Antioxidantes Naturais. Aspectos Saudables, Toxicolóxicos e Aplicacións Industriais

00
Andrs Moure Varela Daniel Franco Ruiz
Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

EditorEs daniel Franco ruiz Andrs Moure Varela
Unin Europea FEDER

Invertimos en su futuro
101030 Cuberta Galego.indd 1
EDITORES
AntioxidAntes nAturAis. Aspectos sAudAbles, toxicolxicos e AplicAcins industriAis
29/10/10 11:03
Edita: Daniel Franco Ruiz e Andrs Moure Varela Lugar: Santiago de Compostela Deseo e Maquetacin: Grficas Garabal Ano: 2010 Imprime: Grficas Garabal Depsito Legal: C 3694-2010 ISBN: 978-84-453-4945-8

Editores Daniel Franco Ruiz Andrs Moure Varela
Xunta de Galicia Consellera do Medio Rural Santiago de Compostela 2010
ndice
Presentacin do Conselleiro.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..11 Presentacin . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..13 Prlogo .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..17 BLOQUE I. ASPECTOS SAUDABLES Poden os antioxidantes naturais alongar a vida? .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..21 Josep Lluis Torres Simn Contribucin das bebidas inxesta de antioxidantes na dieta mediterrnea . ..25 Fulgencio Saura-Calixto Actividade antioxidante dos compostos fenlicos do vio . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..29 M. Carmen Garca-Parrilla Posible efecto protector dos vios tintos fronte ao estrs oxidativo . .. .. .. .. .. ..33 M. Luisa Gonzlez San Jos Beneficio cardiovascular dalgns antioxidantes presentes no t .. .. .. .. .. .. .. ..37 Ezequiel lvarez Castro Efectos vasodilatadores do transresveratrol.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..41 Francisco Orallo Cambeiro (In memoriam) Efectos antitumorais de antioxidantes naturais .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..45 Marta Cascante Serratosa Cancro prosttico: efecto de fitoesterois (Ps) e polifenois (Pf) sobre o crecemento cancerxeno e a metastatizacin .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..51 Mara Jess Nez-Iglesias, Silvia Novo e Manuel Freire-Garabal Nez Antioxidantes naturais na reproducin humana. Papel do estrs oxidativo na fragmentacin do DNA espermtico: utilidade do tratamento antioxidante . .. ..55 Juan G. lvarez Oxidacin lipdica e avaliacin de antioxidantes .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..63 Edwin Frankel Antioxidantes naturais en alimentos ricos en cidos graxos -3.. .. .. .. .. .. .. ..83 Isabel Medina
BLOQUE II. ASPECTOS TOXICOLXICOS Avaliacin da toxicidade de novos compostos antioxidantes .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..87 Guillermina Font Accin protectora de antioxidantes fronte toxicidade de dioxinas e PCBs .. ..97 Csar Ordez Micotoxinas, estrs oxidativo e antioxidantes.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 109 Teresa Cabaleiro Toxicoloxa de metais e antioxidantes naturais: cadmio e melatonina .. .. .. .. 121 Alejandro Romero Toxicoloxa de insecticidas organoclorados e radicais libres: metoxicloro e xido ntrico . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 129 Ana Caride Radicais libres e morte celular programada . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 137 Rafael Balaa Fouce Neurotoxicidade, estrs oxidativo, enfermidades neurodexenerativas e antioxidantes .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 151 M. Anunciacin Lafuente Radicais libres, estrs oxidativo e carcinoxnese . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 161 Arturo Hardisson de la Torre BLOQUE III. APLICACINS Quimiometra e antioxidantes .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 175 Carlos Herrero Aspectos legais do uso de antioxidantes en envases de alimentos, novas formulacins de envases activos . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 179 Vctor Teruel Muoz Interese dos antioxidantes na industria de alimentos.. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 185 Nick Hedges Envases activos antioxidantes. Desenvolvemento e perspectivas de uso no envasado de carne fresca . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 187 Pedro Roncals Rabinal Aplicacin de antioxidantes para a mellora da seguridade e a calidade sensorial e tecnolxica da carne e produtos crnicos .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 197 Jos Antonio Garca Regueiro
Achega optimizacin do perfil nutritivo do leite mediante a alimentacin do gando: antioxidantes .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 203 Ismael Martnez Lede Antioxidantes e oxidacin lipdica de produtos crnicos .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 207 Daniel Franco Ruiz Extraccin de compostos fenlicos da uva relacionados coas caractersticas tecnolxicas e funcionais . .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 219 Celestino Santos-Buelga Influencia do nivel de maduracin da uva e das tcnicas de vinificacin sobre a composicin en compostos fenlicos do vio .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 227 Fernando Zamora Marn Aplicacin da extraccin supercrtica ao aproveitamento dos subprodutos de vinificacin .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 233 Miguel Rodrguez Rodrguez Recuperacin e concentracin de antioxidantes dos residuos de alcoholeira 237 Beatriz Daz Reinoso
Editores:
Daniel Franco Ruiz. Dr. Ciencias Qumicas. Centro Tecnolxico da Carne. Andrs Moure Varela. Dr. Ciencias Qumicas. Dpto. Enxeera Qumica. Universidade de Vigo. Autores: lvarez, E. Facultade de Medicina e Odontoloxa. Universidade de Santiago de Compostela. lvarez, J. G. Bioloxa Reprodutiva. University of Harvard. Balaa, R. Dpto.Toxicoloxa. Universidade de Len. Cabaleiro,T. Dpto. Toxicoloxa. Universidade de Vigo. Caride, A. Dpto. Toxicoloxa. Universidade de Vigo. Cascante, M. Facultade de Bioloxa. Universidade de Barcelona. Daz-Reinoso, B. Dpto. Enxeera Qumica. Universidade de Vigo. Frankel, E. Dpto. de Ciencia e Tecnoloxa dos Alimentos. Universidade de California. Font,G. Dpto. de Toxicoloxa. Universidade de Valencia. Franco, D. Dpto. Producin Animal. Centro Tecnolxico da Carne. Freire-Garabal, M. Facultade de Medicina e Odontoloxa. Universidade de Santiago de Compostela. Garca, J.A. Qumica Alimentaria do IRTA. Generalitat de Catalua. Garca-Parrilla, M.C. Facultade de Farmacia. Universidade de Sevilla. Gonzlez, M.L. Dpto. Tecnoloxa dos Alimentos. Universidade de Burgos. Hardisson, A. Dpto. de Toxicoloxa. Universidade da Laguna. Hedges, N. Unilever. Colworth House, UK. Herrero, C. Facultade de Ciencias. Universidade de Santiago de Compostela. Lafuente, M.A. Dpto.Toxicoloxa. Universidade de Vigo. Martnez, I. Dpto. de I+D de FEIRACO. Medina, I. Instituto de Investigacins Marias-CSIC. Novo, Silvia. Facultade de Medicina e Odontoloxa. Universidade de Santiago de Compostela. Nez-Iglesias, M. Jess. Facultade de Medicina e Odontoloxa. Universidade de Santiago de Compostela. Ordez,C. Dpto. de Toxicoloxa. Universidade de Len. Orallo, F. Facultade de Farmacia. Universidade de Santiago de Compostela. Rodrguez, M. Dpto. Enxeera Qumica. Universidade de Cdiz. Romero, A. Instituto de Investigacin Tefilo Hernando. Universidade Autnoma de Madrid. Roncals, P. Dpto. Producin Animal e Ciencia dos Alimentos. Universidade de Zaragoza. Santos-Buelga, C. Facultade de Farmacia. Universidade de Salamanca. Saura-Calixto, F. Dpto. Metabolismo e Nutricin. ICTAN-IF, CSIC. Madrid. Teruel, V. rea de Xestin de Riscos Qumicos. Subdireccin Xeral de Xestin de Riscos Alimentarios. Torres, J.L. Instituto de Investigacins Qumicas e Ambientais. CSIC. Barcelona. Zamora, F. Facultade de Enoloxa. Universidade Rovira i Virgili.
PRESENTACIN DO CONSELLEIRO
Dende que no ano 2006 foi creada a Rede de compostos bioactivos con actividade antioxidante (Antioxgal; http://www.antioxgal.uvigo.es), que integra a grupos de universidades e centros pblicos de investigacin galegos, levronse a cabo diversas actividades para promover a formacin dos membros e divulgar, expandir e consolidar esta rea de traballo en Galicia. Ao longo do ano 2008 celebrronse cinco xornadas e seminarios realizados nos distintos puntos da xeografa galega recollidos no libro Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais. Nestas xornadas, mis de corenta investigadores presentaron aspectos que abrangueron dende os mecanismos fundamentais da oxidacin, a obtencin de antioxidantes a partir de diversos produtos e subprodutos, aspectos de toxicidade, nocins de lexislacin, as implicacins clnicas e as aplicacins alimentarias a produtos crnicos, de peixe e a envases activos. Con estas actividades ofreceuse unha oportunidade para reunirse e revisar coecementos e avances, discutir novas ideas, identificar potenciais reas de interese no seu campo e promover as sinerxas e colaboracins. Este volume recolle unha seleccin dos temas tratados nestas reunins pode ser de interese para estudantes, cientficos e profesionais dos mbitos alimentario, clnico, farmacutico ou cosmtico, e ofrece ao mesmo tempo unha visin xeral das actividades de investigacin dos grupos da ANTIOXGAL en relacin coa de expertos de prestixio internacional. No nome da Consellera quero expresar o meu agradecemento a todos os responsables da edicin e financiamento deste libro, aos relatores que prepararon un resumo das presentacins e aos organizadores e o pblico das xornadas que fixeron delas un marco de encontro, formacin e debate. Samuel Jurez Conselleiro do Medio Rural
PRESENTACIN
Diversos grupos de investigacin de Galicia que vian traballando dende hai dcadas no estudo e nas aplicacins de compostos naturais con actividades biolxica e antioxidante impulsaron nos ltimos cinco anos a creacin e expansin da Rede Antioxgal. No marco desta rede tivemos ocasin de establecer vas de colaboracin slidas e duradeiras e dispor dunha infraestrutura que nos permite abordar estudos mis complexos e ambiciosos. Grazas ao esforzo dos editores, Daniel Franco e Andrs Moure, presentamos agora unha recompilacin dalgns relatorios representativos, tanto de investigadores de prestixio recoecido coma de investigadores mozos que se estn a formar nos grupos da Rede. Fai agora un ano tivemos que dicir adeus ao profesor Francisco Orallo Cambeiro (1958-2009), un dos cientficos mis salientables do panorama galego dos ltimos anos. Xa sobresau dende as etapas da sa formacin, pois recibiu o premio extraordinario de licenciatura (1979-80) e o de doutoramento (1983-84) en Farmacia pola Universidade de Santiago de Compostela. Posteriormente foi galardoado co premio Eloy Dez (1984), co premio da Sociedade Espaola de Qumica Teraputica (1987), cunha mencin honorfica da Fundacin Dr. Esteve (1992), co premio Dolores Trigo (1993), co premio de Investigacin da Xunta de Galicia en Ciencias da Sade (1996) e co premio nacional de Farmacoloxa (2003). Os seus traballos acadaron relevancia e recoecemento internacional. ben patente o impacto e a transcendencia dos seus estudos sobre os efectos cardioprotectores e antidepresivos de diversos compostos naturais, en particular aqueles sobre o resveratrol. Ademais da ampla traxectoria como profesor e investigador sobranceiro, achegounos a sa paixn pola investigacin, a sa actividade incansable, a constancia no esforzo e a sa dispoibilidade e participacin desinteresada. Moi recentemente tivemos que despedir profesora Mercedes Sonia Garca Falcn (1969-2010), investigadora polifactica e brillante que obtivo recoecemento aos seus primeiros traballos co premio Juan Abell da Real Academia de Farmacia de Madrid (1997) e co premio Dolores Trigo (1997). Comezou a sa formacin e seguiu traballando no desenvolvemento e validacin de ferramentas analticas, achegando metodoloxas novidosas e que son un referente internacional. Impulsou e consolidou unha lia de estudos, establecida como unha frutfera colaboracin transfronteiriza, sobre a caracterizacin fenlica en diversos produtos autctonos. Ela tia unha capacidade nica para comunicar e transmitir o entusiasmo polo seu traballo e unha admirable forza para levalo a cabo con alegra e para dirixilo con sentido do humor.
presentacion herminia 101213.indd 1
13/12/10 11:37
Os seus alumnos lembran que ensinaba a aprender xogando, que a mellor forma de aprender. Anda que agora Francisco e Mercedes Sonia non estn connosco, a sa contribucin cientfica seguir a estar vixente e a lembranza e o aprecio da sa vala persoal estar presente entre todos os que tivemos a sorte de coecelos e colaborar con eles. Herminia Domnguez en nome da Rede Antioxgal
presentacion herminia 101213.indd 2
13/12/10 11:37
In memoriam Francisco Orallo Cambeiro Mercedes Sonia Garca Falcn
PRLOGO
Nas ltimas seis dcadas o campo dos antioxidantes experimentou un grande auxe dentro dunha ampla variedade de reas multidisciplinares que engloba tanto alimentos coma sade. Un nmero crecente de evidencias, de tipo epidemiolxico e experimental, indican que os antioxidantes presentes en diversos alimentos teen un papel esencial para a sade. No libro Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais, os seus editores, os doutores Daniel Franco e Andrs Moure, renen os temas tratados nas xornadas e seminarios realizados no marco da Rede Antioxgal. A boa acollida das xornadas reflicte o interese do pblico xeral e especializado por facer do campo de traballo dos antioxidantes naturais unha ferramenta bsica para unha boa sade e a elaboracin dos mellores produtos nas industrias farmacolxicas e alimentarias. Este conxunto de traballos expresa a complexidade da natureza dos compostos con propiedades antioxidantes. Tcanse temas relacionados con aqueles fenmenos que afectan os aspectos saudables para o organismo, as sas implicacins en procesos de oxidacin e inhibicin en sistemas biolxicos, ponse atencin aos aspectos toxicolxicos destes antioxidantes tanto sobre a sa aplicacin directa como a sa accin protectora fronte a xenobiticos e avalase o potencial destes compostos en aplicacins industriais. Este libro polo tanto estruturouse nos tres bloques anteriormente mencionados: un primeiro bloque versado en aspectos saudables dos antioxidantes, un segundo bloque onde se desenvolven os principais aspectos toxicolxicos e un ltimo bloque onde se mostran potenciais aplicacins dos antioxidantes na elaboracin de envases, en matrices alimentarias como produtos crnicos e lcteos; e mstrase a industria do vio como fonte potencial de produtos antioxidantes dende os seus produtos e subprodutos. Cremos que este conxunto de documentos estar ao servizo de estudantes, cientficos e profesionais do sector que busquen incrementar o seu punto de vista delimitado polo seu mbito diario e aproveitar o coecemento entregado neste documento por expertos de prestixio internacional. Sen o esforzo e a colaboracin de todos os autores sera imposible ter nas nosas mans este volume que nos ofrece unha visin de conxunto e tamn pormenorizada do campo de aplicacin e da obtencin dos antioxidantes naturais. Queremos agradecer a Antonia Vega o seu grande esforzo para a adaptacin dos textos lingua verncula.
