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ECOLOGIA MICROBIANA1
2.1 A COLUNA DE WINOGRADSKY
Para melhor compreensão da terminologia a usar neste trabalho, apresenta-se seguidamente uma
breve revisão das estratégias metabólicas dos microrganismos.
Fototrofia
Organismos fototróficos obtêm energia da luz. Se o aceitador final de electrões for a água, liberta-se
oxigénio (fotossíntese oxigénica), mas se em vez de água é utilizado outro composto reduzido (H2S,
lactato, etc.) não se liberta oxigénio (fotossíntese anoxigénica).
Quimiotrofia
Organismos quimiotróficos obtêm energia da oxidação de compostos químicos inorgânicos (litotrofia)
ou orgânicos (organotrofia). A fermentação consiste numa oxidação parcial de matéria orgânica, ao
contrário da respiração que pressupõe a sua oxidação total. Dependendo do ultime aceitador de
electrões empregado na respiração, esta pode classificar-se como aeróbia (oxigénio molecular) ou
anaeróbia (SO42-, NO3-, CO2 ou outro composto inorgânico oxidado, que será então reduzido)
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Modificado de: (1) GAMAZO, C., LÓPEZ-GOÑI, I. & DÍAZ, R. Manual práctico de microbiología. 3ª edição,
Masson, Barcelona. 2005; (2) PEPPER, I.L. & GERBA, C.P. Environmental microbiology – a laboratory manual. 2ª
edição, Elsevier Academic Press, Amsterdão, 2004.
Protocolos de Microbiologia Ambiental 2
Material e métodos
1. Colocar na coluna uma fonte de celulose (papel, erva, alface, etc.). A celulose deve
permanecer no fundo ou na zona intermédia da coluna, mas nunca na superfície, porque as
bactérias que degradam a celulose são anaeróbias.
2. Colocar na coluna um volume igual ao anterior de terra do fundo de um rio ou de um lago,
misturado com uma fonte de enxofre, por exemplo o conteúdo de um ovo.
3. Pressionar este material de forma a obter uma camada de cerca de 10 cm, fazendo com
saia todo o ar.
4. Colocar na coluna água do rio ou do lago, deixando uma camada de ar com cerca de 5 cm.
5. Tapar a coluna com uma película plástica transparente e colocar numa zona fresca mas
bem iluminada.
6. Examinar a coluna periodicamente durante várias semanas, anotando as alterações de cor
e a espessura das diferentes camadas.
7. Recolher amostras das diversas camadas com o objectivo de estudar os diferentes tipos
microbianos.
Resultados
Ao fim de seis semanas será possível visualizar, no mínimo, as seguintes camadas (comunidades) bem
diferenciadas (Figura 2.1):
Zona aeróbia superior (cor verde brilhante): rica em organismos aeróbios, normalmente flagelados,
assim como organismos fotossintéticos (cianobactérias filamentosas).
Zona aquática microaerófila iluminada (bandas verdes e avermelhadas sobre a camada sólida de
terra): contém H2S proveniente do fundo anaeróbio da coluna. Nesta camada predominam as bactérias
fotossintéticas anoxigénicas: bactérias verdes dependentes de enxofre (Chlorobium - células pequenas
com depósitos externos de enxofre) e bactérias púrpuras dependentes de enxofre (Rhodospirilum,
Rhodopseudomonas - células grandes com depósitos internos amarelos de enxofre).
Zona imediatamente acima da camada de terra (cor castanho claro): rica em H2S que difunde da zona
inferior anaeróbia, que é utilizado por organismos litotróficos (oxidantes de matéria inorgânica) como
Beggiatoa e Thiobacillus (filamentosa).
Zona anaeróbia (cor negra): colonizada por microrganismos capazes de realizar processos metabólicos
anaeróbios, tais como a fermentação e a respiração anaeróbia. Alguns géneros como Clostridium
degradam em anaerobiose a celulose, que pode ser fermentada em etanol, ácido acético ou ácido
láctico. Por sua vez estes produtos são respirados por bactérias como Desulfovibrio. Como consequência
da respiração anaeróbia produzem-se alguns compostos inorgânicos reduzidos característicos destes
ambientes (H2S, CH4) que surgem como bolhas de gás.
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Protocolos de Microbiologia Ambiental 2
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Protocolos de Microbiologia Ambiental 2
Questões
Material e métodos
Preparação
Observação
5. Usando um conta-gotas cobrir a superfície com corante de fenol e rosa de Bengal durante
5-10 minutos sem deixar que a lâmina seque
6. Lavar gentilmente a lâmina com água corrente ou com um esguicho de água, secar e
examinar ao microscópio usando a objectiva de 100× com óleo de imersão
Questões
1. Descreva o tamanho e a forma das células bacterianas, dos filamentos e dos esporos de
fungos e de actinomicetes.
2. Anote se há evidências da formação de colónias e qual a relação dos microrganismos uns
com os outros e com as partículas de solo.
3. Como é que distingue os fungos dos actinomicetes?
4. Como é que os microrganismos se orientam uns em relação aos outros e em relação às
partículas de solo?
