LA IDENTIFICACION GENÉTICA DE RESTOS

CADAVÉRICOS

Pablo Martín Martín

Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses
Departamento de Madrid

ÍNDICE: 1. INTRODUCCIÓN.–2. PRINCIPALES ÁREAS DE APLICACIÓN DE LA

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA: 2.1 IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS.
2.2 IBP CUANDO EL PRESUNTO PADRE HA FALLECIDO. 2.3 IDENTIFICACIÓN DE RES-
TOS FETALES. 2.4 ANÁLISIS DE ADN DE RESTOS ANTIGUOS. 2.5 IDENTIFICACIÓN DE
VÍCTIMAS DE CONFLICTOS BÉLICOS.–3. METODOLOGÍA DEL ANÁLISIS: 3.1 PROCESOS
DESTRUCTORES DEL CADÁVER Y SELECCIÓN DE LA MUESTRA. 3.2 EXTRACCIÓN
DEL ADN. 3.3 CONTROLES DE CALIDAD: CUANTIFICACIÓN DE ADN HUMANO.
3.4 AMPLIFICACIÓN GÉNICA. 3.5 POLIMORFISMOS ANALIZADOS: 3.5.1 ADN
nuclear (autosómico y de cromosoma Y). 3.5.2 ADN mitocondrial.–
4. PROBLEMÁTICA ASOCIADA AL ANÁLISIS: 4.1 CANTIDAD Y CALIDAD DEL ADN
DE RESTOS ANTIGUOS. 4.2 DAÑOS MOLECULARES EN EL ADN. 4.3 CONTAMINACIÓN.
4.4 INHIBICIÓN.–5. IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVÉRICOS: AÑOS 2002/
2003.–6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. INTRODUCCIÓN

Desde la aparición de las técnicas de amplificación génica (PCR:

Polymerase Chain Reaction) hace ya casi 20 años (1,2), se han producido
importantes avances en el campo de la Biología Molecular y en concreto
en su aplicación en el campo de la Genética Forense que nos permiten
en la actualidad abordar y resolver casos cada día más complejos, en
concreto en el campo de la identificación genética de restos cadavéricos
se han mejorado los procesos desde la recogida y tratamiento de las
muestras más idóneas hasta la obtención de perfiles genéticos a partir de
estos restos que será el objetivo de nuestro trabajo de identificación.
En la década de los años 80, han sido importantes también, los avan-
ces en las técnicas de extracción de ADN a partir de distintos tejidos
como restos óseos, tejidos momificados, etc (3,4,5), así como el descu-
brimiento de los marcadores genéticos analizados (6,7) y su progresiva

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 LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

aplicación de forma cada vez más optimizada , por ejemplo aumentando

el número de marcadores que se realizan en una sola reacción de ampli-
ficación, así como la tendencia a reducir el tamaño de los productos de
la amplificación. A finales de los años 80 se reporta por primera vez (9)
la amplificación de ADN proveniente de huesos antiguos y se desarrolla
el estudio del ADN mitocondrial, a partir de su secuenciación (10). En
las siguientes décadas la unión de los esfuerzos de distintos campos de
investigación ha servido para el desarrollo de lo que podríamos denomi-
nar una tecnología del ADN antiguo y degradado (11), que es una ver-
dadera rama de investigación que da apoyo a su vez a distintos campos
científicos.
En definitiva, la identificación genética de restos óseos humanos
de distinta antigüedad es una herramienta utilizada por muy diversos
campos científicos entre los que cabe destacar la biología evolutiva, la
ecología, la antropología, la arqueología, la paleontología o la genética
forense.
A lo largo de este tema, revisaremos los principales campos en los
que es requerida una identificación: la identificación genética de restos
cadavéricos propiamente dicha, es decir, cuando se produce la aparición
de un cadáver ó resto cadavérico en que se hace necesaria su identifica-
ción genética, la Investigación Biológica de Paternidad (IBP) cuando el
presunto padre ha fallecido, la identificación de restos fetales, así como
el análisis de restos antiguos por los conocimientos que nos aportan y
dedicaremos un apartado especial a la identificación de víctimas de con-
flictos bélicos, tanto por el gran número de casos que realizamos como
por la gran diversidad de estrategias que utilizamos en su resolución.
A continuación veremos como estamos supeditados para la obtención
de la muestra más adecuada al estado de los restos cadavéricos, por lo
tanto hablaremos de la selección de las muestras y de las herramientas
que se utilizan para abordar este tipo de análisis: las principales técnicas
de extracción de ADN, la amplificación génica, así como los polimorfis-
mos genéticos estudiados y los controles de calidad que se realizan a lo
largo del proceso
Revisaremos por último la problemática más frecuente de este tipo de
análisis que viene determinada fundamentalmente por los daños mole-
culares que se producen en el ADN como consecuencia de la muerte
celular así como los fenómenos de contaminación y la inhibición.

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 PABLO MARTÍN MARTÍN

2. PRINCIPALES ÁREAS DE APLICACIÓN DE LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA

En la actualidad y gracias a la mejora de las técnicas usadas en el

laboratorio, así como la mayor experiencia y formación en la resolución
de este tipo de casos, es posible abordar con mayores garantías de éxito
los casos de identificación genética y cada vez es menor el porcentaje de
casos en el ámbito forense que se quedan sin resolver. A comienzos de
los años 90 aparecen publicados los primeros casos de identificaciones
genéticas de individuos a partir de restos óseos (12,13), el Instituto de
Toxicología resuelve los primeros casos de identificación de individuos
por ADN en el año 1994 (14).
A continuación presentamos algunas de las áreas de aplicación en la
identificación genética de restos cadavéricos centrándonos fundamental-
mente en las más relevantes por el número de casos que se realizan.

