Un enfoque basado en liposomas para los

microarrays de antígenos multicomponentes

integrados
Resumen
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1. Introducción
Al igual que las proteínas y los carbohidratos, los lípidos son una categoría de los
elementos esenciales de las células vivas. Las moléculas lipídicas de diversas estructuras
también son objetivos importantes para el reconocimiento inmunológico y las respuestas de
anticuerpos [ 1 , 2 , 3 ]. Muchos patógenos bacterianos producen fosfolípidos, glicolípidos
y / o lipopolisacáridos (LPS) de distintas estructuras antigénicas [ 3 , 4]. Algunos son
específicos para un patógeno dado y, por lo tanto, sirven como objetivos inmunológicos
para la identificación y diagnóstico de patógenos de enfermedades infecciosas, y como
vacunas para la inducción de respuestas inmunitarias contra la infección. También hay
restos lipídicos conservados entre los microbios, como los componentes lipídicos A de
LPS, que son ligandos de los receptores tipo Toll del sistema inmune innato [ 5 , 6 ]. El
reconocimiento del hospedador de dichos lípidos conduce a respuestas rápidas de primera
línea contra la infección.
Los restos lipídicos de componentes celulares también pueden ser dianas moleculares de
enfermedades autoinmunes [ 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ]. En el lupus eritematoso sistémico
(LES), se han detectado anticuerpos anti-cardiolipina además de los autoanticuerpos contra
componentes de proteínas y ácidos nucleicos [ 9 ]. En la esclerosis múltiple (EM) y la
encefalomielitis autoinmune (EAE), hay un aumento de las reactividades de las células T y
autoanticuerpos que se dirigen a los lípidos de la mielina [ 10 , 12 , 14]. Una proteína
similar a la histocompatibilidad (MHC), CD1, se une a ciertos tipos de moléculas de lípidos
y las presenta a las células T o células NK [ 2 ]. La expresión de CD1 aumenta en el sitio de
las lesiones cerebrales tanto en la EM como en su modelo de roedor, EAE [ 10 , 11 ]. Estas
respuestas autoinmunes pueden ser responsables de la desmielinización en tejidos neurales
centrales y / o periféricos [ 12 , 13 ].
Las reactividades cruzadas antigénicas basadas en lípidos o el mimetismo molecular entre
componentes celulares y antígenos microbianos específicos pueden contribuir a la
patogénesis de enfermedades infecciosas o al aclaramiento de productos lipídicos celulares
[ 7 , 8 , 15 , 16 , 17 ]. La infección por Campylobacter jejuni indujo un trastorno
neurológico autoinmune, el síndrome de Guillain-Barré, en aproximadamente un tercio de
los casos [ 7 , 8]. Este patógeno expresa una molécula de lipopolisacáridos que imita varios
gangliósidos presentes en altas concentraciones en los nervios periféricos. La infección por
esta bacteria puede, por lo tanto, provocar respuestas autoinmunes no deseadas a los
gangliósidos del tejido huésped. Además, numerosas infecciones virales inducen este
síndrome, ya que los virus acumulan gangliósidos a medida que incorporan la membrana
plasmática de la célula huésped.
Además, los componentes autolipídicos pueden modificarse para generar epítopos lipídicos
neo-inmunogénicos [ 16 , 17 , 18 , 19 ]. Por ejemplo, la oxidación de lipoproteínas de baja
densidad (LDL) genera una variedad de lípidos modificados oxidativamente y aductos de
proteínas lipídicas que son inmunogénicos y proinflamatorios, que a su vez contribuyen a la
aterogénesis [ 16 , 17 ]. Las células que sufren apoptosis también muestran restos oxidados
en sus membranas superficiales, según lo determinado por la unión de anticuerpos
monoclonales específicos de oxidación. Algunos autoanticuerpos anti-lípidos juegan un
papel en la eliminación de derivados lipídicos celulares no esenciales o dañinos y, de
hecho, son beneficiosos para los huéspedes [ 16 , 19, 20 ]. La inmunización con
polisacárido de la pared celular de Streptococcus pneumoniae provocó anticuerpos anti-
fosforilcolina T15, que reaccionan de forma cruzada con epítopos oxidados de lipoproteínas
de baja densidad (oxLDL). Curiosamente, esta respuesta de anticuerpos fue efectiva en la
eliminación de oxLDL en circulación y en lesiones ateroscleróticas [ 17 , 19].
En resumen, los lípidos representan una clase importante de biomoléculas que son
estructuralmente diversas y de importancia inmunológica. Existe una creciente necesidad
de integrar el componente lipídico en las plataformas de micromatrices de antígeno para
facilitar la caracterización de antígenos lipídicos y respuestas de anticuerpos anti-
lípidos. Varios investigadores, incluido nuestro equipo, han estado utilizando un método
altamente eficiente para construir micromatrices de proteínas y carbohidratos, es decir ,
detectar moléculas de carbohidratos y proteínas en el portaobjetos de micro-vidrio
recubierto de nitrocelulosa [ 21 , 22 , 23 ]. En este estudio, se exploró un procedimiento
experimental práctico para permitir la producción de alto rendimiento de microarrays de
lípidos utilizando este sustrato de biochip.
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2. Sección experimental.
Una barrera técnica para la producción de micromatrices de lípidos que utilizan un sustrato
de nitrocelulosa es que la mayoría de las moléculas de lípidos necesitan solubilizarse en
solventes orgánicos. Sin embargo, los dispositivos de micro-manchas existentes no fueron
diseñados para manejar solventes orgánicos. Un enfoque experimental para superar este
problema es detectar la suspensión acuosa de vesículas lipídicas, liposomas, en portaobjetos
de micro-vidrio recubiertos con nitrocelulosa [ 24 ]. Nuestros procedimientos
experimentales generales para la producción de liposomas y la construcción de
microarreglos de antígenos de múltiples componentes integrados se describen aquí.

