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La Sra. Viviana Chevaga, secretaria del área, los orientará administrativamente en el horario
de 13.30 a 19.30 en forma telefónica (4524-8450) o por mail a inmuno@fvet.uba.ar.
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Docentes del curso 2010
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INDICE
Sistema de evaluación 4
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Citotoxicidad 111-115
Técnicas para la detección de anticuerpos maternales 116-121
Inmunoelectroforesis 119
Pautas para la elaboración y presentación de los informes de laboratorio 122
Soluciones de uso corriente 123-125
Ejercicos y problemas de aplicación 126-141
SISTEMA DE EVALUACIÓN
Los alumnos serán evaluados a través de:
a) El desempeño en los trabajos prácticos.
b) La aprobación de los informes de laboratorio.
c) Dos parciales obligatorios.
BIBLIOGRAFÍA FUNDAMENTAL
BIBLIOGRAFÍA AMPLIATORIA
DAY M.J. “Clinical Immunology of the Dog and Cat”. Iowa State University Press. 1999.
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JANEWAY, C. A. “Inmunobiología: El sistema Inmunitario en condiciones de salud y
enfermedad”, 2da Edic. 2003. Editorial Masson. (www.ncbi.nlm.nih.gov/Bookshelf)
REGUEIRO GONZALEZ J.R. “Inmunología: Biología y Patología del Sistema Inmune”. 3ra.
Edic. 2002. Editorial Médica Panamericana.
Unidad 2: Inmunoquímica
ANTÍGENOS
Antigenicidad e Inmunogenicidad.
Estructura físico-química de los antígenos. Haptenos. Carriers. Concepto y tipos de
determinantes antigénicos.
Tipos de Antígenos: propios (de órgano; de grupos sanguíneos; de género H-Y) y extraños (de
patógenos, de tumores, de transplantes).
ANTICUERPOS
Inmunoglobulinas (Igs) de membrana y secretadas.
Estructura físico-química: cadenas pesadas y livianas, dominios constantes y variables. Clases
y subclases.
Características de las Igs en las diferentes especies domésticas y de producción: IgT en
equinos, IgY en aves e Igs en camélidos.
La Ig como antígeno: isotipo, alotipo e idiotipo.
Funciones biológicas de las diferentes clases de Igs. Distribución en el organismo.
RESULTADO DE LA UNION DEL ANTICUERPO CON EL AG.
Neutralización. Opsonización. Activación del Complemento. Citotoxicidad celular dependiente
de anticuerpos (ADCC).
PASAJE DE IGS MATERNO FETAL.
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Incidencia de los diferentes tipos de placentación en el pasaje de Igs. de la madre al feto en las
especies domésticas. Composición en Igs. del calostro y leche. Importancia de la ingestión de
calostro.
Técnicas de determinación de la ingestión de calostro.
COLABORACIÓN CELULAR
Activación de los LT, Interleuquinas. Influencia del antígeno y el microambiente en la
cooperación celular: Perfiles Th 1 y Th 2.
Colaboración T-B: Activación de LB y producción de Igs: Switch isotípico. Antígenos timo-
dependientes y timo-independientes.
Colaboración T-T: Citotoxicidad ejercida por LT citotóxicos.
Colaboración T-Macrófagos: Macrófagos activados.
Memoria inmune.
REGULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE
Regulación intrínseca: Efecto de la desaparición del Ag., Niveles de Igs: retroalimentación.
Regulación por linfocitos T (Th 3).
Regulación extrínseca: neuroinmunoendocrinología.
Regulación en sitios privilegiados: ojo, placenta, sistema nervioso central.
CINÉTICA DE LA RESPUESTA INMUNE
Respuesta inmune sistémica.
Respuesta inmune en mucosas: características diferenciales en las especies domésticas.
HIPERSENSIBILIDAD TIPO I
Alergia. Shock anafiláctico: Órgano de choque en las diferentes especies.
HIPERSENSIBILIDAD TIPO II
Daños por anticuerpos en enfermedades autoinmunes y en reacciones alogeneicas. Anemia
hemolítica en equinos y cerdos.
HIPERSENSIBILIDAD TIPO III
Daños por complejos inmunes en enfermedades autoinmunes y en enfermedades infecciosas
crónicas. Piómetra en caninos.
HIPERSENSIBILIDAD TIPO IV
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Bases celulares de la hipersensibilidad retardada. Granuloma tuberculoso. Dermatitis por
pulgas en caninos.
HIPERSENSIBILIDAD TIPO V
Anticuerpos anti-receptores.
FENÓMENOS DE AUTOINMUNIDAD
Concepto. Ejemplos de enfermedades autoinmunes específicas de órgano y sistémicas.
INMUNODEFICIENCIAS
Inmunodeficiencias primarias y secundarias. Virus inmunosupresores que afectan las diferentes
especies.
TRANSPLANTES
Mecanismos de rechazo del injerto.
RESPUESTA INMUNE A TUMORES
Unidad 7: Inmunoprofilaxis
INMUNOPROFILAXIS PASIVA
Ventajas e inconvenientes de su uso.
ELABORACIÓN DE SUEROS HIPERINMUNES
Uso de aves en la elaboración de sueros hiperinmunes.
Producción de anticuerpos por biotecnología.
INMUNOPROFILAXIS ACTIVA
Tipos de vacunas. Ventajas e inconvenientes de su uso:
Vacunas atenuadas.
Vacunas inactivadas.
Vacunas a subunidades. Vacunas a péptidos.
Vacunas recombinantes (a vectores).
Vacunas deleteadas.
Vacunas a DNA desnudo.
METODOLOGÍA DE PREPARACIÓN DE VACUNAS
Proceso de producción de inmunógenos a escala industrial.
Requisitos de bioseguridad.
Controles durante las diferentes etapas de producción.
Métodos de inactivación.
Métodos de atenuación.
Uso de adyuvantes.
Aprobación de vacunas por organismos oficiales. Controles de inocuidad, esterilidad y
potencia.
ADMINISTRACIÓN DE VACUNAS
Vías de inmunización.
Esquemas de vacunación en las diferentes especies animales.
Vacunas mixtas.
Fracasos de la vacunación.
Reacciones adversa a la vacunación.
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Unidad 8: Técnicas Inmunológicas de Diagnóstico
Grupo 2. Aquéllos que pueden causar una enfermedad en el hombre y pueden suponer un
peligro para las personas expuestas, siendo poco probable que se propaguen a la población.
Generalmente existe profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos:
Actinomyces sp, Bacteroides sp, Enterobacterias, Salmonella sp, Shigella sp, Candida sp,
Cryptococcus neoformans.
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Grupo 4. Agentes que, causan enfermedades graves en el hombre, y suponen un serio peligro
para otras personas expuestas, con muchas probabilidades de que se propague a la población.
Generalmente no se cuenta con profilaxis o tratamiento eficaz contra estos agentes. Ejemplos:
Virus de Lassa, Machupo y Ebola.
Niveles de contención
El primer principio de Bioseguridad es la contención.
El término "contención" se emplea para describir los métodos que hacen seguro el manejo de
materiales infecciosos en el laboratorio. El propósito de la contención es reducir al mínimo la
exposición del personal de los laboratorios, de otras personas y del entorno, a agentes
potencialmente peligrosos.
Se suelen describir cuatro niveles de contención o de seguridad biológica, que consisten en
la combinación, en menor o mayor grado, de tres elementos de seguridad biológica: la técnica
microbiológica, el equipo de seguridad y el diseño de la instalación. Cada combinación está
específicamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vías de transmisión de los
agentes infecciosos y la función o actividad del laboratorio.
a) Nivel de contención 1:
Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biológicos del grupo 1.
Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prácticas de universidades o centros
docentes donde se emplean cepas no patógenas (E. coli K12, B. Subtilis, Naegleria sp,
Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos típicos son todos los microorganismos que se
utilizan en la industria de la alimentación para la elaboración de quesos, cerveza, embutidos,
etc.
b) Nivel de contención 2:
Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia
flora habitual del hombre, son capaces de originar patologías infecciosas humanas de
gravedad moderada o limitada.
Deben ser manipulados por personal especializado (técnicos de laboratorio, especialistas en
Microbiología) y son los que con más frecuencia se estudian en el Laboratorio de Diagnóstico
Veterinario (Ascaris sp, Estafilococos, Salmonella, Toxoplasma, Clostridium sp, etc.).
c) Nivel de contención 3:
Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biológicos del grupo 3, microorganismos
que cursan con patologías graves, de difícil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas
y son capaces de producir la muerte. El mayor y más frecuente peligro que entrañan éstos es la
infección adquirida a través de aerosoles y fluidos biológicos. Por ello, las principales medidas
a tomar en este caso son la correcta manipulación y la utilización de cabinas de seguridad.
En los Laboratorios de Diagnóstico Veterinario debe evitarse la contaminación ambiental y la
infección del operador con patógenos como M. tuberculosis, Brucella sp, Virus de la
encefalomielitis equina, etc. Estos microorganismos sólo pueden ser procesados por personal
calificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el Nivel de Contención 3, es
decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculación de aire, con gradiente de presión,
cabinas de seguridad, etc.
d) Nivel de contención 4:
Es el nivel requerido cuando se trabaja con un agente patógeno exótico o no, que
produce una enfermedad infectocontagiosa, de alta mortalidad y para la cual no existe
tratamiento o el tratamiento existente es poco fiable. Normalmente son microorganismos de
dosis infectiva baja y alta contagiosidad.
Agentes del grupo 4 ó animales de experimentación infectados con ellos: Ejemplos de este
nivel son los arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virus
Ebola, etc. Además, deben incluirse en este nivel de contención los microorganismos propios
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del grupo 3 que adquieran propiedades patógenas que los eleven al grupo 4. Un ejemplo sería
Mycobacterium bovis multirresistente que puede causar fallecimiento por fracaso terapéutico.
Residuos patogénicos:
“Son considerados residuos patogénicos todos aquellos desechos o elementos
materiales en estado sólido, semisólido, líquido o gaseoso que presumiblemente presenten o
puedan presentar características de infecciosidad, toxicidad o actividad biológica que puedan
afectar directa o indirectamente a los seres vivos o causar contaminación del suelo, del agua o
de la atmósfera, que sean generados en la atención de la salud humana o animal por el
diagnóstico, tratamiento, inmunización o provisión de servicios, así como también en la
investigación o producción comercial de elementos biológicos o tóxicos”. (Ley 154 de la Ciudad
Autónoma de Buenos Aires, 18 de febrero de 1999).
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Restos orgánicos provenientes del quirófano, de servicios de hemodiálisis, hemoterapia,
anatomía patológica, morgue.
Restos, carcasas y excrementos de animales de experimentación biomédica.
Algodones, gasas, vendas, jeringas, objetos cortantes o punzantes, materiales descartables
y otros elementos que hayan estado en contacto con agentes patogénicos y que no se
esterilicen (Nivel de bioseguridad 3).
Todos los residuos, cualesquiera sean sus características, que se generen en áreas de alto
riesgo infectocontagioso (Niveles de bioseguridad 3 y 4).
Restos de animales provenientes de clínicas veterinarias, centros de investigación y
académicos.
Frascos de medicamentos y vacunas vacíos.
Los residuos patogénicos deben tratarse de manera especial hasta su destino final. Esta
actividad está reglamentada en la ley Nº 154 de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Todos
los residuos patogénicos deben colocarse en bolsas rojas de más de 120 micrones de espesor.
Estas bolsas se colocan en cajas de cartón o en recipientes plásticos debidamente sellados e
identificados. El tratamiento de estos residuos es llevado a cabo por empresas especializadas
que cuentan con la infraestructura necesaria para esterilizarlos sin riesgo de eliminar
patógenos al medio ambiente. En general los residuos patológicos son incinerados en hornos a
temperaturas mayores a los 1200ºC que dejan como residuo vapor de agua y cenizas inocuas
(hornos pirolíticos).
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Toma de muestras para la evaluación del Sistema Inmune
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Toma de muestras de sangre:
La toma de muestras de sangre es una de las prácticas más habituales en la clínica
diaria. Se realiza en razón de múltiples objetivos, entre los cuales tenemos desde una prueba
bioquímica hasta un examen de funcionalidad celular. De acuerdo con estos objetivos, varía la
manipulación y preparación de las muestras. Es por ello que es importante conocer algunos
conceptos básicos para que la maniobra realizada resulte en datos que nos puedan servir de
base para formular un diagnóstico exacto.
Extendidos de Sangre:
Los extendidos de sangre conviene hacerlos inmediatamente después de extraída la
muestra, junto al animal. Para esto se utilizan las últimas gotas de sangre que quedan en la
aguja. Preparados correctamente, estos extendidos son estables aún si no están fijados.
Pueden teñirse hasta varios días después si se conservan secos y protegidos de la humedad.
Envueltos en papeles limpios y colocados en un recipiente hermético, pueden remitirse por
correo. El método de fijación puede variar según la tinción, pero en general se pueden fijar con
calor o con distintos alcoholes. Los extendidos fijados son de estabilidad casi indefinida.
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Extracción de Suero:
Para extraer el suero de la sangre total obtenida, se la deja coagular. Una vez formado
el coágulo, se lo desprende del vidrio con la ayuda de una aguja o varilla. Para obtener la
mayor cantidad posible de suero, se coloca el tubo en una estufa a 37oC durante 30 minutos a
1 hora y luego, para obtener la mayor retracción del coágulo, se lo deja en heladera (4 oC)
durante una noche. A partir de aquí, se puede centrifugar el tubo (a 3000 r.p.m. durante 30
minutos) o extraer directamente el suero (sobrenadante) con una pipeta. En ambos casos debe
operarse cuidadosamente tratando de evitar tocar el coágulo para no producir hemólisis.
El suero puede mantenerse a 4oC durante 48-72 horas. Si hay riesgo de contaminación,
conviene agregarle una pizca de azida sódica (este conservante puede ser tóxico por lo que es
conveniente consultar al profesional del laboratorio antes de hacerlo). Si no se va a usar dentro
de ese lapso, el suero debe congelarse a temperaturas inferiores a -20oC (lo óptimo es a -
70oC). Si bien a estas temperaturas prácticamente no hay degradación proteica, sí la hay
durante cada ciclo de congelación – descongelación.
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Ej. : PROTOCOLO DE ENVÍO DE MUESTRAS
AREA INMUNOLOGÍA
SERVICIO DE DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO
N° DE PROTOCOLO
Fecha de recepción: / /
Examen solicitado:............................................................................................................
Muestra remitida:...............................................................................................................
Observaciones de la muestra:...........................................................................................
Especie: C F
Raza:.................................................................................................................................
Edad:.................................................................................................................................
Sexo: M H
Apellido y Nombre:............................................................................................................
Teléfono:............................................................................................................................
Apellido y Nombre:............................................................................................................
Teléfono:............................................................................................................................
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Técnicas de evaluación de inmunidad innata
Fagocitosis
Los mecanismos que tienen las células para incorporar en su interior fluidos, solutos y
partículas desde el medio externo son: pinocitosis, endocitosis mediada por receptores
específicos y fagocitosis. Mediante el proceso de pinocitosis ingresan a las células fluidos y
solutos. Por medio de la endocitosis mediada por receptores específicos, entran a la célula
macromoléculas, virus y otras partículas de pequeño tamaño. Ambos mecanismos son
independientes de la polimerización de la actina. En cambio, la fagocitosis, que es la ingestión
de partículas de mayor tamaño, ocurre por mecanismos dependientes de la actina. Las células
más eficientes para fagocitar partículas son los monocitos, macrófagos y neutrófilos a los que
se los denomina fagocitos profesionales.
La fagocitosis fue descripta por Metchnikoff en 1882 y es uno de los mecanismos
asociados al sistema inmune que aparece más tempranamente en la escala filogenética. Se
conoce como fagocitosis al proceso por el cual una partícula es ingerida por una célula. Las
partículas pueden ser bacterias, parásitos, células muertas y partículas inertes como el carbón,
etc. La partícula puede ser degradada o no luego de la fagocitosis dependiendo de la
naturaleza de la misma.
No todos los microorganismos son fagocitados; muchos de ellos tratan de evadir el
reconocimiento que es la primera etapa de la fagocitosis. Simultáneamente con esta evasión, el
sistema inmune de los vertebrados ha evolucionado para contrarrestarlo. Se conocen factores
séricos denominados opsoninas que favorecen el reconocimiento e ingestión de
microorganismos.
Las principales opsoninas son los anticuerpos (IgG e IgM), los factores del complemento
(C3b, C3bi, etc.) y las proteínas de fase aguda. Entre las proteínas de fase aguda se
encuentran la proteína C reactiva, las proteínas de unión al lipopolisacárido (LBP) y proteínas
de alto peso molecular llamadas fibronectinas. El LBP se une al LPS bacteriano y aumenta la
unión de éstos a la molécula de CD14 presente en la membrana de las células fagocíticas. La
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fibronectina puede unirse a algunas bacterias como el Staphylococcus aureus y actuar como
puente entre la bacteria y el polimorfonuclear (PMN).
El reconocimiento del microorganismo está mediado por diferentes receptores de
membrana del fagocito pertenecientes a los PRRs o aquellos que reconocen a las opsoninas.
Estos receptores pueden estar involucrados tanto en la adherencia como en la activación del
proceso de fagocitosis. Algunos de ellos son, por ejemplo, el receptor para el fragmento
cristalizable constante de la inmunoglobulina G (FcR), el receptor para la proteína C3b del
complemento (CR1)), o para la proteína C3 (CR3 o CD11b/CD18), y los receptores de
patrones (PRRs) como el receptor de manosa, y el receptor scavenger o carroñero.
Se ha observado que la cantidad de anticuerpos IgG necesarios para inducir la ingestión de un
microorganismo se reduce alrededor de 100 veces si éste además está recubierto por C3b.
Estos receptores actúan cooperativamente para estimular vías de señalización, no sólo para
iniciar la polimerización de la actina sino también para activar la NADPH-oxidasa para la
producción de O2. Este último es uno de los mecanismos citotóxicos que entran en juego luego
de la fagocitosis.
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Los eventos tempranos de activación están interrelacionados y son fundamentalmente cuatro:
1- fosforilación en tirosina de proteínas de membrana y citoplasmáticas
2- hidrólisis del fosfolípido inositol de membrana
3- incremento del Ca2+ citoplasmático
4- incremento de la actividad de la proteinquinasa C (PKC)
Mecanismo de fagocitosis
La interacción receptor-ligando entre el fagocito y la partícula a ingerir activa la
maquinaria de la fase de ingestión para lo cual es necesario la modificación de las proteínas
involucradas en el remodelamiento de la membrana y el citoesqueleto: actina, miosina y
proteínas de unión a la actina. Los microfilamentos de actina en la porción de citoplasma que
subyace al sitio de unión comienzan a polimerizarse. Esta polimerización lleva a que la
membrana envuelva la partícula, formándose seudópodos (extensiones de la membrana en
forma de dedos). Estos rodean a la partícula y finalmente se fusionan formando la vesícula
fagocítica o fagosoma primario. Mientras esto ocurre, los gránulos citoplasmáticos se funden
con la membrana del fagosoma y se produce un fagolisosoma. En el interior del fagolisosoma,
la partícula ingerida queda expuesta a sistemas microbicidas que pueden clasificarse como
oxígeno independientes y oxígeno dependientes.
Moléculas efectoras independientes del oxígeno
Estas sustancias están localizadas en los lisosomas o gránulos citoplasmáticos, se
liberan dentro de los fagolisosomas y no requieren la producción de oxidantes para ser activas.
Pueden actuar tanto intra como extracelularmente en el caso de que la partícula sea muy
grande para ser ingerida generando lesión en el tejido subyacente y efecto conocido como
fagocitosis frustrada. Estos agentes incluyen proteasas y enzimas hidrolíticas como
fosfolipasas, glicosidasas y lisozima; la fagocitina y las leucinas que actúan sobre las
membranas bacterianas; la lactoferrina fija el hierro privando a las bacterias de este elemento
indispensable para su crecimiento y la lisozima, que cliva los mucopéptidos de la pared celular
bacteriana.
Moléculas efectoras dependientes del oxígeno
Durante el proceso de fagocitosis las células pueden incrementar en 50 veces la
cantidad de oxígeno consumido y metabolizar grandes cantidades de glucosa. Debido al gran
consumo de oxígeno, este fenómeno se denomina estallido respiratorio. El consumo de
oxígeno es utilizado para la producción de metabolitos tóxicos como anión superóxido, peróxido
de hidrógeno, radicales hidroxilo, oxígeno singulete, hipocloritos y cloraminas.
Se ha confirmado experimentalmente la relación entre la citoxicidad de los macrófagos y la
producción aumentada de los reactivos del nitrógeno e intermediarios del oxígeno. En los
sobrenadantes de cultivo de macrófagos activados por citoquinas se encuentran niveles
elevados de nitritos inorgánicos (NO2-) y de anión superóxido (O2-), ambos asociados con la
actividad antimicrobiana. Las vías oxidativas productoras de estos dos metabolitos son
diferentes y no comparten precursores comunes.
El siguiente esquema muestra las vías de producción de moléculas efectoras,
señalando algunos de los estímulos necesarios para su activación, a saber: interferón gamma
(IFN), lipopolisacárido de E. coli (LPS) y forbomiristil acetato (PMA).
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L-arginina oxígeno
Otros reactivos
nitrito intermediarios y peróxido de hidrógeno
(NO2-) moléculas efectoras (H2O2)
Existen mecanismos para incrementar la capacidad microbicida del H2O2, Uno de ellos
es la acción de la mieloperoxidasa (MPO), que cataliza la oxidación y halogenación de
diferentes estructuras presentes en los microorganismos.
El óxido nítrico (NO) posee una vida media de pocos segundos, interactúa con una serie
de moléculas dando como resultado citotoxicidad. En presencia de oxígeno y agua, el NO
genera otros reactivos intermedios del nitrógeno y por último se descompone para formar NO 2-
y NO3-.
Los niveles de formación de los reactivos del oxígeno y producción de NO están
relacionados con el grado de susceptibilidad a las infecciones. A modo de ejemplo, podemos
citar la Enfermedad Granulomatosa Crónica que se presenta en individuos genéticamente
deficientes en la enzima NADPH oxidasa.
a) Quimiotaxis:
La quimiotaxis es el movimiento de los PMN a través de un gradiente de concentración de
sustancias (como la formil-metionina) que producen migración dirigida. Los factores
quimiotácticos provienen principalmente de componentes bacterianos, de la degranulación de
los mastocitos durante el proceso inflamatorio y de la activación del complemento (el C5a está
considerado como uno de los más potentes factores quimiotácticos).
b) Quimiotaxis y adherencia
Técnica de migración y adherencia a través de una membrana: para ello se utiliza la
cámara de Boyden, que posee una membrana microporosa con poros de 3 micrones de
diámetro. Se colocan las células en un compartimento y los factores quimiotácticos en otro y se
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lleva a incubar. La capacidad de las células para migrar hacia el estímulo se evalúa tiñendo las
que quedan retenidas en la membrana. Los resultados se comparan con los obtenidos con
células del mismo animal (sin estímulo) y con PMN de un individuo normal utilizado como
control de valor de animal sano.
b) Activación:
La activación de las células fagocíticas se señaliza a través de eventos de fosforilación y
desfosforilación de las proteínas celulares involucradas en la trasmisión de la señal de
activación. La posibilidad de identificar proteínas fosforiladas con el uso de anticuerpos
monoclonales que detectan, por ej., tirosinas fosforiladas, permite identificar el primer paso de
activación de las células fagocíticas. Para esta evaluación es necesario recurrir a las técnicas
de PAGE e Inmunoblot a partir de las células activadas (ver capítulos correspondientes en la
presente guía).
La identificación de la migración de proteínas del citoplasma al núcleo celular para regular la
trascripción de moléculas relacionadas con la inflamación y fagocitosis constituye también una
manera de identificar los primeros eventos de activación celular. Como ejemplos de estos
sistemas podemos incluir la activación del factor NF-kB que involucra la degradación del factor
inhibidor de kB citoplasmático (proteína IkB) y el incremento de sus componentes p50 y p65 en
el núcleo celular. Esta modificación en los componentes proteicos celulares también se estudia
utilizando anticuerpos marcados y mediante el uso de técnicas de SDS-PAGE e inmunoblot.
c) Ingestión:
La etapa de ingestión se puede evaluar utilizando como partícula a ingerir diferentes
microorganismos. La utilización de levaduras como por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae,
se fundamenta en el tamaño de las partículas (fácil de ver en el microscopio óptico) y la
estructura de manosas que poseen estos microorganismos que son fácilmente detectados por
los PRRs. La capacidad de ingestión de las células provenientes del individuo a evaluar se
determina realizando una cuantificación del número de levaduras ingeridas en un determinado
tiempo de incubación.
El recuento de las partículas o microorganismos ingeridos puede ser realizado mediante
diversas metodologías:
- Tinción de las células con las coloraciones de Wright o Giemsa; de esta manera se
diferencian las células que han ingerido de las que no. Se deben contar por lo menos 200
células y determinar cuentas partículas por citoplasma celular es considerado como ingestión
positiva. Los métodos microscópicos requieren una laboriosa observación para determinar la
asociación de los microorganismos a las células y discriminar si estos microorganismos fueron
ingeridos o no.
-Marcación de las partículas a ingerir con fluoresceína; se utiliza la marcación de la partícula
con isotiocianato de fluoresceína u otro colorante fluorescente previo a la incubación con las
células, luego se elimina por lavado las partículas no ingeridas y se detectan las células que
ingirieron por microscopia de fluorescencia o citometría de flujo (ver capítulo correspondiente
en la presente guía). La utilización de la coloración combinada diferencial con bromuro de etidio
permite identificar las bacterias extracelulares (fluorescen en color rojo-naranja) de aquéllas
internalizadas (permanecen de color verde correspondiente a la fluoresceína).
-Marcación de componentes bacterianos como proteínas, DNA y/o RNA con sustancias
radiactivas. Las bacterias se marcan durante su fase de crecimiento con aminoácidos o
nucleótidos marcados con 14C, 35S amino 3H nucleótidos: tritio y luego del experimento de
ingestión en el que se incuban las células y las bacterias durante un periodo de tiempo
generalmente entre 30 a 60 minutos a 37ºC se lavan las células para eliminar las bacterias no
ingeridas y se utiliza un detector de radioactividad como un contador de centelleo líquido o
sólido para cuantificar la radiactividad retenida por el sedimento celular. Esta actividad se
relaciona con el número de partículas radiactivas ingeridas y por lo tanto con la capacidad de
ingestión de las células fagocíticas del individuo evaluado.
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d) Digestión:
NBT (color amarillo y soluble) + O2- ----------› Formazán (color azul e insoluble) + O2
Para esta prueba se pueden utilizar PMN provenientes de sangre entera aislados del
individuo, estimulados con levaduras o forbolmiristilacetato (PMA) Luego de una incubación de
30 minutos a 37C, la formación del formazán puede ser evaluada cuali o cuantitativamente.
Los cristales pueden identificarse intracelularmente por microscopía y realizar un recuento del
número de células que sufrieron estallido respiratorio, o bien los cristales pueden ser
solubilizados utilizando N,N dimetilformamida y realizar la cuantificación por espectrofotometría
obteniendo los datos en densidad óptica.