2.1 Identificación Genética de Restos Cadavéricos

Cuando se produce la aparición de un cadáver o restos cadavéricos

cuya identidad se sospecha (por circunstancias tales como tiempo y lugar
de la desaparición, estado del cadáver, rasgos morfológicos, objetos per-
sonales, etc.) pero no se pueda establecer con total seguridad por méto-
dos tradicionales (antropológicos, odontológicos, etc.), se puede recurrir
a un estudio genético como complemento ó como única vía posible de
identificación.
Los cadáveres de los que no haya sospechas sobre quién se trata deben
ser igualmente analizados y sus perfiles genéticos deben ser almacenados
en una base de datos anónima que permita su comparación con muestras
de referencia de personas que tengan familiares desaparecidos. Estas bases
de datos deberían ser únicas y coordinadas por algún organismo capaz de
centralizar los datos. No obstante, en países como el nuestro el número de
cadáveres que quedan sin identificar es muy escaso.
Los casos en los que es necesario recurrir a una identificación gené-
tica, presentan una mayor o menor complejidad en función de las mues-
tras cadavéricas de que se disponga para realizar la investigación, así
como por la disponibilidad de muestras de referencia para poder identi-
ficar los restos, estas dos circunstancias nos harán decidirnos por una u
otra estrategia de resolución.
Como consecuencia de la gran variedad de situaciones con las que
nos podemos encontrar, vamos a tratar de ordenar ó clasificar los casos
que pueden ser resueltos primero en función del tipo de muestra que

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 LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

debemos analizar, segundo en función del análisis comparativo y tercero

en función del tipo de caso.
A. Atendiendo al estado de conservación de la muestra, los casos
más típicos son:
• Restos cadavéricos en buen estado de conservación. En estos casos
en los que la recogida de muestras se realiza inmediatamente después
de la muerte, las muestras más adecuadas son sangre y/o músculo. La
obtención de ADN en buen estado de conservación de estas muestras no
suele representar un problema. Un grupo muy importante de casos que
se englobarían en este primer apartado son los restos cadavéricos carbo-
nizados. En los casos en los que se producen víctimas carbonizadas, el
ADN es muy estable a las altas temperaturas a las que se ve sometido y
en general es posible obtener ADN de alta calidad de aquellos tejidos que
no hayan sido destruidos incluso para realizar el estudio por VNTRs.
• Restos cadavéricos con un avanzado estado de putrefacción ó
esqueletizados. Se trata de restos en los que la toma de muestras se
realiza después de un periodo de tiempo largo tras la muerte, en este
caso las muestras más adecuadas son piezas dentales ó huesos largos.
Son los casos que entrañan mayor dificultad en cuanto a la obtención y
el análisis del ADN.
• Restos cadavéricos embalsamados. Normalmente son los casos
que entrañan la mayor dificultad puesto que lo más común es que la
conservación del cadáver se realice mediante formol ó derivados y está
demostrado que el formol produce grandes modificaciones de los áci-
dos nucleicos, de tal forma que incluso es posible la no obtención de
resultados de amplificación. Varía en función de las concentraciones y
cantidades usadas, del tiempo que transcurra desde la muerte hasta el
embalsamamiento, y del tiempo en que la muestra esté en contacto con
el formol. Lo mismo ocurre cuando se trata de muestras conservadas en
formol (biopsias) para realizar estudios anátomo-patológicos.
• Restos cadavéricos momificados. En ciertos cadáveres se producen
fenómenos naturales de momificación como consecuencia de la rápida
evaporación del agua del cuerpo, con lo que se detiene el desarrollo
de microorganismos y por tanto la putrefacción y por tanto el material
genético de los tejidos blandos momificados se preserva en condiciones
que permiten su análisis, que en condiciones habituales no sería posible
debido a los procesos destructivos del cadáver. Se trata de fenómenos
excepcionales de preservación cadavérica que no son frecuentes en
nuestra casuística.

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 PABLO MARTÍN MARTÍN

B. Atendiendo al tipo de análisis genético comparativo, según las

muestras de referencia:
• Identificación a través de una IBP directa: como muestras de refe-
rencia utilizaremos a sus hijos biológicos. En la experiencia de nuestro
centro, aproximadamente un 20% de los casos de identificación se resol-
vieron mediante esta estrategia.
• Identificación a través de una IBP reversa: como muestras de refe-
rencia utilizaremos a sus progenitores. Un 60% de los casos son resueltos
a través de una maternidad, de una paternidad ó de una paternidad/
maternidad.
En determinados casos no disponemos de ascendientes ó descen-
dientes directos del individuo a identificar, cuando esto sucede es posible
el estudio de otros familiares como hermanos u otros parientes, depen-
diendo de los familiares de que dispongamos, podemos utilizar otras dos
estrategias de estudio:
• Identificación a través del ADN mitocondrial: como muestras de
referencia utilizaremos a parientes que compartan la línea materna.
• Identificación a través del ADN de cromosoma Y: como muestras
de referencia utilizaremos a parientes que compartan la línea paterna.
Aproximadamente un 18-20% de los casos de identificación se resolvie-
ron mediante alguna de estas estrategias.
• Identificación a través de muestras biológicas del individuo falleci-
do, que hayan sido obtenidas antes de su muerte.
C. Atendiendo al tipo de caso.
Más que una clasificación de lo que se trata es de mostrar la enor-
me variedad de situaciones con las que nos podemos encontrar que
dependerán de los antecedentes ó circunstancias que han provocado la
identificación:
• Identificación de personas desaparecidas: en este apartado se
pueden agrupar una gran variedad de casos, como personas que des-
aparecen de forma accidental, personas víctimas de hechos criminales,
personas víctimas de conflictos bélicos ó políticos, etc.
• Identificación de personas víctimas de accidentes. Se trata de un
grupo con una gran variedad de situaciones como accidentes de tráfico,
domésticos, grandes catástrofes, etc.
A veces no se puede diferenciar si la muerte es accidental ó intencio-
nada, así como es complejo conocer en ciertas situaciones las circunstan-
cias que han motivado la muerte.

