04/05/2010

Bases de datos 
Perfiles de expresión
CUANTIFICACION DE LA EXPRESION 
GENICA MEDIANTE PCR EN TIEMPO 
REAL

GEO

•Validación in silico de genes candidatos para su 
posterior análisis experimental.
•Construcción de hipótesis de trabajo para 
diseños experimentales.
•Integración y complementación del perfil

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Consideraciones a tener en cuenta 
PCR EN TIEMPO REAL para un ensayo de cuantificación de 
expresión diferencial génica 

•Extracción de RNA y transcripción reversa

•Diseño de primers (iniciadores) y determinación 
de la eficiencia de amplificación
LightCycler 480
Hmac 5 Hmct 5
•Química de detección

•Elección del método de cuantificación

Criterios para el Diseño Primers
Extracción de RNA y transcripción reversa
•Calidad de RNA: ratio 260/280 > 1.8, (espectrofotometría)  •Especificidad en la secuencia blanco

•Largo del Primer
•Evitar contaminación con DNA genómico (uso de DNasa) •Temperatura de Melting (Fusión)

•Purificación del RNA después del tratamiento con DNasa

•Purificación del RNA después del tratamiento con DNasa •Contenido de GC
•Contenido de GC

•Propiedades de 3'‐terminal (residuo terminal, contenido de CG)
•Selección de iniciadores para síntesis de cDNA: oligo dT,  •Evitar hairpins en los primers
random primers, primers específicos
•Largo de la región a amplificar
•Eficiencia de retrotranscripción •Evitar interacciones primer‐primer

•Compatibilidad de temperaturas de melting

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La composición de las bases afecta la 
especificidad de hibridación
• Es preferible una composición aleatoria, es decir,
• El largo de Primer tiene su efecto sobre la especificidad y la evitar(A+T) largos y regiones ricas en(G+C), de ser posible.
temperatura de melting/annealing. Es decir, a mayor
longitud del primer, mayor probabilidad de ser único en la
• Usualmente, el contenido promedio de (G+C) alrededor de
secuencia; a mayory longitud
g de pprimer, mayor
y será la
50 60% nos dará la temperatura de melting/annealing
50‐60%
temperatura de melting/annealing. correcta para reacciones de PCR corrientes y dará una
estabilidad de hibridación adecuada, aunque también
• En general, el largo de un primer debe ser al menos de 15 existen otros factores.
bases para asegurar especificidad. Usualmente, se diseñan
de 17‐28 bases de largo.

La especificidad de la PCR depende de los terminales 
3´ de los primers:
•Mientras mejor se ligue el 3´,más eficiente será la síntesis de DNA
•La especificidad aumenta con un terminal 3´ del primer inestable
•Un perfil de (estabilidad)ΔG que decrece mejora la especificidad del  la Tm del DNA será mayor debido a una mayor
PCR
Temperatura de Melting
• La temperatura de Melting Tm: es la
temperatura a la cual la mitad del DNA se
encuentra como hebra simple y la mitad como
hebra doble. La Tm es característica de la
composición de DNA. A mayor contenido de G+C
cantidad de puentes de H.

•Se recomienda mantener en los últimos 5 nucleótidos del 3´
terminal a lo más 3 C ó G.

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Temperatura de Annealing Estructuras internas

T anneal –es la temperatura a la cual los primers se 

unen al templado de DNA. Puede ser calculado 
por medio de la Tm

Tanneal= Tm_primer– 40C

http://www.idtdna.com/SCITOOLS/scitools.aspx
Pares de Primers

• Los primers funcionan de a pares–forward primer y 
reverse primer. Ambos son usados en la misma 
reacción, debe asegurarse de que las condiciones de 
PCR sean las apropiadas
PCR sean las apropiadas.

Un rasgo crítico es sus temperaturas de annealing, las 
que deben ser compatibles entre ellos. La diferencia 
máxima permitida deberá ser de 3 oC. Mientras más 
cercana sean sus Tanneal, mejor será.

