Los péptidos cortos se auto-ensamblan para producir

amiloides catalíticos
Caroline M. Rufo1†, Yurii S. Moroz1†, Olesia V. Moroz1†, Jan Sto¨hr2, Tyler A. Smith1, Xiaozhen Hu3,
William F. DeGrado3* and Ivan V. Korendovych1*
Las enzimas se pliegan en estructuras tridimensionales únicas, que subyacen a sus notables propiedades catalíticas. el requisito
de adoptar una conformación estable y plegada probablemente contribuya a su tamaño relativamente grande (> 10.000 Da). Sin
embargo, los péptidos mucho más cortos pueden lograr conformaciones bien definidas a través de la formación de fibrillas de
amiloide. Probar si los péptidos formadores de amiloide cortos podrían de hecho ser capaces de una catálisis tipo enzima,
diseñamos una serie de siete residuos péptidos que actúan como esterasas dependientes de Zn2+. Zn2+ ayuda a estabilizar la
formación de fibrillas, mientras que también actúa como cofactor para catalizar la hidrólisis del éster acílico. Estos resultados
indican que las fibrillas de tipo prión pueden catalizar no solo su propia formación, pero también pueden catalizar reacciones
químicas. Por lo tanto, podrían haber servido como productos intermedios en la evolución de las enzimas modernas. Estos
resultados también tienen implicaciones para el diseño de nanoestructurados de autoensamblaje catalizadores que incluyen unos
que contienen una variedad de iones metálicos biológicos y no biológicos.

Los mecanismos por los cuales las proteínas evolucionaron para
poseer enzimas la actividad está en gran parte sin resolver. El
aminoácido de una enzima secuencia subyace a su capacidad de
plegarse en una estructura nativa, que posiciona y sintoniza la
dinámica de los grupos funcionales requerido para unión y catálisis.
Las enzimas modernas son generalmente al menos 100 residuos de
longitud, que está cerca de la cadena longitud requerida para crear
un núcleo hidrofóbico bien definido en una proteína globular. Una
proteína de esta longitud, sin embargo, tendría una
astronómicamente gran cantidad de secuencias posibles, y es no
está claro cómo la naturaleza pudo haber probado un número
suficiente de permutaciones para encontrar uno capaz de plegar y
funcionar.
Esta aparente paradoja ha llevado a la sugerencia de que las
primeras proteínas podrían haberse formado a partir de péptidos o
polímeros cortos con secuencias repetitivas de aminoácidos que
dependían del autoensamblaje para lograr una estructura doblada
De hecho, heptapéptidos simples con alternando residuos apolares
y polares se autoensamblan en forma extendida hojas beta
estabilizadas a través de la asociación intermolecular de los
residuos apolares en la secuencia de repetición. Por otra parte,
caracterización estructural de péptidos formadores de amiloide
cortos ha revelado una miríada de las variaciones conformacionales
en la conformación cruzada básica. Por lo tanto, es posible que las
primeras enzimas proteicas primitivas fueran péptidos cortos con
estructuras amiloides que proporcionan los marcos para apoyar sus
actividades catalíticas.
Los metales también podrían haber figurado en gran medida en la
aparición de la actividad catalítica de las proteínas. Los iones del
metal de transición no solo ayudan a catalizar las reacciones, sino