2.1. Preparación de liposomas

Se aplicó un protocolo de sonda de sonicación con modificaciones menores para producir
pequeñas vesículas unilamelares [ 24 , 25 ]. En resumen, las soluciones de lípidos se
secaron mediante un método de evaporación con nitrógeno y luego se resuspendieron en
solución salina mediante agitación con vórtex para producir una suspensión de lípidos
uniforme y lechosa que se sonicó en hielo con un sonicador de sonda (VirSonic 475 de
VIRTIS, Durham, NC EE.UU.) para producir preparaciones de liposomas transparentes
adecuadas para la construcción de matrices de liposomas.
Usando este procedimiento, se produjeron dos tipos de
liposomas, homo y heteroliposipos . Los primeros se hicieron a través de una preparación
lipídica única, por ejemplo, fosfatidilcolina (PTC), cerebrósido y sulfatida. El último
contenía dos moléculas lipídicas diferentes con PTC como soporte para mostrar otros
lípidos / glicolípidos en las proporciones deseadas o densidades de epítopos. Por
ejemplo, se preparó un hetero- liposoma de sulfátido ( Tabla complementaria S1 , Índice de
antígeno # 20) con sulfatida y PTC en una proporción de 1:10 ( p / p ), es decir , 0,2 mg de
sulfatida y 2,0 mg de PTC por ml de Suspensión de liposomas en solución
salina. Brevemente, este liposoma fue nombrado como Sulfatide / PTC_1 / 10. Las
composiciones de todas las preparaciones de liposomas se dan enTabla complementaria
S1 .

2.2. Impresión de proteínas, carbohidratos y lípidos / microarreglos de liposomas

Un robot de alta precisión diseñado para producir micromatrices de ADNc (GMS 417
Arrayer; Genetic Microsystems, Inc., Woburn, MA, EE. UU.) Se utilizó para detectar
preparaciones de antígenos, incluidas proteínas / péptidos, carbohidratos y liposomas de
diversas composiciones sobre los portaobjetos de vidrio. pre-recubierto con polímero de
nitrocelulosa (FAST Slides; Schleicher & Schuell, Keene, NH, EE. UU.). Las proteínas y
los carbohidratos se disolvieron en PBS (pH 7,4) y solución salina (NaCl al 0,9%),
respectivamente. Las preparaciones de liposomas generalmente se suspenden en solución
salina en concentraciones como se especifica en la Tabla S1 . Se imprimieron con tamaños
de punto de ~ 150 μm y en intervalos de 375-μm, de centro a centro. Las micromatrices
impresas se secaron al aire y se almacenaron a temperatura ambiente antes de la aplicación.