Quimioluminiscencia
El estallido respiratorio en los PMN normales está asociado con la generación de
energía luminosa conocida como quimioluminiscencia, la cual es dependiente de la producción
del oxígeno singulete (1O2). Este oxígeno se produce cuando uno de los electrones
desapareados de oxígeno es elevado a una órbita superior con la inversión del spin. La luz se
emite cuando el electrón retorna a su nivel inicial y se mide como quimioluminiscencia. El
oxígeno singulete es producido por la reacción entre H2O2 y el hipoclorito:
La luz emitida se mide por la detección fluorométrica apropiada. La sensibilidad del ensayo se
incrementa por el uso de hidracina cíclica, 5-amino-2,3-dihidro-1,4-phthalazinedione (luminol)
que actúan como substrato para el 1O2. La luminiscencia se mide en un contador de centelleo
usando el canal del 3H.
Producción del NO
Los niveles de producción de NO en los cultivos de macrófagos estimulados con
bacterias o productos bacterianos nos permiten evaluar el grado de activación de estas células.
La vida media del NO es de segundos, por esto, la evaluación de su producción se realiza
mediante la cuantificación de nitritos en el medio de cultivo.
La síntesis de nitritos comienza 4 a 6 horas luego del tratamiento con IFN y LPS en un cultivo
de macrófagos y es lineal por 72 horas. La identificación de este metabolito en los
sobrenadantes de cultivo se realiza mediante la utilización del reactivo de Greiss (sulfanilamida
y naftiletilendiamina) que se colorea cuando reacciona con nitritos y nos permite relacionar la
coloración con los niveles producidos en un cultivo. El cambio de color se evalúa por
espectrofotometría a 550 nm. Se realiza una curva patrón utilizando diferentes concentraciones
conocidas de NaNO2 y reactivo de Greiss. De esta curva se obtiene la relación que permite
estimar la producción de NO in vitro.
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Los análogos de la L-arginina,como la NG-monomethyl-L-arginina (L-NMA), poseen acción
inhibitoria de la producción de nitritos a partir del NO por la vía de la iNOS por un fenómeno
competitivo. La utilización de estas moléculas permite confirmar que el aumento de producción
de nitritos en un cultivo está dado por este mecanismo.
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Bibliografía
1. Wyllie J. Currents Protocols in Immunology.1994.
2. Margni R.A. Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos. Editorial Médica Panamericana
S A 1996.
3. Baehner RL, Nathan DG. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous
disease. N.Engl. J. Méd. 278: 971-976. 1968.
4. Abramson JS, Wheeler JG. The Neutrophil. Oxford University Press. 1992.
5. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocitosis in macrophages. Ann Rev Immunol
1999. 17:593-623.
Complemento
El sistema de complemento (C) está formado por unas 30 proteínas del suero que
interaccionan entre sí de modo regulado formando una cascada enzimática que permite una
amplificación de la respuesta inmune humoral.
Las principales consecuencias de la activación del C son:
1. Lisis del microorganismo o célula diana
2. Opsonización, con la consiguiente mejora de la fagocitosis y destrucción del
microorganismo fagocitado
3. Quimiotaxis sobre los fagocitos
4. Acción anafilotóxica,
5. Eliminación de inmunocomplejos circulantes
23
que corresponden a la zona que va del 0 al 25% y del 75 al 100 % de hemólisis, presentan una
pendiente significativamente menor o nula.
Se define así la unidad de complemento hemolítica 50% (CH50), que corresponde a los mililitros
de suero fresco completo (como fuente de complemento) que son necesarios para producir la
lisis del 50% de los GR sensibilizados con anticuerpos, durante una hora de incubación a 37ºC.
La unidad CH50 se calcula sobre 5 X 108 eritrocitos óptimamente sensibilizados, resuspendidos
en un volumen total de 7.5 ml, en presencia de concentraciones óptimas de Calcio y Magnesio,
a una fuerza iónica y a un pH óptimo para cada especie.
DO (problema) - DO (0%lisis)
% de hemólisis = x 100
24
Este ensayo produce también una curva sigmoidea si se grafica el % de hemólisis vs. la
dilución del suero problema. El valor del 50% de hemólisis es el elegido para definir el título de
un suero como la inversa o recíproca de la dilución del suero que produce un 50% de
hemólisis. Las muestras de suero que van a ser utilizadas para evaluar la función del C deben
ser conservadas a -70ºC dentro de las 2 hs de extraídas, dada la labilidad de las proteínas del
C. Mediante esta técnica se evalúa la vía clásica de activación del complemento.
Este ensayo también puede ser realizado usando placas de agarosa que contienen GR
sensibilizados. El suero se agrega en hoyos cavados en la placa de agarosa y se permite que
difunda durante 20 hs a 4ºC. Las placas se incuban luego a 37ºC por 90 min para permitir la
hemólisis, que se ve como un anillo rodeando los hoyos, cuyo diámetro es proporcional al
logaritmo de la concentración del complemento en el suero.
Anticuerpos
Antisuero policlonal
Figura 1: Producción de antisueros policlonales.
25
El proceso de inmunización es aquel en el que se inyecta al animal el antígeno sólo o
con adición de adyuvantes, cuya función es favorecer su inmunogenicidad. Cuando la
inmunización se realiza sobre animales vírgenes o “naive”, a la primera dosis se la describe
como: inmunización primaria o respuesta primaria. La primer dosis induce la sensibilización
del individuo generando la expansión de los clonos específicos y la aparición de células de
memoria, pero la calidad de la respuesta en niveles de anticuerpos y células específicas puede
ser incrementada y mejorada en dosis sucesivas, por lo tanto en los planes de inmunización se
aplican diversas dosis. Existen numerosos protocolos de inmunización, con una duración
variable, aunque una fase de inmunización primaria suele durar de 1 a 3 meses con
inyecciones cada 15 a 21 días, y el proceso puede durar de 3 a 6 meses (puede variar también
de acuerdo con la especie a inmunizar). La cantidad de antígeno dependerá del animal
empleado. Los más comúnmente utilizados son ratón, rata, conejo, cabra y gallina. Las
cantidades oscilan de los 50 a 1000 µg de antígeno para una dosis en ratón a los 0,25 a 5 mg
por dosis en el caso de la cabra o los 15 mg en el caso de caballo.
Cuando nuestro objetivo es obtener sueros hiperinmunes para utilizar como reactivos de
diagnóstico o inmunidad pasiva, los planes están compuestos por varias dosis. Si nuestro
objetivo es sueros anti-sueros de diferentes especies, debemos considerar la distancia
filogenética para la elección de la especie dadora de suero. Como ejemplo, la utilización de la
gallina como especie para obtención de anticuerpos tiene dos ventajas: la distancia filogenética
existente con los mamíferos, y la purificación de los anticuerpos de la yema del huevo, es
engorrosa pero su obtención no afecta la vida del animal dador.
En conclusión, se denomina suero hiperinmune al obtenido de animales que han
respondido a múltiples inoculaciones de un antígeno determinado. Las aplicaciones son
numerosas, por ejemplo, como reactivos para el diagnóstico de ciertas enfermedades. Estos
sueros contendrán anticuerpos policlonales en alta concentración contra los distintos
componentes de un antígeno.
Anticuerpos monoclonales
26
Anticuerpos monoclonales:
1. Son químicamente homogéneos, poseen las propiedades individuales de la secuencia de
aminoácidos de ese particular anticuerpo.
2. Son de especificidad definida porque todas las moléculas tienen la misma región
hipervariable.
3. Poseen una única avidez y afinidad.
4. Su estabilidad físico-química depende de cada anticuerpo monoclonal en particular. Pueden
ser sensibles a cambios de pH, temperatura, liofilización y marcación con enzimas o
isótopos.
5. En general, no poseen reactividad secundaria, o sea, no forman complejos antígeno-
anticuerpo insolubles con antígenos mono o bivalentes. Pueden hacerlo si el antígeno tiene
epitopes repetitivos.
6. Se pueden producir en cantidades ilimitadas.
Anticuerpos policlonales:
1. Son heterogéneos. Sus propiedades constituyen un promedio de las propiedades de los
distintos anticuerpos constituyentes (del antisuero).
2. Son una mezcla de anticuerpos con especificidades propias para cada epitope del
inmunógeno. Por lo tanto, la probabilidad de reacciones cruzadas con epitopes de otros
antígenos es mayor a la de los anticuerpos monoclonales.
3. Su avidez y afinidad corresponden al conjunto de la mezcla de anticuerpos y varían en
función del momento de la respuesta inmune en que se realizó la determinación. Así, la
afinidad media de los anticuerpos detectada al comienzo de una respuesta inmune será
menor que la detectada a medida que la respuesta inmune avanza. Estos se debe a que a
medida que la respuesta inmune se va desarrollando, se produce la maduración de la
afinidad de los anticuerpos.
4. Son estables como consecuencia de su heterogeneidad, lo que permite que sean más
resistentes frente a distintos cambios físico-químicos.
5. Poseen reactividad secundaria debido a la presencia de múltiples anticuerpos dirigidos
contra distintos epitopes en la molécula antigénica, lo que permite la formación de una red
antígeno-anticuerpo.
6. Se producen en animales inmunizados. Por lo tanto, es difícil de estandarizar.
27
Tabla 1: Comparación de diferentes fuentes de anticuerpos
Concentración
Concentración Posible pureza
Tipo de de Anticuerpos Anticuerpos
Fuentes de Anticuerpos de anticuerpos
Anticuerpo específicos contaminantes
totales (mg/ml) específicos (%)
(mg/ml)
Otros Ac del 10% como
Suero policlonal 10 1 (10% máximo)
suero máximo
Sobrenadante
de cultivo de
Anticuerpos
hibridoma (con Monoclonal 1 0.05 (5%) > 95%
bovinos
10% de Suero
Fetal Bovino)
Sobrenadante
de cultivo (sin Monoclonal 0.05 0.05 (100%) Ninguno >95%
Suero Fetal)
Anticuerpos de
Líquido ascítico Monoclonal 1-10 0.9-9 (90%) 90%
ratón
Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory. 1988.
pp726.
1-a Precipitación
Las interacciones de una proteína en agua ocurren entre las moléculas de proteína-agua y
proteína-proteína. Cuando predominan las interacciones proteína-agua, éstas se hallan en
solución; cuando predominan las segundas (proteína-proteína), éstas precipitan. Cuando a una
proteína que se encuentra en solución acuosa agregamos una sal, como la sal es más
hidrofílica que la proteína, interacciona con el agua, le quita el agua y hace que predominen las
interacciones proteína-proteína. Por lo tanto, la proteína precipita.
Es importante considerar el pH de la solución de trabajo: Cuando el pH de la solución es
igual al punto isoeléctrico (pI) de la proteína, la carga neta de dicha proteína es cero y por lo
tanto sus moléculas no se repelen, se aglomeran y precipitan. Es conveniente trabajar con
sulfato de amonio a 4ºC: A mayor temperatura, mayor solubilidad proteica y viceversa; esto se
cumple para el rango de 0 a 40ºC.
En resumen, los factores que afectan la concentración salina a la cual una proteína en
particular precipitará son:
1- el número y la posición de los grupos polares;
2- el peso molecular de la proteína a purificar;
3- el pH de la solución;
4- la temperatura a la que se desarrolla la precipitación.
Precipitación salina
La precipitación salina es un método que permite separar las distintas fracciones proteicas
del suero. Las sales mas comúnmente utilizadas son el sulfato de amonio y el sulfato de sodio.
La ventaja de trabajar con sulfato de amonio es que no se cristaliza a temperaturas bajas ni
a temperatura ambiente, como lo hace el sulfato de sodio. La concentración de sal a la cual
precipitan los anticuerpos varía según la especie. Por ejemplo, la mayoría de los anticuerpos
de conejo precipitan con una solución saturada al 40%, mientras que los anticuerpos de ratón
necesitan entre 40-50%.
28
1-b Cromatografía
La característica que distingue a los métodos cromatográficos es la presencia de dos fases
mutuamente no miscibles (una móvil y una estacionaria) que se hallan en contacto. La muestra
a purificar se introduce en la fase móvil, por lo que es transportada a lo largo de una columna
que contiene la fase estacionaria homogéneamente distribuida. Los diferentes componentes de
la muestra experimentan repetidas interacciones entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Durante el proceso, los componentes de la muestra se separan en función de su interacción
con la fase estacionaria: el componente que menos interactúa es el menos retenido y eluye
primero, el que más interactúa resulta retenido más fuertemente y eluye último. Una separación
óptima entre dos componentes de una muestra se obtiene cuando el componente que eluye en
segundo término es retenido lo suficiente como para impedir su superposición con el
componente que eluyó en primer término.
Las macromoléculas biológicas difieren en sus características fisicoquímicas: tamaño,
forma, carga, hidrofobicidad y arreglo de sus grupos funcionales dentro de su estructura
tridimensional. La separación de las muestras entre las fases aprovecha las diferencias entre
las propiedades fisicoquímicas de cada uno de los componentes de una muestra dada. Es
lógico, por lo tanto, que los métodos cromatográficos más comunes para la purificación de
estas moléculas sean:
Cromatografía de exclusión molecular (discriminación por tamaño y forma),
Cromatografía de intercambio iónico (discriminación por carga),
Cromatografía de interacción hidrofóbica (discriminación por superficie hidrofóbica),
Cromatografía de afinidad (distribución de aminoácidos específicos en la superficie de las
proteínas, inmovilización de metales).
Fundamentos:
Este tipo de cromatografía utiliza como soporte esferas de gel con poros de diferente
tamaño. Una columna construida de esta manera tendrá dos volúmenes medibles, el volumen
externo (Vo), constituido por el volumen intersticial (el espacio que queda entre las esferas de
gel), y el volumen interno (Vi) que es el volumen de las esferas a los que los solutos y solventes
pueden acceder cuando se introducen dentro de aquéllas a través de sus poros. Las moléculas
que no puedan acceder al Vi, debido a que su tamaño es mayor al de los poros, sólo se
equilibrarán en el Vo, mientras que las de menor tamaño se equilibrarán en ambos volúmenes.
Cuando una muestra compleja de proteínas y otros componentes, disuelta en un pequeño
volumen, es aplicada a una columna con estas características, filtrará a través de la misma. Las
proteínas de mayor peso molecular eluirán con el Vo y por lo tanto eluirán primero, mientras
que las proteínas de menor tamaño, que pueden acceder al Vi, eluirán más tardíamente y en
un volumen de elución (Ve) determinado que dependerá de su peso molecular. Ver esquema
29
Aspectos metodológicos:
La matriz más utilizada en este tipo de cromatografía es ”Sephadex ®”, que se expende en
forma de polvo y puede tener diferentes tamaños de poro, lo que implica la separación de
proteínas de diferente tamaño.
Las muestras no pueden contener una concentración proteica de más de 50 mg/ml. Las
muestras deben ser clarificadas por centrifugación a fin de eliminar todo el material
insoluble que pueda disminuir el flujo de la columna y contaminar la matriz de la misma
previo a la cromatografía.
La fuerza iónica de los solventes cromatográficos debe ser lo suficientemente elevada
como para impedir la adsorción inespecífica del soluto a la matriz por interacciones
electrostáticas o uniones de Van Der Waals
Como las moléculas de IgM son mucho más grandes que las moléculas de IgG y de otras
proteínas que se encuentran en el suero, la cromatografía de exclusión molecular puede
ser usada para separar IgM. Cuando se requiere obtener una preparación pura de IgM, se
puede utilizar esta técnica combinada con la precipitación con sulfato de amonio.
Fundamentos:
La cromatografía de intercambio iónico trabaja mediante la unión de biomoléculas con una
carga determinada, a una matriz estacionaria de carga opuesta.
Las biomoléculas se unen a resinas de intercambio iónico cuando tienen carga opuesta a la de
los iones fijos de la resina. Esta unión es de tipo electrostático y reversible: La fuerza de esta
unión puede ser modificada variando la concentración salina y el pH de la solución buffer
utilizada como eluyente.
La separación de dos o más sustancias mediante la utilización de resinas de intercambio
iónico se consigue por un mecanismo de adsorción reversible, que consiste en la fijación inicial
y posterior remoción de tales sustancias a una resina estabilizada. Si las sustancias fijadas
tienen diferentes propiedades eléctricas, mediante la variación del pH o fuerza iónica del
eluyente se conseguirá que cada una de ellas eluya por separado.
30
Matrices y solventes:
La matriz puede estar constituida por silicato de aluminio, resinas sintéticas, polisacáridos
como la celulosa o el dextrano, etc. La naturaleza de los grupos cargados es la que determina
el tipo y la fuerza de unión del ión intercambiador. Los dos tipos de resinas más utilizadas son:
de intercambio catiónico (con matrices con carga negativa) y
de intercambio aniónico (con matrices con carga positiva).
La elección correcta de la resina, en especial en lo que se refiere al grupo funcional que le
aporta la carga, dependerá de la carga neta de la sustancia que se desea separar.
En los casos de moléculas anfotéricas como las proteínas, que poseen grupos cargados
positiva y negativamente, su carga neta dependerá del pH del medio. Estas sustancias, según
sea el pH del medio, podrán unirse a resinas aniónicas o catiónicas; en su punto isoeléctrico
(pI), tendrán carga neta cero y no se fijarán a ningún tipo de resina intercambiadora.
Cromatografía de Afinidad
Fundamentos:
La técnica de cromatografía de afinidad es una de las técnicas más utilizadas para la purificación de
proteínas. Consiste en una cromatografía de adsorción en la que se aprovecha la especificidad de
interacciones biológicas como las interacciones antígeno-anticuerpo, enzima-inhibidor, hormona-
receptor, lectina-hidrato de carbono, etc. La biomolécula que se quiere purificar (por ejemplo, un
anticuerpo) usualmente tiene un sitio de reconocimiento a través del cual puede interactuar con otra
molécula natural o artificial a la que se llama ligando. El ligando es inmovilizado sobre una matriz
polimérica y es usado para capturar selectivamente a la biomolécula que se desea purificar, cuando ésta
se encuentra en una mezcla impura. La biomolécula deseada puede ser eluída del ligando por cambios
en las condiciones externas (pH, fuerza iónica, solventes y temperatura) que desestabilizan la interacción
biomolécula–ligando y permiten que la molécula deseada sea eluida en forma purificada.
Existe una gran diversidad de biomoléculas que pueden purificarse por este método cromatográfico,
entre ellas: antígenos, anticuerpos, enzimas, proteínas unidas a hormonas, proteínas unidas a vitaminas,
receptores, glicoproteínas, lectinas, ARN, ADN, bacterias, virus, fagos, células y proteínas producidas
por ingeniería genética.
La naturaleza de la matriz a la que se fijan los ligandos es muy importante, ya que en las condiciones
experimentales debe ser física y químicamente estable, no debe actuar como tamiz molecular y debe
asegurar un buen flujo durante la elución.
Existen numerosas matrices comerciales disponibles en su forma activada o sin activar para
ser utilizadas como soporte para el ligando. La activación de la matriz se realiza para que el
ligando quede inmovilizado en ella a través de una interacción química que produzca una unión
estable entre matriz y ligando.
En general, se utilizan matrices de naturaleza polisacárida, en su mayoría derivados de la
agarosa. Debido a su estructura química, estas matrices tienen la característica de ser casi
inertes, de forma que no producen interacciones inespecíficas. Esto es esencial porque la
cromatografía de afinidad se basa en interacciones específicas.
La selección del ligando utilizado en cromatografía de afinidad debe tener en cuenta:
1- que la afinidad de unión del ligando sea específica y reversible por la sustancia que será
purificada.
2- que el ligando posea grupos químicamente modificables que permitan su unión a la matriz
sin que se destruya su capacidad de unión a la sustancia que será purificada.
Por ejemplo, si el ligando es un anticuerpo, éste se va a unir a la matriz a través de su porción
Fc, y por lo tanto, quedará libre el sitio de unión al antígeno. Al agregar un antígeno, éste será
reconocido y unido por el anticuerpo inmovilizado en la columna. Las demás moléculas
presentes pero no unidas a la matriz (no reconocidas por el ligando) se eliminan por lavado.
Posteriormente, el antígeno unido al anticuerpo de la columna se eluye y se obtiene en forma
pura.
El ligando idealmente debería tener una afinidad de unión de 10-4 a 10-8 M-1 en solución. Si
la constante de disociación es mayor que 10 -8 M-1 esta técnica no puede ser utilizada para la
purificación de estas moléculas pues la unión es muy estable y la separación de la biomolécula
del ligando se hace muy difícil. Estas afinidades muy altas corresponden a la interacción
hormona-receptor para lo cual este método no resulta útil.
31
Ejemplos,
Tabla 2
Cobayo ++++ ++
Rata +/- ++
Ratón ++ ++
Fuente: Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring
Harbor Laboratory. 1988. pp726.
32
El objetivo de la elución es recuperar la proteína unida específicamente con un alto
rendimiento, pureza y estabilidad. Para ello es necesario recuperar los antígenos o anticuerpos
provenientes de los inmunocomplejos.
1-Elución específica: Utiliza soluciones de elución con diferentes características, entre las
cuales se encuentran alto pH, presencia de calcio o magnesio, presencia de agentes quelantes
como el EDTA, etc.
2-Elución ácida: Se puede utilizar Glicina-HCl 0.02M pH 2.5, Citrato de sodio pH 2.5, etc. En
algunos casos en que las soluciones que se utilizan aumentan las interacciones hidrofóbicas
entre antígeno y anticuerpo, se obtiene una baja recuperación con este tipo de metodología. La
disociación de estos complejos inmunes puede hacerse más efectiva si se incorpora ácido
propiónico 1M o 10% de dioxano o etilenglicol al eluyente ácido.
3-Elución básica: Este tipo de elución se utiliza para obtener proteínas de membrana que se
unen por interacciones hidrofóbicas y otros antígenos que precipitan en condiciones ácidas
pero son estables en condiciones básicas. Es menos frecuentemente utilizada que la elución
ácida. Pueden usarse los siguientes compuestos: NaOH 1M, Dietilamina 0.05 M pH 11.5, etc.
4-Elución por agentes caotrópicos: Estos agentes desestabilizan la estructura terciaria de las
proteínas. Se utilizan para romper interacciones iónicas como los puentes de hidrógeno y
algunas interacciones hidrofóbicas. Los agentes caotrópicos más utilizados son: guanidinio,
urea-HCl 6M etc.
En la Figura 1 se esquematiza la metodología de purificación de proteínas por columna de
afinidad.
Regeneración de las columnas
El último paso, luego de la elución por cualquier método de elección, es la regeneración de las
columnas de afinidad. Este paso es importante dado que las columnas pueden reusarse y tras
sucesivos lavados con soluciones buffer se pueden utilizar para otras muestras.
Figura1:
Esquema de purificación de una proteína a través de una columna de afinidad
Matriz
+
Ligando
+ impurezas
Muestra
33
En la tabla 3 se muestran los métodos de purificación de anticuerpos. Generalmente es
necesario utilizar varias técnicas para obtener una mejor purificación
2- Fraccionamiento de anticuerpos
La tripsina actúa de manera similar a la papaína y permite obtener los mismos fragmentos.
34
La pepsina, por su parte, cliva el fragmento Fc en piezas pequeñas y deja el resto de la
molécula intacta. Esta porción intacta, denominada (Fab’)2, se halla constituida por dos
fragmentos Fab unidos a través de los puentes disulfuro intercatenarios. Presenta, por lo tanto,
dos sitios de reconocimiento antigénico por lo que su valencia es dos.
Un tercer fragmento de anticuerpos, el Fv, es de gran utilidad para los estudios de afinidad de
antígeno y anticuerpo. Este fragmento está compuesto por las porciones variables de las
cadenas liviana y pesada, con lo cual posee un sólo sitio de combinación al antígeno. Tanto el
fragmento Fab como el fragmento (Fab’)2 están estabilizados por los puentes disulfuro
intercatenarios. Dado que el fragmento Fv no posee estas uniones, debe estabilizarse
agregando un péptido de unión o “linker”. El fragmento linker es una pequeña secuencia que
une el extremo amino terminal de la cadena liviana con el extremo carboxiterminal de la cadena
pesada. La estructura que se obtiene recibe el nombre de “single chain fracción variable” (scFv)
que se puede sintetizar mediante técnicas de ADN recombinante.
Papaina Pepsina
Bibliografía:
1. Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988. pp726.
2. Affinity Chromatography: principles and methods. Pharmacia fine chemicals.
3. Cuatrecasas, P; Wilchek, M and Anfinsen, C. B. Selective enzyme purification by affinity
Chromatography. 1968. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61: 636-643.
4. Fainboim, L; Satz L y Geffner, J. Introducción a la Inmunología Humana. 1999. 387 pp
5. Gagnon, P. Purification tools for monoclonal antibodies.1996. Validated Biosystems. Inc.249
pp.
6. Margni, R. A. Inmunología e Inmunopatología. Fundamentos. Editorial panamericana
Buenos Aires quinta edición. 1996. 976pp
35
7. Roitt, I; Brostoff, J and Male, D. Immunology . Fifth Edition. Mosby International. LTD. 423
pp.
8. Subramanian, A. Immunoaffinity Chromatography. 2000 Methods in Molecular Biology Vol
147: 95-104.
9. Kent, U.M. Purification of Antibodies Using Affinity Chromatography. 1999. Methods in
Molecular Biology Vol 115: 23-28.
10. Wilchek, M and chailen, I. An Overview of Affinity Chromatography. 2000. Methods in
Molecular Biology. Vols 147: 1-6.
*Albúminas: es la proteína más abundante del suero, varía según la especie entre un 35 y 50%
de las proteínas totales. Es sintetizada por el hígado y su principal función es el mantenimiento
del volumen (equilibrio osmótico). Además es transportadora de sustancias poco solubles en
agua (ej: ácidos grasos libres).
*Globulinas: la fracción globulínica de las proteínas plasmáticas es una mezcla muy compleja
que se agrupa en cuatro fracciones con funciones diferentes: alfa-1, alfa-2, beta y gamma
1. -1 globulinas:
Glicoproteínas
Globulina fijadora de tiroxina
Protrombina
Antitripsinas
HDL (lipoproteína de alta densidad)
2. -2 globulinas:
Factor IX
Antiplasmina
Haptoglobina
Ceruloplasmia
Amiloide A
VLDL (Lipoproteína de muy baja densidad)
LDL (Lipoproteína de baja densidad)
36
3. -globulinas:
Transferrina
Fibrinógeno
Factores del Complemento
Proteína C reactiva
Amiloide A
Ferritina
Pueden aparecer trazas de IgM, IgA e IgG en especies domésticas.
4. Fracción globulinas:
IgM
IgA
IgE en concentraciones ínfimas
IgG
Cada especie posee un perfil electroforético caracteristico, a modo de ejemplo se muestran los
Electroforesis
El punto isoeléctrico (PI) de una molécula (en este caso una proteína) es el pH en el
cual la carga neta de la misma es cero. Si se mantiene a este pH, la proteína no migra cuando
se la somete a la acción de un campo eléctrico. El PI es inherente a la estructura primaria de la
proteína, pues depende de cuáles aminoácidos forman la cadena polipeptídica. Por lo tanto, a
determinado pH, distintas proteínas con distinto punto isoeléctrico tendrán distinta carga neta,
lo que permitirá separarlas e identificarlas por medios electroforéticos.
J. Tiselius fue el primero que utilizó la electroforesis en 1937 para separar los
componentes del suero. Existen dos métodos generales para separación de proteínas por
electroforesis:
electroforesis libre o de frente móvil, que se realiza en una fase líquida, y
37
electroforesis de zona, que utiliza una matriz sólida o soporte, como el papel de filtro,
membranas de acetato de celulosa o geles de almidón, poliacrilamida, agar o agarosa. Estos
materiales son porosos e hidratados y permiten retener las proteínas.
