TÉCNICAS

HEMATOLÓGICAS
BÁSICAS

Araceli Escobedo Magallón

araceli.escobedo@edu.uag.mx

1
 Introducción

 La citometría hemática es uno de los exámenes

de laboratorio de mayor utilidad y mas
frecuentemente solicitado por el médico.

 En esta prueba se estudian tres líneas

celulares, eritrocitos, leucocitos y plaquetas que
proporcionan información no solo para el
diagnóstico de enfermedades hematológicas,
sino también para patologías de distintos
órganos y sistemas.

2
 Introducción

 En la serie roja se evalúa el conteo de

eritrocitos, su componente principal la
hemoglobina y las características que
determinan la morfología celular.
 En la serie blanca se determina el conteo total
y diferencial de leucocitos, con el fin principal
de detectar procesos infecciosos e
inflamatorios.
 El estudio de las plaquetas permiten evaluar el
proceso de la coagulación.

3
Contenido

 Anticoagulantes
 Hemoglobina
 Hematocrito
 Conteo celular
 Conteo diferencial de leucocitos
 Conteo automatizado
 Conteo de reticulocitos
 Velocidad de sedimentación

4
 ANTICOAGULANTES

 Sangre entera: sangre obtenida

con anticoagulante.

 Suero: la porción líquida de la

sangre después de completar la
coagulación.

 Plasma: la porción líquida de la

sangre obtenida con
anticoagulante.

5
ANTICOAGULANTES

 EDTA. 1.2 – 2.0 mg/ml de sangre. Quelante de

calcio.

 Citrato trisódico: 3.2 % (0.105 M), para pruebas

de coagulación (1 parte de anticoagulante : 9
parte de sangre), para sedimentación (1 citrato
: 4 sangre). Unión a iones calcio.

 Heparina: 12-30 UI/ml de sangre para obtener

plasma heparinizado. Actividad antitrombina.

6
ANTICOAGULANTES

Códigos de color de los

anticoagulantes:

 EDTA → lila
 Citrato 9:1 → azul
 Citrato 4:1 → negro
 Heparina → verde
 Sin anticoagulante →
rojo
 Ácido cítrico dextrosa
→ amarillo

7
 ESTABILIDAD DE LA MUESTRA

 El suero o plasma se debe separar tan pronto

como sea posible, se recomienda un límite
máximo de 2 horas a partir de la recolección.

 Muestra de sangre total: estable 8 h, a 4°C por

24 h.

 Mejor contar leucocitos y plaquetas dentro de

las 2h.

8
HEMOGLOBINA

Hb: se mide en base al color, por su

poder de combinación con O2, CO o
por su contenido de Fe.

La capacidad de combinación con

O2 de la sangre es 1.34 ml O2 / g
Hb.

Contenido de Fe: 0.347 g Fe  100

g Hb.

9
 HEMOGLOBINA
Métodos de medición

 Métodos: CianometaHb (HiCN); oxihemoglobina (HbO2)

 Método de CianometaHb: dilución sangre (1:251) en solución

de cianuro de potasio y ferricianuro de potasio, la Hb, Hi y
HbCO (pero no SHb) se convierten en HiCN.
 Reactivo: pH: 7.0-7.4; 540 nm contra agua como blanco
A=0; estable varios meses.
 Std HiCN: 550 – 850 mg/l

10
 HEMOGLOBINA
Métodos de medición

 Método HbO2: sangre con sol. de amoniaco 0.4ml/l, en dilución

201.
 Desventaja: no es posible preparar un std estable; usar std
secundario de sangre o lisado con valor asignado con std de
HiCN
 Medición directa: hemoglobinómetros portátiles, escala
calibrada para lectura directa, se basan en el método de HbO2.

 Hb: V.R. Hombre: 150 + 20 g/l (13 – 17 g/dl)

Mujer: 135 + 15 g/l (12 – 15 g/dl)

11
 Hemoglobinas no funcionales

Metahemoglobina (Hemiglobina = Hi)

 Hb con Fe+3 , incapacidad para combinarse con O2.

 V.R: hasta 1.5% de la Hb total.

