UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR PRACTICA Nº 1

PREPARACION DE REACTIVOS Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y REACTIVOS.

PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO

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OBJETIVOS

1. Capacitar al estudiante en el manejo y cuidado de Autoclave, balanza, cabinas de extracción y

bioseguridad Tipo II.
2. Desarrollar habilidades y destrezas en la esterilización de materiales, reactivos y equipos.
3. Preparar en forma correcta los stocks de buffers y soluciones que sean estables para las prácticas de
laboratorio que se desarrollarán durante el semestre.
4. Incentivar el uso de los manuales de los diferentes equipos a fin de conocer su funcionamiento,
cuidados y errores de trabajo.

PRPARACIÓN PREVIA

1. Repace las copias dadas del manual de funcionamiento y cuidados del potenciómetro Acumed,
balanza analítica Sartorios, baño de María Fisher y Micropipetas Gilson.
2. Resuelva las siguientes preguntas y entréguelas al monitor como preinforme de su practica:

a. ¿Cómo descontaminaría un bisturí que se utilizó para cortar un fragmento de músculo de un

cadáver de un día, si se requiere nuevamente para procesar otra muestra?
b. ¿Cómo podría asegurarse de eliminar completamente toda forma de vida microbiana a un bajo
costo?
c. ¿En qué se fundamenta el método(s) que utilizó en el numeral anterior?
d. ¿Por qué los elementos a esterilizar deben estar limpios?
e. ¿Cómo se podría monitorear la eficiencia del proceso de esterilización por autoclave en
materiales y reactivos?
f. ¿Qué medidas se deben tener en cuenta en el manejo de cultivos de microorganismos, muestras
de sangre y orina?
g. ¿Cuales estrategias puede utilizar con los materiales existentes en la Universidad Distrital si
tiene superficies, material e instrumentos contaminados?
h. ¿Qué principio se da al descontaminar por segunda vez agua autoclavada con rayos U.V?
i. ¿Cuáles condiciones utilizaría si tiene para esterilizar: un instrumento metálico, vidrio y plástico
por calor seco?
j. ¿Cómo podría descontaminar una solución con bromuro de etidio?
k. ¿Cómo podría eliminar parásitos, hongos y bacterias?
l. ¿Cuáles son los niveles de bioseguridad en los laboratorios?
m. ¿Qué condiciones de bioseguridad necesitaría para trabajar con el material genético de los virus
Ebola, dengue hemorrágico y HIV?
n. ¿Cuales son las partes de un autoclave?

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 o. Elabore un mapa conceptual de los métodos utilizados para destruir gérmenes patógenos.

MATERIALES Y EQUIPOS

MATERIALES
1 Espátula por grupo y 1 microespátula
1 Esponjilla (Estudiantes)
1 Frasco de Etanol al 70% por todo el grupo
(Estudiantes)
1 Par de guantes cirugía (estudiante)
1 Pinza por grupo (Estudiantes)
1 Pkt detergente (Estudiantes)
1 Pkt Gasa por grupo (Estudiantes)
1 Rollo Cinta (Estudiantes)
1 Rollo de papel aluminio (El grupo) y tijeras.
(Estudiantes)
1 Tijeras pequeñas por grupo (Estudiantes)
1churrusco
2 Marcadores de tubos (Estudiantes)
2 Pipetas 5 y 10 ml por grupo
3 Frascos ámbar 50 ml, 100 ml, 1 L y transparentes.
(Estudiantes)
4 Balón de 25 ml , 50 ml, 100 ml, 1 L por grupo.
4 Beakers 50 ml, 100 ml, 500 ml y 1 L por grupo.
4 Tubos Corning o Falcón de 15 ml (Estudiantes)
6 Tubos eppendorff
8 Hojas papel craff (Estudiantes)
Puntas blancas, amarillas, azules y 3 cajas.
1 PktToallas secantes de mano (Estudiantes)

EQUIPOS
3 Balanzas
1 Horno
4 Micropipetas de volumen variable de 50, 100,
250 y 1000 µL.
2 Potenciómetros
2 Autoclaves
4-6 Agitadores magnéticos, magnetos y varilla.