Técnica
La muestra se siembra sobre un soporte de agar o acetato de celulosa y se somete a
corriente eléctrica. El paso de la corriente provoca la migración de las diferentes proteínas que
conforman la muestra, pero cada una de ellas lo hará a una velocidad diferente según su punto
isoeléctrico.
El pH del buffer utilizado es de 8,6, a este pH, todas las proteínas están cargadas
negativamente. La más cargada es la albúmina, con un PI mucho menor que el pH del medio
(PI de la albúmina: 4,4); las menos cargadas, por el contrario, son las gammaglobulinas, con un
PI mucho más cercano al pH del buffer (PI de las gamaglobulinas: 6,8-7,2). Por lo tanto, las
albúminas son las que migran más rápido hacia el polo positivo, seguidas por las alfa, beta y
por último las gammaglobulinas.
Al efecto de la carga se suma el efecto electroendosmótico, que consiste en un
movimiento en sentido opuesto a la corriente eléctrica que detiene parcialmente la corrida de
las proteínas. Este es causado porque la mayoría de los soportes no son neutros. Debido a su
carga fuertemente negativa, las albúminas logran superar ampliamente el efecto, mientras que
las gammaglobulinas, cuya carga negativa es menor, no pueden superarlo tan fácilmente y
quedan detenidas en el punto de siembra o incluso son arrastradas hacia el polo negativo.
Materiales
Tiras de acetato de celulosa para electroforesis
Solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6)
Cuba de electroforesis
Fuente de poder
Solución colorante
Solución decolorante
Solución transparentizante
Densitómetro Integrador
Procedimiento
Es fundamental que todo el material que se vaya a utilizar esté bien limpio y seco.
1. Se sumergen las tiras en la solución amortiguadora (buffer) durante por lo menos 10
minutos.
2. Se elimina el exceso de líquido entre dos hojas de papel de filtro.
3. Se extienden las tiras sobre un portaobjetos teniendo la precaución de que no queden
burbujas entre el vidrio y la tira. Las tiras de acetato de celulosa tienen dos caras diferentes:
una es la superficie penetrable donde deben sembrarse las muestras, la otra no es
penetrable de tal manera que no debe ser utilizada para la siembra. Para diferenciarlas, las
tiras tienen uno de sus ángulos recortado, este debe quedar ubicado en el ángulo inferior
derecho.
4. Se coloca el portaobjetos sobre el puente de la cuba de electroforesis.
5. Se siembran las muestras con el sembrador. Los sembradores están estandarizados para
sembrar siempre el mismo volumen de muestra. Los equipos generalmente traen 3
sembradores de diferente volumen. Según el ancho de sembrador que se utilice, se podrán
38
sembrar 1, 2 ó 3 muestras por tira. Una de las muestras se tiñe con azul de bromofenol, el
cual se asocia a las moléculas de prealbúmina y permite identificar el frente de corrida.
6. La cuba se llena hasta una altura determinada con el buffer de corrida, se conecta a la
fuente de poder y se aplica una corriente constante de 200 voltios durante 30 minutos. El
grado de separación obtenido para las proteínas de una muestra dada, varía según sea la
especie de la que de proceda la muestra y depende del tiempo de corrida y del voltaje
aplicado. Por lo tanto, estos parámetros deben estandarizarse previamente según las
necesidades de cada caso en particular. (Por ejemplo, una muestra de suero equino se
corre a 200 voltios durante 25 minutos; una muestra de suero canino se corre a 180 voltios
durante 20 minutos).
7. Una vez finalizada la corrida, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se procede a
colorear las tiras, sumergiéndolas durante 5 minutos en la solución colorante de proteinas.
8. Se procede luego a la decoloración de la tira, sumergiendo las tiras en solución
decolorante. El objetivo del decolorante es barrer con el colorante que no se unió a las
proteinas. Este procedimiento se repite hasta que las tiras queden blancas (es conveniente
ir renovando la solución decolorante durante este procedimiento).
9. Las tiras se sumergen en metanol puro durante 30 segundos y luego en la solución
transparentizante durante 1 minuto.
10. Las tiras se colocan sobre un portaobjetos con el ángulo cortado de la tira ubicado en el
ángulo inferior izquierdo (en forma invertida a como lo sembramos), de esta forma la cara
sembrada queda boca abajo, mirando el vidrio. No deben quedar burbujas entre el vidrio y
la tira.
11. Los portaobjetos se colocan en una estufa a 80 ºC hasta su transparentización total. La tira
de acetato debe quedar completamente transparente para que pueda efectuarse la
medición por densitometría.
12. Las diferentes bandas de proteínas separadas a partir de la muestra original sobre la tira de
acetato de celulosa, teñidas y transparentizadas, son leídas en un densitómetro. El aparato
debe ser previamente calibrado según la longitud de onda que vamos a utilizar
(generalmente 520 nm), el largo de la tira que vamos a medir y la concentración de
proteínas de la que partimos. El densitómetro detecta y registra los datos de absorción de
luz de cada banda de proteína y los transforma en un valor numérico de concentración y en
un gráfico (ver figura al final del tema)
Aplicaciones de la electroforesis
La electroforesis es un método extraordinariamente valioso para el diagnóstico de las
alteraciones en los componentes proteicos del suero, orina y líquido cefalorraquídeo (LCR).
Mediante esta técnica se puede diagnosticar un aumento, disminución o alteración de las
proteínas (paraproteínemias)
Por ejemplo ciertas patologías como:
Mieloma múltiple: se detecta la aparición de una banda o curva restringida en la región de
las gamma globulinas, asociada a hallazgos anormales en la electroforesis de orina
(proteína de Bence-Jones)
Hipogammaglobulinemias: Disminución de las gammaglobulinas.
Esclerosis Múltiple: Aparición de bandas oligoclonales en el LCR (en humanos).
Hipoproteinemias por pérdida de proteínas por el sistema digestivo: Disminución general de
todas las proteínas.
Déficit de alfa-1 antitripsina: Disminución de las alfaglobulinas.
Enfermedades infecciosas o neoplásicas agudas: Aumento de alfa-1 globulinas.
Síndrome nefrótico o procesos hemolíticos: Aumento de alfa-2 globulinas.
Debe hacerse hincapié que la electroforesis es casi siempre una prueba que puede llevar a un
diagnóstico presuntivo de las anormalidades de las proteínas del suero, orina o LCR.
Ejemplos de hiperglobulinemias
Policlonales
- Infecciones virales, bacterianas (brucelosis, piodermis), hongos, parásitos (dilofilarias).
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- Enfermedades inmunomediadas:
Lupus eritematoso sistémico
Trombocitopenia inmunomediada
Anemia hemolítica autoinmune.
Pénfigo.
Artritis reumatoidea, Poliartritis
- Neoplasias (generalmente no relacionadas con el sistema inmune)
Monoclonales
- Neoplasias (Mieloma múltiple, linfosarcoma, macroglobulinemia.)
Ejemplos de hipoalbuminemias
Resultado de enfermedades como insuficiencia hepática crónica y síndrome de mala
digestión – mala absorción.
Hipergammaglobulinemia
Secuestro de proteínas en cavidad pleural, peritoneal y tejido subcutáneo.
Dilución por fluidoterapia.
Patologías renales (glomerulopatías).
Quemaduras
Ejemplos de hiperalbuminemia
Deshidratación
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Patrón electroforético del LCR en un sujeto normal y en un enfermo con esclerosis múltiple
Bibliografía
1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana.1º edición,
septiembre de 1986. Capítulo 6.
2. Margni R. A. Inmunología e Inmunohistoquímica Fundamentos. Bs.As.: Editorial médica
Panamericana 1º edición, octubre de 1972. Edición consultada: 5º edición septiembre de
1996. Capítulo V.
3. Stites Daniel P. y Terr Abba I. Inmunología Básica y Clínica Editorial El Manual Moderno
S.A. de C. V. México D.F. 7° edición. 1993 Sección II. Capítulo 18.
4. Inmunología básica. Guía de trabajos prácticos. Fac. Cs. Veterinarias. Año 2000.
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Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE)
Las muestras se siembran en un gel de poro grueso (gel de paso rápido, apilamiento o
stacking) que permite que todos los componentes de la muestra se concentren en una zona
estrecha y comiencen la migración por el gel de separación en forma simultánea, lo que facilita
la comparación entre muestras y los patrones de PM.
Existen sistemas de geles continuos y discontinuos. En los sistemas discontinuos (los
más usados) los buffers utilizados para los geles de apilamiento y de separación poseen
diferente fuerza iónica y pH.
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En forma de síntesis los pasos a seguir son:
A- Armado del gel de poliacrilamida
B- Preparación de las muestras
C- Siembra de las muestras en el gel
D- Corrida electroforética
E- Tinción del gel
F- Análisis e interpretación de los resultados
Los geles teñidos muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se observarán
un número de bandas variables dependiendo de las distintas proteínas que componen la
mezcla. La distancia que recorrió cada proteína en el gel desde el sitio de sembrado de la
muestra es proporcional a su peso molecular, por lo tanto, cuanta más distancia recorrida
menor el PM de esta proteína. Las proteínas del mismo PM corren en forma conjunta.
Algunas de las utilidades son:
Identificar el PM de los componentes en muestras complejas
Identificar pureza en extractos purificados
Constituir el primer paso para el análisis antigénico en muestras que se conoce como
inmunoblot
Anexo
A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un gel de poliacrilamida al
15% utilizando la cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios
Bio-Rad).
1. Armado del gel entre de placas de vidrio:
Realizar una delicada limpieza de las placas de vidrio con alcohol etílico.
Formar un sándwich con ambos vidrios ubicando entre ellos los espaciadores.
Ubicar el sándwich en la abrazadera de manera que la placa más pequeña quede hacia
delante (introducir entre ambos platos la tarjeta alineadora).
Ajustar los tornillos de la abrazadera en forma manera cruzada.
Verificar que no existan pérdidas de líquido: colocar agua entre ambos platos con una
pipeta plástica y observar si el nivel de agua desciende.
Si existen pérdidas, rehacer el armado.
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2. Preparación de la solución de poliacrilamida-bisacrilamida
El oxígeno inhibe la polimerización, por lo que se recomienda desgasificar el agua y todas las
soluciones a utilizar.
Preparar el gel de separación: Agregar al frasco las respectivas cantidades de agua,
mezcla de acrilamida: bisacrilamida (en una proporción de 30:0.8), 1.5 M Tris y SDS 10%.
Agregar los agentes iniciadores de la polimerización: PSA y TEMED. Se debe tener en
cuenta que la mezcla comenzará a gelificarse, de manera que los pasos a seguir deberán
realizarse con la debida celeridad.
Verter la solución con una pipeta plástica entre ambas placas hasta 2 cm por debajo del
borde superior. Agregar rápidamente unas gotitas de agua sobre la solución para evitar el
ingreso de oxígeno que retrasa la polimerización de la acrilamida.
Preparar el gel de apilamiento o stacking. Hacer esto mientras gelifica el gel de separación,
que generalmente demora entre 20 y 30 minutos. No agregar el PSA ni el TEMED a la
solución de gel de apilamiento hasta que el gel de separación haya gelificado.
Una vez ocurrida la gelificación, retirar el agua, verter el gel de stacking y colocar el peine
(para generar las calles) suavemente, evitando la formación de burbujas.
Dejar que la acrilamida polimerice durante 60 minutos a temperatura ambiente. Una vez
gelificado, retirar el peine.
3. Armado de la cuba
Con el armado de la cuba se generan las dos cámaras entre las cuales pasará la corriente
eléctrica. Los geles de poliacrilamida quedarán comunicando las dos cámaras (una anódica
y otra catódica) y el pasaje de corriente a través del gel producirá la corrida del material a
analizar. Por lo tanto, del correcto armado dependerá el éxito del análisis de la técnica.
Se colocan ambos geles en el soporte ad hoc tomando en cuenta la limpieza de las gomas
y su lubricación. Es fundamental que la cámara que se genera entre los dos geles no
pierda. Para comprobar esto se debe cargar con buffer la cámara interna fuera del tanque y
observar que no se produzcan pérdidas. Si esto sucede es posible sellar los bordes de la
cuba con agar al 1%, hasta lograr el aislamiento de la cámara interior. Una vez logrado
esto, se coloca el soporte dentro del tanque y se llena la cámara exterior con un volumen
de buffer que llegue aproximadamente hasta la mitad de su altura. El buffer con que se
llenan las cámaras y que se utiliza para la corrida es denominado buffer electrodo.
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4. Preparación de las muestras
El volumen máximo de muestra que puede sembrarse por cada calle es de 20l. En este
caso, hay que considerar que la muestra está diluida en buffer muestra (preparado a una
concentración de 2X), y por lo tanto el volumen real de la muestra será de 10l.
Una vez diluida la muestra en su buffer se debe hervir durante 10 minutos a fin de que se
produzca la desnaturalización de las proteínas a estudiar.
Nota: La sensibilidad de la técnica depende del colorante de proteínas que se va a utilizar para
ver las bandas, pero el rango de detección se encuentra entre 1 a 10g. En el caso de
muestras complejas conviene sembrar de 50 a 100g de proteína total.
6. Corrida
La cuba se conecta a la fuente de poder y se corre a voltaje constante, 70 volts durante
2 a 3 horas. El frente de corrida, marcado por el colorante presente en el buffer muestra,
permite determinar en qué momento la muestra ha alcanzado la parte inferior del gel. Una vez
concluida la corrida, se desconecta la fuente de poder y se desarma la cuba. Con guantes y
una espátula se despega el gel de los vidrios. El destino de este gel puede ser la tinción o la
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transferencia a una membrana de nitrocelulosa para posteriormente identificar la proteína por
inmunoreactividad.
7. Coloranción de las proteínas corridas
Si el destino es la coloración para proteínas, se lo sumerge en colorante Azul de
Coomassie (Coomassie Blue). Este colorante permite detectar entre 0.2 a 0.5 g de proteínas.
La solución colorante contiene ácido acético que permite fijar las proteínas a la vez que se
tiñen.
En los casos en que la sensibilidad de la tinción con Coomassie Blue no sea suficiente, se
puede utilizar la tinción argéntica (Silver stain) que permite detectar hasta 2 ng de proteínas por
banda. La tinción argéntica, además es útil para detectar polisacáridos y proteínas altamente
glicosiladas.
Bibliografía
Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988. pp726.
Mini-PROTEAN II Electrophoresis Cell Instruction Manual. Bio-Rad
Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed. Interamericana.
46
47
Introducción a las técnicas serológicas
El diseño de una técnica inmunológica está relacionado con el resultado que pretendemos
obtener. Este resultado permite clasificarlas en:
TÉCNICAS CUALITATIVAS
Indican la presencia o ausencia de una "sustancia" (antígeno o anticuerpo) en una muestra. En
algunos casos el resultado es suficiente para confirmar un diagnóstico.
TÉCNICAS SEMICUANTITATIVAS
Brindan una idea de la cantidad de “sustancia” presente en una muestra. A tal fin, la técnica se
realiza sobre varias diluciones de la muestra para obtener el título, que es la inversa de la
última dilución que da resultado positivo.
El título es una manera indirecta de cuantificar la sustancia reaccionante y es directamente
proporcional a la cantidad de "sustancia" presente en la muestra y al límite de detección de la
técnica utilizada. Por esto, cuando tenemos un resultado expresado en título debemos indicar
cuál fue la técnica empleada.
TÉCNICAS CUANTITATIVAS
Determinan la cantidad o la concentración de la "sustancia" presente en una muestra.
Requieren utilizar estándares de concentraciones conocidas que se evalúan simultáneamente
con la muestra y nos permiten realizar curvas patrones.
La cantidad de la sustancia presente en la muestra se calcula a partir de la curva patrón, por
interpolación del resultado obtenido en la medición de la muestra problema.
Diluciones
Una dilución es una mezcla volumen/volumen en proporciones conocidas, formada por una
cierta cantidad de la sustancia que queremos diluir, o soluto (en el ejemplo, un suero) más una
cierta cantidad de diluyente (por ejemplo solución fisiológica o medio de cultivo)
Puede expresarse como una fracción donde el numerador representa la unidad del soluto (S) y
el denominador la suma del soluto más el diluyente (D), o sea el total de la solución.
Por ejemplo
- Dilución 1/2 (factor de dilución 2): 1 parte de S + 1 parte de D.
- Dilución 1/5 (factor de dilución 5): 1 parte de S + 4 partes de D.
- Dilución 1/8 (factor de dilución 8): 1 parte de S + 7 partes de D.
- Dilución 1/10 (factor de dilución 10): 1 parte de S + 9 partes de D.
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Las diluciones pueden expresarse también en forma logarítmica, con sólo colocar el logaritmo
del denominador de la fracción como potencia negativa. Así, por ejemplo:
Como se ve, S está más diluido en la dilución 1/10 (10-1) que en 1/8, 1/5 ó 1/2. (10-0,3) O sea,
que la mayor de estas cuatro diluciones es 1/10.
Para preparar una dilución 1/3, por ejemplo, se pueden usar diferentes volúmenes según el
requerimiento de la técnica a usar:
Una dilución seriada es aquélla en la que se realizan diluciones sucesivas del soluto, de
forma tal que el factor de dilución se mantiene constante y la dilución anterior se utiliza como
fuente de soluto para la dilución siguiente.
Por ejemplo:
En todos los casos, si deseamos mantener el volumen constante, se descarta del último tubo la
misma cantidad que tomamos de cada uno de los tubos anteriores.
El título nos da una idea de los niveles de antígeno o anticuerpo presentes en una muestra.
La principal aplicación de este concepto se refiere al nivel de anticuerpos específicos (contra un
antígeno dado) presente en un suero u otra muestra biológica.
Para obtener el título de anticuerpos, por ejemplo, de un suero, se hace una dilución seriada
de dicho suero y a cada dilución se la enfrenta con una cantidad fija del antígeno para el cual
es específico. La reacción observada entre antígeno y anticuerpo dependerá de la técnica que
se use (aglutinación, precipitación, ELISA, etc.).
El título de anticuerpos presentes en el suero (título del suero) será la inversa de la mayor
dilución en la que se observa reacción positiva.
En el siguiente ejemplo:
Dilución 1/2: reacción positiva
Dilución 1/4: reacción positiva
Dilución 1/8: reacción positiva
Dilución 1/16: reacción positiva
Dilución 1/32: reacción positiva
Dilución 1/64: reacción negativa
El título será la inversa de la dilución 1/32, es decir, 32.
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Si la dilución 1/64 hubiese dado un resultado positivo, deberíamos haber seguido diluyendo el
suero hasta llegar al primer resultado negativo: cuando nuestro objetivo es obtener el título de
un suero debemos llegar hasta la dilución límite o final de reacción.
Se dice que hay conversión serológica cuando el título de anticuerpos contra determinado
antígeno en un individuo aumenta en por lo menos dos diluciones seriadas entre una primera y
una segunda muestra de sangre obtenida esta última, por lo menos 15 a 20 días después de
la primera. Una variación menor a 2 diluciones podría deberse sólo a variaciones en el
procedimiento, o sea al error experimental aceptado.
La seroconversión aporta datos referentes a la etapa de la infección en la que se encuentra un
individuo, sobre todo en enfermedades tales como toxoplasmosis o leptospirosis, en las que
únicamente el aumento del título de anticuerpos contra los respectivos microorganismos indica
enfermedad aguda.
Independientemente de la técnica utilizada para determinar el título podemos decir que dado
que la capacidad de respuesta es propia de cada individuo y está influenciada genéticamente,
sólo una comparación con valores propios (previos y posteriores) puede determinar si ha
aumentado o disminuido la respuesta frente al antígeno.
La reacción Ag-Ac implica una unión de tipo no covalente, reversible entre ambas
moléculas. La forma complementaria de las nubes de electrones en el sitio de combinación
entre el anticuerpo (paratope) y el determinante antigénico (epitope) hace que las dos
moléculas encajen de manera ajustada, de modo que la distancia intermolecular se torna muy
pequeña y aumentan en grado considerable las fuerzas de interacción no covalentes que
participan en la unión. Cuando la complementariedad espacial no es la ideal, se produce
superposición de las nubes electrónicas y se generan fuerzas de repulsión que determinan que
la fuerza de unión (afinidad) sea diferente en distintos anticuerpos que reconocen un mismo
epitope.
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(sangre, suero, orina, tejidos, etc). Las técnicas inmunológicas pueden ser de interacción
primaria o secundaria
De Interacción PRIMARIA:
Ocurren en milisegundos y están determinadas por la afinidad del paratope del anticuerpo por
el epitope de un antígeno. La reacción no se puede reconocer a simple vista, por lo tanto, para
determinar si la misma tuvo lugar se emplean métodos en los que el antígeno o el anticuerpo
se marcan con una molécula que puede ser un radioisótopo (en la prueba de RIA), una enzima
(en las pruebas de ELISA, Inmunoblot e Inmunohistoquímica) o un fluorocromo (en la
Inmunofluorescencia). Estos métodos transforman la reacción primaria en señales (radiactivas,
colorimétricas o fluorescentes) que pueden interpretarse y cuantificarse.
De Interacción SECUNDARIAS:
Es la consecuencia de la unión antígeno-anticuerpo luego de ocurrida la reacción primaria,
dadas por las características del antígeno y del anticuerpo. Si el antígeno es polivalente (varios
determinantes antigénicos) y el anticuerpo actúa como divalente o polivalente, se forma una
red o entramado en el que un anticuerpo está unido a por lo menos 2 partículas antigénicas
diferentes y cada partícula antigénica está unida a una o más moléculas de anticuerpo. Esta
reacción puede observarse a simple vista. Según la solubilidad del antígeno involucrado en la
reacción (soluble o particulado) recibe diferentes nombres:
De interacción TERCIARIAS:
Cuando el reconocimiento del antígeno por el anticuerpo ocurre in vivo, pueden presentarse
manifestaciones visibles en el animal evaluado.
No todas las pruebas serológicas tienen la misma capacidad para diferenciar los individuos
sanos de los enfermos. Existen dos parámetros empleados generalmente para evaluar las
pruebas diagnósticas en general y las pruebas serológicas en particular: la sensibilidad y la
especificidad, que se obtienen al comparar los resultados obtenidos en la prueba evaluada
con los obtenidos con la prueba estándar de oro o de referencia.
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Podemos definir entonces:
Técnica de Referencia o
Infección Real
+ -
(enfermo) (sano)
Técnica Objeto + A B
de Valoración - C D
SENSIBILIDAD = A / A+C
ESPECIFICIDAD = D / B+D
En las que:
(A) Positivos en que coinciden ambos métodos (Positivos Verdadero).
(B) Negativos reales que la técnica objeto de valoración da como positivos (Falsos Positivos).
(C) Positivos reales que la técnica objeto de valoración da como negativos (Falsos Negativos).
(D) Negativos por ambas técnicas (Negativos Verdadero)
Población sana
Población enferma
Resultado de la prueba: - +
Valor de corte
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El término sensibilidad posee otra acepción que se refiere al nivel de detección mínimo o
límite de detección de una técnica inmunológica. Este concepto se refiere a la cantidad
mínima de anticuerpos reaccionantes necesaria para que éstos puedan ser detectados por una
determinada técnica.
En la tabla se ejemplifican los valores de sensibilidad como límite de detección de las técnicas
inmunológicos a fin de compararlas
Límite de detección
Técnica
(mg/ml de Ac)
RIA 0,0001
ELISA 0,0003
AGLUTINACIÓN 0,0300
INMUNOFLUORESCENCIA 0,5000
PRECIPITACIÓN (*) 1 - 4,0000
(*) Difusión doble en agar
ELISA
Como toda reacción antígeno-anticuerpo, posee un equilibrio dinámico con una primera etapa
reversible y una etapa irreversible. Esta cinética depende de la molaridad del medio (soluciones
tamponadas -o buffers- utilizados) y del tiempo y temperatura en que se produce la reacción
(incubación).
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Deben ofrecer un amplio rango de linealidad entre su concentración y la intensidad de color
formado.
Los sustratos de estas enzimas deben poseer un alto coeficiente de extinción molar, con un
máximo de absorbancia entre 400 y 600 nm.
La peroxidasa y la fosfatasa alcalina son las dos enzimas más utilizadas. Desde hace
algunos años se ha difundido el uso de ureasa, -galactosidasa y glucosa-oxidasa.
Peroxidasa
Las peroxidasas son hemoproteínas que transfieren Hidrógeno desde un donante (DH) al O del
H2O2. La peroxidasa más utilizada, obtenida del rabanito (HRP: Horse-Radish Peroxidase),
posee un alto contenido en hidratos de carbono que facilita la conjugación a anticuerpos. Para
revelar la reacción química producida se utilizan diferentes cromógenos, entre ellos:
2,2-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)-6-sulfonato de diamonio (ABTS), que absorbe a 405 nm.
cuando se oxida vira al color verde.
3-metil-2-benzotiazolinona hadrazona (MBTH), que reacciona con el ácido 3-(dimetilamino)
benzoico (DMAB), que absorbe a 590 nm.
orto-fenilendiamina (OPD) o 1,2,-bencenodiamina, que absorben a 492 nm. Cuando se
oxida vira al color ocre
Diaminobenzidina (DAB): cuando se oxida vira al color pardo
El sustrato más utilizado con peroxidasa es el agua oxigenada o peróxido de hidrógeno (H 2O2):
La acción de la peroxidasa sobre el peróxido de hidrógeno degrada este compuesto dando
agua y liberando oxígeno (O-). El oxígeno, a su vez, oxida al cromógeno que pasa de incoloro
en su estado reducido a coloreado en su estado oxidado.
Como todas las enzimas, la peroxidasa acelera el proceso de degradación del sustrato sin
perder su funcionalidad, por lo tanto, se encuentra en condiciones de reaccionar nuevamente
una y otra vez es por eso que debe agregarse una sustancia de solución de freno o stop que
modifica el pH.
Fosfatasa alcalina
Las fosfatasas alcalinas utilizadas en los ELISAs se aíslan a partir de intestino bovino o de
Escherichia coli. Estas enzimas hidrolizan una amplia gama de ésteres de fosfatos (como los
de alcoholes primarios, secundarios, fenoles y aminas), tienen un pH óptimo alcalino (por lo
que se emplean soluciones a base de dietanolamina con pHs cercanos a 9) y requieren Mg y
Zn como cofactores.
Los cromógenos más utilizados para esta enzima son:
-pNPP (paranitrofosfato) que vira de incolora a amarillo.
-5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazolium (NBT/BCIP) que vira de incoloro
a azul.
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2. El exceso de Ag se remueve mediante lavados con 0.05-0.1% de Tween 20 en PBS (PBST).
3. Se agrega una solución que contiene proteínas que no son reconocidas por los anticuerpos
específicos (solución bloqueante), para limitar la unión inespecífica de proteínas. Se puede
utilizar 10% de leche descremada en polvo resuspendida en PBS. Se incuba durante 1 hora
a 37C o durante 16 hs a 4C.
4. El exceso de solución bloqueante se remueve mediante lavados con PBST.
5. Se agrega el suero problema y los sueros control positivo y negativo por duplicado o
triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. (El suero problema es
aquél del cual se quiere conocer si posee Acs específicos contra el Ag que se encuentra
pegado en la placa, en este caso es un suero bovino en el que se analiza la presencia de
Acs anti-B. abortus).
6. Los anticuerpos no unidos al Ag se remueven mediante lavados con PBST.
7. Se agrega un anticuerpo unido a enzima (conjugado) que reconoce a las inmunoglobulinas
de la especie de la cual estamos evaluando el suero (En este caso, el conjugado será un Ac
anti-Ig bovina). Si el Ac específico está presente, el anticuerpo conjugado reacciona con él y
queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C.