2.3. Ensayos de microarrays

Inmediatamente antes del uso, los microarrays impresos se enjuagaron con PBS, pH 7.4,
con Tween 20 al 0.05% ( v / v ) y luego se bloquearon incubando los portaobjetos en BSA
al 1% ( p / v ) en PBS que contenía el 0.05% ( p / v) ) NaN 3 durante 30 min. Luego se
incubaron con anticuerpos diluidos en BSA al 1% ( p / v ) en PBS que contenía NaN3 ( p /
v ) al 0.05% y 0.05% ( v / v)) Tween 20. Cada matriz se tiñó primero con una muestra de
suero a una dilución de 1:25 de un ratón con EAE o un control SJ / L de control de la
misma edad. La IgG capturada se tiñó con un anticuerpo anti-IgG conjugado con Cy5 a 2
μg / ml y la IgM capturada en la misma matriz se reveló mediante un anticuerpo secundario
anti-IgM etiquetado con R-PE a 2 μg / mL (Rockland Immunochemicals, Inc., Pottstown,
PA, EE. UU.). Los portaobjetos teñidos se enjuagaron cinco veces con PBS con 0,05% ( v /
v).) Tween 20, se seca al aire a temperatura ambiente y luego se escanea en busca de
señales fluorescentes. Los microarrays teñidos se escanearon con ScanArray5000A
Microarray Scanner (PerkinElmer Life Science, Boston, MA, EE. UU.) Siguiendo el
procedimiento del manual del usuario del fabricante. El JMP-Genomics 6.0 del Instituto
SAS (Cary, NC, EE. UU.) Se aplicó para un análisis estadístico adicional como se describe
en las leyendas de las figuras.
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3. Resultados y discusión
Una pregunta clave para esta tecnología de matriz de liposomas es si los liposomas
manchados conservan los determinantes antigénicos que son fácilmente reactivos con
anticuerpos específicos anti-lípidos. Cabe destacar que los anticuerpos anti-lípidos están
generalmente presentes en el repertorio del anticuerpo natural murino [ 26 , 27 , 28 ] y que
se identificó un espectro de autoanticuerpos dirigidos a múltiples clases de antígenos en un
modelo EAE [ 12 , 14 , 29].]. Por lo tanto, si los arreglos de liposomas producidos por este
procedimiento conservan los epítopos lipídicos que son fácilmente reactivos con los
anticuerpos anti-lípidos y si el ensayo alcanza la sensibilidad para detectar estos anticuerpos
en la circulación sanguínea, utilice estos arreglos para escanear las muestras de suero
extraídas de cualquiera de los dos. Los ratones o sujetos de EAE permitirían la detección de
los anticuerpos anti-lípidos correspondientes en estos modelos. Como se resume a
continuación, estas suposiciones fueron probadas experimentalmente.