que también pueden influir en el plegamiento de las proteínas
mediante la interacción con las cadenas laterales de ligadura. Por
lo tanto, exploramos el diseño, las interacciones metálicas y las
propiedades catalíticas de los péptidos amiloidogénicos que se
unen a Zn2+. Zn2+ fue elegido como un cofactor dada su alta
abundancia y ocurrencia frecuente en las modernas hidrolasas
dependientes de metales tales como la anhidrasa carbónica y las
metaloproteasas. El ion Zn2+ reduce el pKa de un agua unida,
estabilizando y colocando hidróxido para el ataque nucleofílico del
sustrato. El sitio de unión a Zn2+ en las enzimas a menudo contiene
dos ligandos His que se proyectan desde las posiciones i y i+2 de
una hoja β; un tercio Su ligando de un filamento vecino completa
el entorno del ligando primario. Este sitio de unión al metal
interestrans 3-His muy simple se observa en proteínas tales como
la anhidrasa carbónica de eritrocitos (figura 1a) 9; de manera
similar, se observan dos restos de His de posiciones vecinas de
cadenas b en la estructura de solenoide b de tipo amiloide de una
anhidrasa gcarbónica arqueal10. Adicionalmente, los ácidos / bases
generales de las cadenas laterales vecinas sirven como ligandos
secundarios y ayudan a los eventos de protonación / desprotonación
en la catálisis. Por lo tanto, preguntamos si podría crearse un sitio
similar dentro de la secuencia heptapéptido minimalista formadora
de lámina β (LKLKLKL). Este y los péptidos relacionados tienen
residuos hidrofóbicos alternos, lo que crea una cadena b anfifílica
que se asocia adicionalmente a través de interacciones hidrófobas
para formar estructuras β amiloides extendidas. Se tolera una
variación de secuencia considerable siempre que se preserve la
periodicidad hidrofóbica. Conservamos los residuos de Leu
apolares para impulsar el ensamblaje, mientras que las cadenas
laterales de Lys en posiciones y 6 se cambiaron a residuos polares
capaces de soportar la unión de iones de metales de transición y la
catálisis. Los restos de unión a Zn2+ His se colocaron en las
posiciones 2 y 4, mientras que en la posición 6 (Fig. 1b) exploramos
residuos ácidos (Asp, Glu), neutros (Gln, Tyr) y básicos con
diversos valores de pKa (His, Lys, Arg).
Resultados y discusión
Las enzimas hidrolíticas realizan un conjunto diverso de funciones
que van desde la hidrólisis de amidas, ésteres o lípidos hasta la
catalización del equilibrio entre el CO2 y el bicarbonato. A pesar
de tal diversidad, muchas enzimas hidrolíticas se analizan y
comparan usando un sustrato cromogénico simple, p-
nitrofenilacetato (pNPA). Por lo tanto, elegimos este sustrato para
permitir la comparación con enzimas naturales y varios
catalizadores proteicos diseñados. La mayoría de los siete diseños
originales mostraron actividad mensurable sobre el control de
tampón (pH 8 en presencia de 1 mM de ZnCl2) en el cribado inicial
para la hidrólisis de pNPA, como se muestra en la Tabla 1. La
dependencia de la velocidad inicial de la reacción sobre la
concentración de sustrato para un péptido típico (7, LHLHLRL) es
consistente con el modelo de Michaelis-Menten, con Kcat =3.2±0.4
× 10ˉ2 sˉ1, KM = 1.8 ±0.4 mM y a eficiencia catalítica de kcat /
KM = 18 ± 4 Mˉ1sˉ1 (Fig. 2a, Tabla 1).