Nesta mesma lia de agradecementos, facer mencin Consellera de Educacin e Ordenacin Universitaria (Programa de consolidacin e estruturacin de unidades de investigacin competitivas, Rede ANTIOXGAL 2006/06-Fondos FEDER), as coma aos participantes seus. Por ltimo agradecer Consellera do Medio Rural, Universidade de Vigo, CITI (Centro de Investigacin Transferencia e Innovacin) e ao Centro Tecnolxico da Carne (CTC) en representacin da Rede REAL (Rede de Innovacin e Desenvolvemento Tecnolxico Agroalimentario Norte de Portugal-Galicia, cofinanciada a travs do Programa Operativo de Cooperacin Transfronteiriza Espaa-Portugal 2007-2013 (POCTEP)-Fondos FEDER) por apoiar esta publicacin en beneficio da industria alimentaria. Daniel Franco e Andrs Moure
BLOQUE I. ASPECTOS SAUDABLES
21
PODEN OS ANTIOXIDANTES NATURAIS ALONGAR A VIDA?

Josep Lluis Torres Simn Instituto de Investigacins Qumicas e Ambientais. CSIC. Barcelona A principios do sculo XX os raios-X empezaron a ser utilizados en medicina para a deteccin non invasiva de lesins e enseguida se detectou a sa capacidade para danar os tecidos biolxicos. Mis tarde, no ano 1946 os Estados Unidos botaron das bombas atmicas sobre Hiroshima e Nagasaki e os efectos das radiacins ionizantes manifestronse dramaticamente. Na primeira metade do sculo XX, os estudos sobre os efectos das radiacins X e gamma suxeriron que os radicais libres, sobre todo o radical hidroxilo, eran os responsables do dano celular (Stein e Weiss, 1948). A partir dese momento os captadores de radicais libres apareceron como a solucin ao dano oxidativo relacionado coas radiacins e con calquera proceso biolxico de deterioracin causado polos mesmos radicais. En particular, construuse unha teora que explicaba o envellecemento pola accin dos radicais libres (Harman e Aging, 1956) e, en consecuencia, a solucin tia que vir dos antioxidantes captadores de radicais libres. Esta concepcin anda perdura. En efecto, a morte un proceso irreversible de oxidacin, polo tanto, un antioxidante efectivo como tal debera deter o proceso dexenerativo que remata na morte. Vivimos nun ambiente oxidante A aparicin de oxxeno (fotosntese) na biosfera permitiu a evolucin de organismos cada vez mis eficaces na utilizacin da enerxa qumica dos carbohidratos pero o oxxeno era, sa vez, txico para a maiora destes organismos. Desde entn vivimos nun ambiente oxidante que vez imprescindible e txico. Os seres vivos desenvolvemos unha serie de mecanismos de defensa contra a oxidacin qumica e as radiacins. Son mecanismos de detoxificacin encimtica ou mediante molculas mis pequenas (que chamamos antioxidantes) que captan as especies txicas (xeralmente radicais). Os sistemas de defensa antioxidante manteen o organismo san nun estado de equilibrio redox. No entanto, os sistemas de defensa poden verse desbordados por axentes externos (p.e. as radiacins ionizantes) ou procesos patolxicos cuxa relacin con axentes externos quizais menos directa. En tal caso, axentes antioxidantes exxenos deberan axudar o organismo a protexerse ou a vivir por mis tempo. Lonxevidade e radicais libres Polo que se refire lonxevidade, hai que distinguir entre duracin da vida (life-span) e esperanza de vida (life-expectancy). A primeira o nmero de anos que viviu o in-
22
dividuo mis lonxevo dunha especie (no caso do ser humano 122 anos) e a segunda a media de anos de vida na poboacin dun territorio determinado (p.e. 40,9 anos en Mozambique, 78,7 anos en Europa). En ambos os dous casos o balance redox e os radicais libres parecen ter un papel relevante. Parece ser que o nmero de replicacins de cada clula depende do tamao dos telmeros (secuencia de bases final dos cromosomas) e que os radicais libres poderan influr nos encimas (telomerasas) de reparacin dos telmeros. A influencia dos radicais libres sobre a esperanza de vida parece mis evidente. A lonxevidade, moi por debaixo da duracin mxima, depende en gran medida de factores ambientais, moi probablemente relacionados coa producin de radicais libres (contaminacin, alimentacin deficiente, estrs psicolxico, enfermidades). Os radicais libres poden danar a clula desde fra, e sobre todo desde dentro, por unha sobreproducin na mitocondria.
Figura 1. Mecanismo de producin/eliminacin de radicais libres na clula eucariota
Na mitocondria, a cadea respiratoria transfire catro electrns ao oxxeno para dar auga. No proceso prodcese o anin radical superxido (O2 -). O radical superxido unha molcula moi importante posto que, anda que relativamente inocuo per se, pode dar lugar a outras molculas txicas ou a mensaxeiros secundarios cruciais para o funcionamento celular. Por unha parte, o superxido pasa a perxido de hidrxeno, que en presenza de metais como o ferro divalente pode producir o radical hidroxilo, extremadamente danio fronte ao ADN e protenas. Por outra parte, o in superxido e o perxido de hidrxeno forman parte dos mecanismos de sinaliza-
23
cin molecular involucrados na regulacin da mitose (divisin celular) e a apoptose (morte celular programada). O nivel de superxido est finamente regulado no organismo e a sa alteracin est relacionada coa aparicin de enfermidades (varios tipos de cancros, alzheimer, parkinson). Desde o punto de vista do estado redox, estreitamente relacionado coa presenza de anin superxido, a clula eucariota pode estar nun estado altamente reducido, en estado de repouso, ou altamente oxidado, en estado de necrose (morte traumtica). En estados intermedios, a clula pasa por procesos de oxidacin controlada relacionados co seu crecemento e divisin (Halliwell, 2006). En certa maneira, as enfermidades poden considerarse estados en que os tecidos experimentan un estrs oxidativo excesivo. Este estrs oxidativo pode ser estimulado por axentes externos como a contaminacin qumica e as radiacins, vez que minimizado por antioxidantes. Son eficientes os antioxidantes naturais contra o estrs oxidativo? Entndese normalmente por antioxidantes naturais certos produtos naturais presentes en vexetais e que con maior ou menor frecuencia inxerimos na dieta. Crese que os efectos beneficiosos dunha dieta rica en froitas e verduras se deben a estes antioxidantes naturais. Entre eles atpanse os polifenois (captadores de radicais libres, p.e. catequinas do t, proantocianidinas da uva) e os carotenos (p.e. licopeno do tomate). Curiosamente, os polifenois poden tamn ser prooxidantes. Algns deles (os que presentan un anel de pirogalol, tres hidroxilos fenlicos) poden formar anin superxido. As mesmo as quinonas, produtos de oxidacin, poden dar reaccins redox coa formacin de NAD+. interesante remarcar que esta actividade antioxidante podera ser, paradoxalmente, a verdadeira actividade antioxidante, porque un certo estmulo oxidante pon en marcha os mecanismos de defensa antioxidante. Sexa como fose, hai quen pensa que ningn destes efectos significativo no organismo vivo porque os polifenois son metabolizados axia xa no intestino, e porque a homeostase redox est tan ben regulada que dificilmente pode ser alterada por pequenas doses de compostos moderadamente activos (Halliweel, 2006; Linnane e col., 2007).
24
Figura 2. Fontes e estruturas de compostos antioxidantes
Anda que non hai evidencia de que algunha familia de antioxidantes naturais (p.e. polifenois) poida facer aumentar a esperanza de vida en humanos, cada vez parece mis claro que un estilo de vida que combine dieta adecuada (con inxestin de froitas e verduras en abundancia), exercicio moderado e ausencia de estrs psicolxico est relacionado cunha baixa incidencia de enfermidades como o cancro e os trastornos neurodexenerativos. Polo que se refire dieta, a restricin calrica (diminucin dun 20-30% na inxesta de carbohidratos) parece estar relacionada con menor incidencia de cancros e co aumento da duracin da vida (Willcox e col., 2006). Como queira, unha dieta rica en verduras e fibra que sexa tamn menos abundante en carbohidratos, a restricin calrica podera explicar en parte o efecto beneficioso dunha dieta rica en vexetais. Ademais, o conxunto dos micronutrientes, non soamente os polifenois ou os carotenos, podera conferir dieta os seus efectos beneficiosos. Neste sentido, hai outros compoentes que poderan desempear un papel importante en prevencin, anlogo de azucres (inositois, iminociclitois) que atrasan a absorcin dos carbohidratos. Os antioxidantes naturais, se son tales antioxidantes e son efectivos no organismo vivo, han de contribur a aumentar a esperanza de vida. A cuestin est en saber cales son estes antioxidantes naturais e en desear unha dieta que contea as doses efectivas axeitadas. BIBLIOGRAFA
Stein, G., Weiss, J. (1948). Nature, 161, 650. Harman, D., (1956). J. Gerontol., 11, 298-300. Halliwell, B. (2006), 141, (2), 312-322. Linnane, A. W., Kios, M., Vitetta, L. (2007). Biogerontology, 8, (5), 445-467. Willcox, D., Willcox, B., Todoriki, H., e col. (2006). Biogerontology, 7, (3), 173-177.
25
CONTRIBUCIN DAS BEBIDAS INXESTA DE ANTIOXIDANTES NA DIETA MEDITERRNEA

Fulgencio Saura-Calixto Dpto. Metabolismo e Nutricin. ICTAN-IF. CSIC. Madrid Numerosos estudos clnicos e epidemiolxicos realizados nos ltimos anos asocian de forma significativa o patrn alimentario definido como dieta mediterrnea cunha baixa morbilidade e mortalidade por todas as causas, e especialmente por enfermidades cardiovasculares e algns tipos de cancro. Dado que a inxesta calrica e total de nutrientes desta non explica as diferenzas con outros pases do centro e norte de Europa, con alta incidencia nestas enfermidades, os factores preventivos da dieta hai que buscalos en compoentes especficos tales como os perfs de cidos graxos, fibra e fitoesterois e a inxesta de antioxidantes. A hiptese antioxidante indica que as vitaminas e os compostos bioactivos antioxidantes (fotoqumicos) dos alimentos vexetais poden ter un papel significativo na etioloxa de enfermidades crnicas. Os alimentos vexetais e as bebidas son a principal fonte de antioxidantes na dieta. Os alimentos vexetais son ricos en fibra, esta ltima xunto cos antioxidantes son dos temas que tanto en investigacin como en desenvolvemento de produtos se abordan separadamente. Neste contexto xorde a fibra diettica antioxidante (FA) que combina nun s produto os efectos da fibra e os antioxidantes naturais (Saura Calixto, 1998). As fibras antioxidantes conteen polo menos un 50% de fibra diettica e unha capacidade antioxidante/secuestrante de radicais libres mnima equivalente a 50-100 mg de vitamina E por gramo de fibra. A FA acta liberando os seus antioxidantes gradualmente no intestino delgado e no colon producindo un estatus antioxidante e protector de radicais libres na mucosa intestinal. Os ensaios biolxicos, a experimentacin animal e os ensaios clnicos mostran resultados positivos en sade gastrointestinal e en diversos parmetros de risco cardiovascular. Moi poucos vexetais son materias primas aptas para este tipo de fibra. Ata a data, obtivronse a partir dalgunhas froitas tropicais, alga Fucus, e, especialmente, a partir de subprodutos de vinificacin. Os estudos sobre as propiedades e as aplicacins destas fibras centrouse principalmente na fibra antioxidante da uva (FAU), cuxa composicin se mostra na Figura 1.