3.1. Arreglos de homo-liposomas

En el primer paso, examinamos los " homo- liposomas", que se componen utilizando una
preparación de lípidos homogénea. Se aplicaron cinco preparaciones de homo- liposomas
(cerebrósido, gangliósido, dimiristoilfosfatidilserina (DMPS), sulfátida y PTC) a los
portaobjetos de nitrocelulosa a dos diluciones que producen 10 arreglos
de homo- liposomas para la tinción de anticuerpos ( Figura 1 ). Dado que una gran cantidad
de anticuerpos anti-lípidos, como anti-PTC y anti-sulfatide, están a menudo presentes en los
repertorios de anticuerpos de suero murino, sondeamos las matrices de liposomas utilizando
un panel de sueros de ratón. Estos incluyen tres sueros obtenidos de un modelo EAE y tres
de los ratones SJL / J emparejados por edad.
Figura 1
El homo- microarray liposoma detectado niveles significativos de anticuerpos anti-lípidos en el
repertorio de anticuerpos natural de SJL / J ( A - C ) y un EAE (encefalomielitis autoinmune
experimental) modelo (PLP-SJL / J) ( D - F ). Cada matriz se tiñó con una muestra de suero a una
dilución 1:25 de un ratón con EAE ( derecha ) o un ratón SJ / L de control de la misma edad
( izquierda).). La IgM capturada fue revelada por un anticuerpo secundario anti-IgM marcado con
R-PE a 2 µg / mL. Los resultados se presentan como puntuaciones de micromatrices y se analizan
estadísticamente utilizando el paquete de software JMP Genomics del Instituto SAS. La prueba de
Dunnett se realizó para determinar si las medias de la detección de la matriz de liposomas por
triplicado eran significativamente diferentes de las medias de los valores de fondo (Bg. 1, n=
12). Las medias de los múltiples puntos se muestran como barras verdes horizontales. La parte
superior e inferior de los diamantes verdes representan los límites de los intervalos de confianza del
95% para las medias. Los círculos de comparación para los resultados de la prueba de Dunnett
aparecen a la derecha de los diamantes medios para ilustrar el significado de las diferencias entre
los medios. Estos círculos permiten la inspección visual de la significación estadística de las
diferencias. Cuanto más se intersecan los círculos, menos significativa es su diferencia y
viceversa. El color de los círculos de comparación y el color del nombre del liposoma enumerados
en xLos ejes se identifican en negro para indicar que los medios de detección son significativamente
diferentes de los medios de Bg. 1 y rojo para referirse a la detección no significativa en
comparación con el fondo. Los perfiles anti-lipídicos parecen ser diferentes entre los seis sujetos.
La Figura 1 ilustra un análisis cuantitativo de cada ensayo de micromatriz. Los resultados
se presentan como un grupo de seis diagramas de dispersión, que se obtuvieron mediante
un análisis de varianza de una vía antígeno por antígeno (ANOVA). Las puntuaciones de
micromatrices en el eje y son las intensidades fluorescentes medias (IMF) transformadas
con log2; los antígenos y un control de fondo (Bg. 1) se enumeran en eleje x . La prueba de
Dunnett se realizó para determinar si los medios de detección de un liposoma dado eran
significativamente diferentes de los medios de Bg. 1. Los niveles de significancia de
detección se ilustran visiblemente de dos maneras, es decir:, el color y la ubicación de los
círculos de comparación y el color del nombre del elemento listado en el eje x, ya sea en
negro (estadísticamente significativo) o rojo (no estadísticamente significativo). Dado que
cada círculo se centró en el valor medio para una preparación específica de antígeno y tiene
un diámetro que es proporcional al error estándar para la media, la distancia entre el círculo
de un antígeno y el de Bg. 1 refleja cuantitativamente el nivel de significancia de la señal de
anticuerpo detectada por el antígeno. Cuanto más se intersecan los círculos, menos
significativa es su diferencia, y viceversa. La línea continua horizontal en la gráfica es la
media de las respuestas de anticuerpos para cada matriz.
Los números de detecciones positivas que son estadísticamente significativas en
comparación con el fondo se muestran en cada gráfico. En la Figura 1 A – C, 4/10, 4/10 y
9/10, los liposomas se tiñeron positivamente con los anticuerpos IgM obtenidos de tres
ratones SJL / J normales. La Figura 1 D – F muestra que los liposomas 6/10, 3/10 y 8/10 se
tiñeron positivamente con tres muestras de anti- sueros IgM derivados de EAE. Los
anticuerpos anti-PTC, anti-sulfatida y anti-DMPS fueron positivos en los seis ratones; los
anticuerpos anti-ceramida fueron positivos en un SJL / J y un ratón EAE; y se detectaron
anti-gangliósidos en dos de los tres ratones SJL / J normales, pero no en ratones EAE.
Este experimento de escaneo de antisueros demuestra que las cinco preparaciones
de homo- liposomas muestran los determinantes antigénicos en el chip que son fácilmente
reactivos con los anticuerpos IgM séricos de ratones SJL / L, ya sea de ratones normales o
del modelo EAE o de ambos controles normales y EAE. En notable contraste con estos
perfiles de anticuerpos IgM-anti-lípidos, el anticuerpo anti-lípidos IgG no se detectó en
estas muestras.

