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Introducción

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos


aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos
permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la


actividad de una via metabólica a partir de un sustrato que se incorpora
en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de multiples medios,


los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del
microorganismo en estudio.

De la amplia variedad de pruebas bioquímicas, nosotros en laboratorio


utilizaremos 10, aplicados a 5 especies de microorganisos.

Además estudiaremos los resultados que estos test arrojan,


comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de
trabajo de nuestro laboratorio.
Objetivos

• Realizar el experimento adecuadamente y poder identificar –


aplicando éste método- distintos microorganismos.

• Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas


bioquímcas es o son el (los) adecuado(s) de acuerdo a la
circunstancia que necesitemos estudiar.

• Entender los principios bioquimicos de las pruebas.

• Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados


entregados por laspruebas bioquímias

• Conocer el uso de las pruebas bioquímicas para la identificación de


microorganismos

• Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los


experimentos y poder reconocer en que partes del procedimiento
se cometió el o los errores, para así, mediante el desarrollo
experimental conocer mas profundamente las pruebas
bioquímicas.
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
FACULTAD TECNOLOGICA
TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

Microbiología
“Pruebas Bioquímicas”

Autor:

Lab N° 4
Cod. 06
Bibliografía

• Microbiología / Thomas D. Brock, Michael T. Madigan


2a. ed. en español, 1993. México ; Englewood Cliffs : Ed. Prentice
Hall Hispanoamericana.

• Microbiología / Michael J. Pelczar, Jr., Roger D. Reid


2a. ed. en español., 1982. México : Ed. McGraw-Hill.

• Tratado de microbiología : con inclusión de inmunología y


genética molecular / Bernard D. Davis
2a. ed., 1978. Barcelona : Ed. Salvat.

Internet:

 http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html

 http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html

 http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html

 http://edicion-
micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html
1. Prueba de la Oxidasa

El objetivo de la prueba “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima


Citocromo C oxidasa.

Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena


transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para
fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a
ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora,
pero cuando se oxida vira a púrpura.

Procedimiento:

Con un pequeño papel de filtro añadimos reactivo de Kovacs, lo


impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un
poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30
segundos, observamos si ha ocurrido algún cambio.

Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un


ciclo respiratorio oxidativo.

Se considera positva esta prueba cuando toma un color púrpura la


muestra.

Resultados:

(+) Pseudomonas aeruginosa

( - ) Escherichia coli
2. Prueba de la Catalasa

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa

El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por


vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la
eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O +
½ O2).

Prodecimiento:

Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a


un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacion tomamos
una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos
por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra
de la solucion liíquida de peróxido de hidrogeno y debemos observar la
reacción de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de


oxígeno.

Resultados:

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Streptococcus spp.
3. Prueba de la Coagulasa

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del


plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinación de los
microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta
prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero
Staphylococcus.

Procedimiento:

Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y


0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente
esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el
tubo de ensayo con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a
37° C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al
completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus
resultados.

Resultados:

Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:

1: pequeños coágulos no oganizados


2: pequeños coágulos oganizados
3: gran coágulo organizado
4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando
invierte el tubo.

Se consideran positivos los niveles 3 y 4.

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Staphylococcus epidermis.
4. Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-
Ornitina)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su


motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina.

Procedimiento:

Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo


e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Reacción Interpretación
Enturbiamiento del Hay movilidad
Agar.
Agar transparente de- No hay movilidad
sarrollo solo en picada
Azul (alcalino) Descarboxila ornitina
Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila
Rojo (anillos) Indol (+)
Amarillo (anillos) Indol ( - )
5. Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la


capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa
y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la
producción de SH2.

Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en


la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:

- bacterias fermentadoras de la glucosa


- bacterias fermentadoras de la lactosa
- bacterias fermentadoras de sacarosa
- bacterias aerogénicas
- bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que
contengan azufre.

Prodedimiento:

Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir
la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del
fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar
a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los
cultivos.

Resultados:

 Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares.


Característica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas
sp.
 Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa
fermentadas. Shigella spp.
 Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni
sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico.
Salmonela spp.
 Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa
fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli.

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.


6. Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)

Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen


descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas
la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de
SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Procedimiento:

Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio


de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Reacción Interpretación
Azul (alcalino) Hay movilidad
Rojo No hay movilidad
Engrecimiento Descarboxila ornitina
Ruptura del Agar No descarboxila
Fondo Amarillo y Descarboxilación de lisina
Tendido púrpura
Pruebas Bioquímicas IMViC:

7. Agar Citrato

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil


en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como
única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato
como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización
del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de
bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Procedimiento:

Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un


cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de
cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a
partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El
ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría,
acompañado o no de un viraje del indicador al azul.

Resultados:

(+)Klebsiella spp.

( - ) Escherichia Coli
8. Indol

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del


aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son
capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol,
ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica
importante para la identificación de muchas especies de
microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un
complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-
dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de
Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en
triptofano.

Procedimiento:

Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a


35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de
reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un
vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos
después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba
positiva.

Resultados:

(+) Escherichia coli

( - ) Klebsiella pneumoniae
9. Rojo Metilo

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los


diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la
proporción de productos de fermentación que se originan por la
fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La
fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la
fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y
succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se
forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los
principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0
(amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de
ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.