8. El exceso de conjugado se remueve mediante lavados con PBST.
9. Se agrega el sustrato de la enzima. La reacción de la enzima con el sustrato resulta en un
producto coloreado y es un indicador visual de que la reacción antígeno-anticuerpo ha
tenido lugar.
10. Dado que las enzimas pueden continuar degradando el sustrato dependiendo del
tiempo y la temperatura se realiza el frenado de la actividad enzimática a tiempo de reacción
determinado que se relaciona con la aparición de color en los controles negativos de
sustrato. El freno depende de la enzima utilizada y es en el caso de peroxidasa ácido
sulfúrico y para fosfatasa se utiliza el hidróxido de sodio, ambos modifican el pH y la
reacción se frena.
11. La reacción cromática puede ser leída a simple vista o cuantificada por
espectrofotometría. La intensidad de la reacción es proporcional a la cantidad de enzima
activa presente en cada hoyo.
Lectura:
En caso de haber anticuerpos antibrucella en el suero bovino problema, se observará la
aparición o cambio de color en el sustrato. En un primer paso, los anticuerpos del suero se
unen al antígeno pegado a la placa. Al agregar los anticuerpos conjugados a la enzima, éstos
reconocen y se unen a los anticuerpos del suero. La enzima queda adherida y se produce así
la reacción al agregar el sustrato.
De no haber anticuerpos específicos en el suero problema, el resto de los anticuerpos se
eliminan con el lavado. Al agregar el Ac anti-bovino marcado con la enzima, éste no reconoce
ninguna molécula específica y se elimina al realizar el último lavado. Por lo tanto, al agregar el
sustrato no se producirá ninguna reacción específica. Se puede observar un nivel bajo de señal
por autodegradación del sustrato o debido a la presencia de enzima por lavado ineficaz de la
placa. Por esto es tan importante que después de cada incubación se proceda al lavado con
soluciones salinas con detergentes suaves, a fin de eliminar las proteínas unidas de manera
inespecífica a los soportes sólidos.
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4. El exceso de solución bloqueante se remueve mediante lavados con PBST.
5. Se agrega la muestra a evaluar (muestra problema) y los controles positivos y negativos por
duplicado o triplicado. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. (Muestra
problema es aquélla en la que se quiere determinar la presencia del Ag para el que son
específicos los Acs fijados a la placa)
6. Los antígenos no unidos al Ac se remueven mediante lavados con PBST.
7. Se añade un segundo anticuerpo específico para ese antígeno, pero unido a una enzima
(conjugado). Si el Ag específico está presente, el anticuerpo conjugado reacciona con él y
queda unido. Se incuba durante 1 hora a 37C o durante 16 hs a 4C. El exceso de
conjugado se remueve mediante lavados con PBST.
8. Se coloca el sustrato de la enzima y se relaciona la actividad enzimática observada con la
concentración del antígeno presente en la muestra.
ELISA DIRECTO:
La muestra problema (de la cual no se sabe si contiene o no Ac o Ag) se inmoviliza sobre la
fase sólida. En caso de analizar Ac, estos se detectan por medio de Ags conjugados, y en el
caso de analizar la presencia de Ag, estos se detectan por Ac conjugados. (Fig. 1).
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Positiva
Negativa
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ELISA INDIRECTO:
En el ELISAs indirecto el antígeno o anticuerpo a identificar es capturado en la placa por la
molécula complementaria (Ag o Ac), según corresponda. O sea, si se desea detectar Acs
específicos en un suero, se inmoviliza el antígeno en la fase sólida y se lo hace reaccionar con
el suero problema. Luego se utiliza un Ac anti-Ig de la especie conjugado a una enzima. Este
sistema tiene alta detectabilidad debido a que varias moléculas del conjugado enzimático (Anti-
Ig marcados con la enzima) pueden unirse a cada molécula de Ac que reaccionó a su vez con
el Ag inmovilizado, este efecto se traduce en una amplificación de la señal. (Fig. 2)
= Ac problema o incógnita
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2- De modulación de actividad o competitivos
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Muestra Muestra
negativa positiva
o incógnita
o patrón
Valor de corte = D.O promedio de los controles del suero negativo +/- 2 desvíos estándar del
suero negativo.
El valor de corte debe ser tal que minimice los resultados falsos, ya sean positivos o negativos.
En muchos casos existe una zona de solapamiento en la distribución de la reactividad de
sueros positivos y negativos, en la que no puede establecerse con certeza si una muestra es
positiva o negativa.
Por este motivo el valor de corte se determina de manera tal de tener más falsos positivos o
falsos negativos, según qué tipo de error produzca consecuencias menos graves.
Controles
Para una correcta interpretación de los resultados deben realizarse controles de todos los
reactivos utilizados. Los controles deben permitirnos afirmar que el cambio de color detectado
corresponde a la interacción específica entre Ag y Ac y no a reacciones inespecíficas. Si las
reacciones inespecíficas se detectan estas deben ser minimizadas y tomadas en cuenta en el
momento de establecer el valor de corte.
Podemos ejemplificar los controles en un ELISA indirecto de la siguiente manera:
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Controles del conjugado
A- Control negativo del Conjugado: Dicho control se realiza para determinar que el anticuerpo
conjugado a la enzima no interacciona con ningún otro componente del sistema que no sea el
anticuerpo primario. Se realiza de la siguiente manera: se pega a la placa el antígeno, se
bloquea, no se incuba con el suero o anticuerpo primario (se mantiene el bloqueante), se
coloca el anticuerpo conjugado y por último el sustrato. Este no debería reaccionar con el
antígeno pegado a la placa, dando reacción negativa.
B- Control positivo del Conjugado: Este control se realiza a fin de determinar que el anticuerpo
conjugado a la enzima interactúa correctamente con el anticuerpo primario. Se realiza de la
siguiente manera: Se pega un suero de la especie frente a la cual es específico en conjugado.
Por ejemplo si el anticuerpo conjugado es un anticuerpo anti ratón se coloca en la placa suero
de ratón, se bloquea, no se coloca anticuerpo primario y se coloca el anticuerpo secundario
marcado con la enzima, continuando el resto de la técnica de la misma manera. Este control
debe dar positivo, es decir debe haber color en los hoyos indicando el correcto funcionamiento
del conjugado.
Control del sustrato: Este control nos permite determinar que el sustrato de la enzima no
reacciona con ningún otro componente del sistema excepto con la enzima. Se realiza de la
siguiente manera: se pega a la placa el antígeno, se incuba con el anticuerpo 1º, es decir, el
suero, y no se coloca el anticuerpo conjugado, y se coloca el sustrato el cual no debería
modificar su color, ya que no hay en los hoyos enzima que catalice la reacción.
Proteína A:
Es una proteína de la pared de Staphylococcus aureus que tiene alta afinidad por los
fragmentos Fc de algunos isotipos de Igs (Ka=108 M-1). Tiene 4 sitios de unión, aunque
generalmente reaccionan sólo dos.
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RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Ag* Ac-Ag*
Ac +
Ag Ac-Ag
Donde
Ac representa al anticuerpo específico;
Ag* es el antígeno marcado (trazador) libre;
Ag es el antígeno libre no marcado de las soluciones patrones o de las muestras desconocidas;
Ac-Ag* es el complejo soluble entre el anticuerpo y el antígeno marcado, y
Ac-Ag es el complejo soluble con el antígeno no marcado.
62
Ejemplos de aplicación de la técnica de RIA
RAST (RadioAlergoSorbent Test) o prueba de radialergoadsorción:
Es utilizado para la detección de IgE específica de alergenos. El reactivo marcado es un Ac
(generalmente monoclonal) anti-IgE. Si el animal tiene en su suero IgE específica contra el
alérgeno previamente adsorbido a un soporte, la radiactividad detectada por el RIA será
directamente proporcional a la concentración de esa IgE.
Bibliografía
Inmunoblot o Western-blot1
El análisis de una muestra por la técnica de inmunoblot requiere realizar una primera
etapa de separación de los componentes en un campo eléctrico en geles de poliacriamida
(PAGE) y posteriormente la transferencia de esas proteínas ya separadas por peso molecular
(PM), a una membrana. Esta transferencia se realiza poniendo en contacto el gel con una
membrana de nitrocelulosa y aplicando una corriente eléctrica a pH alto. Las moléculas
proteicas se movilizan y contactan con la membrana, a la cual se fijan. La unión a la membrana
de nitrocelulosa es debida fundamentalmente a interacciones de tipo hidrofóbico.
Las moléculas transferidas a la membrana son identificadas posteriormente por interacciones
con anticuerpos específicos.
1
La transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis desde un soporte
gelificado a una membrana, fue descripta inicialmente por el Dr. Southern. Debido a ello, esta
técnica se denominó Southern-blot. La aplicación de esta técnica para el estudio de RNA se
denominó Northern-blot y cuando ésta se desarrolló para proteínas se la llamó Western-blot.
Por lo tanto son sinónimos.
63
También podemos evaluar la monoespecificidad de un anticuerpo como en el caso de los
monoclonales para lo cual se realiza el PAGE del antígeno complejo luego la transferencia a
una membrana de nitrocelulosa la que se usa como antígeno para interaccionar con el
anticuerpo monoclonal. Como resultado se espera el reconocimiento de un sólo componente
por parte del anticuerpo.
Las membranas teñidas muestran la complejidad de las muestras ya que en cada calle se
observarán un número de bandas variables dependiendo de las distintas proteínas que sean
reconocidas por el anticuerpo primario que componen la mezcla. Al dato del PM se le suma la
antigenicidad de estos componentes analizados.
Anexo
A modo de ejemplo, se describen los pasos necesarios para realizar un inmunoblot utilizando la
cuba Mini-Protean II (nombre comercial del equipo provisto por laboratorios Bio-Rad).
Materiales necesarios:
Guantes libres de talco
2 Esponjas finas tipo Scotch Brite
2 hojas de papel Whatman 3MM o equivalente
Membrana de nitrocelulosa
Aparato de electrotransferencia o electroblotting
Lapicera que permita marcar la membrana aunque esté humedecida.
64
membrana sobre el gel, ya que algunas proteínas comienzan a transferirse tan pronto como
el gel toma contacto con la membrana.
7. Se coloca una segunda pieza de papel Whatman pre-humedecido y de esponja y se
completa el armado cerrando el soporte de transferencia.
8. Se colocan los dos soportes armados en la cuba “ad hoc”. Se debe tener la precaución de
controlar los códigos de colores que indican los electrodos. Como las proteínas están
cargadas negativamente porque están recubiertas con SDS, se mueven hacia el ánodo (+:
base roja).
9. Se coloca el contenedor con hielo dentro de la cuba y se llena la cuba con buffer de
transferencia. El nivel del buffer debe superar el borde superior de la membrana, con el
objetivo de que ésta quede sumergida por completo y la transferencia sea pareja.
10. La transferencia se puede realizar durante 1 hora a 100 V agregando un refrigerante en la
cuba durante 16 horas a 15-30 V en una habitación refrigerada y con agitación del buffer.
11. Cuando el tiempo se ha cumplido, se desconecta la cuba de la fuente de poder y se
desarma el aparato. Los geles pueden ser teñidos con Coomassie blue para determinar la
eficiencia de la transferencia. Si se utilizó un marcador de peso molecular preteñido, éste se
puede utilizar como control de la transferencia.
12. Las membranas deben ser marcadas en sus extremos y calles para poder luego determinar
la identidad de la muestra.
En este procedimiento se logra tener las muestras (antígenos) adheridas a la membrana y en
una posición conocida y determinada por su PM.
Las bandas donde hubo reacción antígeno-anticuerpo se hacen visibles por la precipitación del
colorante sobre la membrana; el fondo del papel donde no ocurrió la unión se observa blanca.
Cuando la imagen es óptima, se frena la reacción diluyendo el substrato y el colorante con
agua destilada. Luego la membrana se coloca entre papeles absorbentes y se puede registrar
el resultado mediante un scanner o cámara fotográfica.
65
El poro de la membrana puede ser de 0.45m cuando se requiere retener proteínas, pero
algunos polipétidos pueden atravesar estas membranas sin unirse. Esto puede solucionarse
utilizando membranas de poro más pequeño, como por ejemplo, de 0.1m.
Las membranas de nitrocelulosa tienen una capacidad de unión de 80g de proteína por cm2
de superficie. Otras membranas, como las catiónicas de nylon (Zeta-Probe o Bio-Rad), son
más resistentes (no se rompen al secarse) y con su utilización se obtiene una capacidad de
unión de proteínas de hasta 500g/cm2. Esta característica es ventajosa, pero por otro lado
puede ser una desventaja, ya que hace que las membranas sean difíciles de bloquear.
Inmunocromatografía
Anticuerpos de detección
m arcados con
Oro Coloidal
Antígeno en la muestra
Siembra de la muestra
NITROCELULOSA
Anticuerpo de Captura Anticuerpo de Captura
contra anticuerpo contra antígeno
de detección Específico
Resultado positivo
Resultado negativo
66
Bibliografía
Antibodies A Laboratory Manual. Ed. Ed. Harlow y David Lane. Cold Spring Harbor
Laboratory. 1988. pp726.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Instruction Manual. Bio-Rad
Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed. Interamericana.
Millipore A. A short guide for developing inmunochromatographic test strips (en línea).
2nd edition; 2001 (Fecha de acceso: diciembre 2001). URL disponible en:
http://www.com/oemproducts.
Engler KH, Efstratiou A, Norn D, Koslov RS, Selga I, Glushkevich TG, et al.
Immunochromatographic strip test for rapid detection of diphtheria toxin: description and
multicenter evaluation in areas of low and high prevalence of diphtheria. J Clin Microbiol
2002; 4(l): 80-3.
Inmunohistoquímica
Las ventajas de las técnicas inmunohistoquímicas son que permiten una localización más
precisa de la reacción antígeno-anticuerpo; la tinción es permanente, estable, puede
67
contrastarse y puede evaluarse con microscopio óptico. El material así estudiado puede
archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción.
Tiene algunas desventajas como la presencia de reacciones inespecíficas o cruzadas,
especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Los anticuerpos monoclonales han
permitido aumentar la especificidad y sensibilidad de esta técnica.
Algunos reactivos son carcinógenos potenciales y su manipulación debe ser cuidadosa,
requieren de estandarización precisa y estricto control de calidad.
Existen diversos tipos de técnicas, cuya indicación dependerá del anticuerpo a utilizar
(monoclonal o policlonal), del material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y de
los antígenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmáticos o nucleares).
Estas técnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos.
En los tejidos, las uniones inespecíficas se pueden bloquear con albúmina bovina, con leche
descremada, o con suero normal de alguna especie distinta y alejada filogenéticamente de la
que se esta estudiando.
Enzimas utilizadas:
Las enzimas más utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina, que reaccionan dando
distintos colores con los diferentes sustratos según la reacción, lo cual servirá para detectar
distintas uniones antígeno-anticuerpo.
Preparación de tejidos para inmunohistoquímica:
El éxito de la inmunohistoquímica depende de la preservación de los antígenos y del manejo de
los anticuerpos. La conservación de los tejidos por congelación puede afectar los tejidos y la
estructura celular, debido a la formación de cristales de agua intracelulares. La necesidad de
mantener la estructura tisular hace de la fijación un paso fundamental en las técnicas
histológicas. Esta necesidad de fijación se contrapone al riesgo de provocar cambios
estructurales y moleculares asociados a cualquier tratamiento de las células o tejidos
destinados a la observación microscópica. En IHQ, la fijación y el tratamiento previo de los
tejidos debe satisfacer diferentes criterios como:
Retener los antígenos
68
Preservar la antigenicidad
Preservar la estructura
Permitir la interacción antígeno- anticuerpo
Fijación:
El mayor problema que suelen presentar los fijadores químicos es que pueden impedir la unión
antígeno-anticuerpo, por el enmascaramiento del antígeno debido a cambios conformacionales
que ocurren en el antígeno (epitope). No existe un fijador universal, en todos los casos hay que
realizar distintas pruebas con diferentes fijadores (y diferentes condiciones de fijación) para
cada antígeno y para cada tejido. El fijador mas utilizado es el formol tamponado,
(formaldehído al 10 % en fosfato disódico y monobásico) debido a que es más accesible por
costos y es menos agresivo a los tejidos que el formol puro.
Preincubaciones
Una vez obtenidos los cortes y antes de iniciar las incubaciones con los anticuerpos, se han de
hacer diversas preincubaciones y lavados a fin de facilitar la penetración de los anticuerpos y
disminuir el marcaje inespecífico. Generalmente todas las preincubaciones se realizan en
soluciones fosfato o tris-HCl o bien en solución salina tamponada. En el caso de que el proceso
se realice sobre portaobjetos gelatinizados, hay que calentarlos previamente entre 37 y 50ºC
(dependiendo de la sensibilidad de los antígenos a la temperatura) durante 10 min.
Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia Directa:
69
Consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante la reacción directa con un
anticuerpo específico marcado con un colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a
través de la inoculación del antígeno en un animal de experimentación.
Inmunofluorescencia Indirecta:
En este caso se busca, en el suero del paciente la presencia de anticuerpos específicos para
un antígeno determinado. Se preparan improntas de los antígenos sobre portaobjetos, por
ejemplo T. gondii, células infectadas por virus, etc. Sobre las improntas se coloca el suero en el
cual se sospecha la presencia de anticuerpos específicos. Si la reacción es positiva, habrá
formación de complejos inmunes. Para hacer ostensible esta unión antígeno-anticuerpo, se
debe utilizar una inmunoglobulina (anti-especie o antigamma) marcada, que reaccionará con el
anticuerpo del paciente. La ventaja de la técnica indirecta es que no se necesita un anticuerpo
marcado para cada antígeno
70
autofluorescencia, que puede llevar a error cuando quien efectúa la lectura no tiene
experiencia suficiente.
Fluorocromos
Los fluorocromos son sustancias que se utilizan para marcar estos anticuerpos específicos.
Estos colorantes permiten identificar la presencia de las sustancias marcadas con ellos, cuando
son excitados por luz ultravioleta. Para unir los fluorocromos a un anticuerpo, estos deben
cumplir con una serie de requerimientos:
Que el fluorocromo desarrolle suficiente fluorescencia para que la señal emitida sea visible y
no se vea interferida por la autofluorescencia del tejido.
Que tenga un grupo funcional capaz de fijarse a la molécula de anticuerpo.
Que sea soluble en soluciones acuosas, ya que los solventes pueden producir la
desnaturalización de las proteínas durante la unión.
Que no pierdan fluorescencia al unirse con los anticuerpos.
Que no alteren la especificidad ni la actividad de los anticuerpos.
Que al formar los conjugados no pierdan su fluorescencia con la acción de la luz.
La marcación de los anticuerpos con los fluorocromos se basa en complejas reacciones que
llevan a la formación de uniones covalentes entre ellos y las moléculas de inmunoglobulinas.
Esta unión se hace a pH alcalino. Además, la conjugación entre ambas moléculas depende de
la temperatura y del tiempo de reacción.
Cuando hay un exceso de anticuerpo con respecto al fluorocromo, se obtienen conjugados que
emiten escasa fluorescencia. Cuando sucede lo contrario, es decir, cuando hay mucho
fluorocromo unido al anticuerpo, se corre el riesgo de tener marcación inespecífica.
Los isotiocianatos reaccionan con los grupos aminos libres de los aminoácidos de los
anticuerpos, particularmente de la lisina. Es importante entonces que los buffers usados para la
conjugación no tengan grupos aminos (tris, azida, glicina, amonio, etc).
El isotiocianato de fluoresceína (FITC) es el fluorocromo más usado para la conjugación con
anticuerpos. Produce una muy buena señal de color verde, que se diferencia notablemente de
la autofluorescencia generalmente más amarillenta y pálida de los tejidos. La fluoresceína es
muy sensible a las variaciones de pH: La mayor emisión se obtiene a pH 8-9. El inconveniente
más importante es que pierde color rápidamente. Por ello, durante el tiempo que se mantengan
las improntas teñidas hay que tener la precaución de guardarlas envueltas en papel de
aluminio y en un sitio oscuro, para evitar el deterioro que les produce la exposición a la luz.
Microscopio de fluorescencia
El microscopio de fluorescencia consta de:
- el microscopio óptico
- una lámpara de mercurio o halógena que emite luz ultravioleta
- un sistema de filtros:
a) El primer filtro es el de excitación o selección de luz, ubicado entre la fuente de luz y el
preparado. Tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud tal que caiga en el
rango azul, con el fin de que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y
produzca emisión de luz fluorescente.
b) El segundo filtro es el de calor y está ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitación
en los microscopios de luz transmitida, y entre la fuente de luz y el espejo dicrómico en los
microscopios de luz incidente.
c) El tercer filtro es el de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daños retinianos
que podrían ser causados por rayos ultravioletas que escapan por reflejo en el espejo
dicrómico.
71
Concentración del Anticuerpo:
Se logra mediante precipitación con soluciones saturadas de sales de amonio. Los anticuerpos
precipitados pueden permanecer en solución salina de fosfatos (PBS) a pH 7.1.
Conjugación:
Es posible conjugar las inmunoglobulinas a partir de suero completo o fracciones de suero
luego de concentrar los anticuerpos. Se debe añadir al suero buffer carbonato-bicarbonato para
mantener condiciones óptimas de pH (9.0). Se agita en baño de hielo añadiendo fluorocromo
en un período de 15 minutos, Luego se mantiene el preparado en heladera toda la noche, en
agitación, ya que la conjugación es del orden del 100% en 24 horas.
Purificación del conjugado:
Se logra mediante la eliminación por diálisis de las sales del buffer y de los elementos utilizados
como solventes del fluorocromo (acetona) que podrían dañar al conjugado. Además se utiliza
extracción con carbón o filtración en columna de sephadex para eliminar los restos de
fluorocromo que no se conjugaron y que pueden ocasionar tinción inespecífica.
72
9) Colocar una gota de líquido de montaje. Cubrir con cubreobjetos y observar en microscopio
de fluorescencia a 100 a 250X. Confirmar a 400X.
Bibliografía
1) Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center for
Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological Sciences
2) Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc. P.O. Box 502, Pullman,
WA 99163, U.S.A.
3) Immunobiology 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Schlomchik,
Mark. Garland Publishing c 2001
4) http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html
5) Manual de procedimientos. Instituto Malbrán.
Citometría de flujo
El sistema de citometría de flujo permite analizar partículas de 0,2 a 150 micrómetros. La luz
desviada por las partículas así como la fluorescencia emitida por ellas es captadas por lentes
posicionados para tal fin. Luego la información es trasmitida a detectores que producirán
señales electrónicas proporcionales a la señal óptica recibida
Es decir que el sistema electrónico convierte las señales ópticas en electrónicas para que
puedan ser procesadas por una computadora. En algunos casos, cuando el aparato tiene
sistema de separación de partículas, el sistema electrónico identifica cuáles de las células o
partículas guardar y cuáles desechar.
.
1-Sistema de fluidos
La zona del citómetro donde las células (o partículas) se juntan con el fluido se la conoce
como cámara de flujo El fluido del citómetro se encuentra a presión y conduce la muestra a
través de la cámara de flujo. Las partículas de la muestra a ser analizadas llegan separadas y
en una corriente de fluido presurizado. El propósito de este sistema es permitir que el rayo láser
atraviese la muestra justo por el centro
2-Sistema óptico
Está formando por un sistema de excitación y uno de recolección.
El sistema de excitación consiste en un láser y lentes que se usan para enfocar el rayo láser
El sistema de recolección consiste en lentes que colectan la luz emitida por la interacción entre
el rayo láser y la partícula y un sistema de espejos y filtros que encausan rangos de ondas
determinados de la luz colectada a detectores ópticos específicos.
73
Generación de dispersión:
Cuando una partícula es incidida por el rayo láser se produce una desviación de la luz
que dependerá de las propiedades físicas de las partículas, es decir: su tamaño y complejidad
interna. La membrana celular, el núcleo, y cualquier material granular que se encuentre dentro
de la célula, afectan la desviación de la luz. La forma de la célula y la topografía de la superficie
celular también contribuyen a la desviación total de la luz.
La luz desviada hacia adelante (Forward Scattered light: FSC) es proporcional a la superficie o
tamaño celular. FSC es una medida de la luz difractada y es detectada por un fotodiodo en
dirección frontal.
La luz desviada hacia el costado (Side Scattered light: SSC) es proporcional a la granularidad
celular y a la complejidad interna de las células. SSC es, esencialmente, una medida de la luz
refractada que ocurre en cualquier interfase dentro de la célula donde hay un cambio en el
índice de refracción. SSC se colecta aproximadamente a 90 grados del rayo láser mediante
lentes colectoras y luego es redireccionada a un detector.
Correlacionando las mediciones de FSC y SSC se pueden diferenciar tipos celulares en una
población heterogénea. La mayoría de las poblaciones leucocitarias pueden diferenciarse
usando FSC y SSC.
Fluorescencia:
Filtros ópticos:
Una vez que la partícula pasó a través del láser, la SSC y la señal fluorescente emitidas
van al fotomultiplicador, mientras que el fotodiodo colecta la FSC. La especificidad de un
detector para una tinción fluorescente en particular se puede optimizar colocando un filtro que
permite que sólo un rango estrecho de longitudes de onda alcance el detector.
Detección de señales:
Los fotodetectores convierten las señales de luz en señales eléctricas. La intensidad de
las señales eléctricas es proporcional a la intensidad de las señales de luz.
Cuando la partícula se interpone en el haz de láser y comienza a desviar la luz o producir
fluorescencia, se crea un pulso. El punto más alto de este pulso ocurre cuando el rayo incide
sobre el centro de la partícula y se capta el máximo de luz desviada o fluorescencia emitida. A
medida que la partícula se aleja del rayo, el pulso baja a la línea de base.
74
Una vez que las señales de luz (fotones) golpean al fotodiodo, son convertidos en un número
proporcional de electrones que se multiplican para crear una corriente eléctrica mayor. La
corriente eléctrica viaja al amplificador y se convierte en un pulso de voltaje; este pulso
depende del número de fotones detectados por el fotomultiplicador.
75
Gate 1
Muestra
Fluorescencia Verde
Láser
Dispersor de luz de
90º (granulosidad)
Collar de Dispersor de luz
carga frontal (tamaño)
- +
Tubos colectores
Desechos
Una vez adquirida la muestra, los datos son guardados en la computadora del citómetro y
pueden ser analizados en cualquier momento y de diversas maneras. Por ejemplo:
76
barreras establecidos no son para la toma de muestras, sino para el análisis de muestras ya
adquiridas por el citómetro. Esto quiere decir que si el operador se equivocó cuando definió los
parámetros de adquisición de la muestra, esos datos los perdió. Por eso es muy importante
conocer el material en análisis.
Por ejemplo, se puede establecer un gate sobre la población linfocitaria, para obtener y
analizar los datos de los eventos que se encuentran exclusivamente en esa región
determinada.
Los datos obtenidos de esta región delimitada, se analizan en otros gráficos: histogramas de un
parámetro, gráficos de puntos de dos parámetros, curvas tridimensionales, etc. A partir de
estos datos luego se obtienen análisis estadísticos, que también son producidos por el sistema
de análisis de datos del citómetro.
Por ejemplo, un histograma permite analizar un parámetro contra el número de eventos.
Siempre se usa un control negativo para saber dónde hay que ubicar los marcadores sobre el
histograma (Ver figura1a y b derecha). Estos marcadores son usados para especificar el rango
de eventos que serán considerados positivos para un parámetro. Una vez que se ha
establecido el primer marcador sobre el control negativo (M1) se ubica el segundo marcador
sobre el pico del histograma que contiene la población considerada positiva (M2).