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http://tools.invitrogen.com/content.cfm?pageid=9716
Química de detección 

Agentes intercalantes de unión 
Sondas Light‐cicler
específicos a dsDNA

1)Adición de las sondas marcadas con dos fluoróforos
2)Durante el ciclo de PCR las sondas hibridan la hebra de 
DNA complementario, permitiendo la fluorescencia del 
aceptor
3)La fluorescencia del aceptor sube proporcionalmente 
con la concentración de DNA

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Sondas TaqMan Molecular Beacon

Molecular Beacons son oligonucleótidos acoplados a un fluoróforo reportero y a un

(1)La fluorescencia del fluoróforo receptor en las sondas TaqMan intactas es  Quencher. Los nucleótidos en el 5'‐terminal son complementarios a aquellos en el 3'‐
suprimida através de un Quencher através de transferencia de energía no‐ terminal formando la estructura secundaria característica de Molecular Beacons. En
radiante(FRET). este estado destemloop el reportero no emite fluorescencia debido a su cercanía con
(2) Durante un ciclo de PCR, la sonda hibrida la cadena de DNA complementaria, la  el Quencher. Al acoplarse a la secuencia de DNA complemetaria durante un ciclo de
fluorescencia del fluoróforo reportero se mantiene suprimida. PCR, la distancia entre el Quencher y el reportero se agranda. La fluorescencia del
(3) Durante el ciclo de PCR la polimerasa Taq corta el 5‘ terminal de la sonda,  reportero puede ser entonces observada.
gracias a su actividad de exonucleasa‐5'‐3‘.La fluorescencia del reportero ya no es 
suprimida por el Quencher y puede ser medida.

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Qué está siendo amplificado?
La cuantificación de la cantidad de cDNA en la muestra original 
debe realizarse cuando la amplificación es logarítmica, es decir, 
al principio de la curvatura y NO en la región lineal de la curva 
(en escala aritmética).

En real –time  .
Threshold: Línea impuesta por el usuario en la zona de
aumento logarítmico de fluorescencia.
CT: Es el punto en que la fluorescencia atraviesa elumbral
(threshold)
CP: Es el punto en que la fluorescencia aumenta notablemente
sobre la fluoresce ncia background. Es medida a un nivel de Dimeros

fluorescencia constante.

Normalización respecto de un gen 
referencia
Cuantificación absoluta. Usado para determinar el
número de copias del transcripto de interés, usualmente
relacionando la señal de PCR con una curva estándar.

Cuantificación relativa En este método una de las

muestras experimentales es el calibrador(control). Cada
uno de los valores de la muestra a normalizar es dividido
por el valor de la muestra calibradora, generando niveles
de expresión relativa.

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Método de curva estándar

Cómo determinar la expresión relativa  Método Pfaffl de cuantificación 

sin usar curvas de estandarización? relativa
• Con el Método desarrollado por M.W. P faffl
determinando eficiencia de amplificación de los 
primers.

A new mathematical model for relative

quantification in real‐time PCR M.W. Pfaffl Nucleic
Acids Research, 2001, Vol. 29 (9)

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Métodos para determinación de 
eficiencia de real‐time PCR

Expresión de IL1‐b en células de ojo 
tratadas con humor vítreo

IL1‐b: Gen problema Con: células de ojo control
RPLP0: Gen referencia  Vit: células de ojo expuestas a humor vítreo

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Método Pfaffl: compara la expresión del 
Gen referencia: RPLP0
gen entre el control y las células tratadas 
Gen Problema: IL1‐b

El incremento real deI L1‐b es 
1901 veces respecto del control

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Método Delta‐Delta CT para 
cuantificación relativa 

•Es un método aproximado, ya que asume un 100% de

eficiencia de amplificación para ambos genes(referencia y
problema)

•Se analiza la diferencia de expresión entre los genes control y

problema para cada muestra (células control, células tratadas)

•Se asume que todas las muestras contienen la misma

cantidad de cDNA

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