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Aislamiento de microorganismos solubilizadores de fosfato y celulolíticos a partir

de muestras de suelos de un cultivo de Zea mays (maíz) de la finca Bella Vista-


Cesar.
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Mandon, Eliacith1´2, Flórez, Katty1, Oliveros, Carolina1, Osman, Karolain1, Baquero,
Rosmira1, Mejía, Zaira & Perpiñán, Jhonatan1

1Estudiante del programa de Microbiología de la Universidad Popular del Cesar, Facultad


ciencias de la salud.
2eleacith@hotmail.com___________________________________________________

Resumen

El suelo es un recurso indispensable para la vida que permite el desarrollo de las plantas,
los animales y el hombre. En su mayoría, los suelos tropicales y subtropicales son
deficientes en fósforo biodisponible, por lo que el empleo de bacterias promotoras del
crecimiento vegetal, principalmente las solubilizadoras de fosfato, pueden reducir el uso
de fertilizantes químicos. En los últimos años se han propuesto nuevas definiciones que
incluyen las propiedades físico-químicas y biológicas de los suelos, así como el
componente de sostenibilidad, producción sana de alimentos y mitigación de la polución
medioambiental. En este estudio se pretende, de forma general, aportar al conocimiento
de la nueva concepción de la calidad del suelo, y el objetivo principal de este estudio fue
aislar microrganismos celulíticos y solubilizadores de fosfatos. Se tomaron muestras de
la Finca Bella Vista vía a Pueblo Bello, cesar, de espécimen de maíz, para, aislamiento
de solubilizadores y celulíticos. Las muestras se inocularon en agar SRS y Celulosa-rojo
Congo respectivamente. Se pudo obtener el aislamiento de microorganismos
exitosamente, demostrando su actividad en cada uno de los medios aislados
(solubilizadores y celulíticos), obteniendo información sobre la calidad del suelo
evaluado.

Palabras claves: medio ambiental, sostenibles, polución, calidad de suelo,


solubilizadores.

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Isolation of phosphate and cellulolytic solubilizing microorganisms in soils of a
zea mays (corn) crop
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Mandon, Eliacith1,2, Flórez, Katty1, Oliveros, Carolina1, Osman, Karolain1, Baquero,
Rosmira1, & Perpiñán, Jhonatan1

1Estudiante del programa de Microbiología de la Universidad Popular del Cesar, Facultad


ciencias de la salud.
2eleacith@hotmail.com

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Abstract

The soil is an indispensable resource for life, which allows the development of plants,
animals and man. For the most part, tropical and subtropical soils are deficient in
bioavailable phosphorus, the use of plant growth promoting bacteria, mainly phosphate
solubilizers, can be used for the use of chemical fertilizers. In recent years they have
expanded. They have been applied. The physical-chemical and biological properties of
the soils have been used, as well as the component of sustainability, the healthy
production of food and the mitigation of accounting pollution. In this study, it is intended,
in general, to provide information on the new conception of soil quality, and the main
objective of this study was the cellulite microorganisms and phosphate solubilizers.
Samples were taken from the Bella Vista farm road to Pueblo Bello, Cesar, corn specimen
for the isolation of solubilizers and cellulitics. The samples were inoculated on SRS agar
and Congo cellulose-Congo red respectively. The isolation of microorganisms can be
obtained successfully, demonstrating their activity in each of the media (solubilizers and
cellulitics), obtaining information on the quality of the soil evaluated.

Key words: environmental, sustainable, pollution, soil quality,


solubilizers.

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Introducción

El fósforo (P) es Uno de los nutrientes más necesarios y, contrario a lo que se cree, más
deficitarios para los cultivos. A pesar de un relativo alto contenido de P total en la mayoría
de los suelos, el 98% de estos, tienen un inadecuado suplemento de P disponible para
la nutrición de los cultivos, condición que lleva a deficiencias en distinto grado de
severidad, con graves repercusiones en los niveles de productividad y rendimiento
(Awasthi y otros, 2011). Esta condición de deficiencia es superada normalmente con la
aplicación de fertilizantes fosfóricos de síntesis química.

El contenido de P en los suelos varía entre 200 y 5000 mg Kg-1, con un promedio de 600
mg kg-1 (Arai y Sparks, 2007; Sharpley, 2012), incluyendo formas inorgánicas (Pi) y
formas orgánicas de P (Po). En la mayoría de los suelos el Pi comprende el 50%-70%
del P total, aunque la fracción puede variar entre el 10% y el 90%, dependiendo del tipo
de suelo. En las rocas primarias y en los suelos jóvenes, el P se encuentra unido
principalmente al Ca y Mg, dando al P una solubilidad típica que se estima entre 0.01 y
0.1 mg L-1 (Sharpley, 2012), mientras, en los suelos altamente lavados como los del
trópico, el P se une principalmente al Fe y Al, formando fosfatos de Fe (Fe-P) y de
aluminio (Al-P), de solubilidad mucho más baja que la de los fosfatos de Ca (Ca-P) (Arai
y Sparks, 2007; Sharpley, 2012; Tiessen, 2008).

