Cristina Nabais. Ecologia Aplicada.

2008

Correlação entre a densidade estomática e as condições ambientais:

comparação entre folhas de luz e de sombra

Descrição da actividade laboratorial

Introdução
Os estomas das folhas são responsáveis pelas trocas gasosas das plantas
vasculares. Os estomas são poros pequenos, tipicamente presentes na página
inferior das folhas, cuja abertura e fecho está sob controlo das células guarda (duas
células em forma de banana). Quando abertos, os estomas permitem a entrada de
CO2 na folha para a síntese de glicose (fotossíntese), e também permitem a saída
de H2O e O2. Para além da abertura e fecho dos estomas, as plantas podem exercer
um controlo sobre as taxas de trocas gasosas, variando a densidade de estomas
quando há produção de folhas novas (primavera e verão). Quanto mais estomas
existirem por unidade de área, mais CO2 é absorvido, mas também há mais saída
de H2O. Uma densidade estomática maior pode amplificar o controlo sobre as taxas
de perda de água e absorção de CO2.
Qual o valor adaptativo do controlo das taxas de perda de água e absorção
de CO2? A capacidade fotossíntese de uma planta está construída para funcionar
num intervalo de temperaturas pequeno. Quando sujeitos a temperaturas elevadas,
os citocromos, pigmentos e membranas, essenciais na fosforilação e fixação de
carbono, desnaturam rapidamente. Para evitar este sobreaquecimento, as plantas
podem abrir os estomas e ocorre evaporação de água, que leva a uma redução da
temperatura da folha. Podemos colocar a hipótese de que folhas mais expostas ao
sol devem ter uma densidade estomática maior do que as folhas de sombra.
Por outro lado, se não existe água disponível, a evaporação excessiva pode
levar a uma dissecação e desintegração do equipamento fotossintético. Portanto,
também será de esperar que folhas expostas a condições de falta de água devem
ter uma densidade de estomas menor em ambientes com sol.
A discussão anterior ilustra um conceito muito importante em biologia
experimental – existem hipóteses alternativas para explicar as variações presentes
na natureza. Neste caso específico, a densidade estomática pode aumentar ou
diminuir em resposta a variações ambientais de disponibilidade de luz solar ou
água. De salientar que, neste trabalho não se vai medir a disponibilidade de luz ou
água e por isso, devem ser cautelosos na forma como se aceita ou rejeita as
hipóteses para as plantas em estudo.

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Materiais e métodos

Local de estudo
As amostras de plantas serão recolhidas no Jardim Botânico da Universidade
de Coimbra, em áreas de luz e sombra. As espécies a observar são:
- Tradescantia fluminensis;
- Acanthus mollis;
- Hedera helix;

Métodos para a obtenção das impressões dos estomas

1. Selecção das folhas para determinação da densidade estomática.

2. No lado onde se vai determinar a densidade estomática (normalmente na
página inferior da folha) colocar uma camada espessa de verniz das unhas.
3. Depois do verniz secar (alguns minutos), obter um quadrado de fita-cola
MUITO LIMPO (sem marcas de dedos). Colar a fita-cola na área que contém
a camada de verniz seco.
4. Retirar devagar, com a ajuda da fita-cola, a camada de verniz – ‘impressão
da folha’.
5. Colocar a impressão da folha numa lâmina de microscópio.
6. Utilizar uma caneta para escrever um código de identificação da amostra na
lâmina.
7. Com um microscópio, focar a impressão da folha com uma ampliação de
400x e observar os estomas.
8. Procurar na amostra uma área que pareça apresentar a maior densidade
estomática. Percorrer a lâmina até o campo de visão estar longe da margem
da impressão, não apresentar sujidade, áreas estragadas e sem uma
nervura grande.
9. Contar todos os estomas observados e registar numa folha. A medida da
área do campo de visão a 400x é 0,12 mm2. Converter os dados de
unidades de ‘número de estomas por campo de visão a 400x’ em ‘unidades
de estomas por mm2’.
10. Repetir os dois passos anteriores três vezes, e o maior número observado
das três contagens será o valor obtido para essa amostra.
11. Repetir todos os passos anteriores para 6 impressões de folhas de luz e 6
impressões de folhas de sombra, para cada espécie.
12. Comparar a densidade estomática entre folhas de luz e folhas de sombra
para cada uma das espécies, com o teste-t

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Apêndice 1

Guia para a análise estatística

A investigação em Biologia recolhe dados quantitativos numa grande variedade de

tópicos. Muitos desses dados são altamente variáveis. Como resultado, as técnicas
de análise estatística são muito importantes para ajudar o biólogo na descrição da
variação dentro de um determinado conjunto de dados, expressar o grau de
confiança que se pode ter nos valores médios, e objectivamente testar hipóteses
sobre os dados de grupos diferentes. Neste apêndice descrevemos algumas
técnicas utilizadas pelos biólogos na análise de dados, que também serão utilizadas
na análise dos dados da densidade estomática.

A. Estatística descritiva

Após a recolha dos dados, estes podem ser analisados estatisticamente para
determinar se os dados suportam ou rejeitam uma determinada hipótese. O
primeiro procedimento que é efectuado é o cálculo de um conjunto de parâmetros
que descreve dois aspectos dos dados: (1) tendência central e (2) dispersão.

(1) Medidas de tendência central. Um determinado tipo de estatística

determina a tendência central dos dados. A tendência central fornece
informação sobre a forma como o valor dos dados recolhidos se organizam à
volta de um único valor médio. Existem três medidas de tendência central
que são utilizadas na análise dos dados:

MODA: o valor mais frequente observado nos dados

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MEDIANA: o valor do meio quando os dados são ordenados em sequência (do

maior para o menor ou do menor para o maior)

MÉDIA: A média é a medida de tendência central mais utilizada. É estimada

utilizando a soma de todos os valores individuais (xi) e divididos pelo número total
de indivíduos na amostra (n):

X =∑
n
x i
= ( x1 + x 2 + x3 + x 4 + K + x n) / n
i =1 n

(2) Medidas de dispersão. Descrevem de que forma os dados estão

‘espalhados’

INTERVALO. O valor máximo menos o valor mínimo.