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 LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

La antigüedad y condiciones de conservación de los restos suelen ser

muy variables, por ejemplo, si se trata de identificar a personas falleci-
das en accidentes de tráfico, las muestras normalmente tienen una anti-
güedad que oscila entre unas horas y varios días; en otro tipo de casos
como por ejemplo cuando se trata de una persona desaparecida, la data
puede oscilar desde días hasta varios años. Conocer la antigüedad y las
condiciones de conservación de los restos es un dato valioso para el
investigador que realiza la identificación.

2.2 Investigación biológica de la paternidad cuando el presunto

padre ha fallecido

En casos en los que existe una reclamación de filiación y el supuesto

padre ha fallecido, se presentan diversas estrategias de análisis para res-
ponder a la pregunta de la filiación:
A. Proceder a la exhumación del cadáver.
B. Recurrir a familiares vivos del supuesto padre, para intentar
deducir su patrimonio genético.
C. Utilizar muestras biológicas del individuo fallecido, que hayan
sido obtenidas antes de su muerte.
En nuestro centro se analizaron en los dos últimos años un total de 54
casos de paternidad cuando el presunto padre ha fallecido, de los cuales
en 17 se realizó un preinforme y se custodió la muestra del padre. En
37 casos se realizó el análisis completo. En todos los casos de inclusión
la probabilidad de paternidad superó el 99,8% aunque se hicieran los
análisis en ausencia de la madre, debido al alto número de marcadores
analizados y por tanto al alto poder de discriminación combinado.
De las muestras procedentes de los padres fallecidos, las que se usa-
ron para el análisis fueron: un 53% sangres ó músculos, un 23% restos
óseos, un 13% piezas dentales y un 9% otro tipo de muestras entre las
que cabe destacar muestras recibidas de centros hospitalarios. Como
vimos en el área de las identificaciones, en el caso de las paternidades
de padres fallecidos el porcentaje de restos óseos y piezas dentales es
muy importante, en este caso es el 36% del total.

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2.3 Identificación de restos fetales

Resolución de casos de abortos ó infanticidios a través de una IBP

reversa.

2.4 Análisis de ADN de restos antiguos

El análisis de este tipo de restos tiene un gran interés en el campo

forense, como hemos visto en las dos primeras áreas de aplicación, un
gran porcentaje de casos son resueltos a través de restos óseos y piezas
dentales y son precisamente este tipo de muestras unas de las más uti-
lizadas en estudios de restos antiguos. La genética forense ha aplicado
técnicas desarrolladas en otros campos como la antropología molecular
(15), sobre todo en lo que se refiere a métodos de purificación de ADN
y a ciertas medidas para evitar la contaminación .
Nuestro centro ha colaborado en trabajos de investigación con la
Universidad Autónoma de Madrid para el estudio de restos humanos
antiguos de excavaciones de asentamientos de hace aproximadamente
4000 años. De la misma forma ha participado en proyectos de estudio de
muestras antiguas (de más de 1500 años) con gran valor antropológico
con la Universidad del País Vasco. Hemos participado en la replicación
de algunos resultados obtenidos por otros centros de investigación, que
es una de las condiciones indispensable para la aceptación de resultados
en este tipo de muestras.
En el estudio de restos antiguos, el análisis de ADN nuclear se
encuentra muy restringido, ya que la posibilidad de obtención de resul-
tados es mínima como consecuencia de la degradación del ADN, casi
todos los estudios se basan en el ADN mitocondrial.

2.5 Identificación de víctimas de conflictos bélicos

La identificación de personas muertas como consecuencia de conflic-

tos bélicos requiere una consideración especial. Como ejemplos citar que
el Instituto está participando en dos proyectos de identificación de vícti-
mas civiles de la guerra de la antigua Yugoslavia a petición del Tribunal
Internacional de La Haya, así como en algunos procedimientos abiertos
para la identificación de víctimas de la Guerra Civil Española.
Durante 1999 se realizó la identificación de 15 personas proceden-
tes de nueve fosas comunes excavadas en Prijedor. Se trataba de restos

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 LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

