UNIVERSIDADE ESTADUAL DO MARANHÃO

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA

CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL

ALUNA: CAROLINA SILVA COSTA

DISCIPLINA: IMUNOLOGIA BÁSICA

RELATÓRIO AULA PRÁTICA

SÃO LUÍS-MA

2017
 Foi realizada visita técnica ao laboratório Cernitas, que é um laboratório de
diagnóstico veterinário e análises ambientais, credenciado pelo ministério da
agricultura, pecuária e abastecimento (MAPA) cujo responsável técnico Daniel
Praseres Chaves mostrou os laboratórios e as técnicas e exames para detecção de
doenças. A responsável técnica Erlin Cely Cotrim Cavalcante demonstrou os seguintes
exames: teste do antígeno acidificado tamponado (AAT), fixação de complemento, 2-
mercaptoetanol e imunodifusão em gel de ágar (IDGA).

Teste do antígeno acidificado tamponado

O método AAT para brucelose, também conhecido como teste rosa de Bengala e/ou
“card test”, está de acordo com a técnica recomendada do Manual Técnico do
Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (BRASIL,
2006). O método verifica se há ocorrência dos grumos de aglutinação ou não,
classificando como positivo ou negativo sendo que devem ser testados
conjuntamente os soros controle negativo e positivo. Nessa prova há a reação de
anticorpos IgG1 e amostras altamente hemolisadas devem ser ignoradas porque
podem mostrar resultados falso-positivos e o resultados não podem passar dos 4
minutos de reação.

Essa técnica baseia-se em pôr o soro em contato com o antígeno, homogeneizar e

realizar movimentos rotatórios contínuos e suaves da placa até o momento da leitura,
após quatro minutos de reação, através do aglutinoscópio. O antígeno empregado
nessa técnica é preparado com Brucella abortus, corado com rosa de Bengala.

É uma prova qualitativa, pois não indica o título de anticorpos do soro testado. O
AAT é o teste de triagem do rebanho, mostrando previamente novas infecções, o ideal
é buscar a confirmação da brucelose através de testes mais específicos devido a
possível ocorrência de falso-positivos por causa da vacina B19 evitando assim a
eutanásia de animais não infectados.

2-Mercaptoetanol
A técnica 2-Mercaptoetanol, é uma prova quantitativa seletiva que detecta
somente IgG no soro, que é a imunoglobulina sugestiva de infecção crônica. O 2-
mercaptoetanol degrada as imunoglobulinas da classe IgM, sendo inativa para as
imunoglobulinas da classe IgG.Deve ser sempre realizada em paralelo com a prova de
soroaglutinação lenta em tubos.

Esta técnica é realizada conforme a metodologia recomendada pelo Manual

Técnico do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose
(BRASIL, 2006). É realizada utilizando antígeno para soroaglutinação lenta, preparado
com Brucella abortus. Como diluente foi empregada solução salina. Os soros são
testados em diluições duplas a partir da diluição 1/25, trabalhando-se com volume
final da mistura diluente-soro-antígeno. A leitura é realizada após incubação por 48
horas, observando-se a formação de grumos de aglutinação.

A interpretação dos resultados é feita pela diferença entre os títulos dos soros sem
tratamento (prova lenta), em relação ao soro tratado com 2-mercaptoetanol. Desse
modo, soros com predomínio de IgM apresentam reações negativas nessa prova e
reações positivas na prova lenta. Os resultados positivos na prova lenta e negativos no
2-ME devem ser interpretados como reações inespecíficas ou como devido a
anticorpos residuais de vacinação com B19. Resultados positivos em ambas as provas
indicam a presença de IgG, devendo os animais ser considerados infectados.

Teste de fixação de complemento

A técnica de Fixação do Complemento consiste em um método de diagnóstico
sorológico de eleição para o mormo e brucelose, por se tratar de um teste com alta
sensibilidade e especificidade. É considerado o teste de referência pela Organização
Mundial de Saúde Animal (OIE). A fixação de complemento detecta tanto IgG1 quanto
IgM só que é mais efetivo para IgG1 que é específico para da infecção

O teste de fixação de complemento tem sido empregado em diversos países que

conseguiram erradicar a brucelose ou estão em fase de erradicá-la. Animais infectados
permanecem positivos por períodos mais longos e com títulos de anticorpos fixadores
de complemento mais elevados do que os detectados nas provas de aglutinação. Em
animais vacinados acima de 8 meses de idade, os anticorpos que fixam complemento
desaparecem mais rapidamente do que os aglutinantes. Apesar de ser um teste
trabalhoso e complexo, possui um custo relativamente baixo e com reagentes de fácil
acesso. É uma técnica com um bom percentual de confirmação sendo utilizada na
maioria dos países que possuem a brucelose erradicada.

Na prova um anti-soro teste é titulado em diluição seriada e uma quantidade fixa de

antígeno é adicionada a cada poço. Se o anticorpo estiver presente no anti-soro,
formam-se complexos imunes. O complemento é então adicionado à solução. Nesta
etapa, antígeno, soro teste e complemento estão reagindo juntos. Se os complexos
estiverem presentes, o complemento é ativado, sendo fixado e consumido.

Na etapa final da reação, as células indicadoras (eritrócitos), juntamente com uma

quantidade subaglutinante de anticorpo (anticorpo antieritrócito) são adicionados à
mistura. Se houver qualquer complemento remanescente, estas células serão
lisadas. Se o complemento tiver sido consumido na etapa dois pelos complexos
imunes (Ag- Ac), as células não serão lisadas devido à quantidade insuficiente de
complemento presente na solução. A quantidade de complemento utilizada é apenas
suficiente para lisar as células indicadoras se absolutamente nada do complemento for
consumido. Os controles adequados são de fundamental importância neste método
porque algumas preparações de anticorpos consomem complemento sem adição de
antígeno, por exemplo, soros que já contém complexos imunes. Alguns antígenos
também podem apresentar atividade anticomplementar. Portanto, os controles
devem incluir somente anticorpo e somente antígeno para verificar que nenhum
destes esteja, por si só, fixando complemento. O resultado do teste de Fixação do
Complemento é baseado no percentual de hemólise dos eritrócitos sensibilizados.

