SALKOWSKY, 1989; MANTILLA 2007).
2.8. Conservación de microorganismos del género Bacillus mediante secado
El éxito en la preservación de los cultivos microbianos es esencial para las actividades

de investigación o industriales basadas en la acción de estos microorganismos.
Tomando como ejemplo los procesos de elaboración de alimentos fermentados, donde
participan cultivos microbianos, se encuentra que el éxito de la producción depende
principalmente y directamente de las técnicas de proceso utilizadas, sin embargo, lo
que permite estandarizar y mantener la calidad uniforme del producto final es la
correcta selección, mantención, manipulación, siembra y propagación de las cepas
utilizadas, por lo cual la elección del método de conservación utilizado debe permitir
mantener las características del microorganismo por las cuales fue seleccionado
(ZAMORA, 2005).
Un método de conservación ayuda en la disgregación de las células bacterianas en un
ambiente adverso reduciendo así, potencialmente pérdidas y/o viabilidad de las
células. A este proceso de conservación se le denomina en conjunto encapsulación o
microencapsulación. El proceso de conservación y el medio de suspensión influyen
directamente en la viabilidad de las bacterias, bajo condiciones adversas con respecto
a cuando las bacterias estaban en el estado no encapsulado (HASSAN, 2003).
La encapsulación es definida como una tecnología de empaque de materiales sólidos,
líquidos o gaseosos en miniatura. Esto implica el recubrimiento de un ingrediente
sensible, ya sea puro o una mezcla, dentro de un material, para otorgar protección
contra la humedad, calor u otras condiciones extremas, de modo de mejorar su
12
estabilidad y aumentar su vida útil. En el encapsulado, la porción activa es designada

como núcleo, fase interna o relleno, y el material encapsulante es llamado cáscara,
recubrimiento o material de pared y puede variar tanto en espesor como en el número
de capas. La forma de las cápsulas es generalmente esférica, pero se ven fuertemente
influenciadas por la estructura del material original no encapsulado (ESCALONA,
2004).
YOUNG et al. (1993), definen la microencapsulación como una técnica "de embalaje"
en la cual gotas líquidas o partículas sólidas son “embaladas” entre las películas
delgadas (finas) de los agentes que microencapsulan. A la estructura formada por el
agente encapsulador se le llama pared, y el material microencapsulado que se
encuentra en el interior se le llama corazón. La pared protege el corazón contra el
deterioro, limita la evaporación (o pérdidas) de materiales volátiles principales, y libera
el corazón cuando las condiciones son las deseadas.
Un biofertilizante tiene que reunir determinadas características: contener el máximo
número de células viables, estar libre de contaminantes y ser activo en las condiciones
de procesamiento. Esta claro que no existe un método único para conservar cultivos
de microorganismos, por lo tanto, la selección de éste tiene que basarse en la
naturaleza del cultivo y considerar ventajas e inconvenientes del método escogido
(ZAMORA, 2005). Las condiciones bajo las cuales se almacenan y conservan las
bacterias son también importantes para la calidad de productos en los cuales serán
utilizadas. Los métodos de la encapsulación se han aplicado para aumentar la
supervivencia y la distribución de cultivos bacterianos (HASSAN, 2003).
El método de secado Spray es un método muy utilizado en la industria de alimentos,
debido a que es un proceso económico, flexible y produce partículas de buena calidad.
Este método es uno de los más usados para secar productos líquidos como leche
concentrada, extractos concentrados de café, huevos, extractos de levadura, caseína,
zumos de frutas, té, sangre y otros concentrados proteicos. Para ello se atomiza (es
decir, se transforma en aerosol o niebla) una solución o suspensión más o menos
viscosa del producto, las pequeñas gotas líquidas así formadas se arrastran y
deshidratan en una corriente de aire dando un polvo seco antes de caer sobre las
paredes interiores de la torre de secado, las partículas de polvo (microcápsulas) al final
del proceso tienen una forma esférica vacía en su interior que permite una fácil
rehidratación (ZAMORA, 2005). Las microcápsulas usualmente caen en el rango de
varios micrones hasta aproximadamente 200 µm.
La calidad del producto tratado no se altera debido a que la intensa evaporación
protege al producto del efecto de la elevada temperatura del aire caliente (el proceso
de evaporación absorbe buena parte del calor aportado). En realidad, la energía
aportada en forma de calor cede al producto el calor latente de vaporización haciendo
que el incremento de temperatura de las partículas (debido al calor sensible) sea muy
bajo. Por otra parte, la tasa de reacciones degradativas disminuye a bajos contenidos
de humedad, y eso favorece que el corto tiempo de exposición de la partícula seca a
temperaturas elevadas no comporte un deterioro importante al producto (ZAMORA,
2005).
En el proceso, se pueden identificar tres pasos básicos:
13
• Preparación de la dispersión o emulsión a ser procesada.

• Homogeneización de la dispersión.
• Atomización de la masa dentro de la cámara de secado.
Este proceso se realiza en un secador Spray que se compone básicamente de un

sistema de alimentación del líquido, un dispositivo de atomización (disco que gira a alta
velocidad), una cámara de atomización y un sistema colector del producto seco
(ESCALONA, 2004).
La rápida evaporación del agua del recubrimiento durante su solidificación mantiene el
material núcleo por debajo de los 100ºC, a pesar de las altas temperaturas utilizadas
en el proceso. Esto, junto a que el tiempo de exposición a temperaturas elevadas es
muy corto (5 a 20 s) hace a este proceso apropiado para materiales sensibles al calor
(PEDROZA, 2002).
La característica de las bacterias del género Bacillus de formar endoesporas y su
termoestabilidad, hacen factible la utilización de procesos de secado mediante
atomización, es así como OJEDA (2007) empleó esta técnica para secar suspensiones
de Bacillus subtilis, formulados como un biopesticida.
14
3. MATERIAL Y MÉTODO
La presente investigación consistió en estudiar el crecimiento de la cepa Chilena C 26