con una antigüedad de aproximadamente 8 años. En todos los casos se

partió de restos óseos (12 huesos largos y uno plano) y cuatro muestras
de piezas dentales. Los resultados fueron de seis cadáveres identificados
mediante IBP reversa, siete cadáveres excluidos de la misma forma, 1
cadáver excluido mediante IBPM reversa y un cadáver sin resultados de
tipaje
Durante 2002, 2003 y 2004 se realiza la identificación de restos pro-
venientes presumiblemente de 56 personas procedentes de una fosa
común cercana a Belgrado que habían sido masacradas e inhumadas en
Kosovo, trasladadas y hundidas en camiones en el río Danubio y vueltas
a inhumar. En todos los casos se partió de restos óseos. Para realizar el
análisis genético comparativo se nos remiten 13 muestras de referencia y
cuatro árboles genealógicos que incluyen a 44 personas fallecidas en la
matanza. Los resultados fueron la identificación de 32 muestras de varo-
nes y 24 de mujeres. De 8 cuerpos había muestras por duplicado y de
dos cuerpos por triplicado. Así mismo 16 cuerpos han sido identificados
utilizando todo tipo de estrategias de análisis y comparaciones: ADN
nuclear (autosómico y de cromosoma Y), ADN mitocondrial, compara-
ciones con muestras de referencia y entre los propios restos.
Por último estamos participando en la identificación de cadáveres de
la Guerra Civil española, se trata de restos óseos de 20 varones de los que
hemos obtenido 30 extractos de ADN de piezas dentales y 6 extractos de
ADN de huesos largos. Hasta ahora 3 individuos han sido identificados
mediante IBP, y en 15 individuos tenemos una identificación preliminar
(ADN mitocondrial y STRs de cromosoma Y) y en 2 cadáveres no han
sido analizadas las muestras. Hasta ahora se han excluido a 10 individuos
en análisis genéticos comparativos. En estos casos la mayor dificultad es
el tiempo transcurrido desde que sucedieron los hechos (cerca de 70
años), lo que condiciona desde el punto de vista del laboratorio el estado
de los restos cadavéricos que debemos analizar, y por otro lado origina
cierta confusión en lo que respecta a las circunstancias de lo sucedido.
Una vez repasados los posibles campos de aplicación de las técni-
cas de amplificación génica en la resolución de casos de identificación,
vamos a pasar a ver cómo se realizan y qué problemática plantea este
tipo de análisis.

3. METODOLOGÍA DEL ANÁLISIS

A lo largo de este apartado vamos a centrarnos en cómo afectan los

procesos destructores en la selección de la muestra, la extracción del

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ADN, y la amplificación génica, y recordaremos los marcadores que más

se utilizan en la actualidad así como las técnicas de análisis.

3.1 Procesos destructores del cadáver y selección de la muestra

Inmediatamente después de la muerte se ponen en marcha los proce-

sos autolíticos y de putrefacción cadavérica que dan lugar a la completa
destrucción de los tejidos blandos. Los procesos destructores del cadáver
son fundamentalmente autolíticos y de putrefacción. En los fenómenos de
autolisis están implicadas gran número de enzimas, las que producen el
mayor daño al ADN son las nucleasas. Los mecanismos de autolisis son
diferentes en cada tejido y variables en función de condiciones tanto intra-
como extracelulares, como la cantidad de agua, la temperatura, etc.
La putrefacción es un fenómeno de fermentación de la materia orgá-
nica mediante procesos de reducción y oxidación como consecuencia de
la actuación de los microorganismos. Las bacterias existentes en la flora
intestinal son las principales responsables de la putrefacción.
En el proceso de destrucción cadavérica, no sólo intervienen las
enzimas de las propias células y los microorganismos, si no que también
intervienen algunas especies de insectos y si se trata de cadáveres que
permanecen a la intemperie o en el agua actúan otro tipo de animales
de orden superior. Bajo determinadas circunstancias es posible que los
fenómenos de putrefacción se detengan y se produzcan procesos de
conservación cadavérica, entre los que cabe destacar: la momificación, la
saponificación y la corificación.
Las muestras que mejor resisten los fenómenos de destrucción cadavéri-
ca y por tanto las que mantienen su estructura celular más intacta son por un
lado los restos óseos y por otro las piezas dentales, fundamentalmente debi-
do a su estructura histológica que proporciona un aislamiento a sus compo-
nentes celulares mayor que el que se produce en los tejidos blandos.
En el caso del tejido óseo, éste se compone fundamentalmente de
una matriz orgánica calcificada impregnada de sales minerales, con una
alta concentración de fibras de colágeno que representa aproximada-
mente un 95% del peso de la matriz orgánica del hueso. En cuanto a
las sales minerales, éstas se encuentran en forma de fosfato cálcico y
de cristales de hidroxiapatita. Esta matriz está recorrida por un sistema
de cavidades (lagunas u osteoplastos) que comunican entre sí y que
encierran las células óseas (osteocitos) y por los canalículos óseos, una
característica interesante es que en los espacios extracelulares apenas
hay líquido intersticial, con lo que la cantidad de agua en el tejido óseo

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 LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

es muy baja. Las células que componen el tejido óseo son los osteoblas-
tos, que al rodearse de la matriz y madurar se denominan osteocitos y
los osteoclastos.
En los dientes, la capa de esmalte en la corona y el cemento en la raíz
recubren a la dentina que es tejido conectivo especializado que forma
la masa principal del diente y presenta una estructura similar a la del
hueso. La dentina ofrece protección física a la pulpa que tiene una gran
densidad celular. Las células que se encuentran en los distintos tejidos
del diente son: los cementoblastos, cementocitos y odontoblastos, así
como las células de la pulpa que en ocasiones se preservan de manera
excepcional. Todos estos factores explicarían también la razón por la cual
el recuperación de ADN es mayor a partir de dientes y diáfisis de hue-
sos largos (tejido óseo compacto) que a partir de tejido óseo esponjoso,
donde la protección del ADN seria mucho menor.
Por tanto, dependiendo del estado de conservación del cadáver,
seleccionaremos sangre ó tejidos blandos si los procesos de putrefacción
no se han instaurado y si estos procesos están avanzados las muestras
más adecuadas serán los restos óseos y piezas dentales.