 El aumento causa cianosis, ésta es obvia a

concentración de 1.5 g Hi/dl (10% de la Hb total).
 Causas de metahemoglobinemia:

 Hereditaria: Actividad disminuida de NADH-citocromo b5

reductasa; Hb M (Hb anormal con tendencia aumentada
a la oxidación)
 Adquirida: Producción aumentada de Hi, por exposición a
drogas o químicos oxidantes (nitritos, nitratos, cloratos,
quinonas).

12
 Hemoglobinas no funcionales

Sulfohemoglobina
 Mezcla de formas oxidadas con S unido a anillos del
Hem  desnaturalización  precipitación = cuerpos de
Heinz.
 No puede transportar O2, puede combinarse con CO 
carboxisulfohemoglobina.
 Causa: tratamiento con sulfamidas y fármacos amino-
aromáticos.
 V.R. < 1 %

13
 Hemoglobinas no funcionales

Carboxihemoglobina
 Hb + CO  HbCO

 El CO endógeno producido por la degradación de Hem

 bilirrubina, representa el 0.5% de HbCO.
 Afinidad de CO por Hb 210 > O2.

 No puede transportar O2, HbCO desplaza la curva de

disociación de HbO2 a la izquierda.
 20 – 30 % de HbCO causa síntomas.

Medición: estos derivados de Hb tienen espectros de

absorción característicos.

14
 HEMATOCRITO (PCV)

 Utilidad: screening para anemia, método de referencia

para sistemas automatizados y como guía para exactitud
de las mediciones de Hb.
 Htc x 1000 es aprox. 3 veces el valor de Hb expresada
en g/l
 Centrifugación tubos capilares: 12 000 g, 5 min. Cuando
el Htc > 0.5, centrifugar otros 5 min.
 PCV aumenta con el almacenamiento, realizar la prueba
dentro de las 6 h de la obtención de la muestra, o 24 h a
4ºC.

 V.R. Hombre: 0.45 + 0.05 (40 – 50 %)

Mujer: 0.41 + 0.05 (36 – 46 %)

15
El conteo de eritrocitos, leucocitos y plaquetas se expresan en
concentración = células / unidad de volumen de sangre. El
volumen tradicionalmente se expresa en mm3 (μl), por las
dimensiones de la cámara hemacitométrica, las unidades SI
son litros.

(Wintrobe. Hematoogía)

16
 CONTEO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

Método manual.
 Eritrocitos. V.R. H: 5.0 + 0.5 x 1012/l M: 4.3 + 0.5 x 1012/l
 Líquido de dilución: sol. Isotónica, ej. citrato trisódico 3.2%
 Dilución: 1:200
 Leucocitos. 4.0 – 10 x 109/l
 Líquido de dilución: solución capaz de lisar a los eritrocitos
(ácido acético al 2-3% + azul de metileno).
 Dilución: 1:20
 Plaquetas. 280 + 130 x 109/l
 Líquido de dilución: oxalato de amonio al 1%.
 Dilución: 1:100

17
 ÍNDICES ERITROCITARIOS

Volumen corpuscular medio (VCM) VR: 80 – 100 fl

 Es el volumen medio de los eritrocitos.
 VCM = Hcto en l /l = femtolitros ( = micrómetros cúbicos)
eritrocitos (número/l)
Hemoglobina corpuscular medio (HCM) VR: 28 – 32 pg
 Es el contenido de Hb en el promedio de eritrocitos.
 HCM = Hb en g/l = picogramos
eritrocitos (número/l)
Concentración corpuscular media de hemoglobina
 Es la concentración media de Hb en un volumen determinado de
eritrocitos.
 CCMH = Hb en g/dl = g/dl VR: 32 – 36 g/dl
Hcto en fracción

18
 EXAMEN DE FROTIS
SANGUÍNEO

Tinción de Wright.
 Solución en alcohol metílico de eosina y una mezcla de
azul de metileno y azur B.
 Solución tampón (pH 6.4) de KH2PO4 y Na2HPO4.

19
EXAMEN DE FROTIS
SANGUÍNEO
Observación. Eritrocitos
 Características de
tinción: hiper o
hipocromia,
policromatofilia.
 Tamaño: micro a
macrocitosis.
 Forma: poiquilocitosis,
eliptocitos, esferocitos,
codocitos,
acantocitos….
 Estructura: punteado
basófilo, cuerpos de
Pappenheimer,
cuerpos de Howell-
Jolly

20
 FROTIS. Conteo diferencial de leucocitos

 Contar 100-200 células, si están presentes células anormales en

pequeño número, contar 200-500.