2 Cabinas de flujo laminar

PROCEDIMIENTO

1. Utilice bata y guantes para lavar con detergente tego el lugar de trabajo, pase nuevamente una
solución de hipoclorito 100 p.p.m.
2. Limpie con una esponja de espuma y un detergente suave la estufa de calentamiento, incubadora,
vortex, plancha de agitación y la autoclave. Impregne una toalla secante con etanol al 70 % y
pásela a cada equipo excepto al autoclave cambiándola las veces que sea necesario. Coloque toallas
secantes o una hoja de papel craff en la parte inferior de la estufa de calentamiento para evitar el
daño del acero inoxidable cuando realice la esterilización por calor de los materiales.
3. Limpie la balanza y la cabina de flujo laminar con etanol al 70% y por ningún motivo utilice
hipoclorito de sodio.
4. Lave los beakers, balones aforados, matraces de fondo plano, probetas y pipetas aforadas asignadas
con extran 3% o con detergente disuelto previamente, ponga todo el material en un recipiente
plástico que contenga una solución de hipoclorito de sodio 100 p.p.m por 10 min, enjuague todo el
material con abundante agua y déjelo secar en la estufa a 160 ° C 45 min y permita que enfríe
lentamente para evitar roturas del material de vidrio.
5. Corte con ayuda de tijeras tiras simétricas de cinta de autoclave.
6. Corte tiras de papel craff con un tamaño mayor al objeto(s) que va(n) a empacarse para su correcta
esterilización: cajas de puntas para 10- 50- 250 1000 μL, pipetas 5 ml y 10 ml, 3 tubos de 1.5ml, 3

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 tubos de 15ml, 3 tubos de 50 ml, (para tubos usados), un par de guantes de cirugía extendidos
separadamente, 1 tijera abierta, pinzas individuales y gasa doblada etc.
7. Encienda la luz UV de la cabina de flujo laminar y deje esterilizar por 15 min.
8. Utilizando bata y guantes estériles coloque dentro de la cabina de flujo laminar una hoja de papel
craff y ponga dentro tiras de toallas secantes de 10 X 10 cm. Introduzca frascos transparentes
esterilizados (mediante autoclave) de diferente tamaño y en forma secuencial llene un 80% de su
capacidad con tubos destapados nuevos de 0.2 ml para PCR, 0.5 ml y 1.5 ml. Tape la boca del
frasco con papel vinilpel y luego con craff, asegúrelo con cinta o utilice papel aluminio y una
banda de caucho.
9. Tome tres tubos nuevos de 15 ml y afloje la tapa (sin destaparlos), envuelva los tres tubos en papel
craff y dibuje una flecha hacia abajo sobre la cinta que quedo cerca de la tapa (con marcador
permanente) con el fin de que se oriente en donde está la base del tubo y la tapa para no contaminarlo
cuando lo destape. Realice el mismo procedimiento para dos tubos de 50 ml. Si tiene disponible un
beaker de 1000 ml estéril colóquelos los tubos de la misma manera dentro de este, tápelo con papel
aluminio y una banda de caucho.
10. Las pinzas y tijeras se envuelven con papel craff y la flecha sobre la cinta que sella el papel se
orienta de manera que al destaparla pueda tomarlas por la parte superior (mango).
11. Ponga los guantes extendidos sobre una misma hoja de papel de manera que la abertura quede abajo,
cubra cada uno con el papel remanente, haciendo un doblez de izquierda a derecha sobre el guante
que quedo al lado izquierdo y viceversa para el otro guante, doble la parte superior dos centímetros
y luego por la mitad de manera que queden superpuestos ambos guantes, pero extendidos y
separados por las tiras de papel. Marque una flecha para orientarse donde se encuentra la abertura
del guante, vuelva a doblar por la mitad y asegúrelos con cinta de enmascarar. Cuando los vaya a
sacar debe destaparlos por el lado en el que puso la marca, de manera que se los pueda colocar
directamente sin contaminarlos.
12. Empaque en una botella ámbar 1 L de agua destilada y tápela con papel aluminio asegurándolo con
una cinta de enmascarar.
13. Con la cabina de flujo laminar encendida y utilizando bata y guantes de cirugía estériles ponga las
puntas nuevas dentro de las cajas estériles del volumen correspondiente, cierre la parte frontal que
une las dos tapas de la caja con una cinta y sobre esta trace con un marcador permanente sharpie una
flecha hacia abajo para orientar hacia donde se encuentra la parte superior de estas, con el fin que
al destapar la caja no se rieguen las puntas y pierda todo el proceso de esterilización. Empaque las
cajas con el papel craff que cortó en forma de regalo, póngale cinta en la parte central y deje el
doblez de papel de los extremos laterales hacia arriba y asegúrelo con cinta, con un marcador
permanente oriente de igual manera como lo hizo con la caja y marque el volumen al cual estas
corresponden. Realice el mismo procedimiento para puntas viejas esterilizadas por calor.
14. Adicione agua a la autoclave hasta que la resistencia quede cubierta, cargue todo el material dentro la
canasta sin apretarlo, coloque en el centro de la carga un frasco de vidrio con una ampolleta de
sterikon plus bioindicador. Ref 1.10274.0001 Merk. Ajuste la tapa apretando simultáneamente los
tornillos que se encuentran paralelos manteniendo la espita de descarga abierta, coloque la válvula
de seguridad a 121 °C. Para que la esterilización sea buena se debe eliminar todo el aire de la
cámara y la carga. Para poder descartar material contaminado colóquelos en recipientes metálicos
de fondo sólido abiertos a una altura no mayor de 8 cm y deje suficiente espacio entre ellos.
15. Cierre la tapa y deje que alcance 121 °C de presión por 15 min, abra la válvula y vuelva a cerrarla
(purga), espere a que alcance nuevamente la misma temperatura y mantenga la presión 15 min,
asegúrese que la presión no este por encima de este valor. Si no esta pendiente del proceso todo el
material se puede dañar y los costos son elevados.
16. Esterilice el material en una de las autoclaves y los reactivos en otra. Prepare los siguientes Stocks
y autoclave los que lo requieran.