3.2. Arreglos De Hetero-Liposomas

A diferencia de los homoliposomas , que son producidos por una sola preparación de
lípidos, un heteroliposoma contiene al menos dos moléculas de lípidos diferentes. La
configuración de los heteroliposomas se parece a cierta característica de la membrana
celular decorada con los restos polares de los lípidos, como los fosfolípidos y las cadenas
complejas de azúcar. Examinamos si los liposomas de PTC pueden servir como una
vesícula para transportar otras moléculas de lípidos para detectar manchas y extender el
espectro de determinantes antigénicos mostrados por las matrices de liposomas. El conjunto
de antisueros aplicado en la Figura 1 se utilizó para examinar si un hetero-liposoma puede
capturar niveles significativos de anticuerpos anti-lípidos. En este análisis, las puntuaciones
de micromatrices de PTC-liposoma sirvieron como valores de fondo en el ANOVA para
determinar las actividades de anticuerpos asociadas con las correspondientes preparaciones
de hetero- liposomas que difieren de la actividad de anticuerpos anti-PTC.
Como se muestra en la Figura 2 , los tres antisueros de control normales detectaron 2/12,
2/12 y 7/12 positivos y los tres antisueros EAE capturaron 9/12, 8/12 y 6/12 positivos,
respectivamente. Entre los antígenos lipídicos, gangliósido / PTC fue positivo en 3/6 casos,
ceramida / PTC en 4/6, cerebrósido / PTC en 1/6, cardiolipina / PTC_1 / 20 en 5/6, GM1 /
PTC_1 / 100 en 0/6 y GM1 / PTC_1 / 10 en 4/6 casos. glucocerebrosides / PTC, salfatide /
PTC, cardiolipina / PTC, eritrosfingosina / PTC, y fitosfingosina / PTC fueron positivos en
todos los EAE pero negativos en los controles. Así, 11/12 hetero.Los liposomas capturaron
niveles significativos de anticuerpos anti-lípidos IgM en al menos uno de los sueros. Dado
que GM1 / PTC 1/100 difiere de GM1 / PTC 1/10 solo en las cantidades de GM1
incorporadas, el resultado negativo del primero puede reflejar que su concentración o
densidad de epítopo es demasiado baja para detectar anticuerpos anti-GM1 en suero.
Figura 2
La micromatriz de heterosiliposomas captura el espectro de anticuerpos anti-lípidos en un modelo
EAE ( D - F) y controles SJL / J ( A - C ). La tinción de microarrays y el análisis de datos se
realizaron como se describe en la leyenda de la Figura 1 . La prueba de Dunnett se realizó para
determinar si los medios de detección de un hetero- liposoma dado eran significativamente
diferentes de los medios de la señal de IgM capturada por el homo- liposoma stock de PTC.
Aunque ambos tipos de liposomas capturaron anticuerpos anti-lípidos en suero, la
frecuencia de positivos capturados por hetero- liposomas pareció ser mayor en el grupo de
EAE que en los detectados en el grupo de control. Sin embargo, esta observación debe
validarse en un tamaño de muestra más grande para determinar si alguno de
estos hetero- liposomas muestra biomarcadores valiosos para monitorear trastornos
autoinmunes.