Figura 1 | Visión general del concepto y diseño. a, Estructura de la anhidrasa carbónica humana que muestra un motivo de unión a metal típico. b,
Modelo para uno de los péptidos diseñados (11, Ac-IHIHIQI-CONH2) en la configuración de cadena b extendida que muestra las posiciones de los
residuos en la secuencia. c-e, modelo de fibrillas derivado computacionalmente formado por 11, que muestra el pliegue global (c), el relleno del núcleo
hidrofóbico (d) y la esfera de coordinación primaria de zinc (e).

La actividad de 7 es extrictamente zinc-dependiente y no se observa

ninguna actividad significativa sobre el fondo en la ausencia de
Zn²+. La actividad catalítica también muestra una marcada
referencia de la naturaleza de los residuos de la posición 6.
Curiosamente, péptido 3, con un residuo amyloidogenico de
glutamina en esta posición fue más activo, con Kcal/KM= 30 ± 3M
1- s-1. Péptidos con residuos de Asp, Glu o His en posición 6 (1,2
y 5 respectivamente) tuvieron poca actividad, posiblemente porque
estas cadenas laterales compiten con residuos de His en las
posiciones 2y 4 para el estancamiento al ion del metal creando los
sitios catalíticos inactivos.

Relaciones estructura-actividad. Integrado por el hallazgo de que

un potencialmente amiloide promoviendo el residuo de Gln
catalizado realzó la actividad catalítica que variamos los residuos
hidrofóbicos del Leu que eran se esperaba que estabilizara la
asociación del Leu que eran se esperaba, que estabilizadora la
asociación hojas β proporción residuos de Ile o Leu producidos por
péptidos 9 y 10 con al menos 50% incrementado de la actividad
comparado con 7. Inversamente, reemplazando Leu con Ala, el
residuo con una hidrofobia más baja y una proporción más débil de
la forma de hojas β, dio un péptido que es mucho más inactivo que
la esterasa. El acetil terminal y carboxamida también parecía ser
importante en la actividad porque el péptido que carecía estos
grupos (14) era catalítico inactivo. Estas observaciones están en
buen acuerdo con los anteriores estudios que demostraban que las
modificaciones sutiles de la estructura secundaria en los
catalizadores cortos del péptido conducen a los mejores
substanciales en la actividad y el substrato específico 17-18.
La actividad 9 podría aumentarse aún más por inclusión de Glu en
la posición que se4 había demostrado para aumentar la actividad en
leucina que contiene péptidos. Los efectos de introducción β-
amino ácidos ramificados y glutamina fue añadido: El péptido
contiene ambas isoleucinas en este hidrofóbico núcleo y Gln en
posición 6 es 3-5 el triple más activo que 7 (tabla 1) y alcanza un
valor de Kcat/Km de 360 + 30 M21s atpH 10,3 (figura 2b). La
catálisis sigue la cinética d Michaelis-Menten, y no se observó
ninguna inhibición del producto sobre 20 volúmenes de ventas. Un
efecto similar, aunque en menor medida, fue observado el Gln fue
introducido en el péptido 10 de la valina que contenía.
Curiosamente, en ambos lados la ganancia en eficiencia catalítica
proviene de la disminución en km en lugar de la mejora de kcat.

Figura 2 | Caracterización funcional de los catalizadores. a, gráficos de la actividad de esterasa catalizada por péptidos representativos (7, 8, 9, 11
y 14 como se especifica en la clave) a pH 8 en presencia de Zn2+ 1 mM, con la curva suave que muestra el ajuste a la ecuación de Michaelis-Menten.
El perfil del péptido más activo (11) muestra una saturación tipo enzima a concentraciones de sustrato más altas. b, El perfil de pH de la actividad
esterasa de 11 es consistente con un modelo de protonación de dos estados. c, Dependencia de la actividad de 11 sobre la concentración de Zn2+, que
muestra una estequiometría de péptido: metal 2: 1. d, Dependencia de la tasa de hidrólisis de p-nitrofenil acetato (pNPA) catalizada por 11 (Ac-
IHIHIQI-CONH2) sobre la concentración de péptido monomérico utilizado para producir fibrillas. La eficacia catalítica de las fibrillas no depende de
la concentración inicial del péptido monomérico utilizado para el ensamblaje. La reacción es de primer orden en péptido en el rango de concentración
estudiado. Las barras de error en todos los gráficos representan desviaciones estándar de al menos tres mediciones independientes.
La actividad de 11 es más de 100 veces mayor en presencia de Zn2+ Figura 3 | Las especies activas tienen una estructura secundaria de
que, en su ausencia, lo que demuestra que la actividad no surge de hoja B. a, b, espectros de CD de 7 (a) y 11 (b) bajo diferentes condiciones.
la catálisis del imidazol simple (que es considerablemente menor
que la tasa medida para las fibrillas de Zn2+ -11). Además, la
actividad de las fibrillas formadas por el 11 es diez veces mayor
que las esterasas no basadas en metales identificadas en líneas
combinatorias por Hecht et al21,22. y diseñado por Baltzer et al23,
Mayo y colegas20. Las fibrillas formadas por 11 tienen un orden
de magnitud más activo que el diseñado de novo, y que la fijación
de zinc en espirales reportadas por Pecoraro et al. y están a la par
con el complejo de zinc-proteína más activo (hasta la fecha)
informado por Kuhlman y colegas. Además, la actividad de 11
sobre una base de peso es mayor que el de la anhidrasa carbónica,
que cataliza la hidrólisis de pNPA con kcat/KM = 2,550 M-1 s-1.
Esta notable eficiencia se debe al pequeño tamaño de la unidad
activa en 11 (probablemente un dímero de péptidos de siete
residuos), mientras que la proteína es al menos 15 veces mayor en
peso molecular.

