Experimento Clásico 5.

SEPARANDO ORGANELOS

E n los años 1950 y 1960, los científicos utilizaron dos técnicas para estudiar
organelos celulares: microscopía y fraccionamiento. Christian de Duve estuvo
a la cabeza del fraccionamiento celular. En la década de 1950, utilizó la
centrifugación para distinguir un nuevo organelo, el lisosoma, a partir de
fraccionamientos previos caracterizo: el núcleo, la fracción mitocondrial y los
microsomas. Poco tiempo después, utilizó la centrifugación de equilibrio de
densidad para descubrir otro organelo.

Antecedentes
en un sitio discreto dentro de la célula. Armado con estas
Las células eucariontes son altamente organizadas y com- hipótesis y la poderosa herramienta de la centrifugación, de
puestas por estructuras celulares conocidas como organelos Duve subdivide la fracción mitocondrial. En primer lugar,
que realizan funciones específicas. Aunque la microscopía identificó a la fracción ligera mitocondrial, que se compone
ha permitido a los biólogos describir la ubicación y el de las enzimas hidrolíticas, que ahora se sabe componen el
aspecto de diferentes organelos, es de uso limitado en el lisosoma. Luego, en una serie de experimentos que se des-
descubrimiento de la función de los organelos. Para ello, criben aquí, identificó otra fracción subcelular discreta, que
los biólogos celulares se han basado en una técnica conoci- él llamó peróxisoma, dentro de la fracción mitocondrial.
da como fraccionamiento celular. Aquí, las células se rom-
pen, y los componentes celulares se separan en función de
su tamaño, masa y densidad, utilizando una variedad de El Experimento
técnicas de centrifugación. Los científicos pudieron aislar y
de Duve estudio la distribución de enzimas en células de
analizar los componentes celulares de diferentes densida-
hígado de ratas. Altamente activo en energía metabólica,
des, llamadas fracciones. Usando este método, los biólogos
el hígado contiene un número de enzimas utilizables para
habían dividido la célula en cuatro fracciones: fracción
estudio. Para buscar la presencia de varias enzimas durante
nuclear, fracción mitocondrial, fracción microsómica y
el fraccionamiento, se basó en pruebas conocidas, llama-
fracción soluble.
das ensayos enzimáticos, para la actividad enzimática. Pa-
de Duve fue un bioquímico interesado en la localización
ra mantener la máxima actividad de la enzima, tuvo que
de enzimas metabólicas subcelulares. Él ya había completa-
tomar precauciones, que incluyó realizar todos los pasos
do un gran cuerpo de trabajo sobre el fraccionamiento de
de fraccionamiento a 0°C, porque el calor desnaturaliza
las células del hígado, en el que había determinado la loca-
las proteínas, pudiendo comprometer la actividad enzi-
lización de numerosas enzimas subcelulares. Mediante la
matica.
localización de estas enzimas en fracciones celulares espe-
de Duve utilizó centrifugación de velocidad zonal para
cificas, pudo comenzar a aclarar la función del organelo.
separar los componentes celulares, por sucesivos pasos de
Ha señalado que su trabajo se basó en dos hipótesis: el
centrifugación. Removió el hígado de rata y lo trituró
"postulado de la homogeneidad bioquímica" y "el postula-
separado por homogenización. Posteriormente, la prepara-
do de la localización." En resumen, estas hipótesis propone
ción cruda de células homogenizadas fue sometida a cen-
que toda la composición de una población subcelular con-
trifugación a velocidad relativa baja. Este paso inicial separa
tendrá las mismas enzimas, y que cada enzima se encuentra
el núcleo de la célula, que se recoge como sedimento en la
parte inferior del tubo, del extracto citoplasmático que
queda en el sobrenadante. A continuación, de Duve sub-
dividió el extracto citoplasmático en la fracción mitocondrial
pesada, fracción mitocondrial liviana y la fracción microso-
mal. Logró separar el citoplasma mediante el empleo de
sucesivos pasos, aumentando la fuerza de centrifugación.
En cada paso, recolectaba y almacenaba las fracciones para
subsecuentes análisis enzimáticos.
Cuando el fraccionamiento está completado, de Duve
realizó ensayos enzimáticos para determinar la distribu-
ción subcelular de cada enzima. A continuación, trazó
gráficamente la distribución de la enzima en toda la célu-
la. A sido demostrado previamente, la actividad de la
citocromo oxidasa, una enzima importante en el sistema de
transferencia de electrones, fue encontrada previamente en
la fracción mitocondrial pesada. Se ha demostrado que la
fracción mitocondrial contiene otra enzima caracterizada pre-
viamente, glucosa-6-fosfatasa. La fracción mitocondrial
liviana, que se compone de los lisosomas, muestra la carac-
terística actividad de la fosfatasa ácida. Inesperadamente, de
Duve observó un cuarto patrón cuando ensayaba la actividad
de la uricasa. En lugar de seguir el patrón de las enzimas de
referencia, la actividad de la uricasa estaba fuertemente con-
centrada en la fracción mitocondrial liviana. Esta fuerte
concentración, en contraste a la amplia distribución, sugirió
a de Duve que la uricasa podría estar aislada en otra po-
blación subcelular separada de las enzimas lisosomales.
Concentración relativa
La centrifugación de equilibrio gradiente-densidad puede
ser realizada utilizando un número de diferentes gradien-
tes, incluyendo sacarosa y glicógeno. Además, el gradien-
te puede ser hecho en agua o “agua pesada”, que contiene
el isotopo de hidrogeno deuterio, en lugar de hidrogeno. En
su experimento, de Duve separó la fracción mitocondrial
rica del preparado por centrifugación de velocidad zonal en
cada uno de esos diferentes gradientes (ver Figura 5.1). Si la
uricasa fuera parte de un compartimiento subcelular sepa-
rado, esta podrá separarse de las enzimas lisosomales en
cada gradiente testeado. de Duve realizó los fracciona-
mientos en estas series de gradientes, luego realizó ensa-
yos enzimáticos como anteriormente. En cada caso, encon-
tró uricasa en poblaciones separadas de la enzima lisoso-
mal, fosfatasa acida, y la enzima mitocondrial, citocro-
5
4
3
Citocromo oxidasa
2
1
20 40 60 80
5
4