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 NOTA Por su seguridad y la de sus compañeros no permita que la presión llegue hasta la señal de
“Caution”. Cuando el proceso finalice permita que el autoclave enfríe y que la presión llegue a cero abra la
espita de descarga de aire vapor lentamente, si se abre cuando la autoclave está todavía bajo presión
cualquier líquido que haya en su interior hervirá de forma explosiva e incluso pueden explotar las botellas que
contengan líquidos.

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 BIOLOGÍA MOLECULAR
PRACTICA DE LABORATORIO N° 1 PREPARACION DE REACTIVOS PARTE A

PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO

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STOCK NaCl 5 M:(25 ml)

 Pese 29.22 g NaCl

 Disuelva por agitación
 Afore con H2O d a 100 ml.
 Almacene a 4 °C.

STOCK SDS 10%: (25 ml)

 Pese 1 g SDS
 Disuelva por agitación
 Afore con H2Od a 10 ml.
 Guarde a temperatura ambiente para evitar su precipitación.

STOCK MgCl2. 7 H20. 1 M

 Pese 10,15 g MgCl2. 7 H20

 Disuelva por agitación
 Afore con H2Od a 50 ml.
 Esterilice con Autoclave y guarde a 4 ° C si lo va ha utilizar para prepar otros reactivos
prontamente, en caso contrario guarde -20 ° C.

STOCK NaOH 10 N.

 Pese 20 g NaOH
 Disuelva por agitación
 Afore con H2Od a 50 ml.
 Guarde a temperatura ambiente.

STOCK EDTA 0.5 M pH 8.0: (25 mL)

 Pese 15,5 g EDTA Na.2H2O

 Adicione 25 ml H2Od
 Ajuste a pH 8.0 con NaOH 10 N
 Afore con H2Od a 50 ml.
 Guarde a 4 °C.

STOCK HCl 1 M.

 Mida con ayuda de un propipeteador  8,62 ml de HCl concentrado.

 Disuelva por agitación.
 Afore con H2O d a 100 ml.
 Guarde a temperatura ambiente.

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STOCK BUFFER PISSUM EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS VEGETALES

 Tome 20 ml de glycerol.
 Adicione 24.1 mL H2O, 12.5 ml buffer Tris HCl 1 M pH. 8.5.
 Agregue 2 g SDS.

BUFFER TRIS- HCl 1 M pH 7.6 (100 ml)

 Pese 121 g tris base

 Disuelva en H2O d por agitación
 Ajuste a pH 7.6 por adición lenta de ácido HCl concentrado.
 Afore a 1 L con H2O d.

BUFFER TRIS- HCl 1 M pH 8.0 (50 ml)

 Pese 121 g tris base

 Disuelva en H2O d por agitación
 Ajuste a pH 8.0 por adición lenta de ácido HCl concentrado.
 Afore a 1 L con H2O d.

SOLUCIÓN ISOTÓNICA 0.85 % p/v PROEINAS LOWRY: (25 ml)

 Pese 0.85 g de NaCl

 Complete a 100 ml H2O d

PATRÓN DE ALBÚMINA SÉRICA BOVINA 120 mg/dL LOWRY. (5 ml)

 Pese 6 mg de BSA.
 Afore a 5 ml con H2O d disuelva mediante agitación por vortex.
 Guarde a –20 C hasta su uso

REACTIVO DE COBRE (25 ml)

 Pese y disuelva en estricto orden en agua hervida

 Tartrato de sodio tetrahidratado 0.278 g,
 Sulfato de cobre pentahidratado 66 mg,
 Hidróxido de sodio 2 g,
 Carbonato de sodio decahidratado 26 g o anhidro 9.53 g
 Complete a volumen final de 100 ml con H2O d

DODECIL SULFATO SÓDICO 1% p/v CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS:(25 ml)

 Pese 0.25 g SDS y disuelva por agitación.