26
Figura 1. Composicin da fibra antioxidante da uva (FAU)
Por outra parte, os antioxidantes principais e maioritarios contidos nos alimentos pdense agrupar en vitaminas (C e E), carotenoides (inclundo a propia vitamina A), compostos polifenlicos e compostos de Maillard. A capacidade antioxidante (CA) dos alimentos e das dietas debida ao efecto combinado e sinrxico de todos eles. Os polifenois son os compostos antioxidantes maioritarios na nosa dieta cunha inxesta estimada en 2000 a 3000 mg fronte aos aproximadamente 150 mg correspondentes a vitaminas C e E e carotenoides Existe unha documentacin ampla sobre a CA in vitro e in vivo dos compostos alimentarios illados e de alimentos concretos, pero moi escasa sobre dietas de poboacins. Contribucin das bebidas inxesta de antioxidantes na dieta mediterrnea Na Tboa 1 mstranse os resultados obtidos empregando o mtodo de ABTS para a medida da capacidade antioxidante total realizada para a dieta espaola, representada como a cantidade de unidades antioxidantes (equivalentes trolox) presentes diariamente no tracto gastrointestinal, e da contribucin dos distintos grupos de alimentos a esta (Pulido e col., 2003; Saura Calixto e Goi, 2006; Saura Calixto e col., 2007). A contribucin de cada alimento CA da dieta depende da cantidade inxerida e da sa propia CA. Cabe destacar que a maior contribucin corresponde s bebidas (72,6%), en contra da crenza xeral de que os alimentos vexetais, e especialmente as froitas e verduras, son a principal fonte de antioxidantes da dieta. Froitas e verduras
27
representan un 17,3% do total, froitos secos e legumes un 8,8%, mentres que a contribucin de cereais e aceites moi baixa. Estes resultados suxiren que para estudar o papel dos antioxidantes na sade se debera considerar a CA da dieta completa. Estudos en alimentos individuais teen un valor moi limitado, pois anda que presenten unha CA alta, a sa contribucin dieta pode ser insignificante. As, atopmosnos que a contribucin do aceite de oliva e do t dieta espaola representa s o 0,4 e 3% da CATD. Pola contra, o vio achega o 17,4% e, sorprendentemente, o caf un 44,6%. Respecto contribucin de compostos especficos, os compostos polifenlicos son cuantitativamente os principais antioxidantes da dieta. As vitaminas C e E representan tan s ao redor do 10% da capacidade antioxidante total da dieta (CATD), e os carotenoides unha cantidade moito menor. Non obstante, hai que ter en conta que as vitaminas son totalmente biodispoibles, mentres que a biodispoibilidade de polifenois e carotenoides baixa (5-15%). A CA da dieta noutros pases mediterrneos previsiblemente comparable de Espaa. Pola contra, debe ser menor en pases con altos ndices de enfermidades cardiovasculares e cancro, como os do norte e centroeuropeos, con dietas que se caracterizan por un mis alto consumo de cereais e menor de froitas, verduras e vio que en pases mediterrneos. Diso conclumos que a CA pode ser un parmetro para considerar en estudos clnicos e epidemiolxicos e para definir a dieta mediterrnea. Consumo Alimentos vexetais (g substancia fresca) Froitos secos Froitos Verduras e hortalizas Legumes Cereais Bebidas (mL) Aceites vexetais (mL) Oliva Outros Capacidade Antioxidante ABTS (mol equivalente trolox)
6,9 265,2 330,7 22,2 221,6 504,8 31,3 20,8 TOTAL
176,4 341,5 271,6 134,7 33,4 2575,7 12,8 2,4 3548,6
Tboa 1. Capacidade antioxidante total inxerida (per cpita/da) na dieta espaola (ano 2000)
28
Fibra antioxidante da uva (FAU) como prevencin de enfermidades crnicas A inxesta de FAU nun grupo controlado de 34 voluntarios e 10 controis aos que se lles subministrou 7,5 g FAU e placebo respectivamente durante 4 meses mostrou os seguintes efectos beneficiosos:
1. 2.
Aumento significativo do trnsito intestinal Diminucin significativa do colesterol total (9%), colesterol LDL (9%), presin sistlica (6%) e diastlica (5%). En suxeitos hipercolesterolmicos, descensos anda mis marcados en colesterol total (14,2%) e colesterol LDL (11,6%), as como en triglicridos (18,6%) Diminucin significativa da porcentaxe de graxa corporal en hipergraxos Posibles efectos de regulacin de glucemia
3. 4.
Tamn se obtiveron resultados prometedores da FAU en experimentacin animal relacionados coa prevencin de cancro de colon, encontrndose pendentes de desenvolvemento os ensaios clnicos. No sector dos alimentos funcionais, os estudos centrronse no desenvolvemento de reestruturados de peixe e de produtos crnicos enriquecidos con fibras antioxidantes como ingredientes funcionais. A adicin de fibra antioxidante de uva en reestruturados de peixe azul inhibe considerablemente a oxidacin durante o perodo de almacenamento a -20C, (Snchez-Alonso e col., 2007). Por outra parte, este ingrediente achega as propiedades nutricionais derivadas da presenza de fibra diettica. En alimentacin animal, a suplementacin da dieta de polos con fibra antioxidante de uva produce carne con elevada estabilidade oxidativa, igual ou superior obtida con suplementos de vitamina E (Goi e col., 2007). Actualmente, encntranse en desenvolvemento estudos para a obtencin de produtos crnicos (hamburguesas) enriquecidas con esta fibra. Os resultados preliminares indican unha inhibicin da oxidacin lipdica nestes alimentos. BIBLIOGRAFA
Pulido, R., Hernndez Garca, M., Saura Calixto, F. (2003). Eur. J. Clin. Nutr., 57, 1275-1282. Saura Calixto, F. Goi, I. (2006). Food Chem., 94, 442-447. Saura Calixto, F. Serrano, J. Goi, I. (2007). Food Chem., 101, 492-501. Saura Calixto, F. (1998). J. Agric. Food. Chem., 46, 4303. Snchez-Alonso, e col., (2007). Food Chem., 101, 372. Goi, I., e col., (2007). Poultry Science, 86, 508.
29
ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS COMPOSTOS FENLICOS DO VIO

M. Carmen Garca-Parrilla Dpto. de Bioqumica, Bromatoloxa, Toxicoloxa e Medicina Legal. Facultade de Farmacia. Universidade Sevilla Nos ltimos anos suscitouse gran interese polos antioxidantes dietticos. Como exemplo podemos comprobar o gran aumento en literatura cientfica dos ltimos anos referida a este tema. As no ano 1995 existan 6.486 artigos cientficos e no ano 2007 uns 21.517, cifras dadas a ttulo orientativo. Este aumento dbese fundamentalmente sa posible relacin coa sade e a prevencin da enfermidade. A asociacin do binomio do consumo moderado do vio e menor incidencia de enfermidade cardiovascular xurdiu como ben coecido co estudo de Renaud e Lorgeil do paradoxo francs publicado en 1992. Como etapa inicial da enfermidade cardiovascular e doutras enfermidades dexenerativas est a oxidacin. As pois, a hiptese de que unha maior inxesta de antioxidante prevn a enfermidade deu p a numerosos traballos no campo. En primeiro lugar, dbese definir que un antioxidante. Un antioxidante unha substancia que evita ou atrasa a oxidacin doutra. Halliwell en 1990 definiu os antioxidantes como substancias que estando en baixas concentracins con respecto s biomolculas que protexen, preveen ou reducen o dano que sofren estas debido oxidacin. As pois nunha acepcin do termo, hai que considerar o antioxidante como compoente do alimento que vai previr a oxidacin deste. Existen numerosos aditivos alimentarios que son antioxidantes. Pero a gran literatura cientfica refrese hoxe da ao efecto que sobre a sade teen substancias que estn naturalmente presentes en alimentos e que poden previr os procesos oxidativos que os radicais libres desencadean no organismo. O cido ascrbico, os tocoferois ou os carotenoides son substancias antioxidantes. Ademais existen substancias que son antioxidantes como os compostos polifenlicos dos que o vio, especialmente o tinto, boa fonte. Pdense identificar e cuantificar grazas cromatografa de lquidos con detectores de dodos e masas. un grupo moi heteroxneo desde o punto de vista estrutural, poden presentarse de forma monomrica, dimrica ou polimrica e unidos a outras molculas. Anda que cada da se coecen mis, tamn certo que anda quedan por dilucidar moitas estruturas. Para pr en evidencia as propiedades antioxidantes existen unha ampla variedade de mtodos in vitro. En xeral, o fundamento destes mtodos pasa pola xeracin dun radical no medio de reaccin e en comprobar como desaparece en presenza do
30
antioxidante. En gran nmero de casos se realiza unha medida espectrofotomtrica. Os resultados refrense a un estndar que adoita ser o trolox, anlogo hidrosoluble da vitamina E. Os mtodos ABTS e DPPH sanse con gran frecuencia. Ademais da molcula que se usa como radical, difiren no modo de xerar este. No caso do ABTS a xeracin do radical pode ser con peroxidasa de ravo e auga oxixenada; tamn con persulfato potsico. No caso do mtodo DPPH, non necesario unha etapa previa de xeracin do radical, simplemente a disolucin do reactivo comercial. Existen ademais diversos matices na realizacin dos mtodos que hai que considerar ao comparar os datos duns autores e outros, dunhas mostras e outras. Para comprobar a reproducibilidade dos mtodos pdense observar os datos obtidos por diversos autores con substancias patrn. Se os valores de actividade antioxidante dos compostos fenlicos poden variar nun 35% aplicando o mtodo do DPPH, no caso dos valores descritos para o mtodo do ABTS pdense ter diferenzas dun 70%. Esta diversidade pon de manifesto que sexa necesario unha estandarizacin das medidas. Neste sentido en EEUU estn usando o mtodo ORAC para recompilar os datos de actividade antioxidante dos alimentos en tboas. O mtodo ORAC basase na perda de fluorescencia que sofre unha protena, a ficoeritrina, polo ataque de radicais peroxilo. Despois comezouse a usar fluorescena como molcula diana xa que mis econmica e os resultados son mis reproducibles. Estes mtodos aplicronse a vios de diversas denominacins de orixe, ao estudo das diferentes fraccins fenlicas ou dos compostos fenlicos illadamente. Tamn se aplicaron para comprobar o efecto de operacins enolxicas na actividade antioxidante total do vio. Os mtodos in vitro para a determinacin das propiedades antioxidantes son un ndice, serven para pr de manifesto unha propiedade. Son tiles para establecer unha orde de reactividade e tamn se pode avaliar con eles un posible sinerxismo. Pdense usar para comparar os efectos dun tratamento tecnolxico dado sobre as propiedades antioxidantes. Pero non hai que perder de vista as diferenzas que existen coa situacin que se pode encontrar no organismo. Hai que recoecer que nestes mtodos se empregan radicais estraos, non son os propios do organismo e o seu valor parcialmente representativo. Para considerar os efectos antioxidantes que poden ter os compostos fenlicos in vivo tras a inxesta de vio hai que ter en conta diversas diferenzas cos ensaios nos que se administra un frmaco, por exemplo. Cando se consome vio estamos proporcionando unha mestura de substancias moi heteroxnea que se encontran a doses relativamente baixas con respecto s que se poden ensaiar cun medicamento. Por outra parte, o efecto beneficioso esperado debe producirse cando o alimento forma parte dunha dieta variada que, ademais no caso do vio, o alcohol limita anda
31
mis a sa inxesta. Por ltimo hai que considerar que as substancias presentes nos alimentos non estn como tales en fludos biolxicos e ademais as sas concentracins son moi baixas. Os compostos polifenlicos non absorbidos chegan ao colon onde son atacados pola flora normal que libera gran variedade de compostos fenlicos de baixo peso molecular que conservan a actividade antioxidante. O posible papel da fraccin polifenlica polimrica como precursor doutros compostos antioxidantes que orixinalmente non estn no alimento un aspecto interesante para o desenvolvemento de novos produtos derivados do sector vitivincola. Recentemente publicouse como o consumo de fibra diettica antioxidante da uva como suplemento diettico mellora o perfil lipdico e a hipertensin. Ademais dos estudos nos que se avala a biodispoibilidade dos compostos fenlicos medindo a concentracin dos seus derivados en fludos biolxicos, cabe considerar outra forma de poer en evidencia os efectos antioxidantes e que consiste en avaliar un biomarcador que puidese ser representativo do efecto anioxidante. Quizais entre estes un dos mis usados nun elevado nmero de estudos sexa a capacidade antioxidante do plasma. A determinacin sinxela, trtase de someter plasma extrado dun voluntario humano despois de ter consumido vio a un test de actividade antioxidante como os descritos anteriormente (ORAC, FRAP). Anda que os seus principais defensores argumentan que unha medida sinxela que pode dar unha idea do efecto antioxidante do conxunto de compostos inxeridos sobre un fludo biolxico, certo que hai diversas substancias como o glutatin ou o cido rico que tamn reaccionan. En estudos de intervencin pxose de manifesto que tras a inxesta de 300 mL de vio tinto a capacidade antioxidante do plasma aumenta entre un 16 a un 22,8% determinada co mtodo ORAC. No caso de estudos de intervencin a medio prazo de varias semanas non se observaron diferenzas significativas na capacidade antioxidante do plasma tras o consumo de vios brancos ou vios tintos. No entanto, existen outros biomarcadores como a actividade das encimas antioxidantes ou os grupos tiol das protenas que se modifican tras a inxesta repetida do vio. Neste sentido pdese dicir que o consumo repetido de vio modifica a actividade das encimas endxenas que constiten parte do noso sistema antioxidante. BIBLIOGRAFA
Fernndez-Panchn, M.S., Villao, D. Troncoso, e col. (2008). Crit. Rev. Food Sci. Nutr, 48, 649. Halliwell, B. (1990). Free Rad Res. Commun, 9, 1-32. Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. (2005). J Agric. Food Chem., 53, 1841-1856. Jimnez, J., Prez; Serrano, J., Tabernero, e col. (2008). Nutrition, 24, 646-653. Manach, C., Williamson, G., Morand, C., e col. (2005). Am. J. Clin. Nutr., 81, 230S-242S. Williamson, G., e Manach, C. (2005). Am. J. Clin. Nutr., 81, 243S-255S.