La coordinación adecuada del ion metálico también es crucial,

porque una sola mutación de residuos de la histidina a alanina, da
como resultado al menos 60 veces de disminución en la actividad
de la esterasa (Tabla 1). La examinación adicional de la actividad
catalítica de 11 (IHIHIQI) como una función de la concentración
del Zn2+, mostró que la actividad aumentó linealmente hasta que
se alcanzó una estequiometría de 1:2 (zinc a péptido), después de
lo cual no se observó ningún aumento (fig. 2C). Este hallazgo es
consistente con el diseño en el que dos péptidos cooperan para
formar el catalizador activo. El perfil de actividad de pH del 11 e
consistente con dos pasos de protonación / desprotonación con
valores de pKa de 7.1 ± 0.4 y 9.3 ± 0.1 (Fig. 2b). Es posible que un
pKa refleje la desprotonación de una de sus cadenas laterales para
liberarla y ligarla al Zn2+, mientras que el pKa superior refleja el
pKa del Zn2+ en agua / hidróxido, aunque se requerirá más trabajo
para confirmar esto. La protonación en dos etapas similares; el En presencia de Zn2+, 7 muestra un espectro típico de la configuración
comportamiento que se observó para otros péptidos activos cruzada, y el péptido 11 más activo muestra un espectro de CD de tipo B a
pH 8, incluso en ausencia del metal. La concentración de péptido fue de 24
(Suplementario Fig. 1). La eficiencia catalítica de las fibrillas no
mM en todos los experimentos.
depende de la concentración inicial del péptido monomérico
utilizado para el ensamblaje; la reacción es de primer orden del Se observaron resultados similares para los péptidos restantes (1-6)
péptido en el rango de concentración estudiado (24-200 μM) (Fig. examinados (Figura 2 complementaria). Curiosamente, el péptido
2d). 5 casi inactivo (LHLHLHL) mostró un espectro de CD tipo β,
incluso en ausencia de Zn2+. Este hallazgo sugiere que este péptido
Caracterización de la especie activa. Habiendo establecido que los
podría estar preorganizado en una estructura que no admite catálisis
péptidos son catalíticamente activos, utilizamos dicroísmo circular
o, como se mencionó anteriormente, el His adicional compite por
(CD) espectroscopias infrarrojas (IR) para demostrar que adoptaron
la unión catalíticamente competente de Zn2+. Curiosamente, los
una conformación de láminas β en presencia de Zn2+. Además, la
péptidos sustituidos Leu-to-Ile más catalíticamente activos (9, 11)
fijación de tioflavina T (ThT) de tinción negativa en la microscopía
mostraron un espectro CD de tipo hoja β a pH 8, incluso en ausencia
electrónica de transmisión (TEM) se utilizaron para investigar la
de Zn2þ (Fig. 3b), lo que sugiere que esta sustitución promovió la
formación de fibrillas. El péptido 7 que contiene Leu adopta una
formación de una estructura catalíticamente competente. La
estructura de lámina β estrictamente dependiente de Zn2+. En
posición de la banda de amida I 'IR de los péptidos catalíticamente
ausencia de zinc, el péptido muestra una característica de espectro
activos (7, 9, 11) cerca de 1,626 cm-1 apoyaba más estas
CD de espirales aleatorios, pero además el ion metálico una
conclusiones27 (Fig. 3 complementaria). Los espectros de CD de 9
configuración de espectro típico β-cruz la cual se observa en (Fig.
y 11 a pH 8 en presencia de Zn2þ muestran mínimos altamente
3a). La Comparación de espectros a pH 2 y 8 mostraron que el
intensos alrededor de 207nm. Se encontraron espectros similares
desencadenamiento del Zn2+ de la estructura de lámina β se
con fibrillas formadas por péptidos derivados de una proteína
producía solo a pH 8, donde los ligandos debían ser desprotonados
priónica de ratón y podrían ser indicativos de estructuras β en
y quedar disponible para iones metálicos complejos.
complejos amiloides fácilmente formados28,29.
Los métodos de separación física mostraron que el catalizador
activo se ensambla en agregados de alto peso molecular. La diálisis
extensa de 11 utilizando una membrana de corte de peso molecular
de 10 K (MWCO) contra el tampón que contiene zinc mostró que
la especie catalíticamente activa no podía difundirse a través de la
membrana. Además, cuando los péptidos agregados se filtraron a
través de membranas con 0,1, 0,22 o 0,45 mm de poros, el filtrado
fue al menos 800 veces menos activo que la suspensión de partida
(Fig. 4a). Además, La unión de ThT y TEM identificaron esta
agregación catalíticamente activa como fibrillas. El ThT se une a
las fibrillas con preferencia a los estados oligoméricos prefibrilares
o péptidos monoméricos, y la unión se evalúa convenientemente a
través de una gran mejora en la fluorescencia de este colorante. En
efecto, La fluorescencia de ThT aumentó significativamente en
presencia de Zn2+ con pH 8, y los péptidos más activos tendieron a
tener la mayor potencia de fluorescencia en este ensayo (Fig. 4b).
Este hallazgo fue confirmado por imágenes TEM de 7, 9 y 11, que
revelan fibrillas amiloideas extendidas (Fig. 4c-f, Figuras
complementarias. 4, 5).