 Afore a 25 ml con H2O d
 Al tomar el SDS tenga cuidado de no aspirarlo es tóxico.

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 BIOLOGÍA MOLECULAR
PRACTICA DE LABORATORIO N° 1 PREPARACION DE REACTIVOS PARTE B

PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO

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ACETATO DE SODIO SATURADO 3 M pH 7.6 (25 ml)

 Pese CH3-COONa .3 H2O 20.4 g.

 Disuelva con H2O d autoclavada
 Ajuste a pH 7.6 con ácido acético glacial.
 Afore con H2O d autoclavada a 50 ml.
 Guarde a temperatura ambiente.

ACETATO DE SODIO SATURADO 3 M pH 5.2: (25 ml)

 Pese CH3-COONa .3 H2O 20.4 g.

 Disuelva con H2O d autoclavada
 Ajuste a pH 5.2 con ácido acético glacial.
 Afore con H2O d autoclavada a 50 ml.
 Guarde a temperatura ambiente.

BUFFER T.E (TRIS EDTA) (25 ml)

 Tris HCl 10 Mm pH 7.6

 EDTA pH 8.0 0.1 mM
 Afore con H2O d a 50 ml
 Esterilice en Autoclave y guarde a temperatura ambiente ó a 4 ˚ C.

BUFFER LISIS GLOBULOS ROJOS: 1 L

 Tris HCl 10 Mm pH 7.6

 MgCl2. 5 mM
 NaCl 10 mM
 Homogenice por agitación magnética.
 Esterilice en Autoclave (15 min 10 Lb de presión) y guarde a 4 ˚ C.

BUFFER LISIS GLOBULOS BLANCOS: (50 ml)

 Tris HCl 10 Mm pH 7.6

 EDTA 10 mM
 NaCl 50 mM
 Homogenice por agitación magnética.
 Esterilice en Autoclave (15 min 10 Lb de presión) y guarde a 4 ˚ C.

BUFFER TBE 5 X ADN

 500 ml de agua destilada

 Tris base 27 g
 Agite con un varilla de vidrio hasta que disuelva
 Acido bórico 13.75g
 Disuelva por agitación magnética
 EDTA 2.07 g
 Disuelva por agitación magnética

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  Afore 1 L con H2O d.
 Guarde a temperatura ambiente, estable por 1 año.

FENOL SATURADO

 Descongele 500 g de fenol por calentamiento a 37 ° C teniendo cuidado.

 Agregue 100 ml de tris HCl 2 M pH 7.4 y agite con un magneto durante 1- 2 h.
 Retire con ayuda de propipeteador y una pipeta estéril la fase acuosa superior.
 Adicione 100 ml de tris HCl 2 M pH 7.4, agite y verifique que el pH llegue a 7.6.
 Coloque 1 ml de  Mercaptoetanol.
 Adicione 300 mg 8- hidroxiquinolina.

MARCADOR DE PROTEINAS 1%
 Catalasa 10 mg
 Peroxidasa 10 mg
 Albúmina sérica bovina 10 mg
 Otras 10 mg
 Lleve a volumen final de 1.000 µL

4 X BUFFER GEL DE RESOLUCIÓN PROTEINAS pH 6.8: 0.5 M Tris HCl pH 6.8 (25 ml)

 Tris 3g
 Ajuste a pH 6.8 con HCl
 Aforar con H2O d hasta 50ml.

Si la electroforesis es No-denaturante no adicione SDS

4 X BUFFER GEL DE CORRIDA PROTEINAS pH 8.8: 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 (25 ml)

 Tris 36.3 g
 Ajuste a pH 8.8 con HCl
 Aforar con H2O d hasta 200ml.

Si la electroforesis es No-denaturante no adicione SDS

SDS 10 % PROTEINAS SDS -PAGE:

 SDS 1.0 g
 Aforar con H2O d hasta 10 ml

BUFFER TRATAMIENTO MUESTRA 2X PROTEINAS: 0.125 M Tris HCL pH 6.8, 4% SDS, 20%
Glicerol, 10% - Mercaptoetanol, Azul bromofenol 0.2%.

Tome los siguientes volumenes.