Un gráfico de puntos (dot plot) muestra los datos de dos parámetros. Cada punto puede
representar uno o más eventos, de acuerdo a lo establecido por el operador. (Ver figura 1b
izquierda y figura 2)
El marcador de cuadrantes divide un gráfico de dos parámetros en cuatro secciones y permite
distinguir poblaciones negativas, positivas y doble positivas.
- El cuadrante inferior izquierdo (LL) muestra la población negativa para ambos parámetros.
- El cuadrante superior izquierdo (UL) muestra la población que es positiva para el parámetro
graficado sobre el eje vertical.
- El cuadrante inferior derecho (LR) muestra la población positiva para el parámetro graficado
sobre el eje horizontal.
- El cuadrante superior derecho (UR) muestra la población positiva para ambos parámetros.
FiGURA 1a
Negativo Positivo
M1 M2
Nº de células
Fluorescencia
77
SSC-H: Granulosidad y complejidad de la partícula
FSC-H: Tamaño de la partícula
78
El sistema de separación de partículas permite capturar aquéllas consideradas de interés para
análisis posteriores. Una vez colectadas, estas partículas pueden ser examinadas
microscópica, bioquímica o funcionalmente.
No todos los citómetros están equipados para hacer separación de partículas.
Para efectuar la separación de partículas, el equipo debe primero determinar cuáles son las de
interés. Una vez que la población de interés ha sido identificada en una curva de adquisición de
datos, se dibuja una región alrededor de ella. Luego se carga esta información en el citómetro
como “región de separación”. Esta región identifica aquellas células que serán separadas de la
corriente de fluido por donde transita toda la muestra.
A medida que cada célula pasa por el láser, el equipo determina si la misma pertenece a la
población de interés. Dado que el alineamiento del láser y la velocidad de la corriente son fijos,
el tiempo que toma el pasaje de las células a separar desde el láser hasta el tubo de captura,
es constante.
Bibliografía:
1. Roum. Biotechnol. Lett., Vol. 6, No. 3, 2001, pp. 177.206. Bucharest University, Center for
Research in Enzymology and Biotechnology, Roumanian Society of Biological Sciences
2. Veterinary Medical Research and Development, 2003 VMRD, Inc . P.O. Box 502,Pullman,
WA 99163, U.S.A.
3. Immunobiology 5th ed Janeway, Charles A.; Travers, Paul ; Walport, Mark ; Schlomchik,
Mark. Garland Publishing c 2001
4. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html
Las reacciones secundarias pueden observarse a simple vista y reciben diferente nombre
según el antígeno involucrado en la reacción sea soluble o particulado.
Si el antígeno es soluble, hablamos de una reacción de precipitación.
Si el antígeno es particulado, hablamos de una reacción de aglutinación.
1. PRECIPITACIÓN
Cuando un anticuerpo bivalente es puesto en contacto con un antígeno polivalente soluble
(proteínas, virus) contra el cual el Ac es específico, se forman complejos Antígeno-Anticuerpo
(Ag-Ac) que se insolubilizan y dan lugar a una reacción de precipitación.
En los agregados de complejos Ag-Ac, cada molécula de antígeno está unida a más de una
molécula de anticuerpo y cada molécula de anticuerpo está unida a más de una molécula de
antígeno.
79
Cuando los complejos Ag-Ac se producen con haptenos monovalentes o antígenos que
poseen un solo determinante antigénico por molécula, la precipitación no se produce.
Un hecho particular lo constituyen los anticuerpos monoclonales, que en su mayor parte no
muestran actividad precipitante. Esto se debe a que en muchos de los casos los anticuerpos
monoclonales reconocen a un único epitope no repetido, lo que les impide formar agregados
(micelas) aunque el antígeno sea una macromolécula (figura 1).
Cuando se utilizan sueros inmunes obtenidos a partir de animales inoculados con estas
mismas macromoléculas la precipitación sí tiene lugar, pues en estos sueros hay una
mezcla de anticuerpos que reconocen distintos epitopes del mismo antígeno, lo que
posibilita la formación de complejos mixtos Ag-Ac insolubles.
La formación de estos complejos ha sido explicada mediante la teoría del enrejado, que
considera que la composición del precipitado formado es una consecuencia del modo en que el
anticuerpo y el antígeno se han unido.
Dada la bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antígeno, las posibilidades de
combinación varían según sea que en la mezcla exista exceso de antígeno, exceso de
anticuerpo o equivalencia de ambos (figura 2).
Figura 1
80
Figura 2
81
Los anticuerpos asimétricos deben ser tenidos en cuenta en la interpretación de los resultados
de las pruebas de diagnóstico. Las pruebas que se basan en reacciones de interacción
primaria (como ELISA o IFI) miden todos los anticuerpos específicos presentes en la muestra.
Por el contrario, las pruebas que se basan en reacciones de interacción secundaria (como
precipitación, aglutinación y fijación de complemento), sólo detectan anticuerpos
funcionalmente bivalentes o polivalentes (no así los anticuerpos monovalentes).
Las proporciones relativas de anticuerpos simétricos / asimétricos presentes en los sueros
hacen que cada prueba deba interpretarse de manera diferente, dado que una misma muestra
arrojará diferentes títulos de anticuerpos en las diferentes pruebas a las que sea sometida,
según sea el tipo de anticuerpos que identifique la prueba. Estas diferencias deben tenerse en
cuenta cuando se realizan estudios de respuesta inmune humoral, correlaciones entre nivel de
anticuerpos y evolución de un proceso infeccioso o grado de protección contra el antígeno en
estudio.
Según sea el medio en que se realice la prueba, la precipitación puede ser en medios líquidos
o en medios con geles.
MÉTODO:
Se coloca en una serie de tubos 0,2 ml del suero con Ac específicos para el antígeno en
estudio.
Se añade luego por las paredes 0,2 ml de la muestra sospechosa de contener el antígeno, en
diluciones seriadas.
Se deja en baño de María a 37 ºC durante una hora y se observa si en alguno de los tubos
aparece un precipitado anular blanco que indica reacción positiva en ese tubo, es decir
correspondencia entre Ag y Ac específicos que producen el enrejado en el tubo que contiene
las concentraciones óptimas de ambos reactantes.
82
gradiente de concentración. En la interfase líquido-gel no se forma precipitado debido a la alta
concentración antigénica en esta zona. La precipitación aparece en forma de bandas en la
zona donde la concentración del antígeno que ha difundido es la óptima. Si en el suero hay
más de un anticuerpo y en la solución añadida hay más de un antígeno que se correspondan,
se formarán tantas bandas de precipitación como sistemas hayan interaccionado.
Difusión bidireccional
En este caso ambos reactivos (antígeno y anticuerpo) migran hacia un gel intermedio (sin
reactivos) por diferencias de concentración y forman el enrejado (precipitación visible) en la
zona en la cual se encuentran la mayor concentración de complejos inmune asociados.
MÉTODO:
Mezclar partes iguales de agar al 1% (fundido y enfriado a 50 ºC) y el antisuero con
especificidad contra el antígeno en estudio.
Transferir 1 ml de la mezcla al tubo de reacción, y enfriarlo rápidamente para que solidifique.
Inmediatamente después, añadir 0,5 ml de agar al 0,5% fundido y enfriado a 50 ºC.
Una vez solidificado, agregar 1 ml de una mezcla en partes iguales de agar al 1% y antígeno.
Después de la solidificación, dejar los tubos a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas
convenientemente tapados para evitar evaporaciones (*2)
Proceder a la lectura de los resultados. Los anticuerpos y las partículas antigénicas difunden
desde la zona de agar al 1% hacia la zona de agar al 0,5%. En el punto de encuentro se
forma la banda de precipitado.
83
En los orificios restantes, colocar 2 microlitros de cada una de las diluciones del antígeno
patrón, de concentración conocida.
Mantener las placas a temperatura ambiente, en cámara húmeda, hasta que el halo de
precipitación no varíe.
Evaluar los resultados mediante la determinación del diámetro de los halos de precipitación.
Los resultados pueden leerse sobre el material fresco o después de lavar las placas (Ver
método más adelante).
Difusión doble en placa, Inmunodifusión doble o técnica de Ouchterlony
Ouchterlony describió un método interesante de difusión doble en placas, el cual
consiste en enfrentar las soluciones de antígeno y anticuerpo en perforaciones efectuadas en
el gel (agar) a distancias convenientes.
De esta manera, ambos difunden a través del agar, se ponen en contacto y producen una
banda de precipitación cuando las respectivas concentraciones están en relación óptima.
- Si las concentraciones de Ag y Ac colocados en los reservorios son las que corresponden a la
zona de equivalencia, la banda de precipitación se forma aproximadamente en la distancia
media que separa esos reservorios.
- Cuando hay exceso de antígeno, la banda de precipitación se forma próxima al reservorio del
anticuerpo
- Cuando hay exceso de anticuerpo, la banda de precipitación se forma próxima al reservorio
del antígeno.
Con esta técnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos moleculares de los
antígenos y anticuerpos reaccionantes, cuando se trabaja con concentraciones óptimas de Ag
y Ac.
- Si la banda de precipitación formada es recta, indica que los pesos moleculares de ambos
son muy próximos.
- Si la banda es cóncava con respecto al reservorio del antígeno, señala que el peso molecular
de éste es superior al del anticuerpo.
- Si la banda es convexa con respecto al reservorio del antígeno, señala que el peso molecular
de éste es menor que el del anticuerpo
Los dos fenómenos descritos son una consecuencia de las leyes generales de la difusión, que
establecen que la distancia a la que una sustancia difunde está en relación directa con su
concentración y en relación inversa con su peso molecular.
Dependiendo de la cantidad de muestras a analizar o del tipo de estudio a realizar, se emplean
distintos esquemas reactivos, como por ejemplo:
1) 2) 3) 4)
84
Figura 3
- En el caso I, los dos sistemas Ag-Ac que reaccionan son iguales y se funden en una única
banda de precipitación (reacción de identidad).
- En el caso II hay dos sistemas Ag-Ac diferentes que reaccionan independientemente y
cada uno produce una banda de precipitación que se cruzan (reacción de no-identidad)
evidenciando la presencia de reacciones Ag.-Ac diferentes.
- En el caso III, uno de los antígenos tiene un epitope que no existe en el otro. Por lo tanto
ambas bandas de precipitación se unen y funden parcialmente en una banda, apareciendo
una prolongación o espolón en la banda correspondiente al antígeno que contiene los dos
epitopes. Este espolón indica que en este antígeno “ab” hay componentes antigénicos no
compartidos con el antígeno “b” (reacción de identidad parcial).
La difusión doble en placa es un excelente método para el estudio de la homogeneidad de
antígenos y anticuerpos purificados. Resulta muy útil también para la búsqueda de impurezas,
lo que está limitado por la concentración en que éstas se encuentren presentes, ya que la
precipitación se hace visible cuando los reactivos exceden valores mínimos. Para obviar este
inconveniente, se emplean generalmente altas concentraciones de Ag y Ac, lo que permite
aumentar la concentración de las impurezas y asegurar su precipitación.
La inmunodifusión doble es utilizada ampliamente en el diagnóstico serológico de varias
enfermedades en Medicina Veterinaria, por ejemplo para el diagnóstico serológico de la
Anemia Infecciosa Equina, método denominado “Test de Coggins” (figura 4). En esta prueba,
en una perforación central se coloca un purificado proteico del virus de la anemia infecciosa
equina y en seis perforaciones equidistantes del antígeno y entre sí, se intercalan sueros de
animales positivos (suero control positivo) y sueros de animales que se desea investigar
(sueros problema: S1, S2 y S3).
- Si el suero problema es negativo (S3) las bandas de precipitación de los dos sueros
positivos adyacentes se introducen en la perforación.
- Si el suero problema es positivo (S2), se forma una banda de precipitación entre el suero
problema y el antígeno que se fusiona con las bandas de precipitación de los dos sueros
positivos adyacentes (reacción de identidad).
- Si la banda del suero positivo se dobla pero no forma una banda de identidad completa, el
suero problema es considerado positivo débil (S1).
En cualquiera de estos dos últimos casos el animal se considera infectado.
Este esquema también se emplea para el diagnóstico serológico de otras enfermedades como
Fiebre Aftosa en bovinos, Brucelosis en caninos (Brucella canis) u ovinos (Brucella ovis ) o la
Enfermedad de Marek en aves.
85
Figura 4
Ag: antígeno
S1
+ + +: suero control positivo
MÉTODO:
En una placa de Petri o un portabojetos se vierte el agar fundido y enfriado a 50ºC. Se deja
solidificar y se confeccionan los orificios con un sacabocados.
Para las pruebas diagnósticas de rutina en Medicina Veterinaria, se coloca el antígeno en el
orificio central y en los orificios exteriores se intercalan el suero control positivo y cada uno
de los distintos sueros problema.
Las placas o portaobjetos se mantienen en cámara húmeda. La lectura de los resultados se
efectúa a las 48 - 72 horas.
Si interesa conservar los resultados, el agar puede colorearse, previa desecación.
- En este caso, el agar debe lavarse previamente por inmersión en solución salina durante un
total de 24 a 48 horas, efectuando el recambio de la solución salina cada 12 horas. Este
lavado es necesario para eliminar las proteínas no precipitadas.
- Luego del lavado, el agar se cubre con un trozo de papel de filtro húmedo y se deja secar a
temperatura ambiente.
- Una vez seco, se retira el papel y se lo sumerge en la solución colorante Azul de Coomasie
durante aproximadamente 1½ hora. El exceso de colorante se elimina por inmersión en
solución decolorante y se procede luego al secado en estufa a 50 ºC.
2. AGLUTINACIÓN
Cuando un anticuerpo (bi o polivalente) es puesto en contacto con el antígeno para el
cual es específico, si este antígeno es polivalente y se encuentra en estado particulado
(hematíes, bacterias, células), se forman complejos Ag - Ac que dan lugar a una reacción de
aglutinación.
Esta reacción puede observarse micro o macroscópicamente como agregados o grumos de
número y tamaño variable.
Los principios que regulan la aglutinación son los mismos que regulan la precipitación; la
ocurrencia de uno u otro fenómeno depende de que el antígeno sea particulado (se encuentre
en suspensión) o soluble (en solución).
La aglutinación se lleva a cabo en medio salino. La concentración óptima de electrolitos es de
0,15 M. Se cree que el mecanismo de aglutinación se debe a que los iones neutralizan en parte
las cargas superficiales de las partículas antigénicas, evitando el rechazo entre ellas y
asegurando la aproximación indispensable para que una molécula de anticuerpo reaccione
con al menos dos partículas antigénicas. De esta manera se inicia la formación de los
complejos inmunes que llevan a la aglutinación.
86
2.a. Aglutinación cualitativa;
Los métodos de aglutinación cualitativa son muy utilizados en serología diagnóstica con el
objeto de identificar bacterias, tipificar grupos sanguíneos, etc. En estos casos es indispensable
disponer de anticuerpos monoespecíficos.
Estas reacciones se efectúan en portaobjetos mezclando las suspensiones de bacterias o
hematíes a identificar, con una batería de anticuerpos con diferente especificidad. La presencia
de aglutinación indica la especificidad del sistema reaccionante.
MÉTODO (Identificación de microorganismos):
Se suspende el cultivo microbiano en estudio en solución salina, procurando que la
suspensión sea lo más densa posible (no menos de 2 x 10 10 bacterias/ ml).
En un portaobjetos se coloca una gota de cada uno de los antisueros específicos (por
ejemplo, suero anti Escherichia coli K88, suero anti E. coli K99 y suero anti E. coli F41) y otra
de solución salina (control negativo), de modo que estén a una distancia tal que se evite su
mezcla accidental.
A cada una de estas gotas, se añade un volumen igual de la suspensión bacteriana y se
mezcla para homogeneizar. El portaobjetos se agita suavemente por rotación manual.
Se incuba durante unos minutos a temperatura ambiente y se observa. La aparición de
grumos o agregados en alguna de las mezclas indica la identidad de la bacteria en estudio.
Estos grumos son de tamaño variable. A veces son visibles a simple vista pero otras veces es
necesario el uso de lupa o microscopio para observarlos.
87
Nacional de Erradicación de la Brucelosis Bovina” se basa en la vacunación obligatoria de las
terneras entre los 3 y 8 meses de edad y en la posterior identificación y segregación de los
animales infectados. La identificación de los animales infectados se realiza a través de la
detección de anticuerpos específicos contra Brucella abortus.
En el caso particular de la cepa 19 de B. Abortus, la vacunación desencadena en el animal
una respuesta inmune primaria, con niveles de IgM que se mantienen en el tiempo y niveles
bajos de anticuerpos de tipo IgG. Las técnicas serológicas de aglutinación rápida y lenta se
emplean para diferenciar los animales que presentan anticuerpos de tipo IgM a consecuencia
de la vacunación de aquellos que presentan anticuerpos de tipo IgG inducidos por una
infección activa con la cepa de campo.
Los sueros problema son analizados por la prueba de B.P.A, que permite la identificación de
los animales que presentan anticuerpos específicos contra Brucella abortus. Esta prueba es
muy sensible pero poco específica y además no permite discriminar si los anticuerpos que
reaccionan son de tipo IgG o IgM. Por lo tanto, las muestras que resultan positivas a B.P.A. son
analizadas luego por las pruebas de Wright y por la Prueba del 2-mercaptoetanol. En ambos
casos se enfrentan diluciones seriadas del suero problema con una suspensión estandarizada
de Brucella abortus cepa 19. Los tubos de la prueba de 2-mercaptoetanol (2-ME) son tratados
previamente con una solución de 2-ME que destruye los puentes disulfuro de las IgM, por lo
que estos anticuerpos pierden su poder aglutinante. De esta manera, si se observa aglutinación
aún en los tubos tratados con 2-ME, significa que la aglutinación es debida a la presencia de
anticuerpos de tipo IgG. Los animales que resultan positivos a esta prueba son considerados
como infectados y deben ser segregados del rodeo.
MÉTODO:
Colocar 60ul de suero a analizar en el pocillo número 1 de una placa de microaglutinación
con pocillos de fondo cónico.
Colocar una gota de buffer borato a temperatura ambiente desde el pocillo número 2 al
número 8.
Diluir el suero en el buffer borato utilizando un microdilutor, descartar el excedente del
pocillo número 8).
Colocar una gota de antígeno de toxoplasma en todos los pocillos.
Agitar las placas enérgicamente durante 30 segundos cuidando de que no se derrame el
contenido de los pocillos.
Colocar un film plástico a fin de evitar la desecación e incubar 24 horas a temperatura
ambiente.
88
transformar la reacción de precipitación en una reacción de aglutinación. Esto se ha logrado
con magníficos resultados mediante la fijación de antígenos solubles a hematíes o partículas
inertes como el poliestireno, el látex y la bentonita.
A la reacción que resulta del empleo de glóbulos rojos como soporte se la llama
Hemoaglutinación pasiva, y simplemente Aglutinación pasiva cuando se utilizan otros
soportes.
Generalmente las uniones de los antígenos a los soportes son no covalentes y la fijación se
obtiene por mezcla directa. En el caso de los hematíes, la fijación de hidratos de carbono no
necesita intermediarios; en cambio para la fijación de proteínas es necesario el tratamiento
previo de los glóbulos rojos con aldehídos simples como el fórmico o pirúvico.
La aglutinación pasiva es un método semicuantitativo que, al igual que la aglutinación, permite
determinar concentraciones relativas de anticuerpos sobre la base de la máxima dilución
aglutinante. Es cuatro veces más sensible que la aglutinación y mucho más aún que la
precipitación. Esto es consecuencia del tamaño de las partículas antigénicas que intervienen
en la reacción. En la precipitación, el antígeno es pequeño y se necesitan muchos complejos
Ag-Ac agregados para que la reacción se visualice, en tanto que en la aglutinación pasiva se
ha transformado al antígeno en una partícula de gran tamaño, capaz de dar aglutinados
visibles con unos pocos complejos Ag-Ac. El número de moléculas de anticuerpo que
intervienen en uno y otro caso difieren muchísimo, de ahí la distinta sensibilidad (límite de
detección).
La reacción se efectúa colocando en tubos distintas diluciones del suero a valorar y un volumen
determinado del antígeno fijado al soporte. Anticuerpo y antígeno se mezclan mediante
agitación suave y se incuban durante un tiempo determinado, en general a temperatura
ambiente. Los tubos se observan sin centrifugar, por la parte inferior, para determinar si ha
habido aglutinación.
Esta técnica se emplea para investigar hormonas y antígenos solubles en sangre, orina y otros
fluidos.
Fenómeno de Prozona:
Cuando se valora un antisuero, la disminución de la concentración de los anticuerpos por el
efecto de la dilución del suero hace que la reacción de aglutinación decrezca hasta hacerse
nula. No obstante ello, en algunos sueros se observa un comportamiento particular que está
caracterizado por la ausencia de aglutinación en los primeros tubos de la serie, en los que la
concentración de anticuerpos es máxima, y aglutinación positiva a diluciones mayores del
suero. A este fenómeno se lo llama prozona.
Mediante el empleo de anticuerpos marcados se ha podido demostrar que en estos tubos, aún
en ausencia de aglutinación, el anticuerpo está unido al antígeno. Puesto que existe un
marcado exceso de anticuerpos respecto a los determinantes antigénicos, estadísticamente es
muy poco probable que los dos fragmentos Fab del anticuerpo puedan unirse a dos epitopes
ubicados en partículas diferentes. Este fenómeno además está relacionado con los anticuerpos
asimétricos o monovalentes mencionados anteriormente. La reacción de Coombs permite
identificar estas reacciones incompletas. (Ver capítulo de grupos sanguíneos y reacciones post-
transfusionales).
Todo esto indica la necesidad de evaluar los sueros a más de una dilución para descartar los
falsos negativos debidos al fenómeno de prozona.
Bibliografía
1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana.1º edición,
septiembre de 1986.Capítulo 6.
2. Margni R. A. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Bs. As. Editorial medica
Panamericana 5º edición septiembre de 1996. Capítulo I.
3. Inmunología básica. Guía de trabajos prácticos. Fac. Cs. Veterinarias. Año 2000.
4. Guerrero R.; Gonzalez C.L.; Medina E.L.; Epidemiología.E.A.U.: Editorial: Addison-Wesley
Iberoamericana.1° edición, 1981. Edición consultada, 1986. Capítulo 14.
89
5. Manual de Procedimientos para el Diagnóstico de la Brucelosis Bovina. Departamento de
Brucelosis. DILACOT – SENASA. 2000
90
anticuerpos naturales en la población, determinan que una primera transfusión de sangre
incompatible, cualquiera sea el grupo sanguíneo al que pertenezcan los eritrocitos
transfundidos, no produzca una rápida destrucción masiva, sino las siguientes consecuencias:
- Estimulación de una respuesta inmune primaria que disminuye la vida media de los
eritrocitos transfundidos, pues los mismos son destruidos progresivamente a medida que la
respuesta inmune se desarrolla.
- Vida media más breve de los eritrocitos transfundidos si la incompatibilidad se debe a
antígenos contra los cuales el receptor posee anticuerpos naturales.
- Sensibilización del animal receptor a los Ags del grupo sanguíneo incompatible
transfundido. De este modo, en futuras transfusiones con sangre incompatible de igual
grupo que la primera se producirá una respuesta inmune secundaria. Este efecto es
importante para grupos que provocan reacción fuertemente hemolítica (DEA1.1 y en menor
medida DEA1.2).
- Posible sensibilización de la madre DEA1.1 negativa a los eritrocitos DEA1.1 del feto
durante la preñez (25 % de incidencia). Esta situación es equivalente a la sensibilización
por transfusión. En cuanto al recién nacido, éste puede llegar a tener problemas de
hemólisis intravascular al mamar calostro que contiene los anticuerpos maternos contra su
grupo eritrocitario (ver isoeritrólisis neonatal).
91
PRUEBA DE COOMBS
La aglutinación es la manifestación visible de una reacción Ag-Ac en la cual el Ag es
particulado, como por ejemplo las bacterias y los eritrocitos.
Sin embargo, en algunos casos, si bien tiene lugar la reacción Ag-Ac no se produce la
esperada manifestación visible, o sea, la formación de lo que se denomina “enrejado” y que se
visualiza en forma de aglutinación.
Diversas son las causas que pueden concurrir para producir este efecto:
a- Exceso de Acs: En este caso, cada molécula de Ac se uniría con la totalidad de sus
valencias a una misma partícula antigénica. Así, sería imposible la formación del enrejado
pues no se producirían puentes de Acs entre las moléculas de Ag.
b- Presencia de Acs monovalentes: Son Acs que debido a determinadas características de
glicosilación se comportan como monovalentes, imposibilitando la formación del enrejado.
Los Acs contra Ags eritrocitarios pertenecen en su mayoría a este grupo.
c- Defecto de Acs: La cantidad de Acs específicos contra el Ag es muy escasa, y no alcanza
para formar un enrejado del tamaño suficiente como para que resulte visible.
La prueba de Coombs, también llamada de la antiglobulina, permite evidenciar estas
reacciones Ag particulado-Ac mediante el agregado de anti-Igs de la especie. Las anti-Igs
agregadas (también llamadas suero de Coombs), harán de puente entre las regiones Fc de los
Acs unidos a las partículas antigénicas, formando de este modo el enrejado que se ve en forma
de aglutinación. La prueba de Coombs puede ser directa o indirecta.
La técnica de Coombs directa consiste en el agregado de la anti-Ig a una suspensión de
partículas de la que nos interesa saber si ya llevan unidas anticuerpos. El diagnóstico de la
anemia hemolítica autoinmune, caracterizada por la presencia de auto-Acs contra los eritrocitos
propios, constituye un ejemplo de uso de esta técnica directa y consiste en el agregado del
suero de Coombs a una suspensión de eritrocitos de un animal sospechoso de sufrir la
enfermedad.
La técnica de Coombs indirecta, en tanto, consiste en el agregado de anti-Ig de la especie a
una reacción previa de aglutinación que ha resultado negativa. Por lo tanto, implica dos pasos:
una primera incubación de la suspensión de Ag particulado con el antisuero y una segunda
incubación luego del agregado del suero de Coombs. De este modo podemos diferenciar los
resultados falsos negativos, cualquiera sea la causa que los provoque, de los resultados
negativos reales debidos a la ausencia de Acs específicos. La prueba de Coombs indirecta
resulta de suma utilidad para evidenciar los fenómenos de prozona y para la tipificación de
grupos sanguíneos. La reacción de Coombs se esquematiza en la figura 1.
Figura 1
92
ISOERITRÓLISIS NEONATAL
Esta enfermedad, también denominada ictericia hemolítica del recién nacido, se produce
cuando la madre transmite Acs contra los Ags eritrocitarios del cachorro a través del calostro,
provocando en el cachorro una reacción de hemólisis intravascular aguda. Puede producirse
cuando una madre DEA1.1 negativa, previamente sensibilizada al Ag eritrocitario DEA1.1, tiene
un cachorro DEA1.1 positivo. El resto de los Ags de grupos sanguíneos carecen de relevancia
en lo que respecta a esta enfermedad, debido a que son Ags débiles y no provocan reacciones
de hemólisis intravascular.
La sensibilización de la madre puede suceder por dos circunstancias:
a- Que alguna vez haya recibido una transfusión de sangre DEA1.1.
b- Que en una anterior preñez de un cachorro DEA1.1 positivo, los eritrocitos del feto hayan
pasado a la circulación sanguínea materna.