Bacillus pumilus que libera hormonas estimulantes del crecimiento vegetal con el
proposito de formular un biofertilizante en polvo. Se evaluaron las condiciones de
crecimiento, de temperatura y pH, como también la liberación de la fitohormona ácido
indolacético (AIA), con el objetivo de formular un prototipo de biofertilizante en polvo a
base de la cepa.
El trabajo práctico se realizó en los laboratorios y planta piloto de Procesamiento de

Productos Vegetales ambos pertenecientes al Instituto de Ciencia y Tecnología de los
Alimentos, Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile, Valdivia,
XIV Región.
3.1 Determinación ácido indolacético (AIA)
La determinación de producción de ácido indolacético de la cepa B. pumilus fue

realizada con el reactivo de Salkowski, el cual fue preparado a partir de H2SO4 a 7,9 M
y FeCl3 al 3 %.
3.1.1 Preparación curva calibración de (AIA). Se prepararon soluciones de ácido

indólacetico comercial (Sigma) con las siguientes concentraciones: 0, 3, 12, 18, 24, 40
y 50 ppm.
• Se toma 1 ml de cada solución de (AIA) en sus diferentes concentraciones en

ppm, y se le agregan 2 ml del reactivo de Salkowsky.
• Se dejan reposar durante 30 min a temperatura ambiente para finalmente medir
absorbancia en un espectrofotómetro a 530 nm.
3.1.2 Medición de (AIA) producida por la cepa C26. La cepa fue inoculada en caldo
soya tripticasa (CST) y medios modificados en su fuente de carbono y nitrógeno, todos
incubados en agitador orbital a 180 rpm, durante 25 horas y 30 min.
Se procedió a medir la concentración de (AIA) de la siguiente manera:
• Se tomaron 5 ml de cada medio de cultivo cada 90 min y fueron colocados en

tubos de ensayos
• Posteriormente fueron centrifugados a 10000 rpm durante 5 min
• Se extrajo 1 ml del sobrenadante de cada tubo y se le adicionaron los 2 ml del
reactivo de salkowsky
• Durante 30 minutos se dejaron a temperatura ambiente para después medir la
absorbancia de cada muestra en un espectrofotómetro a 530 nm.
15
3.2 Material Biológico
Cepa C26 de B. pumilus: Cepa aislada de las raíces de zarzamoras, la cual se

desarrolló en medio de cultivo APD. La cepa se mantiene en tubo de agar inclinado a
5º C, se inocula en agar soya tripticasa 12 horas antes del estudio de crecimiento.
3.3 Medios de Cultivos Utilizados
• Caldo Soya Tripticasa (CST): medio utilizado para curvas de crecimiento de la

cepa de Bacillus pumilus y preparación del inoculo.
• Agua Peptonada medio de dilución para realizar recuento de B. pumilus
• Agar plate count (APC) para realizar recuentos de B. pumilus
• Medio cultivo modificado a base de harina de lupino con y sin hidrólisis (con
enzima papaína) y combinaciones de azúcar y melaza.
3.4 Estudio crecimiento de Bacillus pumilus
Se estudió el crecimiento de la cepa C26 en caldo soya tripticasa se efectuaron en

duplicado a pH: 5,5 – 6,0 – 6,5 – 7,0 – 7,5 – 8,0, en agitador orbital (shaker) a 180 rpm
a dos temperaturas 25ºC y 30ºC.
3.4.1 Preparación del inóculo. Se tomó una colonia aislada de una cepa pura de
Bacillus pumilus sembrada por estrías por agotamiento en placa de agar APC a 30º C y
fue sembrada en 100 ml de (CST) y se incubó en un agitador orbital (shaker) 180 rpm a
25 ºC por 24 horas, para luego inocular los matraces con 200 ml de medio CST al 10%
a los 6 pHs mencionados anteriormente. En la preparación de los medios se utilizó
buffer fosfato.
3.4.2 Confección de curvas de crecimiento cepa C26. Se construyeron curvas de

crecimiento a las dos temperaturas, con los 6 diferentes pHs de cada medio CST
tamponeado, con el fin de conocer las mejores condiciones de desarrollo. La cepa C 26
fue cultivada en matraces Erlenmeyer de litro (con 200 ml de medio de cultivo),
incubados en shaker por 24 horas. Para obtener la cinética de los diferentes medios
de cultivo, se tomaron muestras cada 90 min midiendo Absorbancia a 660 nm (Abs660),
verificando al microscopio su pureza con tinción de Gram.
3.4.3 Modificación de medios de cultivos
Una vez obtenida la mejor condición de crecimiento de pH y temperatura en la etapa

anterior, se procedió a cambiar las fuentes de carbono por melaza y/o sacarosa u
combinaciones de ésta y la fuente de nitrógeno por extracto de proteína de lupino al
10% con y sin hidrólisis utilizando para ello enzima papaína; un esquema de la
preparación se presenta en la FIGURA 3.
Los medios modificados, una vez esterilizados, mostraron el aspecto que se aprecia en
l FIGURA 2.
16
3.4.4 Crecimiento de B. pumilus en medios de cultivo modificados en su fuente

de carbono y nitrógeno.
Se prepararon 50 ml de cada medio, inoculados al 10%, en el CUADRO 1 se presentan

las diferentes concentraciones de los medios.
En cada uno de los medios modificados se sembró la cepa C26 de B. pumilus y se

obtuvo las curvas de crecimiento al incubar los matraces en agitador orbital durante 24
horas, en las mejores condiciones definidas en 3.4.2 para crecimiento y producción de
AIA. Lo anterior con el propósito de evaluar el crecimiento de la cepa C26 y elegir el
medio con el mejor desarrollo y producción de AIA, se trabajó en duplicado.
Debido a que los medios modificados no eran completamente homogéneos por poseer
pequeños sólidos en suspensión y por su coloración oscura, no fue posible diseñar las
curvas de crecimientos por medio de la medición de absorbancia v/s tiempo. Para esto
se realizó un recuento en placa en agar Plate Count para cada medio a los tiempos 0-
6-12 y 24 horas, la medición de la auxina AIA fue medida a los mismos tiempos.
CUADRO 1 Composición medios de cultivos modificados (g/L)
Componentes Medio 1 Medio 2* Medio 3* Medio 4 Medio 5* Medio 6

Sacarosa 5 5 - - 2,5 2,5
Melaza - - 12,5 12,5 7,5 7,5
Cloruro sódico 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Fosfato potásico 5 5 5 5 5 5
* Medio preparado con lupino hidrolizado
FIGURA 2 Aspecto de los medios de cultivos modificados.