La formación de estructuras de tipo amiloide a menudo requiere
una nucleación adecuada y, por lo tanto, se observa con frecuencia
una fase de retraso. Hemos caracterizado la actividad de los
péptidos diseñados en varios momentos después de la adición de
Zn2+ y el aumento concomitante del pH. Péptidos 4, 6 y 7, que
tienen un núcleo Leu, muestran una fase de retraso, alcanzando su
actividad máxima a las 24 h. Introduciendo Gln en la secuencia y,
especialmente, sustituyendo leucina con isoleucina, Reduce
drásticamente el tiempo de fibrilación y la actividad máxima se
logra sin necesidad de una incubación más prolongada (Figura
suplementaria 6). Esta observación es consistente con los
resultados de los estudios de centrifugación realizados para
determinar la fracción de grandes agregados. Las soluciones de
péptidos representativos a pH 8 en presencia de Zn2+ se sometieron
a centrifugación a 100.000 g durante 1 h inmediatamente después
de la preparación y después de 24-48 h de incubación a temperatura
ambiente. Inmediatamente después de la adición del tampón de pH
8 que contiene Zn2+, 11 se oligomeriza esencialmente por completo
(al menos 95%), mientras que 55% del péptido 7 todavía está
presente en forma de especies de bajo peso molecular, a juzgar por
su absorbancia ultravioleta. Después de 24 h de incubación, la
fracción soluble de 7 cae al 20% y permanece constante a partir de
entonces (Fig. 7 suplementaria). Los estudios TEM proporcionan
información adicional sobre la oligomerización de 7: las muestras
recién producidas muestran protofibrillas que maduran
completamente después de una incubación prolongada (Fig. 4c, d).
De manera importante, el péptido 8 no fibrilar no mostró
disminución en la absorbancia de la fracción soluble, lo que indica
que no se formaron especies oligoméricas.
Finalmente, no se observó ninguna evidencia sólida para la
estructura de lámina β basada en los espectros de CD para el
péptido catalíticamente inactivo 14, que ha desbloqueado los
extremos N y C. Además, bajo condiciones en las que los péptidos
activos mostraron una formación de fibrillas extensa, 14 no
produjeron fibrillas, según se juzgó por TEM. Este hallazgo podría
indicar que las hebras β en las fibrillas activas están dispuestas en
forma paralela; en tal escenario, la neutralización de los grupos
terminales por acetilación y amidación estabilizaría la estructura al
eliminar las interacciones electrostáticas desfavorables entre los
grupos terminales cargados. Sin embargo, se requerirán estudios
estructurales para confirmar esta topología y estructura detallada de
las fibrillas.
Esfera de coordinación de metal. Para sondear la esfera de
coordinación del ion metálico en el catalizador activo, estudiamos
la fibrilación de 9 y 11 en presencia de iones de cobalto. Co2+
desencadena la formación de fibrillas de una manera análoga al
zinc, a la vez que proporciona una fácil comprensión
espectroscópica de la geometría de coordinación del metal. La
amplitud e intensidad de la banda de transición d-d en el espectro
UV-vis de las fibrillas formadas por 9 y 11 en presencia de cobalto
excluyen la posibilidad de disposición de ligandos octaédricos y
son consistentes con la coordinación tetraédrica de cobalto30 (Fig.
8). Los estudios TEM muestran que la morfología de las fibrillas
formadas en presencia de cobalto no está alterada en comparación
con las fibrillas unidas a zinc (Fig. 9).
Figura 4 | Las fibrillas amiloides grandes son responsables de la catálisis. a, la diálisis extensa de 11 (24 mM) no afecta la actividad (la diferencia
observada en la actividad es el resultado de una precipitación parcial irreversible de las fibrillas, como lo indica la disminución de la absorbancia
ultravioleta). Además, el examen del filtrado después de pasar una suspensión acuosa de 11 a través de un filtro de 450 nm muestra que las especies
activas son incapaces de impregnar el filtro. b, la actividad se correlaciona con el grado de fibrilación de diversos péptidos (7, 8, 9 y 11 como se describe
en la clave, la concentración de péptido se mantuvo a 200 mM), como se muestra mediante el aumento de fluorescencia de tioflavina T (25 mM). c-f,
imágenes TEM representativas (a × 25,000 aumentos, barra de escala, 100 nm) de fibrillas formadas por diferentes péptidos a pH 8 en presencia de
Zn2+: 7 inmediatamente después de la preparación (c); 7 después de 72 h de incubación a temperatura ambiente (d); 11 inmediatamente después de la
preparación (e); 11 después de 72 h de incubación a temperatura ambiente (f). Tanto 7 como 11 forman fibrillas amiloides. Las muestras recién
producidas de 7 muestran protofibrillas que maduran completamente después de una incubación prolongada, mientras que 11 forman fibrillas muy
rápidamente, esencialmente después de la mezcla. La concentración de péptido fue de 24 mM en todos los experimentos TEM. Las barras de error en
todos los gráficos representan desviaciones estándar de al menos tres mediciones independientes.