Este hecho, que cuando sucede tiene lugar en fecha cercana al parto, estimula la producción
de una respuesta inmune específica de tipo primaria en la madre. Esta respuesta da lugar a
una muy baja o nula cantidad de Acs anti-DEA1.1 al momento de la producción de calostro, por
lo que no hay riesgo de isoeritrólisis neonatal en esta primera preñez. No obstante, la madre
queda sensibilizada para futuras gestaciones.
En una posterior gestación de un cachorro DEA1.1 y en el caso de que los eritrocitos del feto
pasen a la circulación materna, la hembra ya sensibilizada (cualquiera sea la causa de la
sensibilización) responderá a este estímulo antigénico con una respuesta de tipo secundaria.
Esta respuesta dará lugar a una rápida síntesis de una elevada tasa de Acs que serán
transmitidos al recién nacido mediante el calostro. Los Acs anti-DEA1.1 al unirse a los
eritrocitos del neonato, provocarán la activación de la vía clásica del complemento con la
consecuente hemólisis intravascular aguda.
La isoeritrólisis neonatal puede prevenirse si se evita que el recién nacido mame calostro, pero
dado que el calostro es un alimento fundamental, no conviene privar de él al cachorro a menos
que exista la seguridad de la presencia de Acs anti-eritrocitos.
La realización de una prueba cruzada entre el suero o plasma de la madre y los eritrocitos del
recién nacido, es la herramienta con que se cuenta para tomar la decisión: Un resultado
positivo hace contraindicado el mamado de calostro. Es posible realizar esta prueba antes del
parto utilizando los eritrocitos del padre; de este modo obtenemos el dato con anticipación para
poder preparar el manejo adecuado del recién nacido en caso de que la prueba arroje
resultado positivo (administración de calostro artificial, búsqueda de nodriza, etc)
APENDICE
93
Grupos sanguíneos del equino
La determinación de grupo sanguíneo en el equino se puede utilizar para la determinación de
paternidad. También es una técnica corriente en esta especie debido a la incidencia de anemia
hemolítica del recién nacido.
Sistemas Alelos o factores Grupos sanguíneos (1)
A A1 - A` - H - A - H - a A1 - A` - H - A1A` - A1H - A`H - A1A`H - (-)
D D-J-d D - J - DJ - (-)
P P1 - P` - p P1 - P` - P1P` - (-)
Q Q - R - S - QR - RS - q Q - R - S - QR - QS - RS - QRS - (-)
C C-c C - (-)
K K-k K - (-)
T T-t T - (-)
U U-u U - (-)
Bibliografía:
1. Halle A. Canine blood groups and their importance in veterinary transfusion and medicine.
Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. Vol. 25, Number 6, Nov. 1995,
1323-1332.
2. Giger U et al. An acute hemolytic transfusion reaction caused by dog erythrocyte antigen 1.1
incompatibility in a previously sensitized dog. JAVMA, Vol. 206, May 1, 1995, 1358-1362.
3. Margni R. A. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Bs. As. Editorial Médica
Panamericana. 5º edición, septiembre de 1996.
4. Tizard, I. Inmunología Veterinaria. Ed. Interamericana. M.C.Graw – Hill. 4° Edición, 1995.
94
Metodología (Figura 1):
A) Obtención de las células mononucleares por separación en gradiente de densidad
Se centrifuga sangre heparinizada sobre una columna de un reactivo denominado Ficoll-
Hypaque o similar. Este reactivo tiene la propiedad de crear un gradiente de densidad durante
la centrifugación, en el que cada componente de la sangre se ubica en un diferente nivel. De
mayor a menor densidad (desde el fondo a la boca del tubo) se obtienen los siguientes
estratos: eritrocitos, polimorfonucleares, Ficoll-Hypaque, células mononucleares y plasma.
El halo formado por las células mononucleares (linfocitos y un mínimo porcentaje de monocitos)
se aspira con una pipeta.
Las células obtenidas se lavan con solución salina y se resuspenden en medio de cultivo a la
concentración celular de uso.
B) Cultivo en microplacas de 96 hoyos
Las células se resuspenden en medio de cultivo y se siembran en microplacas de cultivo de 96
hoyos. En estas placas vamos a tener:
Hoyos controles, que contienen la suspensión celular sin estimular.
Hoyos estimulados, que contienen la suspensión celular a la que se le agrega el estímulo
proliferativo, ya sea mitógeno inespecífico o antígeno.
Ambos tipos de cultivo se realizan al menos por triplicado. Las placas se incuban a 37°C en
estufa con ambiente húmedo y 5% de CO2.
C) Marcación con timidina tritiada
Luego de varios días de cultivo, se agrega timidina tritiada a cada cultivo. Las moléculas de
timidina marcadas con tritio (3H) se incorporan al ADN de las células en proliferación, que ahora
tendrán ADN tritiado en sus núcleos. Transcurridas 12 a 16 horas de cultivo con el medio que
contiene timidina tritiada, las células de cada hoyo se aspiran con un cosechador quedando
retenidas sobre filtros especiales.
D) Revelado de la proliferación
El tritio que marca las moléculas de timidina emite radiación beta que puede ser leída en un
contador de centelleo líquido y cuantificada como cuentas por minuto (cpm) o desintegraciones
por minuto (dpm). A mayor proliferación en cada hoyo, mayor será la radiactividad retenida en
cada filtro, o sea mayor el número de cpm leído.
Se realiza el promedio de los triplicados correspondientes a cada muestra. Los resultados se
expresan como índice de estimulación (I.E.), de acuerdo a la siguiente fórmula:
95
Figura 1
Sangre periférica
Gradiente de Ficoll-Hypaque
Plasma
Halo mononucleares
Ficoll Hypaque
Polimorfonucleares
Eritrocitos
Cultivo
Estimulados
Controles (SCM + medio de cultivo + estímulo:
(SCM + medio de cultivo) mitógeno o Ag)
Incubación
Cosecha
c.p.m.
96
Se ha desarrollado una variante de la metodología descripta, que utiliza directamente la sangre
entera heparinizada diluida en medio de cultivo como fuente de linfocitos. En caninos, se ha
demostrado que esta metodología es comparable y aún más reactiva que la técnica clásica
descripta. Se postula que tiene la ventaja de reproducir mejor las condiciones in vivo y evitar la
pérdida de células (supoblaciones de L con diferentes funciones) que conlleva el proceso de
purificación en gradiente utilizado en la metodología convencional.
Aplicaciones
La técnica de linfoproliferación puede aplicarse para evaluar:
La capacidad funcional de los linfocitos. Los linfocitos normales deben presentar una
respuesta proliferativa a la estimulación con mitógenos inespecíficos.
La respuesta linfocitaria frente a un antígeno determinado, que nos permite identificar la
sensibilización previa del individuo frente al antígeno.
El efecto que tienen sobre la capacidad funcional de los linfocitos, aquellas enfermedades
que provocan inmunodeficiencia (ej. moquillo canino, parvovirosis canina, leishmaniasis
canina, etc.).
El efecto de los inmunoestimulantes sobre la inmunidad celular
El efecto de diferentes tipos de vacunas o esquemas de vacunación sobre la inmunidad
celular. Para ello, se vacuna a los animales in vivo y se mide la respuesta proliferativa al Ag
in vitro.
La acción inmunosupresora de ciertos fármacos como medicamentos inmunosupresores
(utilizados para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o linfoproliferativas) o de
medicamentos cuyos efectos colaterales inmunosupresores requiere un seguimiento del
paciente.
El efecto que tienen las interleuquinas que se secretan frente a diferente tipo de situaciones
(stress, quemaduras, traumatismos, etc.) sobre los linfocitos.
Por ejemplo, la inmunodeficiencia severa combinada de los caninos (XSCID) es un desorden
genético caracterizado por la falta de funcionalidad de linfocitos B y T. En el trabajo que se cita
infrascripto, esta anomalía se evidencia in vitro mediante la prueba de proliferación linfocitaria
en cultivos estimulados con fitohemaglutinina (PHA).
Los resultados no están expresados en índice de estimulación, sino directamente en cpm.
Como puede observarse en el gráfico que se reproduce, la respuesta proliferativa de los
linfocitos en los caninos con inmunodeficiencia severa combinada es significativamente menor
a la de los linfocitos provenientes de caninos normales.
cpm 30.000
20.000
10.000
Normal XSCID
97
Cultivo mixto de linfocitos
Esta técnica se utiliza cuando es necesario evaluar la compatibilidad entre dos individuos, por
ejemplo, en caso de transplantes. Para esto se cultivan linfocitos del individuo donante junto
con linfocitos del individuo receptor.
La presencia de proliferación celular indica que existen diferencias en los antígenos de
histocompatibilidad entre los dos individuos.
Bibliografía
1. Ramayo. L G, Soba M G, Mundo S L. Evaluación de la inmunidad celular en caninos:
prueba de proliferación de linfocitos in vitro. InVet, 2005, 7 (1): 63-70.
2. Letwin, Bruce and Quimby, Fred. Effects of concanavalina-A, phytohemagglutinin,
pokeweed mitogen, and lipopolysaccharide on the replication and immunoglobulin synthesis
by canine peripheral blood lymphocytes in vitro. Immunology Letters, 14 (1986/1987), 79-85.
3. Krakowa, Steven, Ringer, Susan. Activation specificity of commonly employed mitogens for
canine B- and T- lymphocytes. Veterinary Immunology and Immunopathology, 11 (1986),
281-289.
4. Krakowa, Steven et al. Immunosuppression by canine distemper virus: modulation of in vitro
immunoglobulin synthesis, interleukin release and prostaglandin E2 production. Veterinary
Immunology and Immunopathology, 15 (1987), 181-201.
5. Millen, G.L. et al. Vaccination of racing greyhounds: effects on humoral and cellular
immunity. Veterinary Immunology and Immunopathology, 49 (1995), 101-113.
6. Cook G. et al. Transforming growth factor beta from multiple myeloma cells inhibits
proliferation and IL-2 responsiveness in T lymphocytes. J. Leukoc. Biol. 1999 Dec; 66 (6):
981-988.
7. Choudhry MA, Hockberger PE, Sayeed MM. PGE2 suppresses mitogen-induced Ca2+
mobilization in T cells. Am. J. Physiol. 1999 Dec.; 277 (6 Pt 2): R1741-8.
8. Freitag KA et al. Acute starvation and subsequent reffeding affect lymphocyte subsets and
proliferation in cats. J. Nutr. 2000 Oct.;130 (10): 2444-9.
Técnica de Seroneutralización
98
Una de las explicaciones del fenómeno de neutralización es que el anticuerpo específico
envuelve a la partícula viral e impide que ésta se ponga en contacto con las células
susceptibles.
Algunos autores afirman que hay dos etapas en la neutralización:
1) Formación de partículas no infectivas pero absorbibles a las células por los sitios libres del
virus.
2) Formación de partículas no infectivas ni absorbibles, por bloqueo de todos los sitios activos.
La presencia del virus no neutralizado se detecta a través de diferentes sistemas como cultivos
celulares (ya sean primarios, secundarios o líneas celulares), animales de laboratorio (ratones,
hámster, etc.) o embriones de pollo (utilizando distintas vías de inoculación: corioalantoidea,
alantoidea, cavidad amniótica, cerebral, venosa, etc.).
Aplicaciones
Esta técnica serológica puede ser utilizada para detectar y tipificar virus en animales
infectados o para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes en animales que han
superado la infección o han sido vacunados.
La seroneutralización permite también identificar individuos que carecen de anticuerpos
neutralizantes en su suero; estos individuos se deben seleccionar con preferencia en casos de
vacunaciones, ya que representan una población de riesgo. Recordemos que uno de los
objetivos de la vacunación es estimular la producción de anticuerpos protectores, que son los
que se evalúan por esta metodología y corresponden a anticuerpos capaces de evitar la
infección.
Con esta prueba se pueden seleccionar los animales vírgenes para las pruebas de potencia
de vacunas y también evaluar la eficacia de una vacuna en desarrollo. Sin embargo, la prueba
de seroneutralización no revela el estado inmunitario del animal en su conjunto, ya que evalúa
únicamente inmunidad humoral. Esto significa que como muchas otras pruebas, no tiene en
cuenta la actividad inmunitaria de base celular.
99
sueros. Las mezclas se incuban 1 hora a 37ºC, después de lo cual cada una de ellas se
siembra en cultivos celulares o se inocula en animales de laboratorio.
En esta reacción, el antisuero que neutraliza indica qué cepa o virus es el responsable de la
destrucción o lesión del sistema sensible. La verificación de la presencia eventual de dos o más
tipos de virus en una muestra se facilita si la neutralización se hace con todos los antisueros
existentes. Por ejemplo, en el caso de parvovirus canino, la seroneutralización se lleva a cabo
con los tres antisueros específicos para las cepas CPV2, CPV2a y CPV2b por separado y en
forma combinada para poder identificar con que antisuero(s) monoespecífico(s) se logra la
neutralización.
Para ambas técnicas se debe contar con sueros de referencia negativos y positivos.
Los sueros positivos se obtienen de animales que han estado en contacto anteriormente con el
antígeno (virus) y los negativos de animales que no han tenido contacto alguno con el mismo.
Los sueros se inactivan durante 30 minutos a 56ºC para destruir los factores termosensibles del
complemento y se titulan varias veces en cualquiera de los sistemas sensibles (células,
embriones de pollo, ratones, etc.) Por último se calcula la media de los títulos obtenidos en las
diferentes repeticiones. Estos sueros se conservan fraccionados a -70ºC.
Los sueros problema se procesan de la misma manera, es decir, se inactivan 30 minutos a
56 ºC antes de proceder a su estudio y se prueban en las diluciones de uso sobre el sistema
seleccionado para evaluar la seroneutralización, para determinar si presentan efecto de
toxicidad. En general, en bajas diluciones, la mayoría de los sueros poseen efecto tóxico.
En estos casos se debe aumentar las diluciones y considerarse en el cálculo del Índice de
Seroneutralización (ver anexo).
Título del virus - Título del virus incubado con suero problema, o
Título del virus incubado con suero normal negativo - Título del virus incubado con suero
problema
Por ejemplo,
Título de virus= 106.33
Título del virus incubado con suero problema= 103.40
IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93
10 2.93expresa las dosis neutralizantes 50% del suero problema.
100
Las técnicas descriptas para cultivos celulares se pueden realizar en frascos de cultivo o en
microplacas de cultivo, modificando los volúmenes de reacción.
A fin de facilitar la lectura del efecto citopático, se pueden utilizar colorantes sensibles al pH
en el medio de cultivo, como por ejemplo rojo fenol, que permiten determinar el estado
metabólico de la microplaca. El color será amarillo en los hoyos donde las células mantienen su
viabilidad y será rojo en los hoyos donde hubo efecto citopático.
Bibliografía
1. Guía de trabajos prácticos. Inmunología. Año 1980
2. Harris, RJC. Techniques in Experimental Virology. New York/London: Academic Press.
1964.
3. Robson, DS; Gillespie, JH; y Baker, J.A. The neutralization test as an indicator of immunity
to virus diarrhea. Cornell Vet. 50: 503-509.
4. Sorenson, DK; Chow, TL; Kowalczyk, T.; Hanson, RP.; y Brandly, CA. Persistence in cattle
of serum-neutralizing antibodies of vesicular stomatitis virus. Am. J. Vet. Res. 19: 74-77.
1958.
Anexo
Seroneutralización a Suero fijo-virus variable (SF–VV):
En esta técnica el suero problema se diluye entre 1/2,5 y generalmente no más de 1/10,
dependiendo del virus con que se trabaje. Esta dilución se siembra en cuatro tubos a razón de
aproximadamente 1ml por tubo.
Simultáneamente se procede a la dilución del virus en base 10.
Las diluciones de virus a utilizar en la seroneutralización dependen de que los animales a
evaluar sean libres o vacunados. Los rangos utilizados son arbitrarios, pero para su selección
debemos tener en cuenta el origen de los animales a evaluar:
- En el caso de ser animales libres de infección, se emplea un número bajo de dosis
infectivas ya que al tener el suero niveles mínimos o nulos de anticuerpos, se necesita
poco virus para superar el efecto neutralizante de los anticuerpos y llegar a determinar el
efecto citopático viral necesario para calcular el título.
- En cambio, si se trabaja con suero de animales vacunados, se utiliza un número más alto
de dosis infectivas ya que los niveles de anticuerpos esperados son mayores.
Una vez obtenidas las diluciones del suero y el virus, se mezclan en partes iguales y se
incuban 1 hora a 37ºC.
Luego de la incubación se siembran o se inoculan en el sistema elegido (células, ratones o
embriones de pollo). No hay que olvidarse de colocar los controles con sueros de referencia
positivos y negativos.
Estas reacciones se incuban por un período variable que depende del sistema y del tipo de
virus, pero que en general es de 3 a 10 días.
Las lecturas se realizan diariamente buscando el efecto de la infección viral según el
sistema utilizado.
- En el caso de los cultivos celulares, las lecturas se efectúan por observación
microscópica del efecto citopático que se pone de manifiesto como muerte celular,
modificación de la morfología celular, etc.
- En el caso de los huevos embrionados pueden ser la aparición de pústulas, muerte del
embrión, etc.
- En el caso de los animales de laboratorio se tendrá en cuenta si sobreviven o no.
El cálculo de los títulos se realiza utilizando el método de Reed y Muench, referido a las
dosis infectivas en cultivo de tejido al punto final 50% (TCID50, por las siglas en inglés Tissue
Culture Infectious Dosis 50%). Este término también se lo puede encontrar descrito como dosis
de efecto citopático 50% (DEC50).
En la titulación cuantitativa, el punto final se toma como la dilución en la cual cierto
porcentaje de cultivos o animales muestran lesiones. Se ha demostrado estadísticamente que
el valor más apropiado es aquél en el que la mitad de éstos muestran efecto producido por la
101
infección viral y la otra mitad no. Esta región es la que ofrece mínimo error en lo que atañe a la
variación individual en la sensibilidad al virus. La obtención de resultados estadísticos requiere
inocular el mayor número posible de réplicas y hacer diluciones poco espaciadas.
Reed y Muench idearon un método simple, denominado “método de los totales
acumulativos”. Éste se basa en considerar que los animales o cultivos celulares que recibieron
menor dosis de virus infectante y presentaron lesiones, hubieran mostrado las mismas lesiones
con virus más concentrado.
El objetivo de este método es conocer la dilución del virus que corresponde al 50% de
infección. Se utiliza un sistema de sumas para obtener los totales acumulados y obtener el
cálculo del punto final. Los valores acumulados se obtienen sumando en el sentido de las
flechas, como se esquematiza en el siguiente cuadro.
Muestras o Relación
No
animales Infectados o Valores Valores acumulados
Dilución infectados o %
infectados / muertos acumulados acumulados positivos /
de virus vivos (1)
No (positivos) positivos negativos Total de
(negativos)
infectados acumulados
10-1 4/4 4 0 19 0 19 / 19 100
10-2 4/4 4 0 15 0 15 / 15 100
10-3 4/4 4 0 11 0 11 / 11 100
10-4 4/4 4 0 7 0 7/7 100
10-5 3/4 3 1 3 1 3/4 75
10-6 0/4 0 4 0 5 0/5 0
10-7 0/4 0 4 0 9 0/9 0
DP =. % de positivos superior a 50 – 50 .
% de positivos superior a 50 - % de positivos inferior a 50
En este ejemplo,
DP = 75 - 50 = 0.33
75 - 0
Luego, (DP x log. del factor de dilución) se suma en valor absoluto al exponente de la
dilución superior a 50.
En este ejemplo,
El factor de dilución es 10 y el logaritmo de 10 es 1.
La dilución que da un porcentaje de positivos superior a 50 es 10 -5
Por lo tanto, (0.33 x 1) + 5, determina que el valor es 10 5.33
En este ejemplo,
El volumen de virus inoculado fue de 0.1 ml.
El título, por lo tanto, será: 10 5.33 x 10 = 10 6.33 TCID50/ml.
102
Título del virus - Título del virus incubado con suero problema, o
Título del virus incubado con suero normal negativo - Título del virus incubado con suero
problema
Por ejemplo,
Título de virus= 106.33
Título del virus incubado con suero problema= 103.40
IS = 106.33 - 103.40 = 10 2.93
103
Ejemplo de análisis de resultados:
DP = % de no infectados superior a 50 - 50 .
% de no infectados superior a 50 - % de no infectados inferior a 50
DP = 80 - 50 = 0.5
80 - 20
“DP x log. del factor de dilución” se suma al log. de la dilución que presenta un porcentaje de
no infectados superior al 50%, con el fin de obtener el Índice de Seroneutralización.
La dilución con un porcentaje de no infectados superior al 50% es 1/16 (log 16 es 1,2)
El factor de dilución es 2 (log.2 es 0.3), por lo tanto
IS = 0.5 x 0.3 + 1,2 = 1,35.
El antilogaritmo de 1,35 es 22,4.
Podemos decir, entonces, que 1/22,4 es la dilución del suero que protege al 50% de los
animales. En este caso se calcula el porcentaje de animales vivos o no infectados ya que se
desea conocer el poder de protección del suero.
La prueba será considerada como válida si el título de virus obtenido es el mismo que el
título previo con un margen de error de 0,3 log (una dilución) por encima o por debajo del
mismo.
Inhibición de la Hemoaglutinación
Introducción: Hemoaglutinación
La capacidad de aglutinar glóbulos rojos de ciertas especies animales (Hemoaglutinación o HA)
fue descripta para los virus de las familias Paramixoviridae, Ortomixoviridae y Parvoviridae. Las
proteínas virales responsables de esta propiedad se conocen como “hemaglutininas”. Estas
son proteínas de superficie de los viriones que se unen con receptores de la membrana de los
hematíes que poseen ácido acetil neuramínico en su composición.
Esta interacción entre los viriones y los hematíes resulta en la producción de un cuerpo
compacto. La HA se produce cuando la proporción entre la hemaglutinina viral y los eritrocitos
es óptima, permitiendo la unión de varios eritrocitos adyacentes a una unidad de hemaglutinina.
Esta característica viral nos permite identificar y clasificar virus hemaglutinantes, aislados a
partir de individuos infectados y propagados en huevos embrionarios o cultivos celulares.
Además, se puede titular virus por su efecto hemaglutinante, así como evaluar la capacidad de
un suero de inhibir esta hemaglutinación.
La técnica, que evalúa la capacidad de un suero de bloquear el efecto hemaglutinante del virus
se conoce como Inhibición de la Hemoaglutinación (IH).
Ambas pruebas (HA - IH) se realizan en microplacas de 96 hoyos con fondo en U o V.
La HA se lleva a cabo utilizando diluciones del virus en base 2 a partir de la dilución 1:2; los
glóbulos rojos (GR) capaces de ser aglutinados se colocan a una concentración final de 0.5% o
104
1%. Como diluyente de los Ag y GR se utiliza solución salina buffereada (PBS) con 0.1% de
seroalbúmina bovina (BSA).
Virus 1/2048
A
B
C
D
E
F
G
H
Interpretación de la Titulación:
El punto final de la titulación será la dilución más alta del virus en la que se observe 100% de
HA. Se considera que en esta dilución existe una (1) unidad hemoaglutinante (UHA).
105
Inhibición de la Hemoaglutinación (IH)
Las características del sistema de complemento han permitido idear una reacción
serológica denominada “Fijación de Complemento”, la que mediante un sistema indicador
permite determinar la fijación del C a cualquier complejo antígeno-anticuerpo, esté el antígeno
en solución o en suspensión. Como sistema revelador se emplea el denominado “sistema
106
hemolítico”, que consiste en una suspensión de complejos antígeno-anticuerpo formados por
glóbulos rojos de carnero y anticuerpos con especificidad por estos hematíes (hemolisina).
Esta técnica es muy empleada para la identificación cuantitativa de anticuerpos contra un
antígeno en particular y es la técnica de referencia para muchas enfermedades infecciosas.
Por ejemplo, en el diagnóstico de brucelosis mediante este método, el suero en estudio se
incuba con una suspensión estandarizada de Brucella abortus y una cantidad conocida y
estandarizada de complemento (medida en unidades CH50). En un paso posterior se agrega el
sistema hemolítico. (Figura 1)
Ag
Suspensión de antígeno
Suero problema
C’ GR
Complemento
Sistema hemolítico
F ig u r a 2 A F ig u r a 2 B
C’
GR
C’
Ag Ag
107
Si la muestra en estudio contiene anticuerpos específicos contra Brucella abortus, éstos se fijan
a la bacteria (figura 3 A) y activan el complemento por la vía clásica, que produce su lisis.
Cuando en un paso posterior se agrega el sistema hemolítico, ya no hay complemento
disponible y los glóbulos rojos permanecen intactos (figura 3 B).
Figura 3 A Figura 3 B
GR
C’
Ag
Ag
108
antígeno en la muestra, e inversamente, la observación de hemólisis indica que la muestra
carece de antígeno.
Bibliografía
Margni, R.A. 1996. Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed. Interamericana. 976
pp.
Day, MJ. 1999. Clinical Immunology of the Dog and the Cat. Iowa State University Press.
Esta técnica detecta la unión de pequeñas moléculas marcadas con fluoresceína (por Ej.
antígenos) a grandes moléculas (anticuerpos) cuando la muestra es incidida con un haz de luz
polarizada.
Fundamento:
Todas las moléculas en solución rotan al azar. La velocidad de rotación depende del tamaño y
es inversamente proporcional, por lo tanto las moléculas pequeñas rotan a mayor velocidad
que las moléculas grandes.
Para realizar este ensayo se requiere de la emisión de una luz (onda electromagnética) (a
partir de una lámpara de tungsteno) cuyo campo eléctrico oscila en todas las direcciones
espaciales al azar y con distintas longitudes de onda. Dicha radiación atraviesa un polarizador
de cristal líquido que deja pasar solo un rayo de luz polarizada plana azul (481-489 nm). Al
incidir la luz polarizada plana sobre el trazador (fluorocromo ligado al antígeno), lo eleva a un
estado de excitación, tras el cual dicho trazador vuelve a el estado de equilibrio emitiendo un
haz de luz verde (525-550 nm) que es captado y analizado por el equipo.
En el caso de que el antígeno marcado estuviese unido a una molécula de anticuerpo de gran
tamaño, su velocidad de rotación disminuye y permite que la emisión de luz verde se detecte
en el mismo plano de polarización que la radiación recibida, manteniéndose la polarización.
Por lo tanto, se detecta un valor alto de polarización. Por lo contrario, si dicho trazador está
unido solo al antígeno (de pequeño tamaño) la rotación es rápida y la luz verde emitida se
ubicará en otro plano distinto al de la luz polarizada. De esta manera, se pierde el grado o
valor de polarización.
109
Emisión del haz de luz
Luz Luz azul en un único plano
tungsteno polarizada
Polarizador
Suero positivo
Dirección del haz de luz azul Dirección del haz de luz verde
polarizada incidente emitida
Suero negativo
Dirección del haz de luz azul Dirección del haz de luz verde
polarizada incidente emitida
Anticuerpo
Durante el tiempo que la molécula conjugada con fluoresceína permanece excitada, rota a una
determinada velocidad, produciendo una diferencia entre plano de polarización que la
excita (plano de excitación) y el plano de polarización que emite (plano de emisión), ésta
diferencia se cuantifica y se determina utilizando una fórmula.
Expresión de los resultados: unidades de milipolarización (mP) del suero frente al antígeno.
Cálculo de las unidades de mp de cada muestra.
mP = ( Iv – (Ih x G) / (Ih x G) x 1000
El polisacárido O-: Extraído a partir del LPS de cepas lisas de bacterias gram negativas. Estos
antígenos son específicos para cada serotipo y se obtiene a partir de la purificación del LPS.
