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Abstract The practical application of a polymerase chain reaction (PCR) amplification for the
diagnosis of congenital and perinatal cytomegalovirus (CMV) infections was evaluated. Three
hundred five urine samples were tested by PCR and conventional virus isolation in cell culture. Viruria
was detected in 47 urine samples by PCR using a primer pair which amplifies part of the major
immediate-early (MIE) CMV genome. The PCR compared to virus isolation showed 89,6% sensitivity,
98,5% specificity and 91,5% positive predictive value. PCR with primer pairs amplifying parts of the
glycoprotein B and glycoprotein H genes of CMV were used for confirmation of the positivity of the
47 urine samples. We concluded that this CMV PCR assay in urine has a suitable sensitivity for the
diagnosis of congenital and perinatal infections and its specificity is highly increased by use of more
than one pair of primers among the ones we used.
Key-words: Cytomegalovirus. Cytomegalovirus diagnosis. Polymerase chain reaction. Congenital
and perinatal infection.
Unidade Multidisciplinar de Pesquisa em Virologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP.
Trabalho financiado parcialmente pela FAPESP e CNPq.
Endereço para correspondência: Drª Aparecida Yulie Yamamoto, Unidade Multidisciplinar de Pesquisa em Virologia, FMRP/USP,
Av. Bandeirantes 3900, Campus da USP, Bairro Monte Alegre, 14049-900 Ribeirão Preto, SP. Fax (016) 633-6695.
Recebido para publicação em 03/01/97.
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MIE e gB, nos testes com as diluições decimais observou-se uma sensibilidade 50 vezes maior
da amostra de CMV AD169, ocorreu até a d a PC R co m o s primers MIE e gB o que
diluição 1:100 e na PCR com o primer gH até a permitiria detectar a presença viral em amostras
diluição 1:10, conforme mostra a Figura 3. c o m t í t u l o v i ra l t ã o b a i x o q u a n t o 1 0 1,8
A amostra do CMV AD169 mostrou título de T C I D 5 0 / m l . Ta m b é m , o b s e r vo u - s e u m a
10 3,5 TCID 50 /ml, com base na detecção do sensibilidade 5 vezes maior da PCR com os
efeito citopático. Comparando este resultado primers gH, suger indo capacidade para
com aqueles obtidos por PCR nas diferentes detectar amostras virais com título de 102,8
diluições da mesma semente viral (Tabela 3) TCID50/ml.
Tabela 3 - Positividade para CMV observada nas diferentes diluições da amostra de CMV AD169 pela inoculação em células (efeito
citopático) e pela PCR, avaliando separadamente os três pares de primers.
Diluições da amostra Efeito PCR com PCR com PCR com
de CMV AD169 citopático Primers MIE Primers gB Primers gH
nº % nº % nº % nº %
Não diluído 4 100 4 100 4 100 4 100
1:10 4 100 4 100 4 100 4 100
1:100 0 0 4 100 4 100 0 0
1:1000 0 0 0 0 0 0 0 0
Volume das diluições da semente viral inoculadas nas células: 10µl;
Volume das diluições da semente viral utilizadas na PCR: 2µl.
DISCUSSÃO
É conhecido que crianças com com infecção adquirida23. A detecção do CMV na
citomegalovirose excretam grandes quantidades urina de recém-nascidos nas 3 primeiras semanas
de vírus na urina e por períodos prolongados. de vida define a infecção congênita1 7 23. Por
As quantidades de vírus excretadas costumam outro lado, a infecção perinatal é diagnosticada
ser bem superiores às observadas em adultos quando crianças em que a virúria era negativa
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ao nascimento, passam a apresentá-la entre a reduz esta interferência com a ligação dos
4ª e 12ª semana de vida1 15 23. Assim, a observação primers e a amplificação do genoma viral.
da presença viral na urina é a técnica mais Assim, a metodologia simplificada da PCR que
comumente utilizada para o diagnóstico dessas utilizamos neste estudo permitiu realizar teste
infecções. sem nenhum tratamento prévio com a
Método clássico para a detecção de virúria, vantagem de evitar os complexos procedimentos
o isolamento viral, tem seu uso rotineiro para extração do DNA viral5 16 17 21. Em nosso
dificultado por necessitar recursos laboratoriais estudo, observamos 5 amostras com isolamento
dispendiosos que permitam a manutenção de positivo e PCR negativa. Acreditamos que,
culturas celulares de fibroblastos humanos e nestes casos, a presença de inibidores urinários
por exigir que as amostras de urina sejam tenha interferido nos resultados, reduzindo a
colhidas com assepsia rigorosa e inoculadas sensibilidade da PCR. Estas urinas pertenciam
logo após a coleta, uma vez que os CMV são a 4 crianças com idade entre 3 a 4 meses e
muito lábeis. Outro inconveniente desta por tanto, com teores ur inár ios de uréia
técnica é a demora na obtenção do resultado d o superiores aos observados nos recém-nascidos.