17
Preparación tampón
fosfato pH deseado
Disolución 25 g harina lupino en

1 litro agua tamponada
Agitación por 30 min a 25º C
Dejar decantar 2 horas aprox
Agregar papaína al 2%
Filtrar
Melaza Fosfato calcio
Obtener filtrado
(Medio sin hidrolisis)
Sacarosa Cloruro sodio
Obtener filtrado
(Medio hidrolizado)
45ºC, 30 min
Melaza Fosfato
FIGURA 3 Esquema de preparación del medio de cultivo modificado

18
3.5 Cultivo batch en fermentador con medio modificado
El ensayo consistió en preparar 3 litros del medio que presentó el mejor recuento de
ufc/ml y producción de AIA en la etapa anterior, confeccionado como lo ilustrado en la
figura 1, al cual se le adiciono 300 ml de inoculo para así obtener una gran cantidad de
biomasa, el batch se realizo en duplicado.
Se utilizó un fermentador BIOTRON Intelligent Bio Plant System, el que mantenía las
condiciones de pH, temperatura y rpm controladas de forma automática, la
fermentación fue realizada durante 24 horas.
Durante la fermentación de tomaron muestras a los tiempos 0 y 24 horas determinando

pureza mediante tinción de Gram y recuento de unidades formadoras de colonias
Una vez terminada la fermentación se utilizaron frascos de litros estériles, para recibir
el formulado de Bacillus pumilus, los que se mantuvieron durante 18 horas a 5º C, para
su posterior deshidratación mediante secado Spray.
3.6 Secado Spray de B. pumilus
Al formulado celular obtenido de la fermentación se le adicionó un agente aglutinante

con el objetivo de aumentar la viscosidad y los sólidos en suspensión. Es así como se
agregó maltodextrina al 20%, agitando hasta obtener una mezcla homogénea, luego
las preparaciones nuevamente fueron almacenadas a 5ºC durante 18 horas, con la
finalidad de inducir la esporulación de B. pumillus, condición favorable al momento del
secado Spray.
Las condiciones térmicas de proceso para el secado fueron elegidas en base a

bibliografía existentes a procesos similares de secado de cultivos microbianos,
utilizando temperatura de entrada de 160ºC y temperatura salida de 80-85ºC, utilizados
por (OJEDA, 2007) en la formulación de un biocontrolador.
19
Preparación del
medio
Verificar pureza Producción del

y morfología inoculo (30ºC -24 h)
Fermentación
(30ºC-24 h)
Recuento células
totales inicio (0-24
h)
Decantación del
cultivo (18 h-5ºC)
Verificar pureza Adición maltodextrina

y morfología al 20 %
Recuento células totales
de la mezcla
Almacenamiento
(5ºC-18 h)
Secado mezcla
Envasado del Recuento células

biofertilizante totales
del polvo
FIGURA 4 Línea flujo elaboración de un formulado en polvo a partir de una cepa

de Bacillus pumilus
20
FIGURA 5 Fotografía del secador spray Niro Minor

21
4. PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
4.1 Estudio de crecimiento Bacillus pumilus
A continuación se presentan las curvas de crecimiento de la cepa C26, sometidas a

diferentes condiciones de temperatura y pH.
4.1.1 Crecimiento a 25 ºC, pH 5, 5 a 8,0. Las FIGURAS 6 a 11 muestran las curvas de

crecimiento de los cultivos a pHs 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 y 8,0 a 25ºC, todas gráficas
semilogarítmicas.
FIGURA 6 Curva crecimiento cepa C26 en medio (CST), pH 5,5, 25 ºC y 180 rpm
22
FIGURA 7 Curva crecimiento cepa C26 en medio (CST), pH 6.0, 25 ºC y 180 rpm
FUGURA 8 Curva crecimiento cepa C26 en medio (CST), pH 6.5, 25 ºC y 180 rpm
23
24
4.1.2 Curvas de crecimiento a 30 ºC, pH 5,5 a 8. Las FIGURAS 12 a 17 muestran el

comportamiento de los cultivos a pHs 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 y 8,0 a 30ºC.
25
FUGURA 13 Curva crecimiento cepa C26 en medio (CST), pH 6,0, 30ºC y 180 rpm
FIGURA 14 Curva crecimiento cepa C26 en medio (CST), pH 6,5, 30ºC y 180 rpm
26
FIGURA 15 Curva crecimiento cepa C26 en medio (CST), pH 7.0, 30ºC y 180 rpm
FIGURA 16 Curva crecimiento cepa C26 en medio (CST), pH 7,5, 30ºC y 180 rpm
27
FIGURA 17 Curva crecimiento cepa C26 en medio (CST), pH 8,0, 30ºC y 180
4.1.3 Análisis de varianza para curvas de crecimiento. Las dos condiciones de

temperatura 25 y 30 º C con los 6 pHs analizados se realizaron en duplicado. Con los
resultados obtenidos en las curvas de crecimiento se procedió a la elección de
temperatura y pH que mostró el mejor crecimiento, para esto se calcularon las
pendientes de la fase exponencial de cada grafico (CUADRO 2), para luego someterlos
a un análisis de varianza con el programa STATGRAPHICS Plus, analizando si los
factores pH y temperatura tienen un efecto significativo en la cinética de crecimiento de
la cepa.
Los resultados obtenidos por el análisis ANOVA factorial se muestran en el ANEXO 1