Desde el punto de vista nutricional, el P disponible para las plantas es el fosfato


inorgánico (Pi) presente en la solución del suelo como iones ortofosfato, provenientes de
la mineralización de materiales orgánicos y la solubilización de fuentes minerales (Gojon,
2009), cuya concentración, mencionada anteriormente, varía de manera sustancial,
temporal y espacialmente (200 - 5000 mg P kg-1) (Arai y Sparks, 2007; Sharpley, 2012;
Gojon y otros, 2009; Robinson, 2005). Debido a que las fuentes orgánicas no son
utilizadas directamente para la nutrición microbiana, éstas deben primero hidrolizarse por
la acción de enzimas fosfatasas, producidas y secretadas al suelo por los
microorganismos (Singh y Satyanarayana, 2012).

Por otro lado, la alta producción, unida al manejo inapropiado de residuos sólidos
urbanos, continúa generando serios problemas ambientales en la mayoría de países en
vía de desarrollo. Especialmente en Colombia, la generación diaria de residuos trepa a
28,800 toneladas, representadas por una fracción orgánica (65%) y una inorgánica
(35%). El polímero más común en la fracción orgánica es la celulosa (15 a 60%)
constituida por una cadena lineal de hasta 10,000 moléculas de glucosa; por lo cual el
proceso de su degradación comienza con su fraccionamiento en unidades más pequeñas
que pueden penetrar en las células microbianas y ser metabolizadas (Sylvia et al. 2005).
Las enzimas responsables de dicho proceso son las celulasas (β-1,4-endoglucanasas,
β-1,4- exoglucanasas y β-glucosidasas) producidas por bacterias, hongos, actinomicetos
y protozoarios (Khokhar et al. 2012; Gupta et al. 2012). Es por eso que el objetivo

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principal de este estudio fue aislar microrganismo celulolíticos, solubilizadores de fosfato,
esto como una alternativa de biofertilización, promotores del crecimiento vegetal y
aumentar la calidad del suelo, de igual forma evidenciar la diversidad y existencia de
estos procesos en el suelo evaluado.

Materiales y métodos

Localización de estudio

El espécimen vegetal tomado para la extracción de suelo y raíces, fué Zea mays (maíz),
se obtuvo de la finca Bella Vista vía a pueblo bello, Cesar y las muestras se procesaron
en los laboratorios académicos de la universidad Popular Del Cesar.

Microorganismos celulolíticos

El aislamiento de estos microorganismos se realizó mediante la metodología ofrecida por


la guía de laboratorios de microbiología del suelo, de la Universidad Popular Del Cesar
ajustada a este procedimiento (Valero, 2009). Inicialmente se tomaron muestras de
suelo. Este suelo se dispuso sobre una superficie limpia y desinfectada obteniendo
partículas pequeño tamaño, tratando de conservar su estructura y agregación. Con
ayuda pinzas estériles, se seleccionaron gránulos (5 aproximadamente) y fueron
traspasados sobre cajas con medio de cultivo Agar Celulosa –Rojo Congo e incubados
a 30°C hasta evidenciar colonias de hongos o bacterias en crecimiento alrededor de los
gránulos.

Microorganismos solubilizadores de fosfatos


Para la obtención de microorganismos solubilizadores de fosfatos se procedió de la
misma manera descrita anteriormente, agregando el paso del tamizado de la muestra de
suelo, con tamiz de poros con tamaño de 2mm, y a partir de este se obtuvieron partículas
del menor tamaño. Posteriormente se transfirieron los gránulos seleccionados con ayuda
de pinzas estériles, sobre caja de Petri con medio de cultivo Agar SRS y se incubaron a
30°C hasta evidenciar colonias de microorganismos en crecimiento alrededor de las
partículas.
Para precisar la actividad solubilizadora de fosfatos, se midió el diámetro de halos de
transparencia alrededor de colonias bacterianas que crecieron en el medio de cultivo sin
formas solubles de PO43-, pero con fosfato de calcio o hierro, el cual pudo ser solubilizado
por las colonias microbianas que presentaron esta capacidad.

Resultados y Discusión

Aislamiento de microorganismos solubilizadores de fosfato

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Se presentó un halo alrededor de la colonia y en el medio se evidenció un viraje a color
amarillo. La actividad solubilizadora de dicho microorganismo determinado, corresponde
a un total de 2,5 lo que conlleva a un resultado positivo para la actividad de solubilización
de fosfato. Después de unos días, se evidenció el crecimiento de colonias fúngicas
(Figura 1).