Estos resultados están en buen acuerdo con aquellos resultados de
computación usando el software Rosetta. La energía- modelo
minimizada de las fibrillas formadas por 11 en presencia de Zn2þ
iones se presenta en la Fig. 1c-e. Muestra un núcleo hidrofóbico
formado por residuos de isoleucina, donde los residuos de histidina
soportan una esfera tetraédrica de coordinación de zinc.
disminución de la actividad se observó al aumentar la proporción
de 4 relativo a 7 (Fig. 5b). Se necesitarán estudios estructurales
detallados para dilucidar la composición y la geometría de la unidad
activa como los datos también podrían ajustarse a una
oligomerización más compleja (p. péptido trímero que constituye
la especie activa) modelos.

Interacciones sinérgicas entre péptidos Los estudios anteriores Conclusión

muestran que se necesitan principios de diseño relativamente
simples para descubrir péptidos similares al amiloide, que muestran
actividad catalítica muy sustancial para la hidrólisis del éster. Más
de la mitad de los 14 péptidos estudiados aquí estaban activos, y la
actividad podría mejorarse fácilmente mediante principios físicos
simples como mejorar el potencial amiloidogénico y las
propiedades de formación de láminas peptídicas. Esto es solo una
pequeña fracción de los 207 ¼ 1.28 × 109 posibles secuencias
peptídicas que podrían estar compuestas por los 20 aminoácidos de
origen natural, o 37 ¼ 2,187 si uno fuera a restringir el alfabeto a
solo tres aminoácidos, como His, Ile y Gln en los péptidos más
activos estudiados aquí. Queda por verse cuántas otras actividades
podrían descubrirse en ausencia y presencia de otros procesos
biológicos y iones metálicos no biológicos. Además, la diversidad
podría ser mejorado en gran medida (por un factor de (n þ n2) / 2,
donde n es el número de péptidos) si los péptidos fueron
considerados una mezcla binaria de solo dos péptidos. Para probar
la posibilidad de una mezcla de dos péptidos podría tener
interacciones sinérgicas. Para asegurar la mezcla de un péptido
dentro de la fibrilla, se mezclaron en diferentes proporciones en
HCl acuoso (10 mM) y luego se diluyó en El tampón Tris que
contiene Zn2þ (1 mM) a pH 8 para garantizar una efectividad
mezcla de péptidos antes de la formación de fibrillas. La actividad
muestra sinergia entre 4 y 7 (Fig. 5a) con la máxima actividad
esterasa observada cuando los péptidos se mezclaron en relación a
los individuos, donde un dímero es la especie activa y los péptidos
se distribuyen aleatoriamente en la fibrilla. Por el contrario, si las
fibrillas de los péptidos individuales se dejaron formar primero, y
luego se mezclaron, no se observó sinergia. En cambio, una lineal
Aquí, hemos demostrado que pequeños péptidos formadores de
amiloide de siete residuos diseñados a partir de los primeros
principios forman una catálisis eficiente de la hidrólisis del éster.
Esta observación respalda una posible formación de enlaces de
especies reactivas de oxígeno (ROS) en una forma incompleta
manera entendida (33-35. La facilidad con la que pudimos
descubrir catalizadores de metaloproteína robustos y reproducibles
sugieren que las actividades catalíticas tóxicas se deben considerar
como posible fuente de toxicidad amiloide.
Entre las Asambleas amiloideas y la aparición de catalizadores
proteicos durante la evolución de las enzimas. La capacidad de
pantalla múltiple los arreglos estables de grupos funcionales en
una sola fibrilla proporcionan oportunidades esencialmente
ilimitadas para la detección de alto rendimiento para la actividad
funcional simplemente mezclando péptidos con diferentes
secuencias. Esperamos que este enfoque forme una herramienta
para diseñar los nuevos materiales capaces de realizar catálisis en
ambos naturales y sustratos no naturales. Este trabajo también
podría tener implicaciones para los mecanismos de toxicidad
amiloide, con zinc y cobre iones que alteran la cinética y la
naturaleza de la proteína de prión celular (PrPc) 31, 32. Además,
se ha sugerido que la formación de amiloides. Los péptidos AB
pueden formar complejos con Cu2þ que median la formación de
especies reactivas de oxigeno (ROS) en una incompleta entendido
de manera33-35. La facilidad con la que pudimos descubrir los
catalizadores meloproteinas robustos y reproducibles sugerían
como una fuente posible de toxicidad amiloidea.