que indica que el pH no tiene efecto significativo en el crecimiento de la cepa, p-valor
es mayor que 0,05, de esta forma la cepa crece en un rango de pH de 5,5 a 8,0.. En
relación a la temperatura, ésta sí tiene un efecto significativo en el crecimiento, el valor-
p es menor a 0,05, de esta forma una de las dos temperatura 25 o 30º C proporciona
mejores resultados en la cinética de la cepa. Para la elección de la temperatura se
realizó test de rangos múltiples (ANEXO 2) el que indicó que a 30º C se da un mayor
desarrollo de la cepa.
28
CUADRO 2 Valores de las pendientes de las curvas de crecimiento en CST
pH 25º C 30º C
5,5 0,4422 0,4862
6,0 0,4484 0,4747
6,5 0,4461 0,49435
7,0 0,4718 0,46505
7,5 0,4446 0,48765
8,0 0,4394 0,46205
4.2 Producción ácido indolacético de Bacillus pumilus
Con los valores obtenidos de absorbancia a 530 nm de ácido indolacético (Sigma) se

construyó la curva de calibración FIGURA 18, obteniendo por medio de la ecuación y =
0,021x+0,033 las concentraciones en ppm de AIA liberado durante el crecimiento de la
cepa. En el CUADRO 3 y CUADRO 4 se presentan las producciones de AIA en ppm a
25 y 30ºC en el rango de pH 5,5 a 8,0 y en el ANEXO 3 los valores de absorbancia
obtenidos.
FIGURA 18 Curva calibración AIA

29
CUADRO 3 Producción en ppm de AIA a 25 ºC en un rango de pH de 5,5 - 8,0
Tiempo, h pH 5,5 pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 pH 8,0

1,5 11,60 11,64 13,24 15,43 14,48 15,14
3 18,41 15,45 19,02 15,93 17,95 17,98
4,5 13,64 15,45 15,60 15,29 17,91 17,43
6 13,38 13,91 15,29 15,29 15,83 15,29
7,5 13,17 14,60 15,12 15,26 16,43 16,86
9 14,83 14,69 15,74 15,76 16,05 16,74
10,5 15,36 15,91 16,69 15,26 15,52 16,91
12 16,55 16,26 16,79 15,74 15,98 16,86
24 16,88 15,98 16,64 15,83 16,07 16,29
25,5 16,38 15,45 16,48 15,74 14,83 15,81
CUADRO 4 Producción en ppm de AIA a 30 ºC en un rango de pH de 5,5 - 8,0
Tiempo, h pH 5,5 pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 pH 8,0

1,5 16,67 16,83 17,00 15,79 18,64 18,69
3 16,52 17,19 16,14 16,93 16,21 19,05
4,5 15,31 15,62 16,07 15,60 18,00 18,21
6 15,76 15,41 16,43 15,81 15,88 17,64
7,5 16,60 17,45 15,98 17,52 17,76 18,41
9 16,45 18,67 15,33 15,91 17,74 16,93
10,5 16,67 19,05 16,36 17,79 17,93 19,02
12 16,12 17,29 16,33 17,02 17,71 18,62
24 15,86 16,31 16,19 17,19 17,41 18,12
25,5 14,74 16,50 16,83 17,26 17,12 17,10
30
FIGURA 19 Producción AIA a 25ª C en caldo soya tripticasa
FIGURA 20 Producción AIA a 30º C en caldo soya tripticasa

31
De acuerdo a las determinaciones realizadas la cepa produce concentraciones entre

11,595 y 19,048 ppm de AIA, los mayores niveles de producción de la auxina se
encuentran en los pHs 7,5 y 8,0, estas concentraciones coinciden con los obtenidos
por HERNÁNDEZ (1994) quien demostró que cepas de Pseudomonas y Burkholderia
cepacia producen diferentes hormonas vegetales cuando se cultivan en medios
líquidos, una de las principales es AIA, demostrando que las cepas más activas en
cuanto a la producción de esta auxina producían entre 5 y 20,6 ppm de AIA.
VELÁZQUEZ et al. (1999) y HERNÁNDEZ (1996) encontraron que la cepa de B.

cepacia 0057 producía 20,1 µg/ml de AIA. Los autores informaron resultados positivos al
inocular plantas de maíz con esta cepa, logrando incrementos en el crecimiento y
rendimiento del cultivo, lo que corrobora que la concentración de AIA producida fue
adecuada para ejercer un efecto positivo sobre el crecimiento de las plantas.
Cabe destacar que si al medio utilizado se le hubiera adicionado triptófano la

producción de AIA de la cepa C 26 tendría que haber sido mayor, ya que al adicionar
triptófano al medio este actúa como precursor de la síntesis de este metabolito. En este
sentido Zakharova et al.
Señalaron que 50 µg/ml de triptófano en el medio, favorece de forma óptima la mayor

producción de AIA de Azospirillum brasilense.
En las FIGURAS 19 y 20 se muestran las concentraciones promedio de la auxina

durante el periodo de crecimiento de la cepa C 26, en ambos se ilustra una mayor
producción de AIA a pH 8, en el comienzo (primeras 3 horas) de la liberación de AIA
se obtuvo un mejor resultado a 30ºC en donde presentó concentraciones mayores que
a 25ºC, de igual manera que al final del crecimiento. De acuerdo a lo ilustrado en las
graficas la mejor condición obtenida es a un pH 8,0 y el mejor resultado de liberación
de la auxina es a temperatura de 30ºC, resultado que coincide con la temperatura que
presenta un mejor desarrollo de la cepa.
Las dos condiciones de temperatura y los 6 pHs analizados para de liberación de la

auxina, fueron sometidas a un análisis de varianza, para verificar si los factores de pH
y temperaturas tienen un efecto significativo en la producción de AIA.
El análisis de varianza ANEXO 4 arrojó que el pH no tiene ningún efecto significativo

en la liberación de AIA, no presenta grandes diferencias entre las concentraciones
producidas en los 6 pHs, no obstante según lo ilustrado en las gráficas las mayores
concentraciones de AIA son a pH 8 en ambas temperaturas analizadas, la aplicación
del test de rangos múltiples ANEXO 5 coincide con las gráficas, indicando que a pH 8
hay una mayor producción.
No así el efecto de la temperatura, ya que hay diferencias en la producción de la