3.2 Extracción del ADN

En este tipo de muestras es muy importante la preparación previa

antes de proceder a la extracción del ADN, con el fin de evitar la posible
contaminación de la muestra con material celular de fuentes exógenas,
ya que si se produce cualquier tipo de contaminación celular se detectará
en el análisis posterior. La preparación de la muestra consiste básicamen-
te en la limpieza de las superficies externas y las internas en el caso de
huesos largos: los métodos de limpieza más habituales son el limado de
superficies y los lavados.
El método de extracción más utilizado consiste en una digestión
proteica, seguida de una extracción orgánica del ADN mediante fenol-
cloroformo-isoamílico y un lavado, purificación y concentración del ADN
mediante membranas que retienen el ADN de un determinado tamaño.
En determinadas ocasiones este tipo de extractos deben ser purificados
por otros métodos porque mediante el método expuesto se coextraen
inhibidores que no permiten la obtención de resultados de amplificación
como veremos con posterioridad. Los métodos más usados son los basa-
dos en la purificación mediante membranas de sílica, con los que a veces
conseguimos eliminar los posibles inhibidores sin perder ADN.

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 PABLO MARTÍN MARTÍN

3.3 Cuantificación del ADN

Una vez aislado el ADN, tenemos que realizar una serie de controles
de calidad, que nos permiten por un lado evaluar la presencia de ADN
total y su estado de degradación en el extracto de ADN obtenido, para
ello se realiza una electroforesis submarina en gel de agarosa y posterior
tinción con bromuro de etidio y por otro lado necesitamos conocer la
cantidad de ADN humano , ya que normalmente, al mismo tiempo que
extraemos ADN humano se extrae también ADN de microorganismos.
Hay varios métodos de cuantificación, en nuestro centro hasta ahora
se ha realizado mediante una técnica basada en la hibridación de una
sonda específica de primates superiores con las muestras de ADN y una
posterior detección de una señal de emisión quimioluminiscente que
será comparada con otras señales de cantidad conocida, así mediante
una comparación de intensidades se establece la cantidad aproximada
de ADN humano.
Actualmente la cuantificación se realiza mediante una reacción de
PCR cuantitativa a tiempo real, mediante el uso de primers y sondas
específicas que no solo nos van a dar una cantidad exacta del ADN
humano de que disponemos en cada muestra, si no que además nos
determina el sexo de la muestra puesto que se amplifica una zona del
gen del la Amelogenina, así como nos puede indicar el estado de degra-
dación del ADN si lo que analizamos es el ADN mitocondrial, puesto que
se han diseñado dos zonas específicas con una longitud de unas 100 y
300 pares de bases (16,17)
La problemática asociada a este tipo de controles fundamentalmente
viene asociada a la extracción de ADN procedente fundamentalmente
de microorganismos ya que en el minigel nos enmascara el estado de
degradación del ADN humano y lo mismo ocurre en la detección de
ADN humano, ya que la gran cantidad de ADN proveniente de los micro-
organismos puede interferir en la cuantificación.

3.4 Amplificación génica

Una vez que hemos extraído el ADN de las muestras procedemos a

su análisis mediante técnicas de amplificación génica, que nos va a per-
mitir la obtención de grandes cantidades de las regiones específicas de
ADN que nos interesa estudiar. La técnica de la Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR), es un método automatizado de síntesis enzimática in
vitro de secuencias de ADN, la especificidad de la reacción se consigue

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 LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

usando un par de pequeños segmentos de ADN (de 15 a 30 pares de

bases) que son complementarios a las secuencias que rodean al segmen-
to de ADN que se desea amplificar y que actuarán como iniciadores ó
cebadores de la replicación.
El método de la reacción en cadena de la polimerasa se basa en la
repetición de un ciclo de tres etapas, cada una de las cuales se realiza a
una temperatura determinada. En la primera etapa (desnaturalización),
la doble cadena de ADN se desnaturaliza como consecuencia de apli-
car una alta temperatura (92-95 ºC), en la segunda etapa (anillamiento)
se reduce la temperatura para permitir la unión de los cebadores a las
secuencias homólogas del ADN genómico monocatenario y en la tercera
etapa (extensión), tiene lugar la síntesis de la región que flanquean los
cebadores gracias al ajuste de la temperatura óptima de la ADN polime-
rasa que se utilice.
Cuando amplificamos ADN de restos antiguos es muy probable que se
produzcan fallos en la amplificación, es frecuente que cuando disponemos
de un número pequeño de copias de ADN y el ADN se encuentra muy
fragmentado se produzcan fenómenos de anillamientos inespecíficos entre
las cadenas de ADN, así como con los primers que darán errores en la repli-
cación y es posible que se amplifiquen fragmentos inespecíficos además de
los propios que se amplifican de los fragmentos intactos de ADN.
Una vez concluida la amplificación debemos evaluar si los fragmentos
de ADN se han amplificado con eficiencia, para ello se realiza una elec-
troforesis submarina en gel de agarosa y posterior tinción con bromuro
de etidio.

3.5 Polimorfismos analizados

Los polimorfismos más utilizados en este momento en los laborato-

rios de genética forense son los STRs tetraméricos de autosomas y de
cromosoma Y, ambos forman parte de ADN nuclear. Por otro lado se
estudia el ADN mitocondrial, concretamente la región más estudiada es
la conocida como región de control del ADN mitocondrial.