Para probar esta teoría, de Duve empleo una técnica

conocida como centrifugación de equilibrio gradiente- 3
Uricasa
densidad, que separa macromoleculas en base a la densidad. 2

20 40 60 80

4
Fracción de
organelo 3
Aumento de la densidad

1.09 Fosfatasa ácida

Lisosomas 2
de sacarosa (g/cm3)

1.11 (1.12 g/cm3)

1
1.15 Mitocondria
(1.18 g/cm3)
1.19
20 40 60 80
1.22
Peróxisomas Percent height in tube
1.25
(1.23 g/cm3)
▲ FIGURA 5.2 Representación gráfica del análisis de en-
zimas de productos de un gradiente de sacarosa. La fracci-
Antes de la Después de la
ón mitocondrial rica fue separada como se muestra en la Figura
centrifugación centrifugación
5.1, y, a continuación se realizaron ensayos enzimáticos. La re-
lativa concentración de enzimas activas es trazado en el eje y; la
▲ FIGURA 5.1 Representación esquemática de la separación altura de los tubos es trazada en el eje x. El punto máximo en la
de los lisosomas, mitocondrias y peróxisomas por centrifuga- actividad de la citocromo oxidasa (arriba) y la fosfatasa acida
ción de equilibrio densidad. La fracción mitocondrial de la (parte inferior) se observan en la parte superior del tubo. El pico
centrifugación de velocidad zonal, fue separada en un gradiente de en la actividad de la uricasa (en medio) migra hacia la parte infe-
sacarosa, y los organelos fueron separados en base de su densidad. rior del tubo. [Adaptado de Beaufay et al., 1964, Biochem J.
[De Lodish et al., 3ra edición, página 166.] 92:191.]
mo oxidasa (ver Figura 5.2). Al observar repetidamente
actividad uricasa en una distinta fracción de la actividad
enzimática de lisosomas y mitocondrias, de Duve concluyó
que la uricasa era parte de un organelo distinto. El
experimento también mostró that two other enzymes,
catalase and D-aminoácido oxidasa, segregated into the
same fractions as uricase. Because each of these enzymes
either produced or used hydrogen peroxide, de Duve
propuso que esa fracción representaba un organelo
responsable del metabolismo del peróxido y lo llamó el
peróxisoma.
Discusión
El trabajo de de Duve en fraccionamiento celular propor-
ciona una visión en la función de estructuras celulares,
mientras buscaba la ubicación de enzimas conocidas.
Examinando el inventario de enzimas en una fracción deter-
minada de la célula le dio pistas sobre su función. Su
cuidadoso trabajo resultó en el descubrimiento de dos orga-
nelos: el lisosoma y el peróxisoma. Su trabajo también propor-
cionó importantes pistas sobre la función de los organelos. El
lisosoma, donde de Duve encontró muchas enzimas potenci-
almente destructivas, ahora se sabe que es un sitio importan-
te para la degradación de biomoleculas. El peróxisoma ha
demostrado ser el lugar de oxidación de ácidos grasos y ami-
noácidos, reacciones que producen una gran cantidad de
peróxido de hidrógeno. En 1974, de Duve recibe el Premio
Nobel de Fisiología y Medicina en reconocimiento de su
labor pionera.