auxina entre ambas temperaturas (25ºC y 30ºC). Presentando un valor p menor a 0,05
dado por el análisis ANOVA factorial, (ANEXO 4), para elegir en cual se da el mayor
rendimiento de AIA se aplico el análisis de medias (ANEXO 6) el que indica que la
mejor producción se presenta a 30ºC.
32
Por lo tanto las mejores condiciones logradas para la cepa C 26 son a pH 8 y

temperatura a 30ºC, con estas condiciones de crecimiento, variables que quedaron
fijadas se procedió a cambiar el medio caldo soya tripticasa, en su fuente de carbono y
nitrógeno en diferentes concentraciones como lo detallado en el CUADRO 1. De esta
manera se estudiaron las cinéticas de crecimiento a pH 8 y 30ºC en los 6 medios
preparados.
4.3 Crecimiento de Bacillus pumilus en medios modificados en su fuente de

nitrógeno y carbono
Debido que los medios eran muy turbios para medir absorbancia, el crecimiento sae
evaluó mediante recuentos en placa agar Plate Count para el crecimiento de la cepa
C26, en los tiempos 0-6-12 y 24 h. El comportamiento de la cepa fue similar en los 6
medios estudiados, los recuentos realizados durante las 24 horas fueron irregulares,
los mejores recuentos de ufc/ml se dieron en los medios M1, M2, M3 y M4, los cuales
muestran un comportamiento similar como lo ilustra la FIGURA 21. Al someter los
resultados de ufc/ml a las 24 h a un análisis estadístico para determinar si los medios
tienen un efecto significativo en el crecimiento de la cepa, el análisis de varianza
realizado con el programa STATGRAPHICS (ANEXO 7) indica que M5 tiene un efecto
significativo, con la producción más baja de los recuentos 5,85E+10, simultáneamente
se aplico el test de rangos múltiples el cual evidencia que M3 es el mejor medio en el
cual crece la cepa con un recuento de 1,72E+11 ufc/ml. En relación al efecto de usar
proteína de lupino hidrolizada con papaína, el análisis revela que ello no afecta al
crecimiento, ya que M1 con M2, M3 con M4 y M5, con M6, no presentan diferencias
entre sí, frente al test de rangos múltiples (ANEXO 8).
CUADRO 5 Recuentos de ufc/ml en medios modificados en su fuente de C y N
Tiempo (horas)
Medios
0 6 12 24
M1 4,59E+08 1,44E+09 1,69E+11 1,72E+11
M2 4,30E+08 1,61E+09 1,17E+10 1,08E+11
M3 5,07E+08 4,49E+10 2,10E+11 2,95E+11
M4 5,11E+08 4,40E+10 2,75E+11 2,51E+11
M5 4,21E+08 2,19E+10 9,14E+10 1,83E+10
M6 5,44E+08 3,75E+10 1,43E+11 5,85E+10

33
FIGURA 21 Crecimiento Bacillus Pumilus en medios modificados
4.3.1 Producción de AIA en medios modificados en su fuente de C y N. Durante el

crecimiento de la cepa C26, se tomaron muestras a los tiempos 0 - 6 - 12 y 24 h para
la determinación de AIA liberada en el medio, como se puede apreciar en la FIGURA
20, la mayor producción de AIA se da en M3 y M4, resultado que coincide con los
mayores recuentos a las 24 horas de crecimiento de la cepa.
Con los datos de producción de AIA a las 24 h, tiempo en el que se presentó la mayor
producción de la auxina, se realizó un análisis de varianza ANEXO 9 y el test de
rangos múltiples ANEXO 10, los que indican que e M4 es el mejor medio, el cual
presenta la media más alta de 0,47.
De esta forma el medio elegido para seguir a la siguiente etapa es M4 por ser el que
logró una mayor producción de AIA en comparación a los restantes medios, aunque
M3 fue el medio en el cual se obtuvo un mayor recuento de 2,95E+11 ufc/ml, se prefirió
M4 ya que en este último se obtuvieron recuentos similares de 2,51E+11 ufc/ml no
existiendo diferencias entre ambos medios.
34
CUADRO 6 Producción de AIA (ppm) medios modificados en su fuente de C y N
Tiempo (h)
Medios 0 6 12 24
M1
9,24 10,29 7,48 8,24
M2
9,67 8,10 6,71 6,38
M3
13,10 14,05 15,48 20,48
M4
12,38 16,95 16,10 21,67
M5
13,71 12,52 10,76 17,43
M6
14,67 12,81 12,76 15,48
FIGURA 22 Producción de AIA en medios modificados
4.4 Cultivo batch de Bacillus pumilus en fermentador con medio modificado
Con el medio 4 se procedió a realizar el cultivo batch, la producción de Bacillus pumilus

se realizó en fermentador que controlaba de forma automática la condición de pH 8,
temperatura a 30ºC, agitación (200 rpm) y aireación (1 vvm), con la finalidad de
producir una gran cantidad de biomasa de un cultivo totalmente puro, cabe destacar
que se le realizó un control de pureza al tiempo 0 y al final de la fermentación 24 horas,
para corroborar que no existiera contaminación (FIGURA 23).
35
FIGURA 23 Tinción de Gram de la cepa C26 Bacillus pumilus
4.4.1 Recuentos. Se tomaron muestras al tiempo 0 y al final del desarrollo en medio

liquido por batch, para realizar los recuentos en placa en agar Plate Count a 30º C por
48 horas.
Los recuentos obtenidos al final del desarrollo en medio liquido superaron a los
logrados en el cultivo en matraz del medio M4, las excelentes condiciones de
fermentación con un equipo que controlaba todos los parámetros de forma automática,
permitieron obtener una gran cantidad de biomasa, aspecto muy importante para
continuar con el proceso de secado, puesto que de esta forma se obtiene mayor
concentración en el producto deshidratado. En el CUADRO 7 se presentan los
recuentos en ufc/ml al inicio y final del desarrollo de la cepa C 26 en medio liquido.
4.4.2 Producción de AIA durante el desarrollo en medio liquido de la cepa C26. Se

tomaron muestras cada 6 horas durante el proceso de fermentación, gracias a las
condiciones óptimas entregadas por el fermentador, la concentración al final de la
fermentación fue mucho mayor que la obtenida en el medio de cultivo en matraz del
medio fermentado M4. La concentración de AIA al cabo de 24 horas es notable
alcanzando un valor de 34,048 ppm como lo muestra el CUADRO 8, en comparación
con lo obtenido en el cultivo del matraz agitado que fue de 21.667 ppm.
CUADRO 7 Recuento microbiológico del desarrollo en medio liquido de la cepa