ex a m e, u m a ve z q u e o s C M V s ã o d e Neste trabalho, observamos uma adequada
replicação lenta, podendo levar semanas para o sensibilidade da PCR utilizando os 3 pares de
aparecimento do ECP20. A aplicação da PCR no primers. Em todos as urinas que tiveram
diagnóstico da infecção por CMV apresenta amplificação viral por MIE o teste mostrou-se
algumas vantagens sobre o isolamento viral. positivo quando utilizou-se gB ou gH. Também, a
Para o teste utiliza-se volumes diminutos de adequada sensibilidade da técnica pode ser
material (1 a 2µl) e o seu resultado pode ser observada nos experimentos com o CMV AD 169,
obtido em menos de 24 horas. Também, em que baixos níveis de vírus (101,8TCID50/ml)
as amostras clínicas a serem testadas por PCR mostraram-se detectáveis pelos primers MIE e
podem ser congeladas e armazenadas. gB. Nestes experimentos a sensibilidade de gH
Utilizamos na PCR os primers MIE, gB e gH mostrou-se 10 vezes inferior (Tabela 3 e Figura 3).
com base em estudos prévios mostrando que A confirmação dos resultados obtidos na
estes primers amplificam regiões distintas do PCR para CMV pode ser realizada através de
genoma altamente conservadas nas diversas hibridação com seqüência de nucleotídeos
cepas do vir us e, também, possuem alta específica para a região do genoma amplificada,
especificidade para CMV, não amplificando o marcada com isótopo radioativo ou enzima5 22.
ADN de outros herpesvirus2 5 8 16 17. Entretanto, tal técnica apesar de ser altamente
Analisando os resultados obtidos pela PCR específica, aumenta a complexidade e o custo
em nosso estudo e sua comparação com os do teste. A confirmação da seqüência dos
obtidos pelo isolamento viral, observamos nucleotídeos de CMV obtida por PCR, também
associação altamente significante entre as pode ser feita por técnica denominada nested
técnicas (χ2 = 233,72 e p < 0,0001) e resultados PCR, em que se produz nova amplificação
comparáveis, com sensibilidade (89,6%), genômica com o emprego de primers internos
especificidade (98,5%) e valor preditivo à seqüência inicialmente amplificada19. Em
positivo (91,5%) adequados. Demmler e nosso estudo, foi possível a confirmação da
colaboradores 6 , utilizando os primers MIE, PCR para CMV utilizando mais de um par de
analisaram por PCR urinas de recém-nascidos primers separadamente ou através de um PCR
com infecção congênita e comparando estes multiplex, em que os diferentes pares de
resultados com os obtidos pelo isolamento viral, primers são usados conjuntamente. Assim na
encontraram sensibilidade de 93%, especificidade PCR multiplex, utilizando 3 pares distintos de
de 100% e valor preditivo positivo de 100%, primers, amplificadores de regiões diferentes
valores semelhantes aos observados em nosso do genoma de CMV, conseguimos obter de
estudo. forma rápida, o resultado característico com a
Apesar de alguns trabalhos, como o de presença de fragmentos de tamanhos diferentes
Khan e colaboradores 12, demonstrarem que (Figura 2), relacionados especificamente a cada
existem inibidores na urina para a reação da um dos primers. Nesta situação, cada produto
PCR, como a uréia, sabe-se que os recém- amplificado corresponde a um controle interno
nascidos, habitualmente, possuem baixos teores da especificidade dos outros fragmentos
de uréia, lipídios e proteínas urinárias, o que detectados no mesmo teste, dispensando
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procedimentos posteriores para a confirmação 10. Gleaves CA, Smith TF, Shuster EA, Pearson GR.
destes produtos9. Rapid detection of cytomegalovirus in MRC5 cells
Portanto, a PCR tem uma grande aplicabilidade, inoculated with urine specimens by use of low speed
comparável ao isolamento viral no diagnóstico centrifugation and monoclonal antibody to an early
da citomegalovirose, particularmente na infecção antigen. Journal of Clinical Microbiology 19:917-19,
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