33
POSIBLE EFECTO PROTECTOR DOS VIOS TINTOS FRONTE AO ESTRS OXIDATIVO

M. Luisa Gonzlez San Jos Dpto. de Biotecnoloxa e Ciencia dos Alimentos. Universidade de Burgos Nas ltimas das dcadas proliferaron os estudos enfocados avaliacin da actividade antioxidante dos constituntes alimentarios, as como daqueles que asocian esta actividade antioxidante cos efectos positivos para a sade, derivados da inxesta de determinados alimentos. A base xeral de todos eles que os antioxidantes son necesarios e beneficiosos para evitar o estrs oxidativo que pode desencadear diferentes alteracins fisiolxicas ou fisiopatolxicas como o cancro, enfermidades cardiovasculares, disfuncins cerebrais, declive do sistema inmune, cataratas, envellecemento, etc. As, faise fincap en desenvolver hbitos alimenticios saudables, entre os que se encontra o consumo de alimentos que acheguen antioxidantes. O denominado paradoxo francs, observacin da existencia de certa asociacin do consumo de vio, especialmente do tinto, cunha menor incidencia de enfermidades cardiovasculares, mutaxnicas e neurodexenerativas, foi o principio de mltiples estudos que postularon que o consumo moderado de vio pode ter ou ten un efecto beneficioso para a sade. Un dos piares destas afirmacins o alto contido de compostos con actividade antioxidante presentes nos vios tintos, entre os que destacan os compostos fenlicos, e especialmente os flavonoideos (antocianos, flavanois, entre outros) e os estilbenos (o resveratrol e os seus derivados). Hoxe en da ben sabido que a adecuada avaliacin das propiedades antioxidantes dun alimento non se pode facer por un nico mtodo e polo tanto tndese a facer avaliacins mltiples que definan o perfil antioxidante do alimento. En xeral, a capacidade antioxidante avalase por mtodos que valoran a capacidade para transferir electrns (SET) ou ceder hidrxenos (HAT), a capacidade para quelar metais e/ou para atrapar radicais libres, a capacidade de reaccin de substancias de natureza diversa, etc. Por outra parte, a actividade antioxidante pode ser avaliada por un amplo nmero de mtodos que constiten unha aproximacin in vitro da capacidade dun determinado alimento ou composto de protexer un sistema biolxico da excesiva oxidacin provocada por especies reactivas, nitroxenadas ou oxixnicas. Esta actividade avalase principalmente por mtodos scavenger e de biomarcadores. Na maiora dos traballos publicados nos que se avaliaron as propiedades antioxidantes dos vios descrbese o uso de un a catro mtodos, o que insuficiente para definir adecuadamente o perfil antioxidante real do vio. Ademais, rara vez os mtodos aplicados son os mesmos ou se aplicaron en condicins estandarizadas, polo que se fai moi difcil comparar datos, que s veces incluso son contraditorios. Re-
34
centemente, o noso grupo de traballo propuxo un perfil que engloba datos de nove mtodos, abranguendo cinco qumicos, dous scavenger e tres biomarcadores, froito de traballos de optimizacin de diversas metodoloxas xa descritas como adecuadas para determinar a actividade antioxidante dos vios, e da busca doutras que permitiran achegarse aos posibles efectos saudables a travs de mtodos biolxicos ou de proteccin a biomolculas. Os mtodos seleccionados, agrupados por tipo de informacin, foron os seguintes: relativos capacidade antioxidante: ABTS; DPPH; DMPD; ORAC; FRAP e PT; relativos actividade scavenger: HRSA ou actividade scavenger do radical hidroxilo e SRSA ou actividade scavenger do radical superxido; e relativos a biomarcadores de estrs oxidativo: inhibicin do dano oxidativo ao ADN por electroforese en xel de agarosa e avaliacin do dano a bases nitroxenadas e inhibicin da peroxidacin lipdica nun sistema microsomal. A maiora dos traballos publicados, como xa se dixo, asocian principalmente o potencial antioxidante dos vios sa composicin fenlica. Hoxe en da a composicin fenlica dos vios foi amplamente estudada e sbese que son numerosos os factores que a afectan e modifican. Por iso, definir adecuadamente o perfil antioxidante dos vios implica analizar un nmero amplo deles, e que nas mostras analizadas encerren variabilidade debida ao maior nmero de actores posibles. Son moi poucos os estudos levados a cabo cun amplo nmero de vios, e no seu caso que inclen a heteroxeneidade propia deste tipo de produtos, o que fai que anda existan grandes lagoas respecto ao verdadeiro poder antioxidante dos vios en xeral, ou dalgn tipo deles en particular. O noso grupo de investigacin leva varios anos recompilando datos de vios tintos e distintas variedades, procedencias xeogrficas, idades, tipos de elaboracins e crianzas, e estudouse o efecto dalgns destes parmetros sobre o perfil antioxidante dos vios tintos. Ademais avaliouse a asociacin entre a composicin fenlica e o potencial antioxidante dos vios e planificouse o estudo a dous niveis, un global, derivado da comparacin da dotacin fenlica global dos vios e das sas propiedades antioxidantes, e outro pormenorizado, enfocado esencialmente na fraccin antocinica, no que se comparou o potencial antioxidante dos vios e o da sa fraccin antocinica, illada por cromatografa en columna. Resumindo os resultados obtidos durante estes anos son destacables varios feitos: 1.- Os vios tintos, en xeral, teen un potencial antioxidante elevado, conxunto dunha serie de mecanismos de proteccin: HAT, SET, captura de metais e radicais, proteccin de biomolculas, etc. 2.- Non se detectan grandes diferenzas en canto ao potencial antioxidante dos diversos vios tintos estudados, xa que presentan balances globais similares
35
(figuras 1 e 2), nos que descensos na sa capacidade protectora por un determinado mecanismo, por exemplo SET ou HAT, vense compensados por aumentos noutra como o potencial scavenger ou a proteccin a biomolculas.
ABTS 140 120 100 80 60 40 20 0 AM FR CE SP DPPH DMPD ORAC*1000 FRAP HRSA SRSA ABAP-LP DNA-damage/100
AOC
Figura 1. Perfil antioxidante dos vios tintos criados en barricas de distintos rebles
3.- Anda que a resposta pregunta se resulta saudable un consumo moderado de vio segue sendo sumamente complexa, os resultados apuntan a que o perfil antioxidante do vio tinto presenta propiedades potencialmente beneficiosas para a sade, especialmente debido a que os fenois maioritarios nestes vios son os antocianos, que ademais de presentar un elevado potencial antioxidante son os fenois que mostraron maior biodispoibilidade en traballos doutros grupos. claro que o potencial beneficio debe ser comprobado in vivo e sempre considerando que cada individuo ten respostas diversas, antes de chegar a unha conclusin final definitiva.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 FRAP ORAC*1000 SRSA ABAP-LP DNA damage *10-2
young
12 months
24 months
Figura 2. Valores das propiedades antioxidantes indicadas de vios tintos de distintas idades
AOC
37
BENEFICIO CARDIOVASCULAR DALGNS ANTIOXIDANTES PRESENTES NO T

Ezequiel lvarez Castro Facultade de Medicina e Odontoloxa. Universidade de Santiago de Compostela O t (Camellia sinensis) unha das bebidas mis populares e consumidas en todo o mundo. Constite por iso unha importante fonte nutricional de polifenois, fundamentalmente flavonoides do tipo flavanol ou catequina. Segundo o grao de fermentacin do t nas sas tres formas de verde, oolong e negro, a composicin polifenlica pasa do predominio en catequinas a formas polimricas destas molculas do tipo de teflavinas e terubixinas. Nos ltimos anos levronse a cabo unha serie de estudos epidemiolxicos sobre o posible beneficio cardiovascular do consumo de t. Neste sentido, malia algns datos discrepantes, a anlise global indica unha relacin positiva entre o consumo da bebida e a sade cardiovascular, medida esta como unha diminucin do risco de infarto de miocardio e da mortalidade cardiovascular. Os estudos sobre as causas deste beneficio suxiren que os polifenois son os principais responsables do efecto e que este se debe suma dunha serie de accins sobre o sistema cardiovascular que inclen: defensa antioxidante, antiinflamatoria, antiproliferativa, antitrombtica, vasorrelaxante e antiateroxnica. O efecto antioxidante quizais sexa o mis relevante e, desde logo, o mis estudado. As catequinas do t demostraron actividade antioxidante fronte a diversos radicais libres como os anins superxido, o oxxeno singulete ou o peroxinitrito. A relevancia deste efecto reside no feito de que os radicais mencionados ou os seus derivados foron relacionados co desenvolvemento das enfermidades vasculares mis importantes e frecuentes. Isto , hipertensin, aterosclerose e vasculopata diabtica. Anda se descoece o modo preciso en que os antioxidantes poden interferir no desenvolvemento destas enfermidades e por iso non se puideron elaborar estratexias teraputicas neste sentido, pero avanzar neste coecemento prometedor de importantes beneficios, debido alta morbilidade e mortalidade por causas cardiovasculares na nosa sociedade. O potencial antioxidante dos polifenois do t parece estar en relacin directa coa presenza do grupo galoil na sa estrutura. Isto converte a epigalocatequina-galato (EGCG) e a teflavina-digalato nos compoentes do t mis potentes. Debido a isto e a sa abundancia relativa na planta e a sa infusin, a EGCG con diferenza a molcula mis estudada.
38
Este composto presenta unha marcada actividade secuestradora de anins superxido xerados tanto de forma qumica como encimtica ou por clulas como os macrfagos. En contraposicin, tamn se suxeriu a posibilidade de que este composto en solucin xere de forma espontnea perxido de hidrxeno. Esta cuestin parece contradicir o efecto antioxidante da EGCG, anda que para algns autores supn outra estratexia para combater a accin oxidativa, xa que a exposicin repetida ao estrs oxidativo induce resistencia celular a altas concentracins de radicais libres de oxxeno. Ademais da accin directa sobre os radicais libres, os flavanois do t presentan outras accins que contriben ao efecto antioxidante global. Entre elas, cntanse a capacidade para quelar ins metlicos, a inhibicin de encimas xeradoras de radicais libres e a inducin da expresin de encimas degradadoras destes. Esta pliade de accins pode configurar un contorno no que se bloquea a formacin de radicais tanto de forma qumica, por secuestrar os ins metlicos necesarios para as reaccins que os producen, como de forma encimtica, ao inhibir especificamente as principais protenas responsables da producin radicalaria. Exemplo disto a inhibicin por parte dos compoentes do t, da xantina oxidasa, a lipooxixenasa ou a ciclooxixenasa. O aumento dos niveis proteicos daqueles outros encimas capaces de degradar ou metabolizar radicais de oxxeno, sumado accin directa das catequinas sobre estes que describimos anteriormente, acaban de conformar un panel defensivo fronte oxidacin que, actuando a diferentes niveis, vai limitar enormemente a accin e os efectos dos radicais que se poidan producir. O control do equilibrio de reducin-oxidacin (redox) no interior das clulas pode constitur outra importante baza dos axentes antioxidantes, xa que existen unha serie de factores de transcricin, cuxa actividade se ve influenciada pola situacin redox. Os factores de transcricin son molculas intracelulares que regulan a expresin dunha serie de xenes, consecuentemente existe unha serie de xenes que se coece que son sensibles ao equilibrio oxidativo na clula. En base a isto explcase o efecto indutor (aumento da expresin) das catequinas sobre determinados encimas antioxidantes. As, os niveis de superxido dismutasa, catalasa ou hemo-oxixenasa-1 poden ser modificados a travs deste mecanismo. Existen outros xenes afectados por este tipo de regulacin que son de gran importancia no sistema cardiovascular, xa que participan no desenvolvemento da aterosclerose, unha das enfermidades vasculares de maior morbilidade na nosa sociedade. Entran dentro desta categora xenes para determinadas molculas de adhesin endotelial- molcula de adhesin celular vascular 1 (VCAM-1), molcula de adhesin intercelular 1 (ICAM-1) e E-selectina. Todas elas participan na unin de clulas brancas superficie do endotelio vascular e a sa conseguinte extravasacin ao tecido, onde participan na captacin de lipoprotenas modificadas e inician
39
procesos inflamatorios que, de forma crnica, contriben retroalimentacin deste ciclo. Esta situacin o que se coece como ateroxnese, ou fase inicial da enfermidade aterosclertica. Outros xenes afectados polo equilibrio redox son determinadas citocinas proinflamatorias ou quimiotcticas do tipo da interleucina-8 ou a protena quimiotctica de monocitos 1 (MCP-1), molculas que participan no proceso ateroxnico, exacerbando a resposta inflamatoria e contribundo ao reclutamento de monocitos cara ao tecido vascular, respectivamente. Factores de crecemento como o factor de crecemento endotelial vascular (VEGF) ou o factor de crecemento epidermal (EGF), protenas cuxa expresin tamn sensible ao equilibrio redox, participan na fase proliferativa da aterosclerose, cando se conforma e crece a placa de ateroma e comeza a obstrur o fluxo sanguneo a travs do vaso. Polo tanto, a influencia no equilibrio redox da clula por parte das catequizas pode modificar os niveis de expresin de determinados xenes de importancia no desenvolvemento da enfermidade aterosclertica. Finalmente, a inhibicin da oxidacin de lipoprotenas outro mecanismo antioxidante de relevancia xa que tamn pode frear o proceso ateroxnico. As lipoprotenas captadas do torrente sanguneo cara ao vaso son oxidadas e modificadas de forma que se converten en partculas fagocitables polos macrfagos, que a forza de acumulalas no seu interior se transforman nas chamadas clulas espumosas, que darn orixe placa de ateroma. As catequinas son efectivos inhibidores da oxidacin de lipoprotenas de baixa densidade in vitro: lipoprotenas illadas do organismo e logo tratadas, anda que esta actividade, por circunstancias diversas, non sempre se confirma en experimentos ex vivo, lipoprotenas que reciben o tratamento dentro do organismo e logo son illadas para sometelas ao experimento oxidativo. Para explicar esta discrepancia propuxronse varias hipteses. En primeiro lugar, a alta concentracin de catequinas empregada in vitro inicialmente pensbase que non se poda alcanzar in vivo, pero mis recentemente demostrouse que estes flavanois se poden acumular no organismo a concentracins comparables s empregadas in vitro. Ademais, a capacidade antioxidante destas molculas mantense no plasma. Polo que parece, deben terse en conta para a comparacin entre resultados in vitro e ex vivo as variacins inter-individuais na biodispoibilidade dos polifenois do t, cuestin que fundamentalmente se relaciona con diferenzas na microflora intestinal e en polimorfismos xenticos de encimas implicados no metabolismo dos polifenois. parte do efecto antioxidante, os flavonoides do t demostraron unha serie de accins que tamn contriben ao beneficio cardiovascular. Neste sentido, os efectos antiinflamatorios, antiproliferativo, antitrombtico, vasorrelaxante e antiateroxnico son accins que suman contra o desenvolvemento da enfermidade vascular e axudan a explicar os efectos epidemiolxicos observados.
40
En resumo, os polifenois presentes no t presentan unha serie de propiedades demostradas experimentalmente que poderan explicar os efectos beneficiosos sobre a sade cardiovascular observados nos estudos epidemiolxicos. BIBLIOGRAFA
lvarez, E, Campos-Toimil, M, e col. (2006). Br. J. Pharmacol., 147(3), 269-280. lvarez, E, Leiro, J, e col. (2002). Int. Immunopharmacol., 2(6), 849-855. Khan, N, Mukhtar, H. (2007). Life Sci., 81(7), 519-533. McKay, D.L, Blumberg, J.B. (2002). J. Am. Coll. Nutr., 21(1), 1-13. Riemersma, R.A., Rice-Evans, C.A., e col. (2001). QJM., 94(5), 277-282. Stangl, V., Dreger, H., e col. (2007). Cardiovasc. Res. 73(2), 348-358.
