TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS

SUPERIORES DE ECATEPEC

Análisis de Inocuidad de Alimentos

Practica 6: Pruebas Bioquímicas para la

identificación de Listeria en la Leche LaLa
Resumen

Las pruebas bioquímicas determinan la actividad metabólica de una cepa pura. Son empleadas
principalmente en la identificación y clasificación de bacterias y hongos. Consisten en distintos test
químicos aplicados a medios biológicos en los cuales es conocida su reacción, nos permite identificar
microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento consiste en determinar la actividad de una metabólica a partir de un

sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Se forma para identificar de forma clara y precisa, la presencia o ausencia de una enzima, de un grupo
de enzimas, o de una vía metabólica completa en uno o mas microorganismos.

Algunas pruebas de identificación rápidas pueden ser:

Las pruebas de catalasa, oxidasa, coagulasa, PYR.

Algunas pruebas bioquímicas para la identificación de Listeria monocytogenes son: tinción de Gram,
reacción de catalasa (positiva), oxidasa (negativa), hidrólisis de esculina (positiva) que puede
demostrarse en el agar bilis esculina, dado que es capaz de crecer en bilis al 40%, fermentación de
glucosa y maltosa, motilidad (positiva) a 25 °C que en medio semisólido se observa en forma de
paraguas cercano a la superficie. La prueba de CAMP es (positiva).

Objetivo general:

Determinar a base de pruebas bioquímicas si el microorganismo presente en la leche LaLa

es Listeria monocytogenes

Objetivos específicos:

1. Identificar el microorganismo Listeria monocytogenes en la leche LaLa

2. Conocer el fundamento de las diferentes técnicas utilizadas.
3. Cuantificar y analizar los resultados de la Listeria monocytogenos obtenido.

Prueba de Tinción de Gram

 Se coloca una Re-suspender la Se coloca Cristal
pequeña gota de muestra en el Violeta cubriendo
agua destilada en el portaobjeto y secar toda la muestra por 1
portabjeto en el mechero min.

Luego se coloca el
Se lava a agua Se lava con agua
lugol cubriendo la
ccorriente. corriente
muestra por 1 min.

Se cubre la muestra
Se añade safranina
con alcohol acetona
cubriendo la muestra
para decolorarla Se observa en el
por 15s o por 1 min.
.Este debe cubrir la microscopio.
luego se lava con
muestra hasta que ya
agua corriente
no tenga color

Prueba de la catalasa

colocar una colonia

Se coloca una gota de bacteria de la
de peroxido de placa de agar
hidrogeno al 3% en utilizando una asa
un portaobjeto o punta de pipeta

observar si agitar la colonia

forma bacteriana en el
burbujas peroxido de
(positivo) hidrogeno

Prueba de dilución en gota.


Se preparo el medio
de cultivo TSB
Se homogenizo con el
vortex, tomaron 20μL del
vial y se sembro en la
primera caja petri.
Asi hasta completar
las 8 siembras por
gota. De cada una de
las muestras.
Prueba de estriado.
Se preparo el
medio de cultivo
TSB
Se observa los
resultados
Se cuenta los
microorganismos
y se observa la
morfologia.
Prueba de resistencia a antibiótico
a 8 viales se les
Se vacio el medio de
agrego 900 μL de
cultivo en cajas de
agua esterilizada a
petri
cada uno
Se añadio al primer
Se homogenizo con
vial, y se hizo las
el vortex y tomo 100
siguientes diluciones
μL de la muestra de
tomando 100 μL de
Leche (inoculada y
cada vial hasta el
descompuesta)
octavo vial.
Se observa los
colocar las cajas de
petri en una resultado despues
incubadora a 37ºC de 24h.
Despues se
Se vacio el medio
sembro en la caja
de cultivo en
de forma en estria
cajas de petri
cruzada.
Se hizo lo mismo
Se dejo en
con las dos
incubacion por 24
muetras
horas
diferentes.
 Se homogenizo con el
Se vacio el medio de vortex y tomo 100 μL de la
Se preparo el medio de muestra de Listeria
cultivo en cajas de
cultivo TSB monocytogenes de la leche
petri
descompuesta y de la
inoculada.

Se sumerge la varilla L
en alcohol Se homogenizo con el
Se homogeniza la vortex, tomaron 20μL del
gota del cultivo por esterilizandolo en el
mechero y se deja vial y se sembro en la
toda la caja petri. primera caja petri.
enfriar.

El papel fitro antes

Se coloca en la caja fue mojado con el
petri. Un pequeño antibiotico en un
pedazo de papel colocar las cajas de
100% a 50% y 25% petri en una
filtro con el
de concentracion incubadora a 37ºC
antibiotico.

se observa los
resusltados en los
cuales se mide el
Halo que se forma.

Prueba rojo de metilo

 Aplicar 2 gotas de
Inocular con el asa
solucion indicadora Incubar a 35°C por
bacteriologica una
(rojo de metilo) 24-48 horas
porcion de cultivo
dentro de los tubos

Color rojo: positivo

Color amarillo: Checar resultados
negativo

Prueba movilidad en fresco

Depositar una gota

Colocar en el
entre porta y
cubreobjetos microoscopio

Observar movilidad
de bacterias en el
microoscopio

Técnicas Realizadas y Resultados

 Prueba Muestra Resultados Discusión
Se observó un microorganismo
Leche con Listeria Gram Positiva Bacilo Gram Positivo por su
coloración violeta confirma que su
Tinción morfología es de la Listeria
Gram No se pudo apreciar la morfología del
microorganismo debido a que se
Leche Gram Positiva aplicó mal la técnica de
Descompuesta esparcimiento por cubre objetos, el
color del microrganismo es de
violeta.
La listeria es capaz de descomponer
Leche con Listeria Positivo el peróxido de Hidrogeno en agua y
Oxigeno con la formación de
Catalasa Burbujas
Los microgramitos presentes en la
Leche Positivo leche descompuesta son capaz de
Descompuesta descomponer el peróxido de Oxigeno
con Formación de Burbujas
Se observó La movilidad de los microorganismos
Leche con Listeria microorganismo fue por la presión del porta objetos y
bacilo incoloro cubre objetos
Movilidad en Dificultad para Se observó un microorganismos
Fresco Leche observar a los Bacilos incoloros, no se puede
Descompuesta microorganismos identificar si se trata de listeria
presentes en la leche
La Aparición de la coloración
Leche con Listeria Positivo amarilla en el medio reafirma la
Color Amarillo presencia de listeria por la capacidad
de fermentar D-glucosa a un ácido,
Rojo de bajando el pH en medio y
Metilo presentando una coloración Amarilla
No se produjo un cambio de
Leche Negativo coloración en el medio, el
Descompuesta Color Rojo microorganismo no puede fermentar
D-glucosa
 0.5 ml creció un halo Una de las características de la listeria
1.8 cm descrita por Jesús Oteo en “Control
Leche con Listeria  0.25 ml creció un halo de calidad” la listeria es sensible al
Sensibilidad 2.5 cm antibiótico Gentamicina, los halos se
Antibiótica  1 ml creció un halo formaron aun teniendo diferente
1.8 cm concentración.
GENTAMICINA
 0.5 ml creció un halo El crecimiento de un halo en la
(160 mg en muestra de leche descompuesta
2.5 cm
ml)  0.25 ml creció un halo indica que los microrganismos
Leche 2.5 cm presentes son sensibles al antibiótico
Descompuesta  1 ml creció un halo 2 de gentamincina
cm
 1
 Diluciones 5𝑋101
1
hasta 5𝑋107 Se puede apreciar la formación de
Incontables. colonias de la listeria en la muestra de
1
 Dilución leche inoculada con listeria
5𝑋108
Leche con Listeria monocytogenes.
8 Colonias
4X109 UFC/ml
Log UFC/ml=9.602
Dilución Por
Gota
Diluciones No es posible observar la morfología
(Medio TSB) Leche incontables 1-4 del microrganismo presente en e
Descompuesta Diluciones 5-8 sin medio que en las primeras diluciones
crecimiento. creció abundantemente y en las
ultimas 4 no se presento crecimiento.
Es posible observar un poco la
Leche con Listeria 37 Colonias morfología de la listeria por la
Cuenta en
posibilidad que la técnica de estriado
placa con no fue precisa.
No es posible contarlo puede que sea
estría
Leche Incontable por falla en la técnica, por lo cual el
Descompuesta microrganismo se extendió por todo
el medio.

CONCLUSION

Podemos concluir que en la leche inoculada si se presentaba el microorganismo Listeria

monocytogenes ya que fue agregado y porque dio positivo en las muestras realizadas y la morfología
era parecida a la que ya se conocía. Con eso podemos concluir que si está presente.

En cambio, en la leche en descomposición suponemos que puede haber una pequeña presencia de
Listeria monocytogenes ya que nos dio positivo en algunas muestras, pero al observar la morfología,
no tenía una similitud con las pruebas pasadas. Y también al observar en la tinción de Gram era un
poco confuso ya que se podía observar diferentes formas de microorganismos. Por lo tanto, no
podemos asegurar que en la muestra de leche descompuesta se encuentra el microrganismo Listeria
monocytogenes.
 Muestras

 Tinción Gram
(leche con Listeria) (Leche Caduca)

 Movilidad en Fresco
(leche con Listeria) (Leche Caduca)
  Catalasa

 ROJO DE METILO

Sensibilidad Antibiotica
  Dilusion por gota

Referencias
 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-143-SSA1-1995, BIENES Y SERVICIOS.
METODO DE PRUEBA MICROBIOLOGICO PARA ALIMENTOS. DETERMINACION
DE LISTERIA MONOCYTOGENES.

Anexos
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-143-SSA1-1995, BIENES Y SERVICIOS. METODO
DE PRUEBA MICROBIOLOGICO PARA ALIMENTOS. DETERMINACION DE
LISTERIA MONOCYTOGENES.

9.2.1 Prueba de movilidad en fresco

Hacer preparaciones en fresco (en gota suspendida o entre porta y cubreobjetos) utilizando solución
salina al 0,85%. La suspensión debe ser densa y emulsificarse completamente, y observar con objetivo
de inmersión en un microscopio de contraste de fase o microscopio de campo oscuro.

Las células de Listeria spp son bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si brincaran.

Los bacilos con movimientos rápidos no son Listeria spp.

9.2.2 Prueba de catalasa

Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solución de peróxido al 3%.

La formación inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva.

Las especies de Listeria son catalasa positivo.

¡Precauciones, la emulsión debe realizarse con una asa de plástico o palillo de madera estéril
evitando el contacto del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base con sangre.
Cualquier contaminación de eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas!

9.2.3 Tinción de Gram

Hacer una tinción de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de Listeria son bacilos cortos
Grampositivo; sin embargo en cultivos viejos pueden presentarse como formas cocoides. En
extensiones delgadas se observan de color pálido y pueden confundirse con Bacteroides spp.

9.2.4 Prueba de hemólisis

Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de agar sangre de carnero al 5%.
Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por 48 h a 35ºC. Al inocular,
observar la reacción hemolítica en las placas. L. monocytogenes y L. seeligeri producen una zona
ligeramente clara alrededor del punto de picadura. Confirmar las reacciones dudosas con la prueba
de CAMP.

9.2.5 Prueba de reducción de nitratos

Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35ºC por 5 días. Para la lectura se debe
agregar 0,2 ml del reactivo A y 0,2 ml del reactivo B, un color rojo indica una prueba positiva
(presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de
color rojo después de una hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos).

En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0,2 ml del reactivo B y 0,2 ml del reactivo
C. Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloración no se
observa, adicionar 0,2 ml del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una
prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa -
naftilamina, que es carcinogénica.

9.2.6 Prueba de movilidad en agar

Inocular el medio SIM o MTM, incubar por 7 días a temperatura ambiente (20-25ºC), observar
diariamente. Las especies de Listeria son móviles, dando un crecimiento típico en forma de paraguas.

9.2.7 Prueba de utilización de carbohidratos

Inocular tubos de caldo púrpura para fermentación de carbohidratos al 0,5 %: dextrosa, esculina,
maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 días a 35ºC. Una coloración amarilla indica una
prueba positiva. Todas las especies de Listeria dan positivas las pruebas para dextrosa, esculina y
maltosa. Consultar el cuadro 1 para reacciones con ramnosa, xilosa y manitol. Si la pigmentación
prematura del aislamiento en el medio OXA no deja lugar a duda, el ensayo de esculina puede
omitirse.

9.2.8 Prueba de Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP)

Para la prueba de CAMP se emplean las siguientes cepas de colección de S. aureus y R. equi:

Staphylococcus aureus Rhodococcus equi

Las cepas empleadas en la prueba de CAMP pueden obtenerse de diversas colecciones nacionales e
internacionales.

En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estría de la cepa de S. aureus y, paralelamente
una de R. equi, separadas lo suficiente para que entre éstas se puedan estriar perpendicularmente las
cepas sospechosas de Listeria, sin que lleguen a tocarse (aproximadamente 5 mm de separación).
Después de 24 y 48 h de incubación a 35°C observar el sinergismo entre las hemolisinas de S.
aureus, R. equi y Listeria que se manifiesta como una zona hemolítica más intensa.