C26
Tiempo (h) Recuento ufc/ml
0 6,2 x 108
24 6,2 x 1012
36
CUADRO 8 Concentración en ppm de AIA durante el cultivo batch
Tiempo (h) ppm AIA

0 7,905
6 8,143
12 19,762
24 34,048
4.4.3 Secado spray. Una vez obtenida la fermentación e inducía la esporulación de la

cepa de Bacillus pumilus, se escoge un “carrier” en este caso maltodextrina para
aumentar la viscosidad, se trabaja con una temperatura de proceso de 160º C de
entrada y de salida 80-85ºC parámetros utilizados por OJEDA, (2007) quién realizó el
secado de una cepa de Bacillus subtilis. La temperatura de entrada fue constante ya
que el equipo NIRO Minor cuenta con un sistema de control de temperatura por medio
de resistencias que calientan el aire de entrada a la cámara, no así la temperatura de
salida del producto debido que ésta se ve influenciada por el flujo de alimentación.
Se realizaron 3 procesos de secado el primero a modo de ensayo, y los dos batch de

fermentación mencionados anteriormente.
4.4.3.1 Recuento después del secado. Se realizó un recuento en placa del

concentrado celular en polvo, para determinar la viabilidad del Bacillus pumillus
después del proceso de secado, hay que destacar que realizar recuentos
microbiológicos a bacterias que tienen la capacidad de esporular es sumamente
complicado, más aún si han sido sometidas a un proceso de deshidratado a altas
temperaturas, por lo cual los resultados entregados son poco exactos.
Si bien se tomó una pequeña cantidad del deshidratado en polvo, y se realizaron las
diluciones correspondientes para realizar el recuento, no fue posible obtener resultados
lógicos y confiables, observándose colonias en diferentes estados de crecimiento con
evidentes incrementos y reducciones, esto tendría su explicación en que la bacteria se
encuentra en su estado de latencia formando endosporas, así algunas bacterias
pueden activarse rápidamente formando grandes colonias mientras que otras retardan
en su activación formando colonias muy pequeñas, hay que destacar que no hubo
repeticiones y que la decisión de las diluciones que fueron sembradas no fueron las
más acertadas. En la FIGURA 23 se muestra el producto final, envasado y sellado.
4.4.3.2 Recuento después de 3 meses del secado. Se realizó un recuento celular

después de 90 días de almacenamiento del formulado en polvo a temperatura
ambiente (verano), para analizar la viabilidad remanente de la cepa. El producto en
polvo se encontraba completamente sellado libre de humedad y posible contaminación.
Después de sucesivas diluciones se sembraron las placas por 48 horas a 32º C, hay
que destacar que esta vez los recuentos se realizaron 2 veces en triplicado. Los
resultados obtenidos fueron satisfactorios y coherentes, los recuentos de ufc/ml fueron
lógicos y repetitivos, las colonias observadas eran de color crema opacas, de tamaños
irregulares unas más grandes que otras, las más pequeñas se encontraban incluidas
37
en el agar y las más grandes formaban colonias en la superficie como se puede

apreciar en la FIGURA 24. Los recuentos mostraron crecimiento hasta 108 ufc/ml,
resultado que sólo puede ser comparado con la obtenida al final de la fermentación la
cual alcanzó niveles de 1012 ufc/ml, al no contar con los recuentos a la salida de secado
es imposible obtener la viabilidad remanente del formulado en polvo, sólo queda
aseverar que las concentraciones después del deshidratado fueron bastantes altas y
que la viabilidad después de 90 días arrojó resultados igualmente satisfactorios
llegando a alcanzar 1,3x108 ufc/ml, de esta forma no se puede obtener un resultado en
relación a cuantos ciclos logarítmicos disminuye el crecimiento de la cepa por efecto
del secado.
FIGURA 24 Formulado en polvo de Bacillus pumilus
FIGURA 25 Placa del recuento microbiológico del secado después de 3 meses

38
5. CONCLUSIONES
De acuerdo a los objetivos planteados en esta investigación destaca lo siguiente:
• Se logró remplazar la fuente de carbono y nitrógeno del caldo soya tripticasa,

por concentraciones de melaza y combinaciones melaza/sacarosa y proteína de
lupino respectivamente, con excelentes resultados en el crecimiento de la cepa.
• Fue posible establecer que la cepa C26 produce mejores cantidades de Acido
Indol Acético (AIA), y presenta un mayor crecimiento a pH 8 y 30 ºC
• Fue posible obtener un medio de cultivo modificado M4, en el cual la producción
de AIA superara lo logrado utilizando caldo soya tripticasa
• Durante la fermentación se obtuvo una gran cantidad de biomasa 6,16x1012
ufc/ml , logrando formular un prototipo de biofertilizante en polvo mediante un
proceso de secado spray
• Es posible formular un preparado en polvo a partir de un concentrado celular de
Bacillus pumilus, que no pierde su viabilidad en el tiempo.
• Sin embargo, no fue posible determinar la viabilidad numérica remanente del
formulado en polvo, por la complejidad de obtener datos lógicos y repetitivos al
momento de realizar el recuento microbiológico del polvo deshidratado, debido
a la esporulación del Bacillus pumillus.
39
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43
ANEXOS
44
ANEXO 1
Análisis de la Varianza para pendiente - Sumas de Cuadrados de Tipo III
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
A: temperatura 0,268245 1 0,268245 11,24 0,0038
B: pH 0,000554379 5 0,000110876 0,00 1,0000
RESIDUOS 0,405732 17 0,0238666

------------------------------------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORREGIDO) 0,674532 23
------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.
ANEXO 2
Contraste Múltiple de Rangos para pendiente según temperatura
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Método: 95,0 porcentaje LSD
Temperatura Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

