P URIFICAÇÃO DE P RODUTOS

B IOTECNOLÓGICOS
P URIFICAÇÃO DE P RODUTOS
B IOTECNOLÓGICOS
 Diversidade de produtos
biotecnológicos  não há
processos de purificação e
aplicação geral
 Escolha das operações unitárias 
uso da molécula alvo e suas
características físico-químicas
 E TAPAS P RINCIPAIS
 Clarificação = separação de células e
seus fragmentos do meio de cultivo
 Concentração e/ou purificação de baixa
resolução = separação da molécula alvo
 Purificação de alta resolução =
separação de classes de moléculas com
algumas características físico-químicas
semelhantes
 Operações para acondicionamento final
do produto
P URIFICAÇÃO DE P RODUTOS
B IOTECNOLÓGICOS
 Para produtos associados às células 
rompimento celular
 A redução do número de etapas é de
fundamental importância na viabilidade
do processo
 Exemplo, se a cada operação unitária o
rendimento em produto for de 90%, a
aplicação de 9 operações levará a um
rendimento final de cerca de apenas
40%
 O PERAÇÕES U NITÁRIAS

CLARIFICAÇÃO:
 Filtração convencional
 Centrifugação
 Filtração tangencial
 Floculação
 O PERAÇÕES U NITÁRIAS

ROMPIMENTO DE CÉLULAS:
 Homogeneização
 Moagem em moinho de bolas
 Rompimento químico ou
enzimático
 O PERAÇÕES U NITÁRIAS

PURIFICAÇÃO DE BAIXA
RESOLUÇÃO:
 Precipitação
 Ultrafiltração
 Extração em sistemas de duas
fases líquidas
 O PERAÇÕES U NITÁRIAS

PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO:

 Cromatografia de troca iônica
 Cromatografia de afinidade
(biológica ou química)
 Cromatografia de fase reversa
 Cromatografia de exclusão
molecular
 O PERAÇÕES U NITÁRIAS

TRATAMENTOS FINAIS:
 Cristalização
 Liofilização
 Secagem
 C LARIFICAÇÃO

 É a separação de células suspensas

de um meio de cultivo
 É a primeira operação unitária do
processo de purificação
 O meio resultante (isento de
células) é denominado clarificado
ou filtrado
 Depende da dimensão da partícula
a ser removida
 C LARIFICAÇÃO

Filtros convencionais
Centrifugação
Microfiltração

0,1 m 1 m 10 m 100 m

Bactérias Leveduras
Bolores
F ILTRAÇÃO C ONVENCIONAL

 Aplica-se à clarificação de grandes

volumes de suspensões diluídas de
células (da ordem de milhares de
litros), produtos extracelulares e
situações nas quais a assepsia não é
necessária
 A contínua deposição das células
sobre o meio filtrante resulta a
formação de uma “torta” de filtração
F ILTRAÇÃO C ONVENCIONAL

Filtro Rotativo à Vácuo

 C ENTRIFUGAÇÃO

 Processo que acelera o processo

de sedimentação pela ação de um
campo gravitacional centrífugo
 Resulta em suspensões mais
concentradas em relação à
original
 C ENTRIFUGAÇÃO

Centrífugas Tubulares
 C ENTRIFUGAÇÃO

Centrífugas de Discos
 M ICROFILTRAÇÃO

 Filtração tangencial  fluido de

alimentação escoa
tangencialmente à superfície do
meio filtrante  a tensão de
cisalhamento do fluido minimiza o
acúmulo de células e seus
fragmentos na superfície da
membrana
M ICROFILTRAÇÃO
 M ICROFILTRAÇÃO

Filtro Tubular com Fibra Oca

 M ICROFILTRAÇÃO

Filtro Tipo Quadro e Placa

 M ICROFILTRAÇÃO

 Pode ser conduzida em um ou

mais filtros
R OMPIMENTO DE C ÉLULAS
M ICROBIANAS
 Produtos associados às células
requerem o rompimento ou a
permeabilização destas através de
operações conduzidas sobre o
adensado obtido após a clarificação
 Para recuperação de produtos
termolábeis ou sujeitos a ação de
proteases  processo deve ser rápido
e conduzido em baixas temperaturas
 PAREDE C ELULAR

Bactérias
Gram (+)

Bactérias
Gram (-)D

Leveduras

Fungos
Filamentosos
R OMPIMENTO DE C ÉLULAS
M ICROBIANAS
MÉTODOS MECÂNICOS:
 Homogeneizador de alta pressão 
equipamento constituído de pistões
projetados para aplicar altas pressões à
suspensão celular, forçando sua
passagem através de um orifício
estreito seguida de colisão contra uma
superfície em uma câmara de baixa
pressão. A queda instantânea de
pressão associada ao impacto, provoca
o efetivo rompimento celular sem
danificar proteínas
R OMPIMENTO DE C ÉLULAS
M ICROBIANAS
MÉTODOS MECÂNICOS:
R OMPIMENTO DE C ÉLULAS
M ICROBIANAS

MÉTODOS MECÂNICOS:
 Moinho de bolas
 Ultrassom
R OMPIMENTO DE C ÉLULAS
M ICROBIANAS

MÉTODOS NÃO MECÂNICOS:

 Choque osmótico
 Congelamento e
descongelamento
 Secagem
R OMPIMENTO DE C ÉLULAS
M ICROBIANAS