3.5.1 Evolución del estudio de amplificación de STRs y caracterización

de productos

Los STRs son regiones de ADN repetitivo que se encuentran repartidas

a lo largo de todo el genoma, existiendo, como media, un microsatélite

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 PABLO MARTÍN MARTÍN

cada 5000-10000 pares de bases y están compuestos por una secuencia

de 2-7 pares de bases que se repite en tandem. Un gran número de estas
regiones STR presenta un alto grado de polimorfismo genético de lon-
gitud cuya base molecular es la variación en el número de unidades de
repetición. El alto grado de polimorfismo de algunas de estas pequeñas
regiones del genoma (100-400 pares de bases), la posibilidad de analizar-
los mediante técnicas de muy alta sensibilidad (PCR) (incluso a partir de
muestras antiguas que contienen ADN en un avanzado estado de degra-
dación) y la posibilidad de realizar un tipaje genético de alta resolución
que permite una asignación inequívoca de los alelos, son las razones
fundamentales que han convertido a estos marcadores genéticos en los
más utilizados en la actualidad en el campo de la genética forense.
La amplificación y caracterización de los STRs ha seguido una evolu-
ción paralela, cuando se comenzó a usar la técnica de la PCR, se anali-
zaban de forma individual con reacciones simples de amplificación y del
mismo modo su caracterización se realizaba de forma individual en geles
de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y tinción con nitrato
de plata. Con posterioridad, se amplificaban en reacciones múltiples STRs
que no solapasen en tamaño (2, 3 ó 4 loci simultáneamente) debido a
que la caracterización se realizaba de la misma forma. Actualmente, se
amplifican hasta 16 loci en la misma reacción, gracias al marcaje de uno
de los primers en el extremo 5’ con fluorocromos, lo que nos permite
mezclar en la reacción de amplificación y caracterizar STRs que tengan
el mismo tamaño, puesto que los que coinciden se marcan con fluoro-
cromos que emiten a distinta longitud de onda y por tanto se detectan
con un color distinto. Esta tecnología permite que la caracterización de
productos se realice mediante un análisis automatizado que convierte en
alelos los picos que detecta en función de su movilidad asignándoles un
tamaño, gracias a la incorporación de un estándar interno con fragmen-
tos de longitud conocida.
En cuanto a los STRs de cromosoma Y, en la actualidad se realiza una
amplificación simultánea de 12 STRs, con lo que se ha aumentado de una
forma considerable el poder de discriminación de la técnica al contar con
un número considerable de marcadores, son muy útiles en la resolución
de casos en los que únicamente se dispone de parientes por vía paterna
como muestras de referencia, debido a su herencia paterna.
Se muestra a continuación una lista de las reacciones de amplificación
múltiples más usadas en la actualidad:
– Identifiler: Amelogenina, D8S1179, D21S11, D18S51, TH01, TPOX,
CSF1PO, D3S1358, VWA, FGA, D5S818, D13S317, D16S539, D7S820,
D2S1338 y D19S433

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 LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

– Power Plex 16: Amelogenina, D8S1179, D21S11, D18S51, TH01,

TPOX, CSF1PO, D3S1358, VWA, FGA, D5S818, D13S317, D16S539,
D7S820, Penta E y Penta D
– Power Plex Y: DYS391, DYS389I, DYS439, DYS389II, DYS438,
DYS437, DYS19, DYS392, DYS393, DYS390 y DYS385a/b
La determinación de sexo se realiza en todas las muestras que se
analizan amplificando una corta secuencia del gen de la amelogenina
que en el cromosoma X tiene una longitud de 106 pares de bases y en
el cromosoma Y de 112 pares de bases.

3.5.2 Evolución del estudio de amplificación del ADN mitocondrial y

estudios de secuenciación de productos

Muchos casos de identificación genética de restos cadavéricos sólo se

pueden resolver mediante el análisis de pequeños fragmentos del geno-
ma mitocondrial, ya que en ocasiones se trata del único ADN que puede
recuperarse de forma reproducible de un gran número restos humanos.
Esto se debe fundamentalmente a que el ADN mitocondrial (ADNmt) es
un genoma circular pequeño (16559 pb) que, en contraposición al geno-
ma nuclear, se encuentra en un gran número de copias (100 –1000 copias
por célula) y que debido a su compartimentación dentro de la célula y
a su propia estructura circular podría estar mas protegido de la acción
destructiva de las nucleasas. Tiene algunas características que lo hacen
especialmente útil en la resolución de ciertos casos: su herencia exclu-
sivamente materna hace del ADNmt un marcador ideal para estudios en
los que sólo se disponga de la línea materna. Se usa fundamentalmente
la región no codificante de aproximadamente 1100 pb conocida como
región de control que contiene el origen de replicación de la cadena
pesada y los dos promotores de trascripción y donde se localizan dos
subregiones de aproximadamente 400 pb cada una (regiones hipervaria-
bles I y II: HVI y HV2) que presentan una alta tasa de mutación y, por
tanto, una gran variabilidad de secuencia entre los individuos.

4. PROBLEMÁTICA ASOCIADA AL ANÁLISIS

En general en el análisis del ADN proveniente de restos antiguos los

mayores problemas con los que nos vamos a enfrentar son: la degrada-
ción, las cantidades límites del ADN que se extrae, la contaminación con
ADN moderno y las sustancias inhibidoras que pueden ser co-extraídas

4007
 PABLO MARTÍN MARTÍN

con el ADN. Uno de los problemas fundamentales de la investigación del

ADN antiguo es poder demostrar la autenticidad de los perfiles genéticos
que se generan en este tipo de estudios. La posibilidad de obtener resul-
tados que nada tienen que ver con el vestigio arqueológico en estudio
(cuyo ADN se encuentra degradado y dañado molecularmente) y, por
el contrario, obtener resultados a partir de pequeñas trazas de un ADN
moderno que contamina nuestra muestra es una situación más frecuente
de lo que en un principio se pensó.