Figura 5 | Interacciones sinérgicas entre péptidos. a, el perfil de
eficiencia catalítica (KCAT/km) muestra sinergias entre 4 y 7 con la
actividad de esterasa máxima observada cuando los péptidos fueron
mezclados en relación con los individuos solos. Los datos
experimentales son bien descritos por un modelo simple, donde un
dímero es la especie activa y los péptidos se distribuyen aleatoriamente
en la fibrilla (Fit). B. No se observa ninguna sinergia cuando se
preforma las fibrillas de 4 y 7 se mezclan juntas; en cambio, una
disminución lineal de la actividad es visto al aumentar la relación de 4
relativo a 7. Condiciones: pH 8; concentración de péptido mantenido a
24 µM; contiene buffer 1 mM Zn²+; las fibrillas se equilibraron por 48
h antes de las mediciones. Las barras de error en todos los gráficos
representan desviaciones estándar de al menos tres mediciones
independientes.
Métodos
Síntesis de péptidos. Los péptidos fueron sintetizados por
manual fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), síntesis de fase
sólida a elevada temperatura utilizando nuestro previamente
protocolo divulgado optimizado para los péptidos (36)
hidrofóbicos. La segmentación de los péptidos de la resina y de
la desprotección de la cadena lateral fue alcanzado
simultáneamente por el tratamiento con una mezcla de ácido
trifluoroacético (TFA)/H2O/triisopropyl silano (TIS)
(95:2.5:2.5, vol/vol) durante 2 h a temperatura ambiente. Los
péptidos crudos eran precipitado y lavado con frío metil-terc-
butilo éter, y purificado en un sistema de cromatografía líquida
de alto rendimiento de fase inversa preparativa (HPLC) (Varian
PROSTAR 210) con una columna preparativa C4 (Vydac),
utilizando un gradiente lineal del solvente a (0,1% TFA en
Millipore H2O) y solvente B (90% CH3CN, 10% H2O, 0,1%
TFA). Las identidades y las purezas de los péptidos purificados
fueron confirmadas por masa de desorción láser asistida por
matriz de ionización de tiempo de vuelo (MALDI-TOF)
Espectrometría con una masa Bruker Autoflex III SmartBeam
MALDI-TOF Espectrómetro. La pureza de los péptidos
obtenidos se evaluó Adicionalmente en un Shimadzu
prominencia UFLC instrumento con un ZORBAX analítico
Eclipse XDB-C18 columna (4,6 mm × 150 mm).
Preparación de stocks y soluciones peptídicas. Los péptidos
liofilizados purificados fueron disueltos en ácido hidroclórico
10mM para hacer la solución stock 1,1M.
La concentración fue determinada usando un Agilent 8453 UV-
Vis usando una absorbancia de 214nm en el espectrofotómetro.
Los coeficientes de extinción para los péptidos en esta longitud
de onda fue calculada usando la literatura valores (37). La
acción de trabajo del pH 8 la solución de péptidos se preparó
mezclando 180 ml de la acción pH 2 con 20 ml isopropanol
seguido por adición de buffer 1,8 ml (25 mm Tris pH 8 que
contiene 1 mm ZnCl2). La adherencia a este protocolo garantiza
la reproducibilidad entre las ejecuciones y proporcionó un
método estándar para comparar diferentes péptidos. La solución