Ej.: Brucella spp. Salmonella spp.
110
Estructura de LPS
Péptidos: Sólo puede utilizarse péptidos de bajo peso molecular (que no superen los 20 kDa),
para que no interfiera su tamaño en una menor rotación del antígeno-trazador libre.
Equipamiento
Metodología
Protocolo FPA
1) Agregar 10µl de la muestra (generalmente suero del animal a evaluar) a 1 ml de buffer.
2) Leer el blanco
3) Agregar 10 µl de antígeno marcado
4) Incubar no menos de 2 minutos
5) Realizar la lectura de las muestras ya sea en tubos o en multiplacas.
6) Como dato orientativo, las muestras con lecturas de 10 mP mayores al control negativo son
consideradas positivas
111
Esquema de la técnica. Utiliza como ejemplo el Ag O de Brucella spp.
Ventajas:
Es fácil de realizar y los resultados se obtienen rápidamente.
Implica solamente 2 pasos.
Es una técnica de alta sensibilidad y especificidad.
Permite el procesamiento de varias muestras a la vez.
Suspensiones turbias tales como leche, sueros lipémicos y yemas de huevo o soluciones
coloreadas como sueros hemolizados o sangre entera, no interfieren en la lectura de las
muestras
Citotoxicidad
Introducción
La citotoxicidad es un mecanismo efector de las células del sistema inmune que permite
eliminar células infectadas o alteradas del organismo o células de microorganismos u
organismos invasores. Varios tipos celulares, receptores y mecanismos están involucrados en
este mecanismo. Su evaluación permite conocer el nivel de protección frente a enfermedades
infecciosas de origen viral, capacidad de eliminar células alteradas por procesos tumorales, etc.
Hay dos condiciones indispensables para que cualquier mecanismo citotóxico mediado por
células se lleve a cabo:
1- viabilidad de las células efectoras
2- contacto estrecho entre la célula efectora y la célula blanco.
112
La lisis de la célula blanco (o célula diana) es la consecuencia de la reacción citotóxica.
Cuando se encara el análisis de un fenómeno de este tipo es necesario contar, en primer lugar,
con un método apropiado para evaluar la muerte de la célula blanco.
Por ejemplo, si se trata de una bacteria o un parásito, es posible observar microscópicamente
su destrucción o la inhibición de su capacidad para proliferar en medios de cultivo adecuados,
luego de su contacto con la célula efectora. En cambio, si la célula blanco es una célula tumoral
o normal, pueden utilizarse colorantes vitales como naranja de acridina o azul tripán (trypan
blue) para poner en evidencia la lisis, ya que estos colorantes tienen la particularidad de teñir
únicamente a las células muertas.
Asimismo, es posible recurrir a alguna característica metabólica particular que pueda asociarse
con la viabilidad de la célula blanco utilizada en la reacción. Por ejemplo, si se trata de una
célula secretora, medir su capacidad para liberar un determinado producto de secreción.
El método más difundido para el estudio de los mecanismos citotóxicos es el de la
incorporación de sustancias radiactivas a las células blanco. La destrucción de estas células
permite que la sustancia radiactiva se libere al medio y pueda ser cuantificada fácilmente.
Las sustancias radiactivas deben cumplir ciertos requisitos para ser utilizadas:
Deben incorporarse a las células blanco en cantidades compatibles con los sistemas de
microrreacciones.
No deben liberarse al medio espontáneamente.
Su liberación al medio debe tener correlación directa con el efecto lítico producido
Una vez liberadas al sobrenadante, no deben ser reutilizables en forma significativa por las
células restantes.
El agente radiactivo más utilizado es el Na251CrO4 (dicromato de sodio) que tiene la ventaja
adicional de poner de manifiesto rápidamente el efecto citotóxico. Para el caso de bacterias o
parásitos que no incorporan 51Cr o que lo liberan en forma espontánea, se usan bases
nitrogenadas radiactivas, como por ejemplo la 3H-Timidina (timidina tritiada) que se incorpora a
los ácidos nucleicos o la 35S-Metionina que se incorpora a las proteínas.
Mecanismos de Citotoxicidad
Los mecanismos de citotoxicidad pueden clasificarse de acuerdo a los requerimientos del
sistema, en:
Mecanismos de citotoxicidad específicos: Si es necesaria la sensibilización previa del animal
del cual provienen las células blanco (por ejemplo, citotoxicidad por LT o ADCC).
Mecanismos de citotoxicidad innatos: Si funcionan sin necesidad de sensibilización previa
(por ejemplo. citotoxicidad por células NK o por complemento).
113
Ig. En la mayor parte de los casos, el anticuerpo que participa en la CCDA es de la clase IgG y,
por consiguiente, los receptores para Fc (FcR) presentes en la membrana de las células
efectoras intervinientes son los receptores para el Fc de la IgG (FcR). Sin embargo, ciertos
linfocitos con FcR para IgA (FcR) y los polimorfonucleares neutrófilos, son capaces de mediar
CCDA contra células blanco sensibilizadas con IgA. Además, los monocitos y los
polimorfonucleares eosinófilos que expresan FcR para IgE (FcR) inducen la destrucción de
células recubiertas con IgE. Este último sistema tiene relevancia en la inmunidad contra
parásitos.
Células NK:
El sistema inmune presenta poblaciones linfocitarias que tienen la capacidad innata de lisar
cierto tipo de células tumorales y células infectadas por virus. Este fenómeno citotóxico,
descrito alrededor del año 1970, se conoce como citotoxicidad natural killer o actividad NK.
Para que se lleve a cabo no es necesaria sensibilización previa de las células efectoras. La
actividad NK no se ve influida por la exposición previa al antígeno por parte del individuo del
cual provienen estas células.
114
más recientemente por quimioluminiscencia, tendientes a reemplazar el material radiactivo y
aumentar la sensibilidad.
Metodología:
1. Marcación de la célula blanco con dicromato de sodio (51Cr): Las células deberán
encontrarse en fase logarítmica de crecimiento.
- Centrifugar la suspensión celular y resuspender el precipitado en dicromato de sodio
marcado.
- Incubar 60 min a 37ºC con agitación suave.
- Lavar con medio de cultivo y resuspender las células marcadas a la concentración
deseada.
2. Medición de la actividad citotóxica por medio de un ensayo de liberación de 51Cr: La relación
entre células blanco y células efectoras es un factor importante a tener en cuenta.
Generalmente las evaluaciones se realizan con diferentes proporciones de células blanco y
células efectoras (por ej. 1:50).
- Sembrar en una placa de cultivo de 96 pocillos, células efectoras y células blanco (no
olvidar los controles).
- Centrifugar las placas para aumentar el contacto entre las células e incubar a 37ºC por 4
hs en estufa gaseada con CO2 al 5%.
- Recoger el sobrenadante para la posterior medición de radiactividad en contador de
centelleo.
Medición de liberación espontánea (cpm espontáneas):
En los cultivos de células blanco (sin células efectoras), se mide la liberación espontánea del
51
Cr fijado durante la marcación.
Medición de la máxima liberación de marca (cpm máximas):
A los co-cultivos de células efectoras + células blanco se agrega un detergente (Tritón X-100)
que solubiliza las membranas plasmáticas de las células produciendo la liberación total del 51Cr
fijado durante la marcación.
Cálculo del porcentaje de lisis específica:
Las cpm espontáneas no deben superar el 20% de las cpm máximas para que la prueba sea
válida.
En algunas ocasiones es conveniente expresar los resultados como unidades líticas (UL),
correspondientes a un determinado porcentaje de lisis. Frecuentemente se utiliza el 30% o el
50%. Para ello se grafica el porcentaje de lisis en función de la relación células efectoras:
células blanco.
115
Reacción de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo
Clínicamente, el ensayo de CCDA es útil en la evaluación funcional de células efectoras
inmunocompetentes, por ejemplo, en pacientes con cáncer en tratamiento inmunológico.
Otra aplicación importante de la CCDA es la evaluación de anticuerpos contra aloantígenos,
células tumorales o virus. La CCDA se utiliza para estudiar sueros de los pacientes que
recibirán un trasplante o que padecen una infección viral.
A continuación se describe un método para medir actividad efectora de CCDA en células
mononucleares de sangre periférica, empleando células blanco marcadas con 51Cr.
Metodología:
1. Sensibilización y marcación de las células blanco:
- Se lavan las células tres veces con medio de cultivo. Antes del último lavado se dividen en
dos alícuotas iguales.
- A una de las alícuotas se le agrega el antisuero. Este antisuero ha sido previamente
calentando a 56ºC por una hora, procedimiento que inactiva los factores del complemento.
A la otra alícuota se la toma como control sin suero.
- Se agrega dicromato de sodio marcado (51Cr) y se incuba a 37ºC por 30 min.
- Se lavan las células tres veces con medio de cultivo para retirar el cromo radiactivo no
incorporado.
2. Medición de la actividad de CCDA por un ensayo de liberación de 51Cr:
- Se prepara una suspensión de células efectoras, se hacen diluciones seriadas (1:2, 1:4,
1:8) y se siembran en una placa de 96 pocillos, con los correspondientes controles.
- Se agregan células blanco incubadas con y sin anticuerpos, marcadas con 51Cr.
- Se centrifugan las placas para aumentar el contacto entre las células y se incuban a 37ºC
por 4 a 18 hs. en estufa gaseada con CO2 al 5%.
- Luego de la incubación, los cultivos se vuelven a centrifugar a mayor velocidad y se
levanta el sobrenadante, que se analiza en un contador de centelleo líquido. Las cpm
determinadas en el sobrenadante corresponden al radiactivo liberado por la ruptura
celular.
El porcentaje de lisis específica debe calcularse para las células blanco recubiertas por
anticuerpos y paralelamente para las células no recubiertas por anticuerpos. El porcentaje de
CCDA se calcula restando al porcentaje de lisis específica de las células recubiertas con
anticuerpos, el porcentaje de lisis encontrado para las células blanco sin recubrir.
116
Bibliografía
1. Bamford, A.I; Adair, B.M.; Foster, J.C. Primary cytotoxic response of bovine peripheral blood
leukocytes to parainfluenza Type 3 virus infection. 1995. Veterinary Iºmmunology and
Immunopathology. 45: 85-95
2. Fainboim, L; Satz, ML; Jennifer, J. 1999. Introducción a la Inmunología Humana. 387 pp.
3. Margni, R.A. 1996 Inmunología e Inmunoquímica Fundamentos. Ed. Interamericana. 976 pp.
4. Podack, E.R. Functional significance of two cytotoxic T lymphocites. 1995. Journal of
Leukocyte Biology. 57: 548-552
5. Gondolf C, Burkhardt E, Failing K, Stitz L. A new colorimetric method for measuring cell-
mediated cytotoxicity in dogs. Vet Immunol Immunopathol. 1996 Dec; 55(1-3):11-22.
Pruebas cuantitativas
a) Inmunodifusión radial o técnica de Mancini
Es la técnica de referencia. Permite conocer la concentración de Igs y a la vez reconocer clases
y subclases de Igs. La desventaja es el tiempo de lectura, de 18 a 24 horas (Ver capítulo sobre
reacciones secundarias en esta guía).
117
c) Electroforesis
La electroforesis clásica de proteínas séricas sobre cellogel (tiras de acetato de celulosa) es
una técnica rápida y relativamente sencilla, que permite la posterior cuantificación de las
proteínas por densitometría (Ver capítulo correspondiente en esta guía).
d) ELISA
Esta es una técnica de interacción primaria, altamente sensible y específica. (Ver capítulo
correspondiente en esta guía).
Pruebas semicuantitativas
a) Prueba de látex o aglutinación pasiva
Es una técnica confiable y rápida. Las partículas de látex se cubren con anticuerpos anti–
IgG de la especie en estudio. Al mezclarse con el suero problema, si éste tiene IgG calostrales,
los anticuerpos anti-IgG adheridas a las partículas de látex se unen a las IgGs del suero y
determinan que las partículas de látex aglutinen. Esta prueba se efectúa en 10 minutos
aproximadamente.
El tiempo que tarda en producirse la aglutinación es indicativo del estado de protección, ya que
la concentración de Igs es proporcional al tiempo de lectura; cuanto más rápido aparece la
aglutinación, mayor es la concentración de Igs en el suero. A modo de ejemplo, si aglutina en 2
minutos, indica buen estado de protección.
Solución de sulfito
Concentración de Igs (mg/ml) de sodio
14% 16% 18%
0a1 - - -
Menos de 5 - - +
4a5 - +/- +
6 a 12 - + +
12 a 18 +/- + +
Más de 15 + + +
c) Refractometría
Utiliza un refractómetro que permite medir el índice de refracción de la luz al incidir sobre
una gota de suero. Braun y Tennat relacionaron el nivel de gammaglobulinas en suero con la
concentración de proteínas totales determinadas por refractometría. Esto le permitió clasificar el
riesgo del recién nacido.
118
Concentración de Proteínas
Nivel de inmunidad
totales (g/dl)
Menos de 4,9 alto riesgo
5 a 5,4 riesgo medio
5,5 a 6,9 bajo riesgo
Pruebas cualitativas
a) Prueba del glutaraldehído
Esta prueba determina si hubo o no falla en la transferencia pasiva, basándose en la
coagulación de las gammaglobulinas por el agregado de glutaraldehído (no permite cuantificar
las Igs).
La técnica consiste en colocar en un tubo de ensayo 0,5 ml de suero y agregar una gota de
reactivo, agitar y controlar la gelificación cada 10 minutos durante el término de una hora. El
tiempo se toma desde la adición del reactivo (minuto o tiempo cero). La reacción es positiva
cuando se forma un ”gel sólido” (coágulo) luego de la adición del reactivo. Esto se visualiza
inclinando el tubo unos 45º, verificando que el contenido no se vuelque, es decir, que el suero
se haya gelificado.
Concentración
Tiempo de reacción aproximada de IgG Interpretación
(mg/dl)
Buena trasferencia calostral
Entre 0 y 10 minutos Mayor de 800
Valor normal.
Falla parcial de trasferencia calostral.
Entre 10 y 60 minutos De 400 a 800
Animal en riesgo potencial.
Falla total de trasferencia calostral.
Mayor de 60 minutos Menor de 400
Animal en alto riesgo.
Bibliografía
1. Ing. Gabriela Catalani, Dr Guillermo Berra, Sra Ana Mate. Calostro: Rol en la crianza de
terneros. Detección de Inmunidad. INTA – Castelar.
2. Tizard, I. Inmunología Veterinaria. 4° Edición. Interamericana. M.C.Graw – Hill – 1995.
119
3. Margni, R. Inmunología e inmunoquímica. 5º Edición. Panamericana – 1996.
4. Fernandez, A.S.; Padola, N.L; Estein, S.M. Veterinaria Argentina. Bs.As. Argentina. Vol XII.
N° 116. Agosto 1995. Pág.420 – 425.
5. Aldridge BM, McGuirk SM, Lunn DP. Effect of colostral ingestion on immunoglobulin-positive
cells in calves.Vet Immunol Immunopathol 1998 Mar 18; 62(1):51-64.
6. Belknap EB, Collins JK, Ayers VK, Schultheiss PC Experimental infection of neonatal calves
with neurovirulent bovine herpesvirus type 1.3. Vet Pathol 1994 May;31(3):358-65.
7. Kohara J, Hirai T, Mori K, Ishizaki H, Tsunemitsu H Enhancement of passive immunity with
maternal vaccine against newborn calf diarrhea. J Vet Med Sci 1997 Nov;59(11):1023-5.
8. Yoo D, Lee J, Harland R, Gibbons E, Elazhary Y, Babiuk LA Maternal immunization of
pregnant cattle with recombinant VP8* protein of bovine rotavirus elicits neutralizing
antibodies to multiple serotypes. Colostral neutralizing antibody by rotavirus VP8*. Adv Exp
Med Biol 1997;412:405-11.
9. Bradshaw BJ, Edwards S. Antibody isotype responses to experimental infection with bovine
herpesvirus 1 in calves with colostrally derived antibody. Vet Microbiol 1996 Nov;53(1-
2):143-51.
10. Balázs Mayer, Zsuzsanna Kis, Gyózó Kaján, László V. Frenyó. The neonatal Fc receptor
(FcRn) is expressed in the bovine lung. Vet Immunol. Immunopathol. 98 (2004) 85 – 89.
11. Yaofeng Zhao, Imre Kacskovics, Zhihui Zhao. Presence of the di-leucine motif in the
cytoplasmic tail of the pig FcRn α chain. . Vet Immunol. Immunopathol. 96 (2003) 229 – 233.
12. Blum, J.W., Hammon, H. Livestock Production Science 66 (2000) 151- 159.
Inmunoelectroforesis
Materiales necesarios:-
Aparato de electroforesis
Portaobjetos limpios y desengrasados
Cámara húmeda
Agar noble
Solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8,4-8,6)
Soluciones de antígenos y de anticuerpos a valorar
120
Procedimiento
1- Se colocan dos capas de agar sobre un mismo portaobjeto. La primera, denominada capa
de impregnación, contiene una solución de agar al 2% (0,2 g de agar en 10 ml de solución
amortiguadora). Con un hisopo embebido en esta solución, se cubre el portaobjetos tratando
de formar una delgada capa y luego se deja secar.
2- Los portaobjetos (con la capa de agar de impregnación seca) se colocan en posición
horizontal y sobre ellos se agregan 3 ml de una solución de agar al 1% caliente. Se deja
gelificar a temperatura ambiente.
3- Se efectúan dos perforaciones en el agar: una con un molde circular (sacabocado) y otra
estrecha y longitudinal. En este momento se extrae el agar sólo de la perforación circular.
4- En el recipiente de la unidad de electroforesis (cuba), se coloca la cantidad necesaria de
solución amortiguadora (Buffer Veronal pH 8.6). Los portaobjetos con el agar perforado se
colocan en la cuba y se establece contacto entre la placa de agar y la solución utilizando tiras
de papel de filtro previamente humedecidas con la solución amortiguadora (uno de los
extremos de la tira se apoya sobre el agar y el otro se sumerge en la solución amortiguadora).
5- Se conecta la cuba a la fuente de poder y se ajusta la corriente a razón de 10 voltios/cm. de
gel ó 8 mAmp/portaobjeto durante 15 minutos para equilibrar el sistema.
6- Se desconecta el aparato. Las soluciones de antígeno se colocan en las perforaciones
circulares de las placas de agar utilizando una pipeta Pasteur. Una de las muestras de
antígeno deberá estar teñida con azul de bromofenol para indicar el desplazamiento (frente de
corrida).
7- Se asegura que las tiras de papel de filtro estén bien colocadas y se conecta nuevamente el
aparato, cuidando que la corriente sea correcta.
8- Cuando se observa que la muestra teñida ha migrado lo suficiente hacia el ánodo para una
correcta separación, se desconecta el aparato y se retiran los portaobjetos de la cuba. Se
remueve el agar del canal para colocar el antisuero. Esto debe hacerse con rapidez para evitar
la difusión excesiva del antígeno.
9- Los portaobjetos se incuban en cámara húmeda durante 24 a 48 horas. Para una correcta
interpretación de los resultados, la capa de agar puede teñirse de manera similar a la descripta
para la técnica de inmunodifusión doble. (Ver capítulo sobre reacciones secundarias)
Aplicaciones de la inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis permite separar e identificar antígenos o anticuerpos en una mezcla
antigénica debido a su diferente movilidad electroforética, observándose el resultado por medio
de la tinción de las bandas de precipitación que se producen luego de la incubación con el
antisuero.
Es una técnica cualitativa y semicuantitativa, pues se puede estimar la concentración de
antígenos según sean las características de las bandas de precipitación respecto de la muestra
testigo normal. En el caso de la inmunoelectroforesis en placa de agar, a mayor intensidad,
longitud y cercanía de las bandas al lugar de siembra del antisuero, mayor es la concentración
inicial del antígeno.
En el diagnóstico de laboratorio de las paraproteinemias, los resultados de la electroforesis de
zona y de la inmunoelectroforesis deberán ser combinados. Así, por ejemplo:
La presencia de un aumento franco o de una espiga en la región gamma en una
electroforesis sugiere fuertemente la presencia de una paraproteinemia monoclonal. No
obstante, es necesario llevar a cabo una inmunoelectroforesis para determinar la clase de
cadena pesada y de cadena liviana de la inmunoglobulina.
La inmunoelectroforesis puede ayudar a distinguir si un aumento en las gammaglobulinas es
policlonal o monoclonal.
La disminución o ausencia de inmunoglobulinas que se observa en diversos trastornos o
deficiencias inmunológicas, pueden ser analizados mediante esta técnica.
La inmunoelectroforesis permite la identificación de cadenas livianas en la orina de enfermos
con discracias de células plasmáticas o trastornos autoinmunitarios, mediante antisueros anti–
kappa o anti–lambda específicos. De esta manera se puede confirmar la naturaleza monoclonal
de la proteína de Bence–Jones en el mieloma.
121
Finalmente, la inmunoelectroforesis es útil para identificar las proteínas presentes en
cantidades elevadas en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con diversas enfermedades
nerviosas.
122
Técnica de inmunoelectroforesis:
Bibliografía
1. Morilla A. y Bautista C. R. Manual de Inmunología México: Editorial Diana 1º edición,
septiembre de 1986. Capítulo 6.
2. Margni R. A. Inmunología e Inmunoquímica. Fundamentos. Bs. As. : Editorial Médica
Panamericana 1º edición, octubre de 1972. Edición consultada: 5º edición septiembre de
1996. Capítulo I.
3. Inmunología Básica. Guía de trabajos prácticos. Fac. Cs. Veterinarias. Año 2000.
4. Stites Daniel P. y Terr Abba I. Inmunología Básica y Clínica. Editorial El Manual Moderno
S.A. de C. V. México D.F. 7° edición. 1993 Sección II. Capítulo 18.
123
Pautas para la elaboración y presentación de los informes de laboratorio
En este capitulo se enumeran los ítems mínimos que deben ser incluidos en los
informes de laboratorio que deben ser entregados al docente del TP y aprobados.
Apellido y nombre: Incluye el apellido y nombre de todos los integrantes del grupo de trabajo
y la comisión a la que pertenecen.
Título del informe: Debe dejar claro lo que se pretende comunicar (Puede ser el nombre de
una técnica o los objetivos planteados al realizarla).
Objetivos: Son la/s pregunta/s que se formulan al iniciar una técnica o un experimento.
Procedimientos:
Muestras:
Debe describirse sus características (tipo, origen, cantidad) y cualquier otro dato que sea
relevante para analizar los resultados (modo de transporte, conservación, etc.). Para una mejor
descripción remitirse a la guía de trabajos prácticos, capítulo “Toma de Muestras”.
Metodología:
Debe realizarse una descripción esquemática que incluya el fundamento y las etapas más
importantes de la/s técnica/s realizada/s. Esta descripción no debe ser la trascripción literal de
lo enunciado en la guía de trabajos prácticos sino una tarea de elaboración.
Bibliografía:
Se deberá citar la bibliografía consultada para la elaboración del informe. Cada cita deberá
incluir: Autor, Título, Edición, Fecha, Editorial, Número de páginas. Por ejemplo:
- Roitt, I. Inmunología. Fundamentos. 10ma Ed. 2003. Editorial Médica Panamericana. 559pp.
124
BUFFER VERONAL-TRIS
Veronal sódico 10,30 g
Veronal 1,84 g
Tris 7,20 g
Agua deionizada c.s.p. 1000 ml
SOLUCIÓN COLORANTE
Metanol 45 %
Ácido acético 5%
Agua deionizada 50 %
Negro Amido 1 g/l
SOLUCIÓN DECOLORANTE
Metanol 45%
Ácido acético 10%
Agua deionizada 45%
SOLUCIÓN TRANSPARENTIZANTE
Metanol 85%
Ácido acético 15%
GEL DE APILAMIENTO
Agua 2,70 ml
Acrilamida:Bisacrilamida(30:0.8) 0,67 ml
Tris 1.0 M (pH 6.8) 0,50 ml
SDS 10% 0,04 ml
PSA 10% 0,04 ml
TEMED 4 l
125
Agua deionizada c.s.p. 600 ml
Mantener a 4C.
Diluir 60 ml de la solución 5X con 240 ml de agua deionizada.
Si se observa precipitación, entibiar a temperatura ambiente antes de usar.
BUFFER DE TRANSFERENCIA
Tris 3,03 g
Glicina 14,40 g
Metanol 200 ml
Agregar agua destilada c.s.p. 1000 ml
No agregar ácidos ni bases para ajustar el pH.
El mismo oscilará entre 8.1 y 8.3 dependiendo de la calidad del Tris, la Glicina y el Metanol.
126
Ejercicios y problemas de aplicación:
1) Realice un cuadro que incluya las células que intervienen en el sistema inmune innato indicando:
receptores de membrana, mecanismos involucrados en su acción (fagocitosis, apoptosis, etc.), si actúan
o no como presentadoras de antígeno y patrón de migración.
2) Complete el siguiente cuadro con los componentes humorales del sistema Inmune Innato.
IFN y
Anticuerpos naturales
Canino 1 Canino 2
Nanomoles de Oxido nítrico
6
1,4
5 1,2
4 1
3 0,8
0,6
2
0,4
1 0,2
0 0
Control LPS 10ug/ ml Staphylococcus Control LPS 10ug/ ml Staphylococcus
spp. spp.
a) Indique mediante una tabla que respuesta en producción de ON se obtuvo según los estímulos
indicados, en los dos animales.
b) Compare los resultados obtenidos entre los animales.
c) Proponga una hipótesis que pueda justificar las diferencias observadas.
d) Diseñe un experimento para confirmar la hipótesis propuesta.
127
A B C D
a) ¿Cuáles son los mecanismos de inmunidad evaluados? ¿Qué fases de la fagocitosis está
estudiando?
b) ¿Qué conclusiones puede extraer a partir de este experimento?
c) ¿Qué componentes del suero pueden haber actuado como opsoninas? Explique.
5) Un veterinario necesita purificar anticuerpos de tipo IgG presentes en el suero de un conejo para
probar un nuevo tratamiento.
a) Enumere y explique los pasos que debería seguir en la purificación.
b) Según los resultados de SDS-PAGE que se muestran a continuación: indique qué enzimas
puede haber utilizado para el fraccionamiento de las IgG obtenidas. Esquematice la molécula de
IgG e indique los PM de cada uno de sus componentes antes (To) y después (Tf) de la digestión
enzimática.
PM T0 Tf
97
50
30
25
128
1 2 3 1 2 3
50 kDa
25 kDa
a) Las muestras 1, 2 y 3 corresponden a las fracciones: Igs purificadas por afinidad a proteína G,
suero e Igs obtenidas por precipitación salina. Observando las figuras, qué imagen considera
que podría corresponder a cada muestra y por qué?
b) Cuál de las 3 muestras usaría para opsonizar las bacterias y realizar ensayo de fagocitosis.
Justifique
7) Se evaluó un nuevo kit diagnóstico para virus rábico, para ello se seleccionaron 180 cobayos libres de
patógenos específicos (LPE) a los que se dividieron en dos lotes de 90 animales cada uno. Los animales
del lote Nº 1 se conservaron como negativos, mientras que los del lote Nº 2 fueron inoculados con virus
rábico y presentaron las lesiones características en el 100% de los animales (positivos).
El análisis del suero de los 180 animales, a través del nuevo kit diagnóstico arroja los siguientes
resultados:
Lote Nº 1: 3 positivos y 87 negativos
Lote Nº 2: 85 positivos y 5 negativos
Realice un cuadro con los resultados y calcule la sensibilidad y especificidad del kit diagnóstico.