21
 FROTIS. Conteo diferencial de leucocitos

 El recuento diferencial como % de cada tipo de células debe

relacionarse a los leucocitos totales y reportarse en números absolutos
(x 109/l).

 Mielocitos y metamielocitos registrarlos separadamente de los

neutrófilos; bandas generalmente se cuentan con neutrófilos, pero es
más útil separarlos.
 Bandas constituyen < 6% de los neutrófilos.

 Corrección del conteo por células rojas nucleadas: pueden incluirse en

el conteo diferencial como un % de TNCC (conteo de células
nucleadas totales)
 Ej., si WBC = 8.0 X 109/L y el % de NRBCs en el diferencial es 25%
WBC corregido = 8 – (8 x 25/100) = 6 x 109/l

22
 Conteo diferencial de leucocitos

Valores de Referencia:

valor absoluto (x109/l) %

Neutrófilos 2.0 – 7.0 50 - 70
Bandas 0 - 0.7 0- 3
Linfocitos 1.0 – 3.0 20 – 40
Monocitos 0.2 – 1.0 2 – 10
Eosinófilos 0.02 - 0.5 1 -4
Basófilos 0.02 – 0.1 0-1

23
 Recuento diferencial de Leucocitos. Interpretación

Neutrofilia
 Mecanismos: ritmo de incorporación de células de M.O.
(↑ con el ↑ de corticoides)
 Proporción granulocitos circulantes (GC) y marginales
(GM)

24
Recuento diferencial de Leucocitos. Interpretación

 Ritmo de flujo sanguíneo: ↑ fisiológico en ejercicio

intenso, hipoxia, ↑ adrenalina (↓ GM ↑GC =
pseudoneutrofilia).
 Patológica: infección bacterianas (apendicitis, salpingitis,
otitis…); alteraciones metabólicas: uremia, eclampsia,
gota, diabetes; compuestos químicos: Pb, Hg, digital,
benceno...; destrucción hística: quemaduras, infarto,
fracturas, cirugías, neoplasias.
 Alteraciones mieloproliferativa

Neutropenia
 Por disminución de la producción y paso a sangre
circulante: granulopoyesis ineficaz, hipoplasia mieloide;
aumento de la destrucción por infección o químicos.

25
Recuento diferencial de Leucocitos. Interpretación

Eosinofilia
 Enfermedades alérgicas: asma bronquial, rinitis
estacional (fiebre del heno).
 Alteraciones de la piel: dermatitis atópica, urticaria
aguda.
 Infecciones parasitarias: a nivel tisular.

 Eosinofilia pulmonar: el síndrome de Löffler por

transitorios y repetidos exudado pulmonares que
contienen eosinófilos, acompañados por tos; causados
por fármacos, agentes inhalantes, helmintos.
 Otras alteraciones: leucemia mieloide, trastornos
mieloproliferativos.

26
Recuento diferencial de Leucocitos. Interpretación

Eosinopenia
 En cualquier situación que conlleve a estrés agudo,
debido a secreción de adrenalina o glucocorticoides.
 Estados inflamatorios agudos.

27
 Recuento diferencial de Leucocitos. Interpretación

Basofilia
 Reacciones alérgicas,
leucemia mieloide
crónica, policitemia vera.

Basopenia
 Tratamientos
prolongados con
glucocorticoides,
infección aguda, estrés.

28
Recuento diferencial de Leucocitos. Interpretación

Monocitosis
 En la recuperación de
infección aguda y la
agranulocitosis,
endocarditis bacteriana, no
es frecuente en las
infecciones.

 Leucemia mielomonocítica
crónica.