41
EFECTOS VASODILATADORES DO TRANSRESVERATROL

Francisco Orallo Cambeiro () Dpto. de Farmacoloxa. Facultade de Farmacia. Universidade de Santiago de Compostela A baixa incidencia de cardiopata isqumica e outras enfermidades cardiovasculares na poboacin do sur de Francia, a pesar de ter unha dieta rica en graxas saturadas e uns factores de risco similares aos doutros pases industrializados (escaso exercicio, elevado consumo de tabaco, etc.), foi atribuda ao maior consumo continuado e moderado de vio (especialmente de vio tinto) pola dita poboacin, fenmeno que se denomina o paradoxo francs (Leger e col. 1979). Como os efectos beneficiosos e protectores do vio son totalmente independentes do seu contido en alcohol, ao longo destes ltimos anos levronse a cabo intensas investigacins para identificar os principios activos responsables. A pesar de que os ditos principios activos anda non se coecen, posiblemente debido complexa mestura de substancias presentes no vio con efectos opostos sobre o sistema cardiovascular, existen varias molculas candidatas, entre as que se atopan o trans-resveratrol ou (E)-resveratrol (3,4,5- trihidroxi-trans-estilbeno; t-RESV) (Orallo, 2002; Orallo e col., 2006 ) e outros compostos polifenlicos. Con todos estes antecedentes, estudamos por primeira vez o potencial da actividade vasodilatadora do t-RESV na aorta de rata mediante estudos funcionais e os mecanismos polos que a dita actividade se produce, co obxecto de intentar dilucidar se o t-RESV pode estar implicado nos efectos protectores do consumo moderado e prolongado do vio fronte incidencia de diversas patoloxas cardiovasculares e de intentar explicar o fenmeno do paradoxo francs antes mencionado. O t-RESV (1-10 M) non tivo efecto sobre as contraccins inducidas pola (-)-noradrenalina (NA) e por altas concentracins de KCl extracelular en aneis da aorta de rata desprovistos de endotelio. No entanto relaxou, dunha forma dependente da concentracin, a resposta contrctil producida pola NA (1 M, CI50 = 3,4 0,32 M, n = 5) ou por elevadas concentracins de KCl (60 mM, CI50 = 9,6 0,87 M, n = 5) en aneis intactos da aorta de rata (Orallo, 2002). Os correspondentes valores das CI50 presentaron diferenzas significativas (P < 0,01). Os efectos vasodilatadores do t-RESV foron completamente inhibidos pola N-nitro-L-arxinina (L-NOARG, 0,1 mM) e polo azul de metileno (10M) pero non se viron afectados pola atropina (10 M) e a yohimbina (1 M). O efecto inhibitorio producido pola L-NOARG foi antagonizado pola L-arxinina (0,1mM) pero non pola D-arxinina (Orallo, 2002). O t-RESV (1-100 M) non modificou a actividade encimtica da sintetasa constitutiva de xido ntrico (NO ) en homoxeneizados da aorta de rata. Ademais, o t-RESV (1-100 M) non mostrou propiedades inactivadoras, neutralizadoras ou varredoras (scavenger) de radicais superxido (O2 -) nin inhibidoras da xantina oxidasa porque non alterou a reducin do azul de nitrotetra-
42
zolio (NBT) nin a oxidacin da xantina a cido rico utilizando o sistema hipoxantina/ xantina oxidasa (HX-XO) (Orallo, 2002). O t-RESV (1-10 M) inhibiu a actividade encimtica da nicotinamida adenina dinucletido/nicotinamida adenina dinucletido fosfato [NADH/NADPH ou NAD(P)H] oxidasa vascular en homoxeneizados de aorta de rata, dicir, o sinal de quimioluminiscencia especfica emitido pola reaccin entre a lucixenina e os O2 - xerados a partir do oxxeno e do NADH (o substrato preferido pola NADH/NADPH oxidasa na aorta de rata). O valor da CI50 foi de 4,81 0,37 M, n = 5 (Orallo, 2002). Todos os resultados anteriores demostran que: O efecto vasorrelaxante caracterstico dependente do endotelio do t-RESV na aorta da rata parece ser debido a un incremento da actividade da va da L-arxinina-NO -guanosina 3,5-monofosfato cclico (GMP cclico, GMPc), posiblemente a travs da inhibicin da actividade da NADH/NADPH oxidasa vascular, subseguinte diminucin da biosntese celular basal de O2 - e, por conseguinte, da inactivacin do NO polos ditos radicais (Figuras 1a e 1c). A estimulacin da sintetasa constitutiva de NO presente nas clulas endoteliais (de forma directa ou mediada pola activacin dos adrenoceptores 2 e dos receptores muscarnicos endoteliais) non parece estar implicada nos efectos vasculares do tRESV (Figura 1a). Por outro lado, os ditos efectos tampouco se deben a propiedades neutralizadoras de O2 - nin a unha inhibicin da actividade encimtica da xantina oxidasa (Figuras 1b e 1c).
Figura 1. a) Representacin esquemtica da ruta da L-arxinina-NO -GMPc; b) Reaccins producidas no sistema HX-XO; c)Figura da biosntese de O2 - en clulas vasculares a travs da activacin da NAD(P)H oxidasa e da XO
Xa que a actividade da ruta L-arxinina-NO -GMPc parece ser defectuosa (baixa) e estar alterada (diminucin da sntese de NO /incremento da producin de O2 -) en patoloxas do sistema cardiovascular como a hipertensin e a aterosclerose (Orallo, 2002; Orallo e col., 2006), basicamente debido a unha actividade incrementada da NADH/NADPH
43
oxidasa, se o t-RESV exhibise un comportamento similar nos vasos sanguneos humanos, os nosos resultados permitiran suxerir que este composto polifenlico natural podera desempear un papel importante nos efectos cardioprotectores producidos a longo prazo polo consumo diario de moderadas cantidades de vio. BIBLIOGRAFA
Leger A.S., Cochrane A.L., Moore F. (1979). Lancet; 1 (8124), 1017-20. Orallo, F. (2006). Resveratrol in Health and Disease. Boca Raton, USA: CRC Press, 577-600. Orallo, F., lvarez E., Camia M., e col. (2002). Mol. Pharmacol., 61(2), 294-302.
45
EFECTOS ANTITUMORAIS DE ANTIOXIDANTES NATURAIS

Marta Cascante Serratosa Dpto. de Bioqumica e Bioloxa Molecular. Instituto de Biomedicina. Universidade de Barcelona (IBUB) O cancro o resultado da progresiva acumulacin de alteracins xenticas e epixenticas que levan a unha proliferacin acelerada, desordenada e descontrolada de clulas dun tecido que invaden e desprazan, localmente e a distancia, outros tecidos sans do organismo. Para que un tumor adquira malignidade debe adquirir unha serie de caractersticas entre as que se destacan, entre outras, a capacidade de crecemento independente dos factores de crecemento, a capacidade invasiva e a capacidade de evadir a apoptose. A aparicin dun cancro non se debe a un nico factor senn combinacin de varios factores que se engloban de maneira xeral en dous grupos: a herdanza xentica e o ambiente. A primeira conexin entre o cancro e a xentica propxose a principios do sculo XX, e esta idea serviu como unha das bases da sa investigacin (Klung, 2000). A incidencia do cancro est determinada por factores etiolxicos, como a inestabilidade xenmica, os factores dietticos, a inestabilidade en secuencias microsatlites ou as alteracins epixenticas, e pola susceptibilidade individual (Kamangar e col., 2006; Newcomb e col., 2007). Actualmente os tipos de cancro con maior mortalidade son o cancro de pulmn, seguido do cancro colorrectal e en terceiro lugar o cancro de mama (Terstriep e Grothey, 2006). O metabolismo enerxtico da clula tumoral atraeu a atencin dos bioqumicos desde hai mis de 80 anos. Xa na primeira metade do sculo pasado, Otto Warburg describiu que as clulas malignas eran capaces de fermentar a glicosa consumida ata lactato anda na presenza de oxxeno (Warburg e col., 1924). Dada a ineficiencia enerxtica deste proceso en comparacin coa respiracin mitocondrial, o consumo de glicosa nas clulas tumorais encntrase incrementado con respecto s sas clulas vecias, feito diferencial que foi utilizado para a deteccin de neoplasias mediante a tcnica de PET (Gambhir, 2002). Os mecanismos moleculares que fan posible esta alta capacidade glicoltica foron amplamente estudados nos ltimos anos (Gatenby e Gillies, 2004; Matoba e col., 2006). Debido ao seu crecemento descontrolado, moitos tumores slidos deben progresar baixo condicins de hipoxia. Nesas condicins xoga un papel moi importante o factor de transcricin inducible por hipoxia 1 (HIF-1). Este factor, fai aumentar a expresin de varios encimas glicolticos (Dang e Semenza, 1999; Rimpi e Nilsson, 2007). parte da activacin oncoxnica de HIF-1, outros mecanismos
46
que eventualmente provocan a activacin da glicolise foron descritos. Certamente, o metabolismo mitocondrial garda unha estreita relacin coa progresin do tumor, non s a nivel enerxtico, senn debido xeracin de especies reactivas de oxxeno (ROS). Durante o metabolismo aerobio xranse pequenas cantidades de ROS como radical hidroxilo (OH), anin superxido (O2 -) e perxido de hidrxeno (H2O2), indispensables en moitos procesos. A producin de ROS por parte da mitocondria pode ser entendida como unha espada de dobre fo. Por unha parte, foi descrito un aumento no estrs oxidativo nas clulas tumorais (Pelicano e col., 2004), debido seguramente a un mal funcionamento da maquinaria mitocondria, que podera provocar un aumento na taxa de mutaxnese e as inducir malignidade (Pelicano e col., 2004; Wallace, 2005). Por outra parte, dado que a xeracin de ROS pode desencadear o proceso apopttico, este mecanismo foi proposto para o tratamento do cancro (Engel e Evens, 2006; Mates e SnchezJimnez, 2000). O incremento da formacin de compostos de oxxeno altamente reactivos (ROS: Reactive Oxygen Species) como por exemplo H2O2 ou radicais libres derivados do oxxeno como o radical superxido (O2 -) e o hidroxilo ( OH), describiuse, ademais de no cancro, nun gran nmero de enfermidades que van desde os procesos inflamatorios e alteracins do sistema inmunolxico ata infartos de miocardio (Mates e Snchez-Jimnez, 2000). Os radicais libres xranse in vivo como subprodutos do metabolismo normal. Tamn se producen cando un organismo est exposto radiacin ionizante, a drogas con propiedades oxidantes ou xenobiticos que poden formar in situ metabolitos que son radicais libres. Os radicais libres afectan practicamente todos os aspectos da bioloxa celular xa que poden reaccionar e modificar un gran nmero de molculas que constiten o material estrutural, metablico e xentico da clula. Algns dos efectos prexudiciais ben coecidos dunha xeracin excesiva de ROS nos sistemas biolxicos son a peroxidacin dos lpidos da membrana, a oxidacin dos cidos nucleicos e azucres e a oxidacin de grupos sulfidrilo das protenas. Ademais aos radicais libres formados a partir do oxxeno atribeselles a capacidade de iniciar e promover a carcinoxnese. A propia clula ten mecanismos de proteccin para defenderse dos radicais libres pero o incremento de radicais libres que se produce en situacins de enfermidade, inxestin de xenobiticos e outras situacins de estrs ambiental como exceso de radiacins etc. poden sobresaturar os sistemas de defensa celulares e poden produ-
47
cirse danos irreparables na clula que conduzan sa morte ou perda do control de proliferacin e a sa conversin en clula tumoral. Os sistemas de desintoxicacin que ten a propia clula para desintoxicarse dos ROS son de carcter encimtico e non encimtico e constiten o que se denomina os sistemas antioxidantes de defensa. Os principais sistemas de defensa son os seguintes sistemas encimticos:
1)Superxido dismutasa; 2) Catalasa; 3) Glutatin peroxidasa; e 4) Os sistemas encimticos de rexeneracin do glutatin.