3.3. Captura de perfiles de anticuerpos personalizados utilizando microarrays

multicomponentes integrados
Una de las aplicaciones importantes de esta versátil plataforma de biochip es el perfilado de
anticuerpos a gran escala. Este potencial se investigó mediante la construcción de un
conjunto de microarrays personalizados de lípidos, carbohidratos y proteínas y aplicando
estos arreglos para explorar el repertorio de anticuerpos séricos.
La Figura 3 muestra un ejemplo de tales conjuntos de antígenos de múltiples componentes
de 104 características, que incluyen 52 preparaciones de lípidos / liposomas, 39
carbohidratos y 13 proteínas. Cada clase de antígenos se detectó en la zona de matriz
correspondiente, como se ilustra en la figura. La inspección visual de estas imágenes de
micromatrices revela fácilmente matrices de puntos positivos por triplicado en cada zona de
antígeno. Es sorprendente que el repertorio de anticuerpos naturales en el ratón SJL / J no
inmunizado sea predominantemente de anticuerpos IgM anti-lípidos (Figura 3 B); solo se
detectaron seis puntos de positivos positivos en el panel de IgG; eran anticuerpos anti-
Levan en la zona de carbohidratos (Figura 3 A). Sin embargo, aparecieron matrices de
positivos adicionales en las tres zonas de antígenos en el panel EAE-IgM (Figura
3RE). Además, se capturaron múltiples matrices de manchas de IgG positivas fuertes en la
zona de proteína en la muestra de EAE ( Figura 3 C). Por lo tanto, esta tecnología es lo
suficientemente sensible como para detectar específicamente anticuerpos anti-lípidos, anti-
carbohidratos y anti-proteínas en la circulación sanguínea.
figura 3
Una plataforma versátil de bioarray muestra un panel diverso de proteínas, péptidos, carbohidratos
y lípidos / liposomas para controlar los anticuerpos naturales ( A , B ); y las respuestas autoinmunes
en un modelo animal EAE ( C , D ). Como se indica con líneas discontinuas en las imágenes de la
matriz, los antígenos se detectaron en tres zonas, es decir , lípidos, carbohidratos y proteínas. Se
analizaron los anticuerpos séricos recogidos de estudios previos de EAE. El modelo EAE fue
inducido por ratones SJL / J desafiantes con proteína proteolípida de mielina (PLP), residuo de
aminoácido 139–150, emulsionado en adyuvante completo de Freund (CFA) [ 14]. La señal del
anticuerpo específico del antígeno se reveló mediante la tinción de las matrices con anticuerpos IgG
anti-murinos (Cy5) y anti-IgM (R-PE) marcados con fluoróforos, como se especifica en los
métodos. Los puntos encuadrados en cada matriz fueron una preparación para detectar el control
positivo (P1). ( panel superior : IgG; panel inferior : IgM).
En la Figura 4 se ilustra un procedimiento para cuantificar perfiles de anticuerpos
personalizados utilizando microarrays de múltiples componentes
integrados . Específicamente, los conjuntos de datos de micromatrices para la Figura 3 se
representaron con puntuaciones de micromatrices en el eje y ; los elementos antigénicos en
el eje x ; Las zonas antigénicas están divididas por líneas discontinuas. La prueba de
Dunnett se realizó para determinar si las medias de una detección específica de antígeno
dada eran significativamente diferentes de las medias de los valores de fondo (Bg. 1). La
visualización de cada gráfico nos permite determinar si la detección es estadísticamente
significativa y está por encima de la línea media de respuestas de anticuerpos séricos
multiplex en cada ensayo.