29
 Recuento diferencial de Leucocitos. Interpretación

Linfocitosis
 Linfocitosis infecciosa. Asociada
con virus Coxsackie, puede
presentarse fiebre, afección
respiratoria, molestias
abdominales y diarrea.
Leucocitosis (20-50 x 109/l), 60-
95% son linfocitos.
 Tosferina. Síntomas de resfriado,
leucocitos > 30 x 109/l, linfocitosis
con linfocitos pequeños.
 Linfocitosis crónica. Linfocitosis
persistente no neoplásica,
asociada a infección viral.
30
Recuento diferencial de Leucocitos. Interpretación

Linfocitosis
 Mononucleosis infecciosa. Trastorno secundario a
infección por el EBV, se manifiesta con fiebre, dolor de
garganta y adenopatía, leucocitos entre 12 – 25 o hasta
80 x 109/l (ocasionalmente), linfocitos 60-90%, linfocitos
de estrés e inmunoblastos; Ac heterófilos (reacción con
eritrocitos de carnero).
 Infección por citomegalovirus.

 Toxoplasmosis.

 Leucemia linfocítica.

Linfocitopenia
 Niveles aumentados de adrenocorticoides, quimioterapia
o irradiación; genética; alteración linfática; casos
avanzados de linfomas; infección por HIV (↓TCD4).
31
 CONTEO DE RETICULOCITOS

 Reticulocitos: contienen residuos de RNA ribosomal que

reacciona con colorantes básicos como: azur B, azul de cresilo
brillante, nuevo azul de metileno, para formar un precipitado
azul o púrpura de gránulos o filamentos.
 El número de reticulocitos en sangre periférica refleja la
actividad eritropoyética.
 Se expresan como % células rojas o en número absoluto/l.
 Cuando hay una anemia severa el conteo de reticulocitos debe
ser corregido y se expresa como índice.
 Índice de reticulocitos = reticulocitos observados % x ( Htc
medido / Htc normal).

32
 CONTEO DE RETICULOCITOS

 Cálculo:
Número de reticulocitos en n campos = x
Promedio de número de células rojas por campo = y
Número total de células rojas en n campos = n × y
Reticulocitos % = [x ÷ (n × y ] × 100
Reticulocitos conteo absoluto: % × RBC

 Otra forma de conteo manual de reticulocitos es por

microscopía de fluorescencia, con tinción con naranja de
acridina (1 vol /1 vol de sangre).
 RNA produce un fluorescencia anaranjada-roja, el DNA
fluorescencia amarilla
 La tinción fluorescente combinada con citometría de flujo
constituye el principio para conteo automatizado.
 V.R: 25 – 75 × 109/l (0.5 – 2.5%)

33
 CONTEO AUTOMATIZADO

 Conteo celular: impedancia o por dispersión de luz.

 Impedancia: las células al pasar a través de una apertura desplaza

a un fluido conductor e incrementa la resistencia eléctrica →
cambio de potencial entre los electrodos → altura del pulso
producido indica el volumen de la célula.

34
 Dispersión de luz: suspensión de células fluyen a través de una
apertura frente a una fuente de luz → dispersión de luz proporcional al
área superficial → detección por fotodiodo → impulso eléctrico
proporcional al volumen celular.

35
 CONTEO AUTOMATIZADO

 El pH, T°, grado de ionización deben estandarizarse y permanecer

constantes, cambios en éstos alteran el campo eléctrico, tamaño,
forma y estabilidad de las células en el diluyente.

 Contadores de un solo canal (células rojas): diluyente pH 7.0 – 7.5,

miliosmolalidad 340 + 10; solución salina fisiológica (para uso i.v)
o salina-buffer fosfato; filtración a 0.22 o 0.45 μm

 Conteo total de leucocitos: agente lítico para destruir células

rojas y reducir el estroma a un residuo que no produzca
respuesta.
 Cetrimida, formaldehído en solución salina, ácido acético
glacial, NaCl y agua

36
 CONTEO AUTOMATIZADO

 Conteo diferencial: la mayoría usan citometría de flujo

incorporada al contador

 Un diferencial de tres partes asigna la células a:

 (a) granulocitos o “células grandes”;
 (b) linfocitos o “células pequeñas”
 (c) monocitos “células mononucleares” o “células medianas”

 Conteos de 5 a 7 partes clasifica: neutrófilos, eosinófilos,

basófilos, linfocitos y monocitos e incluir: células inmaduras
grandes (blastos y granulocitos inmaduros) y linfocitos atípicos
(incluyendo blastos pequeños).