8) La Paratuberculosis bovina es una enfermedad crónica y de difícil diagnóstico que afecta a los
bovinos. La prueba de oro para la confirmación de esta enfermedad es el aislamiento del
microorganismo causante (Mycobacterium paratuberculosis) a partir de muestras de animales
sospechosos. Dado el lento desarrollo de este microorganismo, se hace necesario contar con otras
pruebas que permitan un diagnóstico más rápido.
A continuación se transcribe una tabla de datos obtenidos por un equipo de investigadores que analizó el
valor predictivo de un ELISA frente a un antígeno proteico de M paratuberculosis como prueba
diagnóstica de rutina:
Aislamiento
positivo negativo Total
positivo 3 0 3
ELISA comercial negativo 2 75 77
total 5 75 80
Calcule la sensibilidad (S) y la especificidad (E) de la prueba de ELISA y decida en función de estos
parámetros, si la implementaría o no como prueba diagnóstica de rutina.
129
9) A partir de las siguientes muestras para el diagnóstico de enfermedades infecciosas indique que tipo
de Inmunofluorescencia realizaría (directa o indirecta) y reactivo necesario.
Toxoplasmosis Suero
10) La Pseudorrabia es una enfermedad infecciosa, producida por el virus de Aujeszky, que afecta
principalmente a cerdos pudiendo transmitirse a otras especies. Se caracteriza clínicamente por
trastornos nerviosos, respiratorios y reproductivos, siendo el prurito generalizado seguido de parálisis y
muerte los signos característicos.
El agente etiológico pertenece a la familia Herpesviridae, presenta una cápside icosaédrica que contiene
glicoproteínas (GP) que son los principales componentes estructurales reconocidos por el sistema
inmune y contra las que se producen grandes cantidades de anticuerpos. La detección de anticuerpos
específicos contra el virus en un cerdo se considera sinónimo de infección y el animal debe ser separado
de la población sana.
Para la prevención de la enfermedad se utilizan vacunas que generan una respuesta inmune similar a la
infección natural.
Un grupo de investigación generó, por técnicas de ingeniería genética, una variante de la cepa de campo
a la que denominó “GPp 7 (-)”. Esta variante es idéntica a la cepa de campo, excepto que carece de una
de las glicoproteínas de superficie, la GP7.
Diseñe un ELISA donde se pueda diferenciar animales sanos no vacunados de vacunados y de
infectados (No olvide los controles)
11) Al final de la prueba de ELISA se agrega una solución ácida (o alcalina, dependiendo del protocolo)
¿Cuál es el objetivo?
12) ¿Cómo sería el esquema de un ELISA diseñado para detectar la presencia del virus de la Influenza
equina en muestras de secreciones nasales? Indique los reactivos que necesitaría.
13) Los siguientes datos son los resultados de un ELISA de tres gatos sospechosos de padecer VIF. Los
números expresan el promedio de los valores de densidad óptica de cada muestra leída a 450 nm. Las
densidades ópticas comprendidas en el rango de 0.300 a 0.499 indican valores indeterminados; en estos
casos se deben repetir los estudios.
PACIENTE
Control Control
Positivo Negativo
A B C
Responda:
a) ¿Cuál seria su informe sobre cada uno de los pacientes?
b) ¿Qué sucedería si se hubiese omitido por error el agregado de los sueros, y los otros pasos se
hubiesen realizado correctamente?
c) ¿Qué sucedería si no se hubiese lavado el conjugado Anti-inmunoglobulinas felinas antes del
agregado del sustrato?
d) ¿Por qué repetiría los resultados en el paciente B? ¿En qué momento lo haría?
14) La anemia infecciosa equina es una enfermedad de etiología viral de los caballos, de carácter
crónico, con aparición de episodios agudos febriles, marcada depresión y debilitamiento. El contagio se
produce a través de vectores hematófagos que transportan el virus en forma mecánica desde los
animales enfermos a los sanos. El diagnóstico se realiza por la identificación de anticuerpos precipitantes
en el suero de los animales infectados, test de Coggins.
130
Usted tiene un laboratorio de diagnóstico y realiza esta prueba de forma rutinaria. Un colega tomó
muestras de sangre de tres caballos y se las remite para su análisis.
Ag: antígeno
P: control positivo
1-2-3: muestras P
1 2
Ag
P P
3
Analice los resultados explicando a que se deben las bandas observadas y como las interpreta. Indique
¿Qué informaría sobre estos animales?
15) La campaña nacional de erradicación de la brucelosis bovina se basa en dos pilares: la vacunación
de todas las terneras entre los 3 y 8 meses de edad (los machos no se vacunan) y la posterior
identificación de los animales infectados y su segregación del rodeo. La vacunación se lleva a cabo con
una cepa viva atenuada de Brucella abortus denominada cepa 19.
Para identificar los animales infectados se realiza diagnóstico serológico a la totalidad de las hembras
mayores de 18 meses de vida y los toros mayores de 6 meses.
a) Explique el fundamento de la prueba de aglutinación.
b) Explique por qué el diagnóstico serológico se realiza a diferentes edades según sean hembras o
machos.
16) La leucosis bovina es una enfermedad inmunosupresora que afecta al ganado y es producida por un
retrovirus. El SENASA acepta como prueba de diagnóstico de rutina a la inmunodifusión doble en placa
con un antígeno estandarizado altamente conservado entre las cepas de este virus.
Responda:
Analice las variaciones esperables en la sensibilidad y la especificad de esta prueba diagnóstica de esta
prueba si sustituimos el antígeno empleado por:
a) Otro antígeno viral de alta variabilidad entre cepas debido a una gran frecuencia de mutación.
b) Otro antígeno viral compartido que se expresa tanto en la superficie del virus de la leucosis como
en la de otros virus emparentados.
.
17) Un canino hembra de 8 meses de edad presenta convulsiones. El veterinario, entre otras pruebas,
solicita serología de toxoplasmosis al momento de la primera consulta y quince días después. El
laboratorio realiza las pruebas de inmunofluorescencia indirecta (I.FI.) y aglutinación directa (A.D.) y
obtiene los siguientes resultados:
18) Con el objetivo de estudiar el efecto de la inmunización pasiva frente al desafío viral se obtuvieron
sueros inmunes frente al virus del Sarampión de diferentes cepas de ratones y se utilizaron para
inmunizar pasivamente un grupo homogéneo de ratones de la cepa Balb/c. Los ratones tenían dos
semanas de vida y se les aplicó una dosis de 150ul de suero.
Se evaluó la supervivencia de los ratones luego del desafío
a) ¿Cuáles fueron los resultados al día 2, al día 9 y al día 17? Realice un cuadro.
131
b) ¿En que consistió en control negativo y para que lo realizó?
c) Admitiendo que las diferencias observadas entre los tratamientos son estadísticamente
significativas ¿Cómo interpreta los resultados?
% supervivencia
132
habían presentado infección previa por moquillo canino.
20) En la prueba de fijación de complemento se inactivan los sueros antes de evaluarlos, ¿cuál es el
objetivo? Y ¿cómo se realiza?.
Además, el suero en estudio debe estar completamente libre de hemólisis y de contaminaciones. ¿Por
qué?¡
21) Haga un cuadro en el que se comparen los siguientes mecanismos de citotoxicidad celular:
fagocitosis, actividad NK, ADCC, lisis por complemento. Mencione la célula blanco, la célula y/ o
mediadores químicos efectores, mecanismo de reconocimiento y de lisis.
22) En 1974 Peter Doherty y Rolf Zinkernagel realizaron el siguiente experimento: Infectaron cepas de
ratones BALB/c y CBA con virus de la linfocoriomeningitis murina (LCMV).
Siete días después tomaron células de bazo de estos ratones y evaluaron su habilidad para lisar células
blanco infectadas con el virus (midieron el grado de lisis por la liberación del radioisotopo 51Cr por parte
de las células blanco).
Explique los mecanismos celulares y las moléculas involucradas en esta evaluación.
En base a los resultados: Explique qué demostraron con este experimento.
23) Para evaluar una vacuna BCG recombinante, se procedió a la inoculación de ratones BALB/c y se
evaluó el porcentaje de lisis específica utilizando diferentes tratamientos: Medio de cultivo solo (●), Anti-
CD4 () y Anti-CD8 (□) Se realizó una estimulación previa in vitro con un péptido y luego se la evaluó
sobre células blanco que expresan el mismo péptido.
Explique los mecanismos celulares y las moléculas involucradas en esta evaluación.
Explique los resultados en las diferentes proporciones de células.
133
24) Como se denominan los Ac. dirigidos contra los antigenos eritrocitarios en una transfusión? (alo –
iso – idio)
25) a) Analice el cuadro y explique qué pasará con el potrillo en cada caso
b) En caso que sea necesario realizar una transfusión: Cual seria según su criterio el
donante indicado: - madre
- padre
- otro
Justifique en cada caso.
madre
2º parición
26) La Arteritis Viral Equina es una enfermedad respiratoria que puede causar abortos en yeguas
preñadas. Se transmite por vía aérea y venérea, y cura espontáneamente dejando inmunidad duradera.
En los machos, el virus puede acantonarse en el tracto reproductor transformando al animal en portador
sano, que elimina virus con los fluidos seminales.
La enfermedad es endémica en Estados Unidos y Europa, donde se utiliza una vacuna a virus vivo
atenuado como herramienta profiláctica.
En nuestro país es una enfermedad exótica de la que se han registrado algunos brotes en los últimos
años como consecuencia de la importación de semen infectado.
Los dueños de los haras afectados solicitan que se importe y se aplique la vacuna de USA, que ha dado
muy buenos resultados.
¿Si usted fuera responsable del organismo de control sanitario nacional, permitiría la utilización
de dicha vacuna? ¿Por qué? De no permitirlo, proponga un plan profiláctico alternativo.
27) Luego de una castración, un potrillo recibe antibióticos y suero antitetánico para prevenir
complicaciones postquirúgicas. Unos meses después el potrillo es vendido y su nuevo dueño decide
vacunarlos contra el tétanos. Ante la información de que el potrillo ya ha recibido una dosis de suero
antitetánico, el veterinario actuante decide darle sólo una dosis de vacuna y suprimir el refuerzo,
argumentando que el suero antitetánico ya recibido funcionaría como primer estímulo para el sistema
inmune. ¿Está de acuerdo con la actuación del veterinario? Justifique
28) Las vacunas a subunidades proteicas pueden ser obtenidas por técnicas de biología molecular.
Utilizando clonación en un vector de expresión (el plásmido: PRsetA este vector agrega a la proteina una
cola de histidinas) se obtuvo en un cultivo de bacterias E. coli la siguiente proteína perteneciente a una
134
secuencia de Mycobacterium paratuberculosis. Los cultivos de E. coli se analizaron por la técnica de
SDS-PAGE.
En la calle 1 se observa las proteínas de los cultivos de E. coli sin transformar y en la calle 2 las
proteínas de los cultivos de E. coli transformadas con el plásmido. En la calle 3 se observan los patrones
de PM. En las calles 4, 5, 6 y 7 se observan las eluídos de la columna de Níquel.
¿Cuál es el fundamento de la metodología utilizada para la purificación proteica?
Según los resultados de las corridas, ¿considera que la purificación fue efectiva? Justifique
29) Un grupo de investigadores está intentando desarrollar una vacuna contra leptospirosis bovina a
subunidades, cuentan con aislamientos de las serovariedades de la zona y con sueros de bovinos
infectados.
a) ¿Qué metodología les propondría para la identificación de proteínas compartidas por las distintas
serovariedades?
b) Una vez identificados las proteínas compartidas ¿Cómo podrían seleccionar aquellas que son
más inmunogénicas para los bovinos?
30) Para ahorrar material descartable un veterinario carga en la misma jeringa una dosis de vacuna
antirrábica (virus inactivado) y una de moquillo (virus atenuado). ¿Es correcto inmunizar con 2 antígenos
distintos el mismo día? ¿Y administrarlos en la misma jeringa? ¿Por qué?
31) Un veterinario había oído decir que la vía ideal para la inmunización es la puerta de entrada natural
del patógeno y sabía que el virus de la Fiebre Aftosa ingresa por vía aerógena. Juntando estos
conocimientos, se propuso evaluar el efecto de la aplicación en spray de la vacuna covencional
antiaftosa (virus inactivado) sobre las vías áreas. Para esta evaluación, dividió en dos grupos losa
animales de un campo en el que trabajaba; a la mitad le aplicó la vacuna por la vía convencional y con la
otra mitad empleó el sistema de spray. Unos meses después un brote de aftosa afectó a la gran mayoría
de los animales vacunados con el sistema de spray, sin provocar alteraciones entre los animales
vacunados de la manera convencional.
a) ¿Le parece correcto vacunar con spray sólo a la mitad de los animales disponible para evaluar la
eficacia del sistema? ¿Por qué?
b) ¿Cómo explicaría los resultados obtenidos por este colega?
32) Usted debe elegir entre dos vacunas atenuadas para vacunar a todos los cerdos del país contra la
gastroenteritis transmisible. Una contiene el virus completo y otra el virus completo más una proteína
extraña (la betagalactosidasa)
Desde el punto de vista epidemiológico, ¿qué vacuna le parece mejor? Justifique
33) Un laboratorio entiende que, por haber formulado una vacuna a virus atenuado con un vehículo a
base de agua destilada estéril apirógena no debe realizar un control de inocuidad. ¿Está usted de
acuerdo?
135
34) Un cerdo ingresa al país desde un área de USA libre de Pseudorrabia. Como los anticuerpos contra
el virus de la Pseudorrabia son protectores, se decide administrarle una dosis de suero hiperinmune anti-
pseudorrabia al momento del ingreso al país. Al llegar al establecimiento de destino el veterinario
propone esperar unas semanas para vacunarlo contra la enfermedad. ¿Le parece correcto este
proceder? Justifique
35) Cuando aparece un foco de una enfermedad exótica es imperioso el control de dicho foco para evitar
la diseminación de la enfermedad. Entre las medidas sanitarias que se adoptan en estos casos se
encuentran el rifle sanitario y la vacunación en anillo de todos los animales susceptibles que habitan las
zonas lindantes a la de la aparición del foco. Qué tipo de vacuna eligiría para aplicar en uno de estos
casos:
a) vacuna a virus vivo atenuado
b) vacuna a virus inactivado
c) vacuna a subunidades? Justifique su elección
36) A un pueblo llega un nuevo veterinario que sostiene la teoría de que es mejor no vacunar contra el
virus del moquillo debido a que, además de no producir 100% de protección, esta vacuna induce
reacciones adversas en algunos de los animales vacunados. Debido a su prédica, muchos dueños de
perros dejan de vacunar contra este patógeno. Al cabo de unos años aparece en el pueblo un brote de
moquillo que afecta principalmente a los perros no vacunados, pero también a algunos que sí habían
sido vacunados. Cuando el veterinario es confrontado como responsable del brote, aduce que después
de todo el tenía razón, ya que también habían enfermado los animales inmunizados.
Si usted fuera una autoridad sanitaria con jurisdicción en dicho pueblo, ¿cómo respondería a la
aseveración del veterinario?
37) A una clínica veterinaria llega a consulta una perra recientemente preñada. Su dueña está
preocupada porque la perra nunca fue vacunada y una vecina le comentó que los cachorros se podían
morir de parvovirosis. La mujer quiere saber cómo proceder.
¿Usted qué le aconsejaría como veterinario? Si decide vacunarla, indique qué tipo de vacunas
utilizaría y ¿por qué?
38) Un cachorro de 2 ½ meses recibió 2 dosis de vacuna contra Parvovirus y Moquillo. Sus dueños lo
sacan de paseo por la plaza y a la semana el perro comienza a manifestar signos compatibles con
Parvo/Moquillo. Se presentan los dueños en la veterinaria con la queja, alegando que la vacunación
recibida por su mascota no había sido correcta, ya que a pesar de haber recibido 2 dosis de vacuna el
cachorro se había enfermado. ¿Tienen razón estos dueños? ¿Cómo argumenta su respuesta?
39) La Rabia es una enfermedad neurológica de origen viral. Cuando un animal se infecta, el virus se
disemina por vía neurógena hacia el encéfalo, donde produce las lesiones causantes de la
sintomatología de la enfermedad. Teniendo en cuenta estas consideraciones:
a) Proponga una técnica diagnóstica que permita confirmar la etiología rábica frente a la
muerte de un animal con signos clínicos compatibles.
b) Esquematice la metodología propuesta.
c) Indique reactivos y equipamiento necesarios.
40) Para la elaboración de suero antitetánico se recurre a la inoculación de equinos, debido entre otras
razones a los grandes volúmenes de suero que producen estos animales.
a) ¿Qué antígenos inocularía y cómo diseñaría el plan de inoculación del equino en cuanto
al nº de dosis y al intervalo temporal entre las mismas? ¿Por qué?
b) ¿Qué técnica utilizaría en los equinos inoculados para evaluar la respuesta frente al
antígeno?
c) ¿Qué tipo de inmunidad podría conferir la administración a otro animal del antisuero
producido?
d) Explique ventajas y desventajas de la administración del antisuero a otro animal.
41) En la Clínica veterinaria, es recibido un paciente canino con signos de anemia aguda severa.
Entre las pautas iniciales de manejo, el profesional actuante decide instaurar una hemotransfusión.
Dada la urgencia del caso y considerando que el animal no había recibido transfusiones previas se
decide recurrir a “Lucy”, mascota de la veterinaria, como donante de sangre. El paciente comienza a
manifestar vómitos, hipertermia y signos compatibles con un shock incipiente. Explique:
136
a) ¿Qué mecanismos inmunológicos podrían estar involucrados?
b) ¿Cómo se podría confirmar el diagnóstico?
c) ¿Cómo se podría haber prevenido el agravamiento del caso?
42) El virus de la linfocoriomeningitis murina infecta, entre otras, a las células dendríticas. En ellas
disminuye la expresión de moléculas de MHC clase II, CD40 y CD80. ¿Cuáles serán las consecuencias
de esta acción en el desarrollo de la respuesta inmune contra el virus? Explique.
43) Usted trabaja en un laboratorio y lo consultan porque una empresa desea exportar plasma bovino.
Para ello la aduana le exige un análisis cualitativo del mismo.
Usted en su laboratorio sólo posee los siguientes reactivos:
Anti – IgG bovina marcada con fluoresceína.
Anti – plasma bovino.
Anti – IgA bovina marcada con fosfatasa alcalina.
Con sus conocimientos sobre técnicas Inmunológicas y con los reactivos que usted posee:
¿Qué técnica puede usted realizar que le permita determinar si lo que se está exportando es
plasma bovino? Explique brevemente cómo la realizaría.
44) Estoy desarrollando una vacuna inactivada para caninos y quiero efectuar una prueba de potencia.
a) ¿Cuál es la especie de elección?
b) ¿Qué características deberán tener los animales en los que se lleve a cabo la prueba?
c) ¿Cómo diseña y evalúa la prueba?
45) Los potrillos son susceptibles de padecer neumonía por Rhodococcus equi. Esta es una bacteria
intracelular facultativa, que se aloja en los pulmones y causa lesiones que suelen llevar a la muerte.
Al estudiar las causas de la marcada susceptibilidad de los potrillos, se encontró que los animales
jóvenes tienen deficiencia de IFN gamma, lo que afecta su respuesta inmune.
a) Describa alguna técnica in vitro que le permita demostrar la diferencia en la producción de IFN
gamma.
b) ¿Cómo se verá afectada la respuesta inmune a esta bacteria por la deficiencia de IFN gamma?
46) Un perro de cinco años de edad sufre una herida el ojo. Tiempo después, presenta lesiones oculares
resistentes a la terapéutica convencional. Este animal no tenía historia previa de enfermedad
autoinmune. Se le detectan anticuerpos contra antígenos de la retina en suero.
¿Por qué normalmente un individuo no tiene anticuerpos contra antígenos de la retina en suero? ¿Por
qué se podrían haber desarrollado en este caso?
47) Dentro de las patologías del tracto digestivo que afectan a los terneros neonatos, la Rotavirosis es
una de las más relevantes. Este virus ingresa al organismo por vía oral e infecta los enterocitos de las
vellosidades intestinales, generando las lesiones responsables del cuadro de diarrea observado.
Responda:
a) ¿Qué mecanismos efectores del sistema inmune consideran que tendrán mayor importancia
para lograr una respuesta inmune efectiva frente a Rotavirus?
b) Proponga un modelo de vacunación para la prevención de esta enfermedad en terneros
neonatos, explicando qué tipo de vacuna, justifique.
48) Se presenta a consulta una gata siamesa de 5 años de edad con 5 cachorros de los cuales 1 estaba
muerto y otros 2 presentaban decaimiento e ictericia. El veterinario sospecha de isoeritrólisis neonatal.
a) ¿Qué le preguntaría a los dueños (anamnesis)?
b) ¿Qué técnicas utilizaría para comprobar sus sospechas?
137
1- Describa cómo se obtienen las proteinas recombinantes.
2- ¿Cuál es el objetivo buscado al realizar intradermorreacción a bovinos con PPD?
3- ¿Qué grupo/s control faltaría/n?
4- ¿Qué tipo de hipersensibilidad es esta intradermorreacción? ¿Cómo se produce?
5- Interprete los resultados
51) Los individuos positivos (con anticuerpos frente al Dengue) fueron seleccionados a través de la
técnica de ELISA, y se los consideraba como tal a aquellos que presentaban títulos en suero mayor o
iguales a 256.
1- Describa el tipo de ELISA utilizado, materiales, fundamento y controles.
2- Indique las diluciones de uso de los sueros, teniendo en cuenta que títulos > 256 son
considerados positivos y la dilución final de uso fue de 1/2048. ¿Cómo realiza las diluciones
teniendo en cuenta que el volumen a utilizar es de 20 µl de suero?
52) Un paradigma clásico de la inmunología plantea que para que ocurra cambio de isotipo en loa
anticuerpos es condición sine qua non la presentación del antígeno a un linfocito T helper (LTh) por parte
de una célula presentadora de antígeno (CPA). En el presente trabajo se presentó un modelo animal,
ratones BALB/c, de respuesta inmune frente a dos antígenos típicos. Se utilizó dextran como Ag T
independiente y seroalbúmina bovina como Ag T dependiente, y se estudió la respuesta analizando los
isotipos de los anticuerpos producidos.
Se utilizaron 12 ratones BALB/c machos y 12 ratones BALB/c hembras de entre 5 y 8 semanas de edad
y fueron divididos en dos grupos de 12 animales c/u (6 machos y 6 hembras) Los animales fueron
inoculados intraperitonealmente con seroalbúmina bovina el grupo 1 y con Dextran el grupo 2, los días 1
(preinmune), 7,14 y 28 (A la vez se tomaron muestras de sangre del seno venoso retroorbital).
Los ensayos para evaluar respuesta inmune se realizaron mediante un ELISA y los sueros utilizados en
una dilución 1/250
Responda:
1. ¿Qué isotipos deberían evaluarse para conocer la respuesta inmune primaria y
secundaria?
2. Establezca los pasos del ELISA utilizado
3. Si la dilución utilizada fue siempre la misma ¿Cómo se evaluó en este trabajo los niveles
de Ac. medidos?
4. Grafique la respuesta primaria y secundaria esperable para ambos antígenos, indicando
el isotipo predominante. Si existen diferencias, ¿A que las atribuye?
5. Analice los gráficos de detección de anticuerpos frente a ambos antígenos. ¿Encuentra
diferencias? Explique
6. ¿Qué control agregaría?
138
53) Una Cabaña vende un torito a un establecimiento ganadero. Para prevenir la ¨Fiebre de los
transportes¨, antes de subir al camión, el torito recibe una vacuna contra IBR y Pasteurella multocida
(principales agentes causales de la enfermedad).
Cinco días después de llegar a destino el torito muere súbitamente. La necropsia se realizó
inmediatamente, se observaron lesiones compatibles con neumonía. Durante la anamnesis se informó
que el animal recibió 2 dosis de vacuna contra IBR hace 1 año, no así contra Pasteurella. Se sospecha
de ¨Fiebre de los transportes¨
Se toman muestras y se envían al laboratorio.
Los resultados son concluyentes. La muerte se debió a una infección aguda por P. multocida, sin
participación del virus de IBR.
Discuta
1 ¿Qué muestras envió al laboratorio?
2 ¿Qué estudios solicitó? Descríbalos y fundamente su elección
3 ¿Cómo debieron ser los resultados para asegurar que la muerte del animal se debió a una
pasteurelosis aguda y que el virus de IBR no puede ser acusado de toricidio
4 ¿Qué medidas se deberían haber tomado para evitar esta muerte?
54) La producción industrial de pollos para carne se ve afectada por la ocurrencia de diferentes
enfermedades virales (Bronquitis infecciosa, Gumboro, New Castle, etc) que se transmiten muy
rápidamente entre los pollos de un galpón de engorde
Las gallinas transfieren anticuerpos en forma pasiva a sus pollitos a través del huevo, que lo protegen
contra enfermedades específicas durante un período variable de tiempo (hasta un máximo de 40 días) si
éstas fueron correctamente inmunizadas.
Para evaluar la eficacia de esa transferencia se emplea la técnica de ELISA indirecto. Se toman
muestras de sangre de 30 cada 10.000 aves. De acuerdo a los valores de D.O. obtenidos (en relación
directa con la concentración de anticuerpos específicos contra la enfermedad en cuestión) se elaboran
139
histogramas de frecuencia según rangos de D.O. establecidos por estudios estadísticos. De acuerdo a la
distribución de las D.O. obtenidas se establece el “grado de protección” o “status inmunitario” del lote
frente a esa enfernedad y se anticipa o retrasa el momento de vacunación activa para mantener las aves
en un “alto status inmunitario” durante todo el período de producción (45 – 60 días).
cantidad de muestras
20 17 8 7
6
15 13 6 5 5
4
10 4 3
5 2
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Grupo 1 Grupo 2
cantidad de muestras
cantidad de muestras
15 13 10 8
8 7
9 6
10 8
6 4
4 3
5 2
2
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Grupo 3 Grupo 4
55) 1) Se sabe que el Virus de la Inmunodeficiencia Felina (VIF) infecta a los linfocitos T CD4+,
causando una depleción de los mismos y que en esta infección, la relación CD4:CD8 de linfocitos
circulantes constituye un factor pronóstico. Los siguientes gráficos corresponden a la corrida en un
citómetro de flujo de la muestra de sangre de un paciente felino recién diagnosticado. Para marcarla se
emplearon 3 anticuerpos: anti CD3 (maracador de LT), anti CD4 y anti CD8; cada uno marcado con un
fluorocromo distinto.
140
Teniendo en cuenta que la relación CD4:CD8 esperada para un felino sano es aproximadamente 2:1,
analice e interprete estos resultados:
SSC-Height ->
Los gráficos CD8 vs. CD3 y CD4 vs. CD3 fueron construidos considerando solamente los eventos
incluidos en la región linfocitaria (gate linfoide)
56) Un grupo de científicos está investigando la respuesta inmune de porcinos frente al virus de la Peste
Porcina (VPP). En este problema se muestran los resultados de uno de sus ensayos, donde realizaron
una prueba de linfoproliferación de sangre periférica de animales infectados con el virus. Emplearon
como estímulo linfoproliferativo una solución de virus inactivado.
a) Analice los resultados expresados en la siguiente tabla y proponga un diseño (muestras empleadas,
controles, reactivos) para el ensayo realizado.
141
b) Luego, evaluaron las citoquinas producidas por los LT CD4+ proliferados usando la citometría de
flujo.
142