4.1 Cantidad y calidad del ADN de restos antiguos

Aunque los ácidos nucleicos preservan su estructura durante cierto

tiempo, en general a partir de restos antiguos el material genético que se
obtiene se encuentra bastante deteriorado y presenta distintos grados de
degradación y modificación. Las cantidades de ADN humano obtenidas
suelen ser muy pequeñas (del orden de subnanogramos), en cambio se
extraen altas concentraciones de ADN total (del orden de picogramos).
Normalmente, el ADN proveniente de los microorganismos suele superar
más del 90% del ADN total (12).
Si nos referimos a la calidad, en muchos restos biológicos, especial-
mente si la muestra es antigua, el ADN se encuentra degradado y como
consecuencia es muy frecuente que sólo sea posible la extracción de
fragmentos muy pequeños (menores de 500 bases) de ADN. El grado de
degradación del ADN va a limitar la obtención de resultados; en general
los marcadores genéticos de mayor tamaño se amplificarán con menor
eficiencia que los más pequeños, incluso en ocasiones, debido a la falta
de templado de una determinada longitud, no se obtendrán resultados o
se producirán fenómenos de pérdidas de alelos que pueden condicionar
la fiabilidad de los resultados en estos marcadores. Por lo tanto, una de
las características que van a condicionar la eficiencia de amplificación de
los STRs es su tamaño.

4.2 Daños moleculares en el ADN

Dependiendo del grado de los daños producidos en el ADN y por

tanto de la modificación que haya sufrido, podremos ó no acceder al
estudio de ese material genético mediante técnicas de amplificación
génica.

4008
 LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

¿Cuáles son los principales factores que causan las modificaciones o

daños moleculares en el ADN? Fundamentalmente los agentes oxidantes,
las radiaciones (en especial las ultravioletas), la temperatura, la humedad,
el pH, los procesos mecánicos (18,19,20), y las enzimas; tanto las proce-
dentes de las propias células, como las procedentes de microorganismos,
en ambos casos, cabe destacar a las nucleasas.
En el material genético se están produciendo de manera continua
daños que principalmente afectan a los enlaces entre las bases nitrogena-
das y los azúcares y a los enlaces fosfodiéster internucleotídicos, pero al
mismo tiempo actúan los mecanismos correctores, después de la muerte
estos efectos correctores se detienen.
Los principales cambios ó modificaciones que se producen en la
estructura del ADN son cambios que afectan a los enlaces químicos y
son debidos fundamentalmente a fenómenos de hidrólisis y fenómenos
oxidativos, éstos últimos afectan en especial a las bases derivadas de la
pirimidina (timina y citosina) (21,22). Los fenómenos de hidrólisis y las
oxidaciones lo que provocan son roturas de enlaces, que nos conducen
en líneas generales a la fragmentación de la cadena nucleotídica y por
tanto a la degradación del ADN.
Un fenómeno importante que tiene gran importancia en este tipo de
material genético es la aparición de uniones inespecíficas entre cadenas
de ADN (cross-linking), que pueden llegar a formar estructuras com-
plejas por condensación de esas dobles cadenas de ADN y afectan a la
amplificación génica. Las radiaciones de la luz ultravioleta provocan la
formación de dímeros de pirimidina.
Las modificaciones de las bases nitrogenadas son un hecho común en
el ADN, como mínimo 1 de cada 10 pirimidinas se encuentra modificada
(21) y por último apuntar que las principales enzimas que degradan el
ADN son las nucleasas tanto del propio organismo como las procedentes
de microorganismos.
Todos estos daños en el ADN, van a dar lugar a que en último tér-
mino nos encontremos con un ADN muy degradado; la mayoría de los
fragmentos tendrá un tamaño de 100-200 pb, aunque algunas moléculas
pueden alcanzar tamaños de hasta 1000-2000 pb y éstos serán las que
nos permitan la obtención de resultados para los marcadores STRs que
analizamos en la actualidad, y que no superan los 350 pb de longitud.

4009
 PABLO MARTÍN MARTÍN

4.3 Contaminación

En todas las muestras de restos cadavéricos va a haber contaminación

producida por microorganismos, debido a ella además de extraer el ADN
humano correspondiente a la muestra se co-extrae ADN proveniente de
microorganismos y en general en unas cantidades mucho mayores que
las de ADN humano. Esta contaminación puede tener efectos negativos
en el análisis en el sentido de enmascarar la cantidad y calidad de ADN
humano y en la amplificación de algunos marcadores pueden aparecer
productos inespecíficos. En los STR que se utilizan en este momento se
ha realizado un estudio previo de especificidad frente a templados bacte-
rianos obteniéndose resultados negativos en todos los marcadores y para
todos los microorganismos probados (23,24).
Uno de los mayores problemas al que nos enfrentamos cuando estu-
diamos restos antiguos mediante técnicas de amplificación génica es la
contaminación con ADN humano exógeno. Si la muestra a analizar pre-
senta cantidades límites de ADN (del orden de subnanogramos) o este
ADN se encuentra en un avanzado estado de degradación, lo que es muy
frecuente cuando trabajamos con restos cadavéricos, una contaminación
con ADN moderno exógeno por muy pequeña que ésta sea, puede traer
graves consecuencias en el análisis.
La contaminación que se puede considerar como más grave de las
descritas pues, es la producida por ADN humano y moderno, en primer
lugar porque no puede diferenciarse del ADN antiguo y en segundo
lugar porque al tratarse de ADN moderno y en buen estado, se amplifica
con mayor eficiencia.
La contaminación puede producirse tanto en el laboratorio como
antes de que las muestras lleguen a él. A continuación se exponen una
serie de recomendaciones para evitar la contaminación durante el proce-
so de análisis en el laboratorio:
• Separación de las áreas de trabajo dedicadas a:
– Toma y preparación de muestras
– Extracción de ADN
– Amplificación génica
– Detección de los productos de amplificación
• Los procesos de extracción y amplificación deben realizarse en
campanas de seguridad biológica con flujo laminar provistas de luz
ultravioleta, utilizando material y reactivos estériles. Es necesario el uso
de puntas de pipeta estériles con filtro y que las pipetas sean específicas