Figura 4
Un microarray integrado de lípidos, carbohidratos y proteínas revela perfiles de anticuerpos
personalizados en un modelo de EAE y un control normal SJL / J (NM) de la misma edad. ( A )
perfil de anticuerpo NM-IgM; ( B ) perfil de NM-IgG; ( C ) perfil de anticuerpo EAE-IgM; ( D )
perfil EAE-IgG. Los dos controles de fondo de microarrays que flanquean la lista de antígenos son
los puntos impresos con solución salina (Bg. 1; n = 12) y los "puntos virtuales" en la misma matriz
que se capturaron durante el escaneo de microarrays (Bg. 2; n= 63). Ambos Bg. 1 y Bg. 2 reflejan la
suma de fondo de sustrato y 1% de fondo de tampón de bloqueo BSA. Los dos controles de
impresión incluyen un DyeMix (P1) fluorescente positivo y un tinte visible Bismarck (P2), que
fueron detectados para monitorear el proceso de impresión y escaneo de microarrays. El color de los
círculos de comparación y el color del nombre del antígeno listado en el eje x se identifican en
negro para indicar que los medios de detección son significativamente diferentes a los de los medios
de Bg. 1 y rojo para referirse a la detección no significativa en comparación con el fondo. Todas las
preparaciones de antígeno se indizaron con los nombres y las descripciones enumeradas en la Tabla
complementaria S1 .
La Figura 4 A muestra que las detecciones de 40/52, 2/39 y 1/13 de NM-IgM estaban por
encima de la línea de respuesta media en las zonas de lípidos, carbohidratos y proteínas,
respectivamente. En contraste, solo 1/52, 2/39 y 0/13 positivos en las zonas de antígeno
correspondientes estaban por encima de la línea en elpanel delaFigura 4 B NM-IgG. La
Figura 4 C muestra el perfil EAE-IgM, que tiene 40/52, 3/39 y 5/13 positivos positivos en
las zonas correspondientes; La gráfica delaFigura 4 D-EAE IgG muestra 0/52, 3/39 y 5/13
positivos por encima de las medias globales en las zonas correspondientes.
En resumen, este análisis ilustra cuantitativamente cada perfil de anticuerpo y pesa
estadísticamente el nivel de significancia para una detección determinada. Es importante
destacar que proporciona una comparación cuantitativa de las actividades de los
anticuerpos entre los tres componentes principales de los antígenos, es decir , lípidos,
carbohidratos y proteínas. Al inspeccionar estas parcelas, se revelan las características
personalizadas del modelo EAE y un control normal SJL / J de edades similares. El perfil
de EAE-anticuerpo se destaca de manera notable por el marcado aumento de las respuestas
de IgM e IgG a una serie de proteínas de mielina y también se detectan autoanticuerpos
contra los lípidos y carbohidratos.
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4. Conclusiones
En este estudio, se exploró un procedimiento basado en liposomas para construir
microarrays de lípidos. Prácticamente, cada suspensión acuosa de vesículas lipídicas se
imprimió en portaobjetos de microcristales recubiertos con nitrocelulosa. Con este
procedimiento, las sustancias que pueden formar liposomas o pueden incorporarse en
liposomas son adecuadas para la construcción de micromatrices utilizando los dispositivos
existentes para detectar micromatrices. Las matrices de liposomas construidas por este
procedimiento han alcanzado la sensibilidad requerida para detectar anticuerpos anti-lípidos
en la circulación sanguínea.
Los microarrays integrados de lípidos, carbohidratos y proteínas producidos con este
enfoque pueden tener un valor único en los estudios inmunológicos. Como se ilustra, un
análisis serológico del modelo de EAE que usa tales micromatrices integradas de antígeno
revela efectivamente que el modelo de EAE inducido por PLP se caracteriza por una
respuesta predominante de anticuerpos IgG contra la proteína de la mielina que acompaña a
las respuestas de IgM a un espectro de autoantígenos, incluyendo proteínas, lípidos, y
carbohidratos. Parece práctico monitorear los perfiles de anticuerpos personalizados usando
esta tecnología. En consecuencia, esta plataforma de biochip puede tener un uso potencial
en las prácticas de atención médica personalizada en el futuro.
Se requieren estudios adicionales para examinar la estabilidad a largo plazo de las matrices
de liposomas y la correlación de los resultados entre esta matriz de liposomas multiplex y
otros ensayos de lípidos individuales. Al considerar la diversidad estructural de lípidos y
glicolípidos, pueden requerirse condiciones optimizadas para
producir hetero- liposomas estables para algunas dianas. También es importante determinar
si las modificaciones químicas de los lípidos manchados tienen lugar en el chip a lo largo
del tiempo. Por ejemplo, la oxidación puede ocurrir bajo una condición de secado al aire,
que puede introducir neo-epítopos inesperados para complicar la interpretación de un
resultado de perfilado de anticuerpos. En este sentido, la optimización del procedimiento
para el almacenamiento a largo plazo de matrices de liposomas impresos es probablemente
un requisito a corto plazo en el desarrollo de la tecnología de matriz de lípidos / liposomas.