de stock pH 2 fue estable por lo menos una semana, mientras
que la solución de stock de trabajo de péptidos en pH 8 se
preparó inmediatamente antes de los experimentos. Ensayos
cinéticos. Las mediciones cinéticas se realizaron en un termo
Labsystems Lector de placa de espectro Multiskan control de
absorbancia del producto (p-nitrofenol) a 348 nm y 405 nm a
22 8C en placas de 96 pocillos. p-Nitrophenylacetate se utilizó
a partir de un stock de 0,1 M en acetonitrilo (la última el
contenido de acetonitrilo fue del 2% en todas las mezclas de
reacción). Un volumen de 150 ml de recién solución de sustrato
preparado en Tris de 25 mm (pH 8), 1 mm ZnCl2 (a un sustrato
final la concentración de 0.195-0.75 milímetros) fue agregada a
50 ml buffered (amortiguador de 25 milímetros) solución de
stock de péptidos a pH 8 (hasta una concentración de péptidos
finales de 24 mm). Los coeficientes de extinción de 1.700,
4.300, 9.100, 12.700 y 16.600 M21 cm21 fueron utilizado para
determinar la concentración del producto en los valores de pH
de 6, 6,5, 7, 7,5 y 8, respectivamente, a 405 nm. Se utilizó un
coeficiente de extinción de 18.700 M – 1 cm21 en pH 8,5 y
superior a 405 nm. Los coeficientes de extinción reportados
obtenida experimentalmente midiendo espectros UV-Vis de p-
nitrofenol en tampones en diferentes valores de pH. Las
soluciones de p-nitrofenol fueron obtenidas por la dilución 40-
Fold de 2,5 mm de solución de stock de p-nitrofenol en
acetonitrilo en el apropiado búferes. Los resultados reportados
se obtuvieron promediando al menos tres medidas. Los
parámetros cinéticos (KCAT y km) se obtuvieron ajustando los
datos a la ecuación de Michaelis-Menten {V0 ¼ KCAT [E] 0
[S] 0/(km þ [y])}. valores de KCAT/km se obtuvieron ajustando
la porción lineal de la parcela de Michaelis-Menten a v0 ¼
(KCAT/km) [E] 0 [S] 0. los estudios de Perfil de pH se
realizaron en un Agilent 8453 Espectrofotómetro control de la
absorbancia del producto a 405 nm a 22 8C utilizando una
cubeta de cuarzo de 1 cm. Avolume de solución tampón 150 ml
(los siguientes buffers fueron utilizado en una concentración de
25 mm: mes (pH 6 – 6,5), HEPES (pH 7 – 7,5), Tris (pH 8 –
8.5), se añadieron los grifos (pH 9 – 9.5) y los tapones (pH 10
– 10.5) a 50 ml de péptido solución (en 25 mm Tris pH 8 que
contiene 1 mm de ZnCl2) en una cubeta, seguida de la adición
de 2 ml de 20 mm pNPA en acetonitrilo. Debido a la
precipitación de hidróxido de zinc a altos valores de pH, los
tampones añadidos a valores de pH de 8 y a continuación
contenía 1 mm ZnCl2, los tampones de pH 8,5 – 9 contenían
0,5 mm ZnCl2 (Zn2þ final de 0,625 mm) y a valores de pH
superiores a 9,5 el búfer añadido contenía Sin sales de zinc
(Zn2þ final de 0,25 mm). los cambios del pH que se presentan
de mezclar diferente se tomaron en cuenta los volúmenes de
búfer a diferentes valores de pH. Producto

la formación se monitoreó durante 5 minutos cada 30 s. Los

datos del perfil de pH fueron

ajustar a la siguiente ecuación