Algns sistemas encimticos como a superxido dismutasa e a catalasa actan especificamente contra ROS mentres que outros sistemas encimticos reducen grupos tiol. Os antioxidantes non encimticos son menos especficos e poden actuar sobre outros radicais orgnicos e inorgnicos. Os antioxidantes poden ser clasificados como solubles en auga ou ben liposolubles dependendo se actan primariamente na fase acuosa ou na membrana. Os antioxidantes hidroflicos inclen por exemplo o cido ascrbico (vitamina C) e os antioxidantes liposolubles inclen ubiquinois, retinoides, carotenoides e tocoferois (como por exemplo a vitamina E). Algunhas protenas plasmticas e o glutatin (GSH) son exemplos de antioxidantes endxenos mentres que o cido ascrbico, os carotenoides, os retinoides, os flavonoides e os tocoferois constiten exemplos de antioxidantes provenientes da dieta. Estes antioxidantes posen a capacidade de secuestrar e anular varios radicais provenientes do oxxeno, carbono, anel fenlico etc., as como outros tipos de ROS. Actualmente, o interese da comunidade cientfica cara correcta alimentacin foi en aumento debido relacin directa deste factor etiolxico coa sade da poboacin. Un gran nmero de estudos apoian a idea de que unha dieta rica en froitas e verduras ten un efecto preventivo sobre o cancro e outras enfermidades debido ao seu alto contido en substancias antioxidantes tales como o cido ascrbico e os carotenoides. No entanto, non hai que esquecer que a froita e os vexetais tamn conteen unha gran diversidade de flavonoides e compostos fenlicos que poden actuar tamn como antioxidantes. Os flavonoides poden funcionar como: 1) quelantes de metais e axentes redutores, 2) antioxidantes secuestradores de ROS, 3) inhibidores da formacin de radicais derivados de oxxeno, 4) protectores da degradacin do cido ascrbico. Os polifenois naturais presentes na uva e no t convertronse en substancias moi apreciadas pola sa accin antioxidante e atpanse presentes en moitos suplemen-
48
tos nutricionais recomendados para previr o envellecemento e o cancro. As mesmo, a fibra diettica tamn apreciada como fonte de prevencin do cancro colorrectal, debido s sas propiedades reguladoras do intestino (Kim, 2000). Os efectos beneficiosos dos antioxidantes naturais, presentes en froitas e verduras, como preventivos do estrs oxidativo que deriva no dano celular e na carcinoxnese foron extensamente estudados. As, demostrouse que distintos antioxidantes que mimetizan a accin dos sistemas encimticos de defensa celulares son capaces de inhibir a tumoroxnese inducida por distintos axentes carcinoxnicos. Un dos grupos de antioxidantes naturais sobre o que mis estudos se realizaron nos ltimos anos o dos flavonoides. As como o efecto preventivo da aparicin de tumores dos antioxidantes naturais presentes na dieta est amplamente recoecido, o efecto dos antioxidantes sobre o tumor xa formado foi obxecto de controversia. ben sabido que existen principalmente dous camios a travs dos cales se produce a morte celular: A necrose e a apoptose. Na necrose tipicamente leva consigo que a clula se inche, se produza a consecuente lise celular e resposta inflamatoria. A morte por necrose tradcese na liberacin de material intracelular que desencadea a resposta inflamatoria. En cambio, a apoptose considrase unha morte celular programada xa que a clula perde volume, os ncleos condnsanse e en xeral, anda que non sempre, prodcese a fragmentacin do DNA. A apoptose leva consigo a liberacin de moi pouco material intracelular co que non se produce resposta inflamatoria. Os corpos apoptticos producidos son eliminados polos macrfagos. Na clula existen mecanismos de vixilancia e control de maneira que cando se detecta alteracin irreversible no material xentico deberan activarse os mecanismos que conducen apoptose. A apoptose e o cancro considranse fenmenos opostos xa que na clula tumoral, a pesar de ter anomalas a nivel xentico, a apoptose non se produce espontaneamente como debera de ocorrer. Os antioxidantes naturais como os flavonoides poden actuar como unha arma de dobre fo xa que moitos deles a altas concentracins pode actuar como prooxidantes (Decker, 1997). As, a concentracins moderadas, poden actuar como secuestradores de ROS, diminundo a elevada concentracin que presenta a clula tumoral e interfirindo as na sa proliferacin. No entanto, a altas concentracins poden actuar como produtores de ROS inducindo a apoptose celular. Os radicais libres, e en particular as ROS, propuxronse como un mediador comn para a apoptose. Por outro lado, a pesar da extensa evidencia a favor de que as ROS xoguen un papel crucial na apoptose, existen tamn datos indicativos de que as ROS non son esenciais.
49
Polo que se refire gran familia de antioxidantes constituda polos flavonoides, describronse diversos compostos capaces de inducir apoptose en distintas lias celulares (para unha revisin ver Middleton e col., 2000). Os mecanismos a travs dos cales os antioxidantes actan inhibindo a proliferacin tumoral e favorecendo a regresin do tumor van sendo pouco a pouco elucidados. Ademais describiuse que o efecto dos antioxidantes naturais presentes na dieta selectivo para as clulas tumorais, o cal representa un dos seus maiores atractivos a nivel farmacolxico. Entre a gran cantidade de antioxidantes naturais que existen, no noso laboratorio centrmonos no estudo de polifenois bioactivos derivados de subprodutos vincolas. Os ditos produtos obtivronse a partir dun fraccionamento de extractos primarios de bagazos de uva mediante a tcnica de HPLC. As diversas fraccins extradas estn formadas por monmeros e polmeros de catequinas e flavanois. Os estudos que se levaron a cabo demostraron que fraccins dos extractos de uva con alto grao de galoizacin posen propiedades antitumorais e poderan ser utilizados na prevencin e o tratamento do cancro (Lizarraga e col., 2007). Ademais, actualmente, tamn estamos realizando estudos que indican que a fibra diettica combinada con antixodantes presentes na uva podera ser efectiva na prevencin e o tratamento do cancro de colon. Agradecementos Ministerio de Educacin e Ciencia (AGL2004-07579-C04-02 e AGL200407579-C04-03), Instituto Carlos III e Fondos Feder da Comunidade Europea (ISCIIIRTICC (RD06 0020 0046) e Generalitat de Catalunya (2005SGR00204). BIBLIOGRAFA
Dang, C.V. e Semenza, G.L. (1999). Trends Biochem Sci., 24, 68-72. Decker, E.A. (1997). Nutr. Rev., 55(11 Pt 1), 396-398. Engel, R.H. e Evens, A.M. (2006). Front. Biosci., 11, 300-312. Gatenby, R.A. e Gillies, R.J. (2004). Nat Rev Cancer., 4, 891-899. Gambhir, S.S. (2002). Nat. Rev. Cancer., 2, 683-693. Kamangar, F., Dores, G.M. e Anderson, W.F. (2006). J. Clin. Oncol., 24, 2137-2150. Kim, Y.I. (2000). Gastroenterology, 118, 1235-57. Lizarraga D., Lozano C., Bried J., e col. (2007). FEBS Journal, 274 (18), 4802-4811. Mates, J.M. e Snchez-Jimnez, F.M. (2000). Int. J. Biochem. Cell. Biol., 32, 157-170. Matoba, S., Kang, J.G., Patino, W.D., e col. (2006). Science, 312, 1650-1653. Middleton, E., Jr., Kandaswami, C. e Theoharides, T.C. (2000). Pharmacol. Rev., 52, 673-751. Newcomb, P.A., Baron, J., Cotterchio, M. e col. (2007). Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 16, 2331-2343.
50
Rimpi, S. e Nilsson, J.A. (2007). Biochem. Soc. Trans., 35, 305-310. Pelicano, H., Carney, D. e Huang, P. (2004). Drug Resist. Updat., 7, 97-110. Terstriep, S. e Grothey, A. (2006). Expert. Rev. Anticancer Ther., 6, 921-930. Wallace, D.C. (2005). Cold Spring Harb Symp. Quant. Biol., 70, 363-374. Warburg, O., Posener, K. e Negelein, E. (1924). Biochem. Z., 152, 309-344.
51
CANCRO PROSTTICO: EFECTO DE FITOESTEROIS (PS) E POLIFENOIS (PF) SOBRE O CRECEMENTO CANCERXENO E A METASTATIZACIN
Mara Jess Nez-Iglesias, Silvia Novo e Manuel Freire-Garabal Nez Dpto. de Farmacoloxa. Facultad de Medicina e Odontoloxa. Universidade de Santiago de Compostela Unha das lias de traballo do noso grupo de investigacin versa sobre o efecto de diferentes compostos e factores biolxicos no crecemento tumoral e metastatizacin, empregando para iso diversos modelos de cancro. Actualmente, o noso traballo centrouse no estudo do cancro de prstata (CaP). Esta enfermidade a neoplasia maligna invasora mis comn (Jermal e col., 2005) nos pases occidentais. Malia unha maior vixilancia e deteccin precoz, o CaP segue ocupando o segundo lugar como causa de morte relacionada co cancro. Polo tanto, son necesarias novas actitudes teraputicas coas que abordalo. O tratamento do CaP metastsico un importante desafo para mdicos debido ao seu comportamento refractario e sa resistencia a quimioterapias convencionais. Estudos previos demostraron que substancias antioxidantes naturais tales como o resveratrol ou a xenistena poden inhibir a iniciacin, promocin e progresin da tumorixnese. hora de determinar efectos beneficiosos de compoentes naturais sobre o CaP, dous aspectos claves relacionados co devandito proceso deben ser tidos en conta: anxioxnese e metstase. Anxioxnese A anxioxnese un proceso esencial implicado no desenvolvemento e progresin do cancro prosttico (Guo e col., 2007). O factor de crecemento do endotelio vascular (VEGF) un regulador esencial do proceso anxioxnico durante a carcinoxnese prosttica. Nos nosos estudos investigamos posibles mecanismos antianxioxnicos de diversas molculas, principalmente fitosterois (PS) e polifenois (PF) de orixe natural, sobre a expresin de VEGF en cultivos celulares e in vivo. Clulas cancerxenas prostticas humanas andrxeno insensibles PC-3 e PC3-M son cultivadas baixo condicins in vitro e durante diferentes perodos de experimentacin, baixo a influencia de PS e PF incorporados ao medio de cultivo en diferentes concentracins. Extrese o sobrenadante e mdense as concentracins de VEGF mediante a tcnica de ELISA. Por outra parte, e tras despegar as clulas das cuncas pequenas con tripsina, a expresin xnica de VEGF determnase por RT-PCR.
52
O efecto destas substancias tamn estudado nun modelo anxioxnico in vitro con clulas endoteliais articas bovinas (BAEC), seguindo os procedementos previamente descritos (Mantell e col., 2000). A anxioxnese cuantifcase mediante un sistema de anlise de imaxe computarizada. As clulas con crecemento elongado son representadas dixitalmente, e a rea ocupada por estas determinada expresndose como unha porcentaxe da rea total. Por outra parte, tamn se realizan ensaios de apoptose con kits comerciais. Os ncleos celulares examnanse mediante microscopa de fluorescencia tras efectuar unha tinguidura con laranxa de acridina. A integridade do ADN extrado das clulas cultivadas sobre discos cubertos con xelatina determnase en presenza destes compostos utilizados na tcnica de ELISA. Para os estudos in vivo (Mantell e col., 2000) realzanse dous implantes subcutneos na rexin dorsal de ratos espidos BALB/c nu/nu femia, de 6 semanas, baixo anestesia con halotano. Transcorridos 6 das, en cada rato realzase, baixo anestesia con fluotano, un implante subcutneo de clulas PC3 en cada flanco. O crecemento tumoral monitorzase semanalmente. Despois de 8 semanas, os ratos son sacrificados e os tumores extrados. Finalmente, realzase tinguidura histoqumica de seccins tumorais obtidas por crioconxelacin e determnase a densidade microvascular. Estudos de metastatizacin A protena quinasa activada por mitxeno (MAP) p38 regula a activacin da metaloproteinasa da matriz tipo 2 (MMP-2) e a invasin celular. Algunhas substancias que bloquean o crecemento prosttico tamn impiden a activacin da MAP quinasa p38 mediada polo factor de crecemento transformante beta (TGFbeta) (Xu e Bergan, 2006). Recentemente, identificronse a protena quinasa 2 activada por MAP quinasas (MAPKAPK2) e a protena de choque trmico 27-kDa (HSP27) como reguladores derivados da accin da p38MAPK. O noso grupo de traballo desenvolveu ensaios in vitro empregando clulas PC3 e PC3-M para determinar os efectos de novas substancias sobre a cascada metastsica derivada da activacin de MMP-2 polo TGF-beta, analizando a expresin da quinasa de adhesin focal (FAK), a p38MAPK e a HSP27 mediante western blot e zimografa. Ademais, estudamos o efecto de diferentes PS e PF en ensaios de invasin celular, segundo protocolos previamente descritos (Huang e col., 2005; Liu e col., 2002; Xu e Bergan, 2006). Brevemente, 24 horas despois da sementeira, as clulas PC3 e PC3-M son transfectadas cun vector de expresin xunto ao vector -galactosidasa (pCMV--gal), para permitir a deteccin das clulas transfectadas. Ao da seguinte, as clulas son disociadas, colocndose a suspensin celular no compartimento
53
superior dunha cmara de Boyden de 48 cuncas pequenas, e permitndose que as clulas migren durante un perodo de 10 horas a travs de membranas Nuclepore (dimetro de poro 8 m). Previo procesamento das membranas e tinguidura DiffQuick (Dade Behring AG, Dudingen, Switzerland) realzase a contaxe de clulas invasoras e non invasoras empregndose coordinadas de campo predeterminadas. En resumo, mediante os procedementos anteriormente sinalados, ns temos informacin preliminar pero fidedigna sobre propiedades teraputicas de molculas PS e PF achegadas por outros membros da rede ANTIOXGAL sobre o cancro prosttico. Os nosos resultados sentan unha base frrea para a realizacin de futuros ensaios clnicos. BIBLIOGRAFA
Guo, Y., Wang, S., Hoot, D.R., y col. (2007). J. Nutr. Biochem. 18, 408-417. Huang, X., Chen, S., Xu, L., y col. (2005). Cancer Res., 65, 3470-3478. Jemal, A., Murray, T., Ward, E., e col. (2005). Cancer J. Clin., 55, 10-30. Liu, Y., Jovanovic, B., Pins, M., e col. (2002). Oncogene, 21, 8272-8281. Mantell, D.J., Owens, P.E., Bundred, N.J., e col. (2000). Circ. Res., 87, 214-220. Xu, L., Bergan, R.C. (2006). Mol. Pharmacol., 70, 869-877.