 El análisis puede depender solo del volumen o de reacciones

citoquímicas (peroxidasa)

37
 CONTEO AUTOMATIZADO

 Índices de células rojas: VCM, HCM y CHCM.

 ADE: CV = 12.8 + 1.2 %
 ADH: CV = 1.82 – 2.64
 Conteo de plaquetas: entre dos umbrales 2 – 20 fl
 VPM: 6.5 – 12 fl
 Conteo por citometría de flujo con Ac para CD41 y CD61.
 VPM: varía inversamente con el conteo de plaquetas.
 Conteo de reticulocitos: reacción con colorantes y flurocromos;
colorantes usados: auramina O, anaranjado de tiazol, CD4K
530; no fluorescentes: oxazina 750, nuevo azul de metileno....

38
 CALIBRACIÓN DE CONTADORES

 Sangre normal con valores asignados para Hb, PCV, RBC,

WBC y plaquetas por métodos de referencia estandarizados.

 Calibrador estable (sangre preservada o substitutos) al que

se ha asignado valores apropiados para el instrumento por
comparación con sangre fresca normal.

 Calibrador comercial con valores asignados adecuados para

el instrumento.

39
 CALIBRACIÓN DE CONTADORES

Procedimiento para asignar valores a muestras de sangre fresca e

indirectamente a un calibrador estable.
1. 4 ml de sangre anticoagulada con K2EDTA de 3 voluntarios sanos.
2. Hb: asignar valor con método HiCN, media de dos mediciones.
3. PCV: valor asignado por método microhematocrito, media de 4
tubos.
4. RBC: por contador de apertura-impedancia; media de 2 diluciones
c/u contada dos veces.
5. VCM: calcular de PCV y RBC .
6. WCB: igual que RBC
7. Plaquetas: valor asignado con citómetro de flujo capaz de medir la
relación de plaquetas con células rojas. Si se dispone de Ac
monoclonales fluorescentes usar el método de referencia ICSH
8. Leucocitos diferencial, reticulocitos: por métodos manuales.

40
 CALIBRACIÓN DE CONTADORES

Calibrar contador directamente con las tres muestras de sangre: 2 conteos

con c/muestra  media.

“Marcas” o “señales”: indicadoras de alteración cuantitativa – fuera de los

límites especificados- o cualitativa → requiere investigación
adicional → revisión de frotis sanguíneo….

41
 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR
(VSG)

 Longitud de recorrido descendente de los eritrocitos en

un intervalo de tiempo.

Factores que la determinan.

 Plasmáticos. Los niveles elevados de fibrinógeno
aumentan la VSG, en menor medida las globulinas α2, β,
γ. Debido a ↓ del potencial zeta.
 Eritrocitarios. La anemia ↑ la VSG por ↓relación
eritrocitos/plasma que favorece el apilamiento; VSG es
inversamente proporcional al área superficial, los
microcitos sedimentan mas lento que los macrocitos;
forma de la célula, ej. esferocitos no se apilan.

42
 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR
(VSG)

Fases del proceso

1. En los 10 min iniciales hay poca sedimentación.
2. Durante 40 min la velocidad es constante.
3. La sedimentación disminuye en los 10 min finales.
 V.R. 10mm/h en hombres; 20 mm/h en mujeres.
Aumenta gradualmente con la edad.
 Interpretación. VSG ↑ notablemente en trastornos de
las proteínas plasmáticas, como el mieloma múltiple o
macroglobulinemia, hiperglobulinemias policlonales
debidas a enfermedad inflamatoria, ↑ fibrinógeno; ↑
moderado en enfermedades inflamatorias activas como
artritis reumatoide, infecciones crónicas, enfermedad
del colágeno y neoplasias.

43
 Referencias bibliográficas

 Imágenes celulares: Solís Martínez Raul Antonio

 Henry J.B. (2007). El laboratorio en el diagnóstico
clínico. Madrid. Marbán libros.
 González Hernández A. (2010). Bioquímica clínica y
patología molecular. Barcelona. Elsevier.
 Lewis S.M., Bain B.J., Bates I. (2008). Dacie y Lewis.
Hematología práctica. 10ª. Edición. Madrid. Elsevier.

44