----------------------------------------------------------------------------------------------------
1 12 0,266892 0,0445969 X
2 12 0,478333 0,0445969 X
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Contraste Diferencias +/- Límites
----------------------------------------------------------------------------------------------------
1-2 *-0,211442 0,133065
----------------------------------------------------------------------------------------------------
* indica una diferencia significativa.
45
ANEXO 3
Determinación AIA medición de absorbancia 530 nm
Determinaciones correspondientes a medios trabajados a 25º C
t.h pH 5.5 pH 6.0 pH 6.5 pH 7.0 pH 7.5 pH 8.0

1,5 0,284 0,284 0,304 0,408 0,331 0,338
3 0,347 0,401 0,519 0,367 0,421 0,399
4,5 0,329 0,36 0,351 0,337 0,387 0,387
6 0,338 0,326 0,365 0,347 0,338 0,326
7,5 0,321 0,348 0,372 0,348 0,359 0,398
9 0,367 0,376 0,387 0,368 0,345 0,376
10,5 0,329 0,365 0,401 0,372 0,362 0,378
12 0,356 0,361 0,389 0,356 0,358 0,398
24 0,378 0,369 0,377 0,361 0,366 0,371
25,5 0,364 0,358 0,389 0,363 0,347 0,362
Determinaciones correspondientes a medios trabajados a 30º C
t.h pH 5.5 pH 6.0 pH 6.5 pH 7.0 pH 7.5 pH 8.0

1,5 0,399 0,416 0,440 0,368 0,453 0,442
3 0,386 0,400 0,395 0,418 0,382 0,471
4,5 0,319 0,348 0,397 0,371 0,401 0,456
6 0,356 0,334 0,401 0,396 0,335 0,410
7,5 0,401 0,444 0,392 0,431 0,421 0,483
9 0,375 0,419 0,358 0,371 0,394 0,370
10,5 0,390 0,455 0,395 0,390 0,414 0,462
12 0,362 0,362 0,402 0,396 0,401 0,448
24 0,365 0,373 0,4110 0,436 0,413 0,449
25,5 0,338 0,375 0,440 0,416 0,409 0,419
46
ANEXO 4
Análisis de la Varianza para AIA - Sumas de Cuadrados de Tipo III
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
A: pH 8,21933 5 1,64387 2,27 0,0943
B: Tº C 9,29896 1 9,29896 12,82 0,0023
RESIDUOS 12,3284 17 0,7252

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------
47
ANEXO 5
Contraste Múltiple de Rangos para AIA según pH
----------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------
pH Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
--------------------------------------------------------------------------------
5,5 4 15,544 0,425793 X
6 4 15,9821 0,425793 X
7 4 16,1167 0,425793 XX
6,5 4 16,1631 0,425793 XX
7,5 4 16,7726 0,425793 XX
8 4 17,3533 0,425793 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
5,5 - 6 -0,438095 1,27046
5,5 - 6,5 -0,619048 1,27046
5,5 - 7 -0,572619 1,27046
5,5 - 7,5 -1,22857 1,27046
5,5 - 8 *-1,80929 1,27046
6 - 6,5 -0,180952 1,27046
6-7 -0,134524 1,27046
6 - 7,5 -0,790476 1,27046
6-8 *-1,37119 1,27046
6,5 - 7 0,0464286 1,27046
6,5 - 7,5 -0,609524 1,27046
6,5 - 8 -1,19024 1,27046
7 - 7,5 -0,655952 1,27046
7-8 -1,23667 1,27046
7,5 - 8 -0,580714 1,27046
--------------------------------------------------------------------------------
48
ANEXO 6
Tabla de Medias por mínimos cuadrados para AIA con 95,0 Intervalos de
confianza
------------------------------------------------------------------------------------------------------
Error Límite Límite
Nivel Frecuencia Media Estándar Inferior Superior
------------------------------------------------------------------------------------------------------
Media Total 24 16,322
pH
5,5 4 15,544 0,425793 14,6457 16,4424
6 4 15,9821 0,425793 15,0838 16,8805
6,5 4 16,1631 0,425793 15,2647 17,0614
7 4 16,1167 0,425793 15,2183 17,015
7,5 4 16,7726 0,425793 15,8743 17,671
8 4 17,3533 0,425793 16,455 18,2517
-----------------------------------------------------------------------------------------------------
TEMPERATURA
1 12 15,6995 0,245832 15,1809 16,2182
2 12 16,9444 0,245832 16,4258 17,4631
-----------------------------------------------------------------------------------------------------
ANEXO 7
Análisis de la Varianza para Recuento según Medios
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Fuente Sumas de cuad. Gl Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Entre grupos 1,17958E23 5 2,35917E22 24,04 0,0007
Intra grupos 5,88775E21 6 9,81291E20
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 1,23846E23 11
49
ANEXO 8
Contraste Múltiple de Rango para Recuento según Medios
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
Medios Frec. Media Grupos homogéneos
--------------------------------------------------------------------------------
5 2 1,825E10 X
6 2 5,85E10 XX
2 2 1,075E11 XX
1 2 1,715E11 X
4 2 2,505E11 X
3 2 2,945E11 X
--------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
1-2 6,4E10 7,66511E10
1-3 *-1,23E11 7,66511E10
1-4 *-7,9E10 7,66511E10
1-5 *1,5325E11 7,66511E10
1-6 *1,13E11 7,66511E10
2-3 *-1,87E11 7,66511E10
2-4 *-1,43E11 7,66511E10
2-5 *8,925E10 7,66511E10
2-6 4,9E10 7,66511E10
3-4 4,4E10 7,66511E10
3-5 *2,7625E11 7,66511E10
3-6 *2,36E11 7,66511E10
4-5 *2,3225E11 7,66511E10
4-6 *1,92E11 7,66511E10
5-6 -4,025E10 7,66511E10
--------------------------------------------------------------------------------
50
ANEXO 9
Análisis de la Varianza para producción de AIA a las 24 h - Sumas de Cuadrados

de Tipo III
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
EFECTOS PRINCIPALES
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
A: MEDIOS 0,134793 5 0,0269585 23,88 0,0007
RESIDUOS 0,006773 6 0,00112883