Aislamiento de microorganismos celulolíticos

Positivo para aislamiento de microorganismos celulolíticos, se evidenció crecimiento y


halos alrededor de las partículas inoculadas en el medio (Figura 2).

Los organismos involucrados en las transformaciones del P en el suelo incluyen


bacterias, hongos, chromista, protozoos y algunos nematodos (Awasthi y otros, 2011;
Oberson y Joner, 2005; Bünemann y otros, 2011; Jones y Oburger, 2011). En general,
los microorganismos del suelo dinamizan el ciclo del P a través de procesos de
mineralización, inmovilización y solubilización, los cuales están relacionados con su
metabolismo nutricional. Debido a que las fuentes orgánicas no son utilizadas
directamente para la nutrición microbiana, éstas deben primero hidrolizarse por la acción
de enzimas fosfatasas, producidas y secretadas al suelo por los microorganismos (Singh
y Satyanarayana 2012).

Las bacterias pueden tener capacidad de hacer uso de diferentes mecanismos para
solubilizar el P, la estimulación puede depender de diversos factores, entre ellos, la
procedencia de los aislamientos, las poblaciones alcanzadas, entre otros.
Paralelamente, el mecanismo de solubilización de P, puede estar influenciado por el
género, la especie o medio de cultivo en el cual se realice la evaluación (Panhwar et al.,
2012).
El principal mecanismo microbiológico por el cual los compuestos fosfatados son
solubilizados es la disminución del pH del medio extracelular hasta valores aproximados
a 2,0 que son necesarios para que se pueda llevar a cabo la solubilización (Lara et al.,
2011). Este fenómeno se origina debido a la liberación de ácidos orgánicos de bajo peso
molecular por parte de los microorganismos, cuyas propiedades quelantes favorecen la
formación de complejos insolubles con metales, con la consecuente liberación del fosfato
(Fernández et al., 2005).

La celulosa es un polisacárido muy abundante en la naturaleza que en combinación con


la hemicelulosa y la lignina constituye la fracción lignocelulósica la cual se genera en
grandes cantidades durante las actividades agrícolas (Piñeros & Rivas, 2004; Cedeño et
al., 2014). Las celulasas, como base de este estudio, desempeñan un papel importante
en el ciclo del carbono en el suelo, degradando desechos vegetales que están
compuestos en su mayoría de celulosa. Esta actividad cobra gran importancia en

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agroindustrias debido a que la degradación de este polímero se relaciona directamente
con la fertilidad y calidad del suelo (Gutiérrez et al., 2008; Cedeño et al., 2014). Los
organismos capaces de degradar la celulosa son principalmente hongos y bacterias,
ellos son reconocidos por la habilidad de producir enzimas no sólo celulasas sino también
amilasas, proteasas y peptidasas entre otras (Cedeño et al., 2014).

Hablando el pro de la agricultura, obteniendo información sobre la calidad y fertilidad del


suelo mediante el aislamiento de estos microorganismos esenciales con resultados
positivos, será en beneficio de los agricultores y el medio ambiente, principalmente para
evitar el uso excesivo de agroquímicos para su fertilidad y mayor rendimiento de los
cultivos de Maiz, así como lo menciona Núñez & Cruz (2015), encontrar y obtener cepas
de microorganismos capaces de solubilizar fosfato y celulosa eficientemente del suelo y
promover el crecimiento de las plántulas de interés agronómico, es esencial para
enfrentar los desafíos de la agricultura moderna que implica aumentar los productos
agrícolas, reducir el consumo de energía fósil y la emisión de gases de efecto
invernadero generada por el uso excesivo de fertilizantes.

Conclusión

Se concluye que se logró el objetivo principal, el cual fue aislar microorganismos con
capacidad solubilizadora de fosfatos y celulolíticas en pro del suelo y las plantas. Debido
a la importancia del suelo como recurso, pues es el sustrato para el establecimiento de
cultivos agronómicos a gran escala, preservar su calidad es una necesidad apremiante.
Dentro de las estrategias para conseguir este propósito es urgente implementar prácticas
agrícolas amigables con el medio ambiente, como programas de fertilización que
incluyan el uso de insumos biológicos o biofertilizantes. Estas enmiendas microbianas
pueden fabricarse a base de algunos microorganismos promotores de crecimiento
vegetal, como los microorganismos solubilizadores de fosfato, y celulolíticos. Dada la
importancia de estos insumos biológicos por la reducción de los costos de producción y
la disminución de la contaminación ambiental.