Todos os controles são necessários já que a prova de fixação de complemento é

trabalhosa, de baixa reprodutibilidade, exigindo que todos os reagentes e sistemas
sejam verificados e controlados a cada prova.

Imunodifusão em gel de ágar

A técnica de imunodifusão é qualitativa e identifica IgG precipitado sendo realizada
em meio semi-sólido, geralmente o ágar ou agarose associado com solução fisiológica
ou tamponada e baseia-se na migração de antígeno e anticorpo. Esse encontro leva a
formação de complexos antígeno-anticorpo que se tornam visíveis na lâmina de
microscopia ou placa de Petri através de linha ou banda de precipitação. As
concentrações de antígeno e anticorpo não podem ter variação extrema podendo
causar inibição ou má localização do complexo antígeno-anticorpo.

Na lâmina, o resultado é lido por quadrante, em cada quadrante são classificados

os soros .O animal pode ser positivo ou negativo, mas existe uma variação muito fina,
fraco positivo, quando a linha de precipitação quase toca o poço com o soro do animal
mas faz uma ligeira curva e as vezes não se junta com a outra e pode ocorrer reação
inespecífica.

Esta reação pode ser, ainda, influenciada por uma variedade de condições físico
químicas, dentre elas, concentração eletrolítica, tampão, pH e temperatura .Alterações
bruscas de temperatura, durante a incubação, levam a formação de artefatos de
técnicas indesejáveis para o teste. Altos níveis de lipídeos e protídeos nos reagentes
podem afetar a formação e observação da linha de precipitação.

Uma das limitações da IDGA está relacionada à sua sensibilidade, onde amostras
com baixos títulos de anticorpos apresentam leituras difíceis de serem realizadas
contribuindo para a ocorrência de resultados falsos negativos, já que a leitura é visual
e subjetiva, sujeita a erros de interpretação. Outra causa de resultados falsos negativos
ocorre quando amostras de soro são coletadas de animais no primeiro episódio clínico
induzido pela infecção pelo EIAV, pois os animais não tiveram tempo suficiente para
montar a resposta imune contra a p26 (Issel e Cook, 1993).

A prova da imunodifusão em gel de Agar (IDGA) é considerada o teste padrão-ouro.

No Brasil, os laboratórios e técnicos interessados em realizar o diagnóstico devem ser
cadastrados no Ministério da Agricultura.

Referências
ALVAREZ, I.; GUTIERREZ, G.; VISSANI, A. et al. Standardization and validation of an Agar
gel immunodiffusion test for the diagnosis of equine infectious anemia using a
recombinant p26 antigen. Vet. Microbiol., v.121, p.344-351, 2007.

BRASIL, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa

Agropecuária - Departamento de Saúde Animal, 2006. Programa Nacional de Controle
e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) – Manual Técnico. Brasília: MAPA
/ DAS / DSA, 188p,2006.

COOK, R.F.; COOK, S.J.; Li, F. et al. Development of a multiplex real-time reverse
transcriptase-polymerase chain reaction for equine infectious anemia virus (EIAV). J.
Virol Meth., v.105, p.171-179, 2002.

ISSEL, C. J.; COOK, R.F. A review of techiniques for the serologic diagnosis of equine
infectious anemia. J. Vet. Diag. Invest. v.5, p. 137-141, 1993.

LEVIEUX, D. Immunoglobulines bovines et brucellose. I – Purification des

immunoglobulines et preparation de leurs atisérum spécifiques. Annales de
Recherches Vétérinaires, v.5, n.3, p.329-42, 1974.

MATHIAS, L.A. Diagnóstico laboratorial da brucelose. In: ENCONTRO DE

LABORATORIOS DE DIAGNÓSTICO VETERINARIO DO CONE SUL, I, 1996, Campo
Grande. Anais... Campo Grande: Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, p.139-
40, 1996.

PAULIN, L.M.; PRADO, G.E.S.; FEDERSONI, I.S.P.; TEIXEIRA, A.C.; CASTRO, V.; GENOVEZ,
M.E. Estudo comparativo dos testes 2-mercaptoetanol e reação de fixação do
complemento no sorodiagnóstico da brucelose bovina. Arquivos do Instituto
Biológico, São Paulo, v.69, n.4, p.41-7, 2002.

PINTO, M.R.A.; FAGLIARI, J.J.; MATHIAS, L.A.; MEGID, J.; SALGADO, V.R. Avaliação da
prova do antígeno acidificado tamponado, em comparação com as provas de fixação
de complemento e 2-mercaptoetanol, para diagnóstico sorológico da brucelose em um
rebanho bubalino (Bubalus bubalis) infectado por Brucella abortus. Ars Veterinaria,
v.21, supl., p. 147-154, 2005.

PIZA, A.S.T.; PEREIRA, A.R.; TERRERAN, M.T. et. al, Serodiagnosis of equine anemia by
agar gel immunodiffusion and ELISA using a recombinant p26 viral protein expressed in
Escherichia coli as antigen, Prevent. Vet. Med., v.78, p. 239- 245, 2007.

RADOSTITS, O.M.; GAY, C.C.; BLOOD, D.C.; HINCHCLIFF, K.W. Clínica Veterinária:
Tratado de doenças dos bovinos, ovinos, suínos, caprinos e eqüinos. 9.ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 1737 p, 2002.