4010
 LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

para cada proceso. Los operarios deben ir provistos de guantes, masca-

rilla y bata desechables.
• Los reactivos utilizados en la extracción deben ser preparados en
condiciones de esterilidad y deben estar separados de los reactivos utili-
zados en la amplificación.
• Separación obligatoria del análisis de las muestras dubitadas y las
muestras de referencia, así como sus extractos y en la medida de lo posi-
ble deben estar separados en función de la cantidad de ADN .
Por otro lado deben establecerse una serie de medidas de monitori-
zación de la contaminación, entre las que destacaremos:
• Es obligatorio el uso de controles negativos en los procesos de
extracción y amplificación. Se deben usar controles positivos de amplifi-
cación para controlar el correcto funcionamiento de la reacción.
• Debemos conocer los perfiles genéticos de todo el personal de
laboratorio para los marcadores que se analizan.
• En caso de muestras con cantidades mínimas de ADN (con menos
de 100 picogramos), los análisis deben ser realizados al menos por dupli-
cado y por dos operarios distintos.
A pesar de las medidas que se establecen con el fin de evitar la con-
taminación, en ocasiones ésta se produce y en nuestra experiencia suele
ocurrir que es el operador que manipula la muestra en los procesos de
preparación y extracción el que más posibilidades tiene de contaminarla.
Cuando el extracto de ADN está contaminado, es posible detectar sola-
mente el perfil genético de la persona que ha contaminado la muestra ó
detectarlo en mezcla con el perfil propio de la muestra, en ambos casos
la solución es la repetición de la extracción. Esto no suele representar un
problema si estamos trabajando con restos óseos puesto que suele haber
bastante material de partida, en cambio si trabajamos con un número
limitado de piezas dentales se podrían agotar y habría que recurrir a otra
muestra si ello fuera posible.

4.4 Inhibición

Debido a la presencia de inhibidores de la polimerasa en el soporte

o en la propia muestra que no conseguimos eliminar en el proceso de
extracción, es posible la no obtención de resultados de amplificación.
En las muestras de restos antiguos es frecuente la co-extracción de
inhibidores. Se sabe por ejemplo que residuos de porfirinas y el colágeno

4011
 PABLO MARTÍN MARTÍN

de tipo I actúan como inhibidores de la polimerasa, así como algunos

componentes del suelo como ácidos húmicos ó fórmicos (25).
La inhibición se puede controlar primero con experimentos específi-
cos y una vez establecida la presencia de inhibidores, se pueden tomar
medidas para tratar de evitarla, entre las que destacan:
1. Aumentar la cantidad de polimerasa en la reacción de amplifica-
ción.
2. Volver a extraer la muestra cambiando el método de extrac-
ción; por ejemplo, si se ha realizado una extracción orgánica mediante
fenol/cloroformo es posible extraer el ADN mediante resinas quelantes
o purificarlo mediante otras técnicas como puede ser la utilización de
membranas de sílica que retienen de forma específica los ácidos nuclei-
cos y no así los posibles inhibidores, según se describió en el punto de
extracción de ADN.
3. Diluir el extracto de ADN si la cantidad que se extrae es sufi-
ciente, de tal forma que se diluye el inhibidor hasta que no afecte a la
polimerasa.

5. IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVÉRICOS: AÑOS 2002/2003

Durante los años 2002 y 2003 se realizaron 126 casos de identifica-

ción genética de restos cadavéricos sin incluir los casos de IBP cuando
el supuesto padre ha fallecido. En 17 casos se nos encomendó la custo-
dia de la muestra, en 38 casos únicamente se realizó un preinforme, es
decir se procedió a la extracción de la muestra y a comprobar que se
obtenían resultados de amplificación, en los otros 71 casos se realizó la
identificación genética completa de los restos. El 93% de los casos fueron
identificaciones positivas y sólo un 7% resultaron exclusiones. Más de
un 60% de los casos fueron resueltos utilizando STR autosómicos y en
aproximadamente un 40% de los casos hubo que recurrir al estudio de
ADN mitocondrial y/o STR de cromosoma Y, casi siempre determinado
por los familiares disponibles para realizar la identificación.
En cuanto a las muestras analizadas, fueron en total casi 200 muestras
dubitadas y unas 70 de referencia. Las muestras más comunes fueron las
de restos óseos y dientes que superaron el 55% del total, las muestras
de tejidos blandos (fundamentalmente músculo esquelético), y fluidos
(sobre todo sangre), rondaron el 40%, el 5% restante fue de otro tipo de
muestras como biopsias, útiles personales de la persona fallecida, etc. La
muestra depende como ya se ha comentado del estado en que aparece

4012
 LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE RESTOS CADAVÉRICOS

el cadáver que normalmente es un factor determinante; más de un 30%

de los cadáveres aparecieron en fase de esqueletización, un 25% fueron
cadáveres carbonizados, un 17% eran cadáveres en buen estado de con-
servación, un 12% eran cadáveres en estado de putrefacción y en otro
12% de los casos se desconoce cómo se encontraban los restos.
El tipo de investigación, así como la situación del cadáver fuero muy
variables, las muertes abarcan todas las posibilidades. Muertes acciden-
tales ó intencionadas y cadáveres enterrados, a la intemperie, dentro de
vehículos, edificios, sumergidos, y un porcentaje muy importante de ori-
gen no especificado y por tanto desconocido para el laboratorio.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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