5. Haverá competição entre microrganismos pelo espaço?
6. Qual lhe parece ter sido o factor limitante para o crescimento e para a actividade dos
microrganismos no solo?
2.3 FIXAÇÃO DE AZOTO POR MICRORGANISMOS SIMBIONTES: OBSERVAÇÃO DE BACTEROIDES DE RHIZOBIUM SPP.
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Uma vez formados, os bacteróides já não podem voltar a transformar-se em bactérias normais e não
têm capacidade de reprodução - o processo é irreversível. Desta forma para isolar uma estirpe de
Rhizobium a partir de um nódulo, é necessário ter bactérias ainda não transformadas em bacteróides.
Além dos microrganismos capazes de fixar azoto em simbiose com plantas, existem outros capazes de
realizar fixação não simbiótica de azoto molecular. As bactérias a que se atribui esta faculdade
compreendem espécies que se podem agrupar do seguinte modo:
1) Fotossintéticas:
a. Anaeróbias: e.g. Chromatium vinosum
b. Aeróbias: e.g. Anabaena cylindrica
2) Não fotossintéticas:
a. Anaeróbias: e.g. Clostridium pasteurianum
b. Aeróbias: ex. Azotobacter vinelandii
As azotobacteráceas são aeróbias obrigatórias que habitam o solo, a água ou a superfície das folhas e
podem ser bacilos e cocos Gram negativos. Recorre-se a frascos escuros para evitar a utilização dos
meios de cultura por bactérias (fixadoras de azoto) fotossintéticas. Para evitar a multiplicação de
bactérias (fixadoras de azoto) anaeróbias incubam-se as culturas em aerobiose.
Material e métodos
Objectivos (1) Verificação da letalidade da radiação UV; (2) Cálculo da percentagem de morte ao
fim de um dado tempo de exposição.
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Protocolos de Microbiologia Ambiental 2
classes: a natural e a artificial. A fonte mais importante de radiações ultravioleta é o sol. As fontes
artificiais compreendem uma variedade de arcos e lâmpadas incandescentes.
A dose de radiação ultravioleta é medida em microwatt segundos por centímetro quadrado (μWs/cm2).
Quanto maior for o microwatt e/ou o tempo de exposição maior será a dosagem utilizada. A radiação
ultravioleta é letal para a maior parte dos microrganismos (Tabela 2.1).
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Material e métodos
Preparação (consultar também a Tabela 2.2) Não esquecer de marcar os tubos com o tempo de
exposição e com a diluição
1. Retirar 1 mL de uma suspensão diluída de uma bactéria ou de uma levedura, fazer diluições
decimais sucessivas (10-1, 10-2, 10-3 e 10-4) e inocular por espalhamento à superfície 0.1 mL
das diluições 10-2, 10-3 e 10-4, fazendo 2 repetições
2. Colocar 10 mL de mesma suspensão numa caixa de Petri e expor à radiação UV durante 1
minuto
3. Retirar 1 mL, fazer 4 diluições decimais sucessivas (10-1, 10-2, 10-3 e 10-4) e inocular por
espalhamento à superfície 0.1 mL das diluições 10-2, 10-3 e 10-4, fazendo 2 repetições
4. Expor novamente a caixa de Petri à radiação UV durante mais 1 minuto (total=2 minutos)
5. Retirar 1 mL, fazer 3 diluições decimais sucessivas (10-1, 10-2 e 10-3) e inocular por
espalhamento à superfície 0.1 mL das diluições 10-1, 10-2 e 10-3, fazendo 2 repetições
6. Expor novamente a caixa de Petri à radiação UV durante mais 1 minuto (total=3 minutos)
7. Retirar 1 mL, fazer 2 diluições decimais sucessivas (10-1 e 10-2) e inocular por espalhamento
à superfície (2 repetições) 0.1 mL das diluições 10-2 e 10-1
8. Expor novamente a caixa de Petri à radiação UV durante mais 1 minuto (total=4 minutos)
9. Retirar 1 mL, fazer 1 diluição decimal sucessiva (10-1)
10. Inocular por espalhamento à superfície (2 repetições) 0.1 mL das diluições 10-2 e 10-1
11. Expor novamente a caixa de Petri à radiação UV durante mais 1 minuto (total=5 minutos)
12. Inocular por espalhamento à superfície (2 repetições) 0.1 mL da suspensão não diluída
13. Identificar as caixas de Petri com o número do grupo, repetição, tempo de exposição e
diluição inoculada
14. Inverter e incubar a 25ºC durante 24-48 horas
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Tabela 2.2 Diluições decimais a inocular em função do tempo de exposição à radiação UV.
Contagens e cálculos
1. Contar as UFC nas caixas de Petri que apresentem um número contável (30-300 colónias).
2. Fazer uma média das 2 repetições e calcular o número de células/mL da diluição
3. Calcular o nº de células na suspensão original (sem diluições)
4. Calcular a % de morte de acordo com a seguinte fórmula:
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