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
51
ANEXO 10
Contraste Múltiple de Rangos para Producción de AIA a las 24 h según MEDIOS

-----------------------------------------------------------------------------------------------------
MEDIOS Recuento Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

-----------------------------------------------------------------------------------------------------
2 2 0,204 0,0237 X
1 2 0,2115 0,0237575 X
5 2 0,3855 0,0237575 X
6 2 0,393 0,0237575 XX
3 2 0,447 0,0237575 XX
4 2 0,47 0,0237575 X
-----------------------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------
1-2 0,0075 0,0822118
1-3 *-0,2355 0,0822118
1-4 *-0,2585 0,0822118
1-5 *-0,174 0,0822118
1-6 *-0,1815 0,0822118
2-3 *-0,243 0,0822118
2-4 *-0,266 0,0822118
2-5 *-0,1815 0,0822118
2-6 *-0,189 0,0822118
3-4 -0,023 0,0822118
3-5 0,0615 0,0822118
3-6 0,054 0,0822118
4-5 *0,0845 0,0822118
4-6 0,077 0,0822118
5-6 -0,0075 0,0822118
--------------------------------------------------------------------------------

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Crecimiento de Bacillus pumilus Productor de la

Auxina Ácido Indolacético, Como Base para

Olga Maribel Zúñiga Bravo

A todos mis seres queridos, a mi papá, hermano, familiares, compañeros y amigos, en

"Pide y recibirás. Busca y encontrarás. Llama y la

La finalidad de esta investigación fue estudiar las cinética de crecimiento y la

Palabras claves: Bacillus pumilus, Ácido Indolacético (AIA), Biofertilizante en

Key words: Bacillus pumilus, Indolacético acid (IAA), Biofertilizers powder.

Hoy en día existe una gran preocupación en la productividad agrícola y el manejo

En la actualidad los biofertilizantes son considerados como componentes del manejo

El estudio de microorganismos promotores del crecimiento vegetal representa una

Estudiar el crecimiento de la cepa C26 de Bacillus pumilus en un medio de cultivo

• Evaluar el crecimiento y la liberación de AIA de la cepa en caldo ST en pHs de

2.1 Bacterias promotoras del crecimiento

En los últimos años el estudio de nuevos sistemas y prácticas alternativas que

Las bacterias edáficas beneficiosas de vida libre se denominadas Plant Growt

Las bacterias promotoras del crecimiento se definen como bacterias habitantes de la

2.2 Reguladores del crecimiento vegetal

Se denomina hormona a cualquier sustancia orgánica específica, efectiva a bajas

El comportamiento de ciertas sustancias vegetales parecía ser lo suficientemente

2.2.1 Auxinas. Estas hormonas son un grupo de compuestos que estimulan la

Una característica sorprendente de la auxina es la fuerte polaridad exhibida en su

La auxina ha sido relacionada en la regulación de diferentes procesos fisiológicos,

El mecanismo estudiado con mayor amplitud ha sido la producción de auxinas,

El ácido indolacético es catalogado como una fitohormona, y asimismo, es la auxina

2.3 Producción de ácido indol acético (AIA)

Estas bacterias (PGPB) se encuentran entre los principales grupos microbianos

2.4 Del género Bacillus

El género Bacillus spp. comprende en un gran número de diversas formas de bastón,

2.4.1 Bacillus pumilus. Esta bacteria es considerada un organismo promotor del

2.4.2 Bacillus pumilus como regulador del crecimiento en el trigo. De la rizósfera y

todas estas cepas fueron estudiadas, aisladas e identificadas taxonómicamente

De la misma forma que en el parámetro anterior el efecto promotor se debería a que

2.5 Sistemas de cultivos de microorganismos

Se han desarrollado varias técnicas para el cultivo de microorganismos, a saber, cultivo

El cultivo batch o discontinuo ocurre cuando al ser inoculado un cultivo de

FIGURA 1 Curva de crecimiento batch para una población bacteriana.

2.6 Nutrición de los microorganismos

No basta que el medio de cultivo elegido para el desarrollo de un organismo o de un

2.6.1 Macronutrientes. Según BROCK et al. (1998) carbono, oxígeno, hidrógeno y

Macronutrientes, son aquellos requeridos en grandes cantidades, estando en mayor

2.6.2 Micronutrientes. Aunque los micronutrientes son requeridos en muy pequeñas

Algunos de los microelementos más comunes se encuentra: manganeso, molibdeno,

2.6.3 Factores de crecimiento. Los factores de crecimiento son compuestos

Las vitaminas son los factores de crecimiento más comúnmente necesitados y la

2.6.4 Producción de una alta cantidad de biomasa Los componentes empleados en

2.7. Detección colorimétrica de auxinas: Reactivo de Salkowsky

El reactivo de Salkowsky, ha sido ampliamente utilizado para establecer la presencia

2.8. Conservación de microorganismos del género Bacillus mediante secado

El éxito en la preservación de los cultivos microbianos es esencial para las actividades

estabilidad y aumentar su vida útil. En el encapsulado, la porción activa es designada

• Preparación de la dispersión o emulsión a ser procesada.

Este proceso se realiza en un secador Spray que se compone básicamente de un

La presente investigación consistió en estudiar el crecimiento de la cepa Chilena C 26

El trabajo práctico se realizó en los laboratorios y planta piloto de Procesamiento de

3.1 Determinación ácido indolacético (AIA)

La determinación de producción de ácido indolacético de la cepa B. pumilus fue

3.1.1 Preparación curva calibración de (AIA). Se prepararon soluciones de ácido

• Se toma 1 ml de cada solución de (AIA) en sus diferentes concentraciones en

Se procedió a medir la concentración de (AIA) de la siguiente manera:

• Se tomaron 5 ml de cada medio de cultivo cada 90 min y fueron colocados en

3.2 Material Biológico

Cepa C26 de B. pumilus: Cepa aislada de las raíces de zarzamoras, la cual se