Anexos

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Fotografía 1. Aislamiento de microorganismos
solubilizadores de fosfato de muestras de suelo.
Colonias bacterianas.

Figura 2. Aislamiento de microorganismos


celulolíticos de muestras de suelo.

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Cuestionario

1. Consulte y elabore una síntesis de los mecanismos bioquímicos que presentan


hongos y bacterias para llevar a cabo la solubilización de fosfatos.

Algunos microrganismos solubilizan el fosfato mediante el proceso de producción de


ácidos orgánicos, fosfatasa, quelatació, reacciones de diversos intercambios que tienen
diferentes especies bacterianas, para solubilizar compuestos fosfatados inorgánicos
como el fosfato Tricalcico, fosfato dicalcico hidroxiapatita y rocas fosfóricas entre estas
se incluyen bacterias gran negativas y gran positivas incluso algunas especies de
Streptomyces.
Las principales bacterias que se ha estudiado son especies de los géneros Bacillus
Pseudomona, Azospirillum Rhizobium y Burkholdelia estas bacterias se caracterizan por
presentar producción de ácidos orgánicos que ayudan a la solubilización de los minerales
de fósforo la producción de polisacáridos y la producción de enzimas como la fosfatasa
alcalina de igual forma se ha reportado otros microorganismo solubilizadores de fosfato
como Bacillus lichenifomis B. amyloliquefaciens, B. fitrophaceus paenibacillus,
Xanthobacter aglilis, entre otros . Sobre bacterias ya existen datos que demuestran el
gran potencial de estas con respecto a la subilizadores de fosfato (Penicillum spp ,
Aspergillus Níger, Afumigatus scopulariopsis sp ) y los solubilizadores de fosfato calcio
encontramos (Trichodermas, Aspergillus) otras características importante de estos
microorganismo que además pueden producir otros metabolitos, elimina metabolitos
tóxicos para promover el crecimiento , inducir defensa o inhibir patógenos, algunos
exhiben una estrecha especificidad mientras otros pueden tener un amplio espectro de
huéspedes.

2. Consulte las fuentes de fosfato inorgánico y orgánico sobre las cuales actúan los
microorganismos solubilizadores para liberar el ión ortofosfato.

De forma orgánica, el fosforo se encuentra en la materia orgánica, que se origina por la


degradación microbiana de restos de animales y vegetales. Una gran porción de fosforo
orgánico está representada por los fosfatos de inositol y en una menor cantidad por otros
esteres de fosfato como fosfolípidos presentes en membranas biológicas.

El fosforo inorgánico se encuentra formando parte de minerales de calcio, hierro y


aluminio originados por mecanismos de precipitación y pueden liberar fosforo muy
lentamente por medio de la meteorización. También pueden encontrarse en formas de
sales en solución, sales cristalinas o sales absorbidas por los coloides del suelo. Las
plantas adquieren el fosfato a partir de la solución del suelo en forma inorgánica en

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estados solubles como fosfatos mono y dibasico, siendo necesario un PH de 6,5 para
que el ion ortofosfato en el suelo sea aprovechable por las plantas.

3. Explique el mecanismo de acción de organismos celulolíticos, para la


descomposición de la celulosa.

En estudios de organismo celulolitico nos permite contar con una fuente fácilmente
disponible en enzimas celulolitica para ser utilizadas en enzimas celulolitica para ser
utilizadas en la hidrolisis de polisacáridos lignocelulosicos, lo que contribuyen
grandemente a disimular la contaminación ambiental que estos productos tratados como
desechos provocan , es por ellos que el uso de células a la degradación de los mismos
por hongos celulolitica es una alternativa para convertir estos residuos en materias
primas y obtener provecho en materias primas y obtener beneficios de ellos la habilidad
de estos microorganismo para producir enzimas en su recursos no explotado a plenitud
para procesos de producción de los azúcares fermentables sin la necesidad de adquirir
las enzimas . El complejo celulitico costa de tres tipos enzimas que actúa de forma
sinergia en la hidrolisis de la celulosa (endoglucanasa, exoglucanasa que incluye
glucohidrolasa y celobiohidrolasa

4. Consulte algunos géneros de hongos y bacterias conocidos por su actividad


degradadora de celulosa.

Bacterias celuloliticas. Géneros hongos celulíticos


Microbispora sp. Neocallimastix sp.
Streptomyces sp. Piromonas sp.
Bacillus sp. Sphaeromonas sp.
Clostridium sp. Aspergillus sp.
Penicilium sp.

5. Consulte un método para evaluar la actividad de microorganismos celulolíticos.

Prueba cualitativa con rojo Congo.


Prueba cuantitativa por la técnica del ácido 3.5- dinitrosalicilico (DNS)

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