55
ANTIOXIDANTES NATURAIS NA REPRODUCIN HUMANA. PAPEL DO ESTRS OXIDATIVO NA FRAGMENTACIN DO DNA ESPERMTICO: UTILIDADE DO TRATAMENTO ANTIOXIDANTE
Juan G. lvarez Bioloxa Reprodutiva. Harvard Medical School. Boston, MA (EEUU) Introducin A integridade do xenoma paterno de vital importancia no inicio e mantemento dun embarazo a termo tanto in vivo como in vitro. En xeral, espermatozoides co DNA danado poden fecundar ovocitos en metafase II coa mesma eficacia que espermatozoides con DNA intacto (Aitken e col., 1998). No entanto, a presenza no embrin de certas modificacins a nivel de nucletidos e/ou fragmentacin nas cadeas do DNA procedentes do complemento xenmico paterno (que non fosen reparadas polo ovocito despois da fecundacin) incompatible cun desenvolvemento embrionario e fetal normal. Estmase que un 25% das causas de infertilidade masculina son de orixe idioptica. A etioloxa dalgunhas destas causas podera estar relacionada con dano do DNA nos espermatozoides. Non entanto, este dano podera ser reparado polo ovocito despois da fecundacin. Isto vai depender sobre todo (i) da calidade citoplasmtica e xenmica do ovocito; e (ii) do grao de dano nas cadeas do DNA do espermatozoide que fecundase ao ovocito. Dado que a capacidade do ovocito de reparar este tipo de dano dimine coa idade e que, ao mesmo tempo, o nivel de fragmentacin do DNA nos espermatozoides aumenta, iso podera explicar, polo menos en parte, a diminucin significativa na taxa de embarazo que se observa en parellas de idade avanzada. Este tipo de dano nas cadeas do DNA podera encontrarse en embrins cun complemento cromosmico normal. dicir, a presenza de dano do DNA non reparado por encima dun limiar crtico en embrins xerados tanto in vivo como in vitro podera explicar o paro no desenvolvemento embrionario que se produce tras a implantacin de embrins cun cariotipo normal. Estudos recentes suxiren que este tipo de dano se expresa a partir do da 3 de desenvolvemento embrionario e foi caracterizado como late paternal effects (Tesarik e col., 2004). Cabera puntualizar que o dano do DNA que se puidese encontrar no embrin non ten porque estar exclusivamente relacionado co dano do DNA no espermatozoide que fecundase o ovocito. Este dano podera provir tamn do ovocito ou de ambos os dous. No entanto, dado que (i) a anlise de fragmentacin do DNA en gametos destrutiva; (ii) este dano podera variar dun ovocito a outro; e (iii) o nmero de ovocitos
56
limitado, isto non nos permitiu estudar ata agora a presenza desta patoloxa nos ovocitos. En cambio, o uso de tests que permitan o estudo do grao de fragmentacin do DNA (especialmente cando se trata de dano do DNA de cadea dobre) en blastmeras de embrins obtidas para DGP, podera aplicarse ao estudo da integridade da cromatina embrionaria. O uso combinado de PCR, de sondas cromosmicas e de tests de fragmentacin do DNA permitiranos estudar de forma simultnea a presenza de enfermidades monoxnicas, aneuploidas e o grao de fragmentacin do DNA no embrin, permitndonos as seleccionar os embrins de mellor calidade xenmica. Mecanismos de fragmentacin do DNA espermtico Como se produce a fragmentacin do DNA nos espermatozoides? O dano do DNA nos espermatozoides pode afectar tanto o DNA mitocondrial como o nuclear, e pode ser inducido por cinco mecanismos principais: (i) apoptose durante o proceso de espermatoxnese; (ii) roturas do DNA ou nicks producidos durante o remodelado da cromatina que ten lugar durante o proceso de espermioxnese; (iii) fragmentacin do DNA a nivel post-testicular inducida por ROS e caspasas/endonucleasas durante o paso dos espermatozoides a travs do epiddimo; (iv) fragmentacin do DNA inducida por caspasas e endonucleases espermticas; e (v) fragmentacin do DNA inducida por radio e quimioterapia. Destes cinco mecanismos, quizais no que xoga un papel mis importante sexa a fragmentacin do DNA a nivel post-testicular durante o transporte dos espermatozoides a travs do epiddimo. Isto vn avalado por estudos previos que demostran que a fragmentacin do DNA mis alta en espermatozoides do epiddimo (Steele e col., 1999) e exaculados (Greco e col., 2005; Ollero e col., 2001) que en espermatozoides testiculares (Greco e col., 2005). 1. Inducin de apoptose durante o proceso de espermatoxnese. Durante o proceso de espermatoxnese ten lugar un screening celular importante que resulta na inducin de apoptose nun 50-60% das clulas xerminais que entran na meiose I. Estas clulas earmarked con marcadores apoptticos tipo Fas deberan ser fagocitadas e eliminadas pola clula de Sertoli, cal se encontran asociadas (Billig e col., 1996; Pentikainen e col., 1999; Sakkas e col., 1999). No entanto, isto non sempre va ocorrer e unha porcentaxe variable destas clulas xerminais entran no proceso de remodelado celular da espermioxnese (que o que determina a morfoloxa espermtica), aparecendo posteriormente no exaculado. En relacin a este proceso de screening fallido, os resultados dun estudo recente suxiren que existe unha disociacin entre a calidade xenmica da clula xerminal e o remodelado espermtico que ten lugar durante a espermioxnese (Burrello e col., 2004). dicir, unha clula xerminal pode ter o ncleo pulverizado por apoptose ou ser aneuploide e non obstante o espermatozoide resultante ter unha morfoloxa normal. De a que cando se microinxecte un espermatozoide de morfoloxa normal, isto non nos garanta que o xenoma sexa
57
normal. O que si se constatou que cando existe oligospermia, a probabilidade de que un espermatozoide con morfoloxa normal sexa aneuploide moito maior que se existe normozoospermia (Burrello e col., 2004). Isto probablemente estea relacionado cun bloqueo madurativo parcial asociado a alteracins meiticas. Por ltimo, o feito de que unha porcentaxe variable de espermatozoides no exaculado expresan marcadores apoptticos do tipo de Fas, fosfatidilserina, Bcl-XL, p53 (Sakkas e col., 2002) podera utilizarse para seleccionar espermatozoides non apoptticos en mostras de seme. Un mtodo desenvolvido recentemente nesta direccin o utilizado para separar espermatozoides apoptticos de espermatozoides non-apoptticos mediante o uso das columnas de ANnexin-conjugated MicroBeads (ANMB Microbead Kit, Miltenyi Biotec, Germany). O principio no que estn baseadas estas columnas que os espermatozoides apoptticos expresan fosfatidilserina na hemicapa externa da membrana e se unen anexina V. Ao aplicar un campo magntico s columnas, os espermatozoides unidos anexina V conxugada coas micropartculas magnticas seran retidos na columna, mentres que os non-apoptticos pasaran a travs desta (Grunewald e col., 2001). Outro mtodo, quizais mis especfico, sera a seleccin de espermatozoides apoptticos por tcnicas de inmunoadsorpcin fase slida mediante o uso de anticorpos anti-Fas adheridos a placas de Petri. 2. Roturas do DNA durante o proceso de espermioxnese. Alteracins no proceso de remodelado da cromatina espermtica durante a espermioxnese poderan resultar na fragmentacin do DNA. McPherson e Longo postularon que a presenza de roturas no DNA podera ser indicativa de maduracin incompleta durante a espermioxnese. Para que se produza o empaquetamento da cromatina do espermatozoide necesaria a actividade de nucleasas endxenas que corten e liguen o DNA durante a sa protaminacin. Estes cortes proporcionaran unha liberacin de estrs torsional axudando as ao empaquetamento da cromatina durante o desprazamento das histonas polas protaminas (McPherson e Longo, 1992, 1993a, b). Alteracins no control deste proceso poderan resultar en roturas do DNA non reparadas. Estas alteracins produciranse antes da espermiacin. 3. Fragmentacin do DNA a nivel post-testicular. Estudos recentes demostran que espermatozoides inmaturos que producen niveis elevados de ROS poden inducir dano do DNA en espermatozoides maduros. Este dano producirase despois da espermiacin durante a comigracin de espermatozoides maduros e inmaturos desde os tbulos seminferos ao epiddimo (Ollero e col., 2001). Dado que os espermatozoides se encontran en ntimo contacto no epiddimo, e que a vida media dos ROS da orde de nano a microsegundos, isto facilitara que os ROS induzan fragmentacin do DNA a nivel do epiddimo, xa sexa actuando directamente sobre o DNA ou ben indirectamente mediante a activacin de endonucleasas e caspasas espermticas. Isto consistente co feito de que a co-centrifugacin de espermatozoides inmaturos (que producen niveis elevados de ROS) con espermatozoides maduros resulta na
58
inducin de fragmentacin do DNA nestes ltimos, xa que nestas condicins estes espermatozoides tamn se encontraran en ntimo contacto (Twigg e col., 1998). Isto tamn consistente co feito de que a exposicin in vitro de espermatozoides maduros a ROS resulta en dano significativo do DNA (Aitken e col., 1998; Lopes e col., 1998). Por outra parte, o mesmo epiddimo podera tamn xogar un papel activo hora de inducir fragmentacin do DNA nos espermatozoides ao seu paso por este, xa sexa producido por radicais libres como o anin superxido (Britan e col., 2006), o radical hidroxilo ou o xido ntrico, ou ben mediante a activacin de caspasas e endonucleasas espermticas por axentes txicos ou por factores epididimarios. No primeiro caso, este tipo de dano podera previrse mediante o uso de axentes antioxidantes, mentres que no segundo caso este tratamento carecera de eficacia. Isto vn avalado polos resultados recentemente publicados por Greco e col. (2005), onde o uso de antioxidantes produciu unha reducin significativa nos niveis de fragmentacin do DNA. Probablemente, os espermatozoides que expresen un maior dano do DNA sexan aqueles que adquiran un menor grao de crosslinking de pontes disulfuro na cromatina espermtica durante a sa maduracin no epiddimo. Neste sentido, estudos recentes demostraron que, en xeral, o grao de fragmentacin do DNA en espermatozoides exaculados mis alto que en espermatozoides testiculares (Greco e col., 2005; Steele e col., 1999), e que en espermatozoides do corpo e cabeza do epiddimo (que onde se completa o proceso de crosslinking) e que a inducin de fragmentacin do DNA nos espermatozoides ao seu paso polo epiddimo podera estar relacionada coa calidade xenmica do espermatozoide. dicir, ademais do mecanismo de screening da clula de Sertoli, ao que faciamos referencia antes, existira outro mecanismo de screening a nivel do epiddimo dirixido para eliminar espermatozoides xenomicamente defectuosos (Suganuma e col., 2005). O dano potencial do DNA que os espermatozoides poden experimentar ao seu paso polo epiddimo ten unha gran trascendencia clnica, xa que en casos de niveis elevados de fragmentacin do DNA en seme e fallo en dous ou mis ciclos de FIV/ ICSI, podera recorrerse microinxeccin de espermatozoides testiculares obtidos mediante a tcnica de TESA ou TESE (preferiblemente TESA, dado que menos invasiva e gozara dunha maior aceptacin por parte do paciente e do xineclogo). Isto vn avalado polos resultados obtidos nun estudo publicado por Greco e col. (2005), onde a microinxeccin de espermatozoides testiculares en pacientes cun nivel de fragmentacin do DNA en seme > 15%, medido polo test TUNEL, resultou nunha taxa de embarazo do 44,4%, mentres que con espermatozoides exaculados a taxa de embarazo evolutivo foi do 0%. Cabe destacar que a fragmentacin do DNA inducida polo radical hidroxilo resulta na formacin de 8-OH-guanina e 8-OH-2-deoxiguanosina nun primeiro estadio,
59
seguido da fragmentacin do DNA de cadea sinxela ou de cadea dobre (Cui e col., 2000). Mentres que o dano do DNA do primeiro tipo puidese ser reparado polo ovocito, a fecundacin dun ovocito por un espermatozoide con fragmentacin do DNA da cadea dobre extensiva practicamente irreversible e incompatible co desenvolvemento dun embarazo a termo. Dado que valores de fragmentacin do DNA en espermatozoides exaculados > 20%, medidos por TUNEL (Sergerie e col., 2005), ou > 30%, medidos polo test SCSA (Evenson e col., 1999), estn asociados a taxas de embarazo < 5%; a hiptese que se veu postulando ata agora que anda que un 20% e 30% dos espermatozoides teen roturas nas cadeas do DNA, o resto dos espermatozoides poderan ter modificacins nas bases do DNA do tipo de 8-OH-guanina e 8-OH-2-deoxiguanosina. Polo tanto, a probabilidade de que un espermatozoide con DNA normal fecunde o ovocito sera moito mis baixa que a esperada cun valor de fragmentacin do DNA do 20% ou 30%, respectivamente. dicir, ademais da fragmentacin do DNA medible do 20% e 30%, o 80% e 70% restante dos espermatozoides, teran outro tipo de dano que non miden os test habituais de fragmentacin do DNA e que, de non ser reparado, non sera compatible co desenvolvemento dun embarazo a termo. Este concepto foi designado como o efecto iceberg (Evenson e col., 1999). No entanto, na actualidade barllase outra hiptese alternativa: dado que nalgns estudos se encontra unha correlacin entre un valor patolxico de fragmentacin do DNA e as baixas taxas de embarazo en tcnicas de reproducin asistida e noutros non se encontra esta correlacin, incluso en parellas cun perfil de factor feminino moi similar e sen factor masculino xentico (FISH en seme e meiose normal), o mis probable que esta aparente discrepancia estea relacionada co tipo de dano do DNA: dicir, se o dano do DNA espermtico reparable ou non polo ovocito. Dous pacientes puideran ter un mesmo valor de fragmentacin do DNA, e.g., 40%, e no entanto nun caso, o dano ser reparable e no outro, non. Polo tanto, estariamos falando de subpoboacins de varns con diferentes tipos de dano do DNA, mis que de valores absolutos de fragmentacin do DNA (lvarez e col., 2004). 4. Activacin de caspasas e endonucleasas espermticas. A activacin de caspasas e endonucleasas en espermatozoides diferenciados por factores fisicoqumicos pode inducir tamn fragmentacin do DNA espermtico. Estudos previos indican que a exposicin de espermatozoides de rato in vitro a 40oC resulta nun aumento significativo no grao de fragmentacin do DNA (Sailer e col., 1997). Mis recentemente, Banks e col. demostraron a inducin de fragmentacin do DNA en espermatozoides de rato in vivo tras ter sido expostos os testculos a unha temperatura de 42oC (Banks e col., 2005). Dado que a fragmentacin do DNA se encontrou en espermatozoides illados do epiddimo unha hora despois do estmulo. Os autores concluron que o dano observado tera que terse producido nos espermatozoides ao seu paso por epiddimo e que podera ser causado por radicais libres ou por activacin de caspasas e endonucleasas espermticas.