 4 X Buffer gel de Resolución pH 6.8 2.5 ml

 SDS 10 % 4.0 ml
 Glicerol 2.0 ml
 Azul bromofenol 0.2%
 - Mercaptoetanol 1.0 ml
 Aforar con H2O d hasta 10.0 ml
Haga Alícuotas y congele, adicione el - Mercaptoetanol antes de su uso. .

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BUFFER TRATAMIENTO MUESTRA 2X PROTEINAS: 0.125 M Tris HCL 6.8, 4% SDS, 20%
Glicerol, Azul de Coomasie 0.1 mg/mL, 10% - Mercaptoetanol.

Tome los siguientes volumenes.

 4 X Buffer gel de Resolución pH 6.8 2.5 ml / 0.25 ml

 SDS 10% 4.0 ml/0.4 ml
 Glicerol 2.0 ml/0.2 ml
 Azul de Coomasie 1mg/ ml 1000 L/0.1 ml
 Adicione H2O d 0.5 ml/ 0.05 ml

Haga Alícuotas y congele, en el momento de trabajar tome 180 L de esta mezcla y adicione 20 L de
- Mercaptoetanol

Si la electroforesis es No-denaturante no adiciones ni SDS ni - Mercaptoetanol.

BUFFER CÁMARA 4X/1X PROTEINAS: (0.025 M Tris HCl pH 8.3, 0.192 M glicina, 0.1 % SDS) (1 L)

 Tris BASE 12 g / 3 g
 Glicina 57.6 g /14.4 g
 SDS 10 % 40ml /10 ml
 Aforar con H2O d hasta 1L / 1L
Si la electroforesis es No-denaturante no adiciones SDS

PERSULFATO DE AMONIO 10%:

 Persulfato de amonio 25 mg
 Aforar con H2O d hasta 250 L
Prepare fresco, aunque es estable hasta un mes en congelación.

ACRILAMIDA 30% T, 2.7% C bis: (25 ml)

 Acrilamida 7.3 g
 N’N’N’N BIS ACRILAMIDA 0.2 g
 Disuelva por calentamiento a 37 C
 Aforar con H2O d hasta 25 ml

BUFFER LISIS PLÁSMIDOS: (25 ml)

 NaCl 0.1 M
 Tris.HCL 10 mM pH 8.0.
 EDTA pH 1 mM pH 8.0.
 5% tritón X-100

ACETATO DE SODIO 2.5 M PH 5.2 EXTRACCIÓN DE PLÁSMIDOS: (25 ml)

 Acetato de sodio saturado 3 M 20.833 ml

 Afore con H2O d autoclavada hasta 25 ml.
 Guarde a temperatura ambiente.

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SOLUCIÓN DE DENATURACIÓN: (1.2 L)

 300 mL NaCl 5 M
 50 mL 10 M NaOH
 650 mL H2O d autoclavada.

SOLUCIÓN DE NEUTRALIZACIÓN: (1.2 L)

 200 mL CH3COONH4 10 M
 4 mL NaOH 10 M
 1,796 mL H2O d autoclavada.

STOCK DE ACRILAMIDA 30 %: (25 ml)

 Pese 29 g acrilamida.
 Agregue 1 g N,N- dimetil Bis Acrilamida.
 Adicione 30 ml H2O d.
 Disuelva en un baño maría a 600C
 Afore a 100 mL
Estable durante un mes a 4 ° C
Nota: la acrilamida es un potente neurotóxico y es absorbido por la piel.

STOCK PERSULFATO DE AMONIO 10 %: (250 µL)

 Pese 0.1 g (NH4)2S2O8

 Adicione 1 ml H2O
Prepare fresco y guarde a 4 ° C estable durante un mes.

BUFFER CARGA 6 X TIPO III: (5 ml)

 Tome 0.25 ml del stock xilencianol al 10 % (0.25 % de xilencianol)

 Agregue 0.25 ml del stock azul de bromofenol al 10 % (0.25 % azul de bromofenol)
 Adicione 3 ml glicerol (30% de glicerol)
 Afore a 10 ml con H2O bd
 Alicuotar y guardar a –20 ° C

BUFFER CARGA 6 X TIPO I: (5 ml)

 Tome 0.25 ml del stock xilencianol al 10 % (0.25 % de xilencianol)

 Agregue 0.25 ml del stock azul de bromofenol al 10 % (0.25 % azul de bromofenol)
 Adicione 4 g sacarosa (40 % de sacarosa)
 Afore a 10 ml con H2O bd
 Elabore alícuotas de 1.5 ml y guarde a –20 ° C

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