VARIÂNCIA. A variância é a soma de cada uma das diferenças ou desvios entre os

valores individuais e o valor médio. A diferença total é dividida pelo número de
indivíduos na amostra, menos um.

(X i − X ) 2 2
n n ( X i − n∗ X )
σ =∑ =∑
2

i =1 n −1 i =1 n −1

DESVIO PADRÃO. A raiz quadrada da variância.

2 2
n ( X i − n∗ X )
σ ∑
2
S= =
i =1 n −1

ERRO PADRÃO. O erro padrão é o desvio padrão dividido pela raiz quadrada do
tamanho da amostra.

ERRO PADRÃO = S
n

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Exemplo para os dados: {3, 3, 4, 5, 6, 6, 6, 6, 7, 8, 10}

MODA= 6
MEDIANA= 6
MÉDIA= (3+3+4+5+6+6+6+6+7+8+10)/11 = 5.82
VARIÂNCIA= 4.363636
DESVIO PADRÃO= 2.088932
ERRO PADRÃO= 0.629837

ESTATÍSTICA DESCRITIVA UTILIZANDO O MICROSOFT EXCEL

1. Em Ferramentas (Tools) e em Suplementos (Add Ins) seleccionar “Analysis

ToolPack” e OK.

2. Novamente em Ferramentas (Tools), seleccionar a opção “Data Analysis” e

depois em Estatística Descritiva (Descriptive statistics).

3. Seleccionar a coluna de dados e seleccionar “Summary Statistics”. Em

seguida especificar o “Output range”, isto é, onde deve ser colocada a tabela
com os valores da estatística descritiva. O programa faz uma tabela com os
valores da estatística descritiva.

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B. Teste estatístico: comparação de médias utilizando o teste-t.

O teste-t determina se as médias de dois conjuntos de dados são

significativamente diferentes. Em termos estatísticos, o teste-t é utilizado para
determinar se dois conjuntos de dados são provenientes da mesma ou de
diferentes distribuições. O teste-t apenas pode ser utilizado para comparar as
médias de duas amostras. Mais do que duas amostras requer um teste estatístico
diferente.
Para se fazer o teste-t, tem de se calcular um valor-t a partir dos dois conjuntos
de dados que se pretendem comparar. O valor-t é uma medida da razão do ‘sinal’ e
‘ruído’ dos dados. O ‘sinal’ em numerador representa a diferença entre as médias.
Por outras palavras, se as médias das duas amostras forem muito diferentes, o
‘sinal’ é grande.

t = sinal / ruído

O ‘ruído’ em denominador representa a variação total em ambas as amostras e

é determinado pela soma dos desvios padrão para cada um dos conjuntos de
dados, dividido pelo tamanho de cada um dos conjuntos de dados. Se existe uma
grande variabilidade em cada um, ou ambos os conjuntos de dados, é mais difícil
dizer se as médias são diferentes. Esta é a ideia base do teste-t (assim como de
uma larga classe de testes de estatística designados por testes paramétricos).

t=
média # A − média # B
= x −x
A B
var total
σ +σ
2 2
A B

n A n B

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Como se pode observar pela equação acima, à medida que a diferneça entre as
médias dos dois grupos for maior, o valor de t é maior. À medida que a variação é
menor, o valor de t também é maior.
A próxima questão é para que valores de t se pode concluir que as médias são
significativamente diferentes? Esta questão é extremamente importante e a
resposta é o core de todas as análises estatísticas. A resposta depende de duas
coisas – de qual o tamanho da amostragem? E o grau de confiança que querem ter
em que as médias são de facto diferentes?
O efeito do tamanho da amostra pode ser facilmente compreendido analisando
a equação do teste-t. De notar que o tamanho das amostras (nA e nB) aparecem
no denominador do denominador. Assim, se n é maior, a variação global é menor, e
o valor de t é maior. A outra forma de olhar para o efeito do tamanho da amostra é
mais formal e envolve um termo designado por ‘graus de liberdade’. O número de
graus de liberdade – df (degrees of freedom) - para um tese-t é igual ao tamanho
da amostra total menos 2 (no entanto, se as variâncias não são iguais um método
mais complicado é utilizado). Os df são uma indicação do poder das médias, de
acordo com o valor de t calculado – quanto maior o valor de df, maior a resolução.
O segundo ponto mencionado acima para determinar que valor de t necessário
depende no grau de confiança que queremos ter. Se queremos ser realmente
confiantes de que as médias diferem, então o valor de t deve ser muito elevado.
Mas, se o nível de confiança é marginal (digamos que 1 em 20 estamos errados
quando dizemos que as médias diferem) então estaremos satisfeitos com um valor
de t baixo. O nível de confiança é designado no teste por “P”, de probabilidade. A
probabilidade é expressa como um décimal, P=0.05 é o mesmo que P=5%. Quando
se executa um teste estatístico e se obtém um valor de P=0.05, então existe 95%
de probabilidade que as médias diferem, no entanto também existe 5% de
probabilidade de estarmos errados. O valor de 0.95 é o critério mínimo de
significância. No entanto, podemos ter uma certeza de 99%, e utilizar P=0.01 como
critério de significância. O nível de probabilidade aceitável é determinado ANTES de
fazer o teste-t (a maior parte das experiências utilizam o critério P=0.05).

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TESTE-t UTILIZANDO O MICROSOFT EXCEL