MÉTODOS QUÍMICOS:
 Álcalis
 Solventes
 Detergentes
 Ácidos
 R OMPIMENTO DE C ÉLULAS
M ICROBIANAS
MÉTODOS ENZIMÁTICOS:
 Adequados para a recuperação de
biomoléculas sensíveis à tensão de
cisalhamento ou pressão de trabalho
geradas pelos métodos mecânicos
 Quando uma certa quantidade de parede
é removida, a pressão osmótica interna
rompe a membrana citoplasmática,
permitindo que o conteúdo intracelular
seja liberado para o meio externo
 R OMPIMENTO DE C ÉLULAS
M ICROBIANAS
MÉTODOS ENZIMÁTICOS:
 Sistemas líticos são específicos para
cada grupo de microrganismo
 Para leveduras  como glucanases,
proteases e mananases
 Para bactérias  enzimas como
glicosidases, acetilmuramilalanina
amidases, endopeptidases e proteases
 R OMPIMENTO DE C ÉLULAS
M ICROBIANAS
MÉTODOS ENZIMÁTICOS:
 Vantagens  facilidade no controle do
pH e temperatura, baixo investimento
de capital e alta especificidade para
degradação da parede celular
 Desvantagens  alto custo das enzimas
e variação da eficiência da lise
enzimática com o estado fisiológico do
microrganismo
 P RECIPITAÇÃO

 Método utilizado para separar os produtos

microbianos em meio aquoso
 Método tradicional de concentração e
purificação de proteínas
 A solubilização de proteínas precipitadas
pode ser dimensionada de modo a
promover a redução do volume inicial e,
portanto, levar ao aumento da
concentração  pode proceder processos
de elevada resolução, como cromatografia
 P RECIPITAÇÃO

 Proteínas precipitadas têm sua

estrutura tridimensional modificada 
sua aplicação só é viável quando a
conformação da proteína é recuperada
após a precipitação
 “Salting-out” = precipitação de
proteínas em altas concentrações
salinas. Mais usados: citrato de sódio,
sulfato de sódio e sulfato de amônio
 P RECIPITAÇÃO

 “Salting-out” = precipitação de
proteínas em altas concentrações
salinas. Mais usados: citrato de sódio,
sulfato de sódio e sulfato de amônio
 Precipitação por solventes = devido à
redução da constante dielétrica do
meio
 U LTRAFILTRAÇÃO

 Utilizada para concentrar

macromoléculas como proteínas ou
polissacarídeos
 Transporte de soluções através de
membranas com poros de diâmetros
de 0,001 a 0,1m, sob pressão de
transmembrana de 100 a 500kPa e
fluxo de filtrado de 10 a 200 L/hm2
 U LTRAFILTRAÇÃO

VANTAGENS:
 Separação de bioprodutos de caldos
fermentados diluídos
 Promover a concentração de
compostos a baixa temperatura e
pressão
 Possibilitar a retirada de sais e outras
moléculas pequenas
 Manter constante o pH do meio
E XTRAÇÃO EM S ISTEMAS DE
D UAS FASES A QUOSAS
 As moléculas alvo e as impurezas são
separadas como resultado de suas
diferentes solubilidades nas fases líquidas
imiscíveis (fase aquosa e solvente)
Sistemas de suas fases aquosas:
 Polietilenoglicol (PEG)/ dextrana (Dx)
 Polipropilenoglicol (PPG)/ Dx
 Sulfato dextrana de sódio/PPG
 PEG/ fosfato de potássio
 PEG/ sulfato de magnésio
 PEG/ citrato de sódio
 C ROMATOGRAFIA

 Processo  os solutos de um meio

líquido (proteínas, peptídeos,
anticorpos) são adsorvidos ou
retidos em um leito de material
poroso
 A posterior remoção gradual dos
solutos por ação de uma fase
líquida móvel (eluente), resulta na
separação das diferentes moléculas
C ROMATOGRAFIA
C ROMATOGRAFIA
 C ROMATOGRAFIA

Processos cromatográficos
industrialmente mais utilizados:
 Gel filtração  baseado na
separação de moléculas em função
do volume efetivo em solução
 Troca iônica  baseado na adsorção
das moléculas sobre o leito
cromatográfico
 T RATAMENTOS F INAIS

 Liofilização
 Cristalização
 Secagem
 L IOFILIZAÇÃO

 Processo de remoção de um
solvente (tipicamente a água)
de uma solução por
sublimação
 Nesse processo o material é
congelado e em seguida
submetido a baixa pressão
para sublimação da água livre
 C RISTALIZAÇÃO

 Processo de agregação de
cristais de moléculas presentes
em soluções homogêneas
supersaturadas
 Operação Unitária Características determinantes
Densidade e tamanho das células
Centrifugação
Viscosidade do meio
Filtração convencional Compressibilidade e tamanho das células
Microfiltração Tamanho das células ou partículas
Resistência física da parede celular ao
Homogeneização
gradiente de pressão
Resistência física da parede celular à
Moinho de bolas
tensão de cisalhamento
Extração em SDFA
Solubilidade de proteínas
Precipitação
Cromatografia de troca
Mobilidade eletroforética de proteínas
iônica
Ultrafiltração
Massa molecular
Gel filtração
A LGUMA D ÚVIDA ?