Procedimiento:

Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas


del microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego
de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivo de
rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo
estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para
producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa
por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo
y el amarillo no es considerado como positivo.

Resultados:

(+) Escherichia coli


( - ) Enterobacter aerogenes
10. Vogues Proskauer

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación


del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-
carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de
butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es
oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un
color rojo-fucsia.

Procedimiento:

Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del


microorganismo en estudio. Incubar a 35°C durante 24 horas. Luego de
finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a un
tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al
40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno
atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de
un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de
diacetilo, producto de oxidación de la acetoína y por lo tanto una prueba
VP positiva.

Resultados:

(+) Enterobacter aerogenes

(-)Escherichia coli
Microorganismos utilizados en las Pruebas Bioquímicas

MICROORGANISMO FAMILIA TINCION FORMA MOVILIDAD


PSEUDOMONA SPP. ENTEROBACTER GRAM - BACILOS POSEE
CORTOS,
FLAGELOS
CURVADOS O
RECTOS POLARES
SALMONELLA ENTEROBACTER GRAM - BACILOS FLAGELOS
CORTOS
PERÍTRICOS
SHIGUELLA SPP. ENTEROBACTER GRAM - BASTONCILLOS NO TIENE
ESCHERICHIA COLI ENTEROBACTER GRAM - BACILOS FLAGELOS
CORTOS NO
PERÍTRICOS
ESPORULADOS
STAPHYLOCOCCUS MICROCACEAE GRAM + COCACEA NO TIENE
AUREUS
Resultados Experimentales

Grupo 1: Sebastián Leyton – Carlos Vera

Grupo 2: Yuri Gálvez – David Fuica

Grupo 3: Graciela Quintero - Carolina

Grupo 4: Carolina Iribarra – Jessica Pizarro

Oxidasa

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4


PSEUDOMONA SPP. + + + +
SALMONELLA + + + +
SHIGUELLA SPP. - - - -
ESCHERICHIA COLI + + + +
STAPHYLOCOCCUS AUREUS - - - -

Catalasa

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4


PSEUDOMONA SPP. + + + +
SALMONELLA + + + +
SHIGUELLA SPP. - + - +
ESCHERICHIA COLI + + + +
STAPHYLOCOCCUS AUREUS + + + +

Coagulasa

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4


STAPHYLOCOCCUS AUREUS + + + +

Indol

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4


ESCHERICHIA COLI + + + +
Agar Citrato

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4


ESCHERICHIA COLI - - - -

Vogues-Proskauer

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4


ESCHERICHIA COLI - - - -

Rojo Metilo

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4


ESCHERICHIA COLI + + + +

LIA

MICROORGANISMO(S) GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

DETECTADO(S)
SALMONELLA DESCARBOXIL DESCARBOXIL DESCARBOXIL DESCARBOXIL
ACION DE ACION DE ACION DE ACION DE
ORNITINA ORNITINA ORNITINA ORNITINA
SHIGUELLA SPP. DESCARBOXIL DESCARBOXIL DESCARBOXIL DESCARBOXIL
ACION DE ACION DE ACION DE ACION DE
LISINA LISINA LISINA LISINA

MIO

MICROORGANISMO(S) GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4


DETECTADO(S)
PSEUDOMONA DESCARBOXIL DESCARBOXIL DESCARBOXIL DESCARBOXIL
ACION DE ACION DE ACION DE ACION DE
ORNITINA ORNITINA ORNITINA ORNITINA
SPP.
ST. AUREUS NO NO NO NO
DESCARBOXILA DESCARBOXILA DESCARBOXILA DESCARBOXILA

ORNITINA ORNITINA ORNITINA ORNITINA


TSI

MICROORGANISMO(S) GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

DETECTADO(S)
SALMONELLA GLUCOSA GLUCOSA GLUCOSA GLUCOSA

FERMENTADA FERMENTADA FERMENTADA FERMENTADA

LACTOSA NI LACTOSA NI LACTOSA NI LACTOSA NI

SACAROSA SACAROSA SACAROSA SACAROSA

FERMENTADAS FERMENTADAS FERMENTADAS FERMENTADAS

PRODUCCION PRODUCCION PRODUCCION PRODUCCION

DE ACIDO DE ACIDO DE ACIDO DE ACIDO

SULFHIDRICO SULFHIDRICO SULFHIDRICO SULFHIDRICO


SHIGUELLA SPP. GLUCOSA GLUCOSA GLUCOSA GLUCOSA

FERMENTADA FERMENTADA FERMENTADA FERMENTADA

LACTOSA NI LACTOSA NI LACTOSA NI LACTOSA NI

SACAROSA SACAROSA SACAROSA SACAROSA

FERMENTADAS FERMENTADAS FERMENTADAS FERMENTADAS


Diagrama de flujo realización de Pruebas Bioquímicas

RECOLECCIÓN DE MATERIALES A
UTILIZAR EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS

PREPARACION DE MATERIAL DE
LABORATORIO

REALIZACION DEL PROCEDIMINTO


PARA PRUEBAS BIOQUIMICAS

INCUBACION DE MUESTRAS

ANOTAR RESULTADOS

ANALISIS DE RESULTADOS

COMPARACION DE RESULTADOS
EXPERIMENTALES Y TEORICOS

EVALUACION Y RESULTADOS FINALES


DE PRUEBAS BIOQUIMICAS