60
Tratamento da fragmentacin do DNA espermtico Baseado no exposto anteriormente dervase que o tratamento do estrs oxidativo epididimario con antioxidantes podera ser de gran utilidade hora de reducir, polo menos en parte, o dano do DNA espermtico e mellorar as taxas de embarazo en parellas de infertilidade. De feito, estudos previos (Greco e col., 2005) indican que o tratamento con vitaminas E e C reduce de forma significativa a fragmentacin do DNA espermtico. No entanto, estudos recentes indican que o uso a longo prazo deste tipo de antioxidantes pode danar a cromatina espermtica (Menezo e col., 2007), quizais debido a que se altera o equilibrio de xido-reducin nas clulas do epitelio epididimario onde a producin de radicais libres utilizada para a oxidacin das pontes disulfuro das protaminas da cromatina espermtica (Britan e col., 2006). Por outra parte, axentes antioxidantes tipo diclofenaco non parecen interferir con este equilibrio de xido-reducin e producen resultados satisfactorios a longo prazo. O mecanismo polo cal o diclofenaco prevn a fragmentacin do DNA espermtico independente do seu efecto anti-inflamatorio. No entanto, en casos de procesos inflamatorios/infecciosos no epiddimo, o efecto anti-inflamatorio do diclofenaco podera contribur a reducir o estrs oxidativo, xa que se demostrou que factores pro-inflamatorios poden magnificar de forma considerable a producin de radicais libres por parte de espermatozoides inmaturos (Saleh e col., 2002). Estudos previos indican que o diclofenaco acta como antioxidante a travs dun dobre mecanismo: (i) quelante de metais pesados que catalizan a reaccin de Haber-Weiss entre o anin superxido e o perxido de hidrxeno; e (ii) actuando directamente como scavenger do radical hidroxilo (Aruoma e Halliwell, 1988). A dose inicial de diclofenaco habitualmente utilizada de 50 mg cada 12 horas durante polo menos 4 semanas. Tamn se adoita combinar cun antibitico tipo doxiciclina (100 mg cada 12 horas durante das semanas) para tratar unha posible infeccin subclnica a nivel do epiddimo causada sobre todo por Ureaplasma e Chlamydia trachomatis (Gallegos e col., 2007). Unha vez que se levase a cabo este tratamento inicial, recomndase continuar o tratamento de diclofenaco cada das semanas para previr a fragmentacin do DNA espermtico que se poida producir a nivel post-testicular. A razn pola cal se establece un perodo de tratamento de das semanas est relacionada co tempo de trnsito dos espermatozoides polo epiddimo, que aproximadamente dunha semana. 0 semanas Control Diclofenaco 17,3 2,01 p=0,81
1
1 semana 17,8 1,8 12,0 0,9 p<0,01
4 semanas 18,5 2,2 12,4 0,6 p<0,01
8 semanas 19,2 1,9 11,5 0,6 p<0,01
18,0 2,20
Tboa 1. Efecto do diclofenaco nos niveis de fragmentacin do DNA espermtico valores representan a media a desviacin estndar
61
Conclusins O estrs oxidativo no epiddimo xoga un papel moi importante na fisiopatoloxa da infertilidade masculina. Os radicais libres, e en particular o radical hidroxilo, inducen dano do DNA tipo 8-OHdG e fragmentacin do DNA da cadea sinxela e cadea dobre, ademais da peroxidacin de fosfolpidos de membrana (lvarez e Storey, 1995). Este dano post-testicular pode ou ben previrse, polo menos en parte, mediante tratamento farmacolxico con antioxidantes ou ben mediante o uso de espermatozoides testiculares en combinacin con tcnicas de reproducin asistida (TESA-ICSI). Ademais, a seleccin de espermatozoides mediante columnas de Annexin V ou o uso de Confocal Light Absorption Scattering Spectroscopy (CLASS) vainos permitir nun futuro prximo poder seleccionar espermatozoides con baixos niveis de fragmentacin do DNA ou incluso coa cromatina intacta, respectivamente. BIBLIOGRAFA
Aitken, R.J., Gordon, E., Harkiss, D., e col. (1998). Biol. Reprod., 59, 1037-1046. lvarez, J.G. e Storey, B.T. (1995). Mol. Reprod. Dev., 42, 334-346. lvarez J.G, Ollero M., Larson-Cook K.L., e col. (2004). Fertil. Steril., 81, 712-713. Aruoma O.I., Halliwell, B. (1988). Xenobiotica,18, 459-470. Banks, S., King, S.A., Irvine, D.S., e col. (2005). Reprodution, 129, 505-514. Billig, H., Chun, S.Y., Eisenhauer, K., e col. (1996). Hum. Reprod. Update, 2, 103-117. Britan, A., Maffre, V., Tone, S., e col. (2006). Cell Tissue Res., 2, 1-10. Burrello, N., Arcidiacono, G., Vicari, E., e col. (2004). Hum. Reprod., 19, 2298-2302. Evenson, D.P., Jost, L.K., Marshall, D., e col. (1999). Hum. Reprod., 14, 1039-1049. Gallegos, G., Ramos, B., Santiso, R., e col. Fertil Steril. Greco, E., Scarselli, F., Iacobelli, M., e col. (2005). Hum. Reprod., 20, 226-230. Greco, E., Iacobelli, M., Rienzi, L., e col. (2005). J. Androl., 26, 349-353. Grunewald, S.D., Paasch, U., Glander, H.J. (2001). Cell Tissue. Bank, 2, 127-133. Lopes, S., Jurisicova, A., Sun, J.G., e col. (1998) Hum. Reprod., 13, 896-900. Lopes, S., Sun, J.G., Jurisicova, A., e col. (1998). Fertil. Steril., 69, 528-532. McPherson. S.M.G., Longo. F.J. (1992). Mol Reprod. Dev 31, 268-279. McPherson. S.M.G., Longo. F.J. (1993a). Devel Biol 158, 122-130. McPherson. S.M.G., Longo. F.J. (1993b). Eur J Histochem 37, 109-128. Menezo, Y.J., Hazout, A., Panteix G., e col. (2007). Reprod. Biomed. Online., 14, 418-421. Ollero, M., Gil-Guzman, E., Lpez, M.C., e col. (2001). Hum. Reprod., 16, 1912-1921. Pentikainen, V., Erkkila, K., Dunkel, L. (1999). Am. J. Physiol., 276, E310-E316. Sailer, B.L., Sarkar. L.J., Bjordahl, J.A., (1997). J. Androl. 18, 294-301. Sakkas D., Mariethoz, E., Manicardi, G., e col. (1999). Revi. Reprod. 4, 31-37. Sakkas, D., Moffatt, O., Manicardi, G.C., e col. (2005). Hum. Reprod., 20, 3446-3451. Steele, E.K., McClure, N., Maxwell, R.J., e col. (1999). Mol. Hum. Reprod., 9, 831-835. Suganuma R., Yanagimachi R., Meistricht M. (2005). Hum. Reprod., 20, 3101-3108.
62
Tesarik, J., Greco, E., Mendoza, C. (2004). Hum. Reprod., 19, 611-615. Twigg, J.P., Irvine, D.S., Aitken, R.J. (1998). Hum. Reprod., 13, 1864-1871.
63
OXIDACIN LIPDICA E AVALIACIN DE ANTIOXIDANTES

Edwin Frankel Universidade de California. Davis. EEUU Oxidacin producida polos radicais libres A oxidacin de aceites comestibles un problema importante para a industria alimentaria debido ao considerable aumento no uso de graxa e aceites polinsaturados que proceden de vexetais e peixes, feito este unido ao abandono do uso de antioxidantes sintticos e ao enriquecemento dalgns alimentos con ferro. A oxidacin dos lpidos provoca a aparicin de aromas e olores rancios en alimentos, e isto leva consigo unha diminucin na calidade nutricional e por conseguinte problemas de seguridade alimentaria debido formacin de produtos secundarios despois do procesado e tamn cociado. A oxidacin dos lpidos acontece mediante un mecanismo en cadea iniciado por radicais libres e no que se poden encontrar os seguintes procesos: iniciacin, propagacin e terminacin. Estas etapas constan a mido de complexas cadeas de reaccins (Figura 1).
Figura 1. Cinticas de oxidacin
1. Iniciacin. En presenza de iniciadores, os lpidos insaturados (RH) perden un tomo de hidrxeno, dando lugar a un radical libre. RH H + R 2. Propagacin. O radical alquilo dos lpidos insaturados reacciona moi axia co oxxeno molecular para formar radicais peroxilo. Esta etapa sempre moito mis rpida (k=107-9) que a seguinte reaccin de transferencia de hidrxeno cos lpidos
64
insaturados para dar lugar formacin de hidroperxidos (ROOH) que son produtos primarios das reaccins de oxidacin. Debido a que esta etapa lenta, e polo tanto limitante o secuestro de H dos lpidos insaturados, realzase de forma selectiva dende os enlaces hidrxeno mis dbiles.
R + O2 ROO ROO + RH ROOH + R
3. Terminacin. En presenza de altas concentracins de radicais alquilo e peroxilo interactan con outros para dar lugar a produtos non radicalarios, que se coece como reaccins de terminacin.
R + R Produtos non radicalarios ROO + R Produtos non radicalarios ROO + ROO Produtos non radicalarios
Oxidacin va radicais libres do oleato. O mecanismo clsico que describe a oxidacin do metal oleato leva consigo a captura dun tomo de H dos carbonos alilicos 8 e 11, o que d lugar a tres radicais carbn alilicos deslocalizados (Figura 2). De acordo a este mecanismo, o oxxeno ataca os carbonos terminais deses produtos intermedios dando lugar a unha mestura de catro hidroperxidos alilicos que conteen grupos OOH nos carbonos 8, 9, 10, e 11:
9-hydroperoxy-trans-10-octadecenoate (trans-9-OOH) 11-hydroperoxy-cis-9-octadecenoate (cis-11-OOH) 10-hydroperoxy-trans-8-octadecenoate (trans-10-OOH) 8-hydroperoxy-cis-9-octadecenoate (cis-8-OOH)
65
Figura 2. Oxidacin radicalaria do oleato
Oxidacin va radicais libres do linoleato. O linoleato aproximadamente 50 veces mis reactivo que o oleato, debido a que pose un grupo activo metileno di-alilico no carbono 11 entre dous dobres enlaces que poden perder un tomo de H moi doadamente. O secuestro do tomo de H na posicin 11 do carbono do linoleato d lugar a un radical pentadienilo hbrido que reacciona co oxxeno nas posicins finais do carbono 9 e 13 dando lugar a unha mestura de dous dienos conxugados (9 e 13 hidroperxidos) (Figura 3). A gran reactividade do linoleato debida formacin do radical intermedio pentadienilo que mis efectivamente estabilizado por resonancia e os dienos hidroperxidos producidos son as mesmo estabilizados por conxugacin. Os ismeros conxugados frmanse en concentracins equimolares para diferentes niveis de oxidacin. Estudos estereoqumicos mostraron que a formacin da mestura de 4 dienos conxugados hidroperxidos cis, trans e trans, trans.
9-hydroperoxy-trans-10, cis-12-octadecadienoate (ci, trans-9-OOH) 9-hydroperoxy-trans-10, trans-12-octadecadienoate (trans, trans-9-OOH) 13-hydroperoxy-cis-9, trans-11-octadecadienoate (cis, trans-13-OOH) 13-hydroperoxy-trans-9, trans-11-octadecadienoate (trans, trans-13-OOH)
66
Figura 3. Oxidacin radicalaria do linoleato
Inicialmente e a baixas temperaturas os ismeros cis, trans-OOH son os maioritarios. A proporcin de trans, trans-OOH aumenta co incremento da temperatura. Oxidacin va radicais libres do linolenato. O metilo linolenato teen dous grupos metilo dialilicos e reacciona co oxxeno das veces mis rpido que o linoleato. Linolenato aproximadamente das veces mis reactivo que o linoleato. De xeito anlogo ao mecanismo presentado para o linoleato, no caso do linolenato frmanse dous radicais pentadienilo por secuestro de tomos de H dos carbonos 11 e 14 situados entre os dienos 1,4 entre o carbono 9 e 13 nun lado e no carbono 12 e 16 do outro lado da molcula (Figura 4). A reaccin do oxxeno cos carbonos terminais de cada un dos radicais pentadienilo d lugar a una mestura de catro radicais peroxilo que d lugar aos correspondentes dienos conxugado 9-, 12-, 13- e 16-hydroperxidos contendo un terceiro dobre enlace cis illado.
9-hydroperoxi-trans-10, cis-12, cis-15-octadecatrienoate (trans, cis, cis-9-OOH) 13-hydroperoxi-cis-9, trans-11, cis-15-octadecatrienoate (cis, trans, cis-13-OOH) 12-hydroperoxi-cis-9, trans-13, cis-15-octadecatrienoate (cis, trans, cis-12-OOH) 16-hydroperoxi-cis-9, cis-12, trans-14-octadecatrienoate (cis, cis, trans-16-OOH)
67
Figura 4. Oxidacin radicalaria do linolenato
Unha anlise do linolenato autooxidado mostrou que as cantidades de 9- e 16-hidroperxidos foron aproximadamente das veces maiores que as de 12- e 13-hidroperxidos. Esta distribucin non equimolar dos hidroperxidos do linolenato foi atribuda tendencia do 12- e 13-radicais perxilo a unha rpida ciclacin dos radicais peroxilo para dar lugar a ciclacin nos carbonos 1 e 3 e posterior oxidacin que produce os hidroperxidos-5-epidioxido, como produtos maioritarios. Oxidacin radicalaria de cidos graxos poliinsaturados de cadea longa (PUFA). Os cidos graxos de cadea longa Omega 3 mis importante encontrados en aceites de peixe, algas e produtos marios son o cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentanoico (EPA), e o cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoico (DHA). De acordo ao mesmo mecanismo establecido para o linolenato, o EPA d lugar formacin de 8 hidroperxidos 5-, 8-, 9-, 11-, 12-, 14-, 15- e 18, mentres o DHA d lugar a dez 4-, 7-, 8-, 10-, 11-, 13-, 14-, 16-, 17- e 20. A oxidabilidade de cada PUFA duplcase por cada grupo metilo dialilico. Polo tanto a oxidabilidade do EPA aproximadamente catro veces maior que o DHA e 5 veces maior que o do linoleico (Figura 5). Utilizando esta regra pdese calcular a oxidabilidade de aceites vexetais dende o 9-10%-10 para aceite de oliva e palma, ata valores do 46-73%-73 para aceites de colza, algodn, soia e xirasol (Figura 6).
68
Fatty acids Relative rates 18:1 n9 1 18:2 n6 50 1 18:3 n3 100 2 18:4 n3,20:4 n6 3 20:5 n3 (EPA) 4 22:6 n3 (DHA) 5
PUFA Oxidizability = 2 X active CH2

12 9
Figura 5. Potencial de oxidacin calculado para cidos graxos insaturados
80 70 60 50 40 30 20 10 0
69 46
73 51
Oxidizability
10
nf lo we r
liv e O
yb ea n
Ca no l
So
Figura 6. Potencial de oxidacin de aceites vexetais: (% 18:2 x 1) + (% 18:3 x 2)
Co tto
Su
ns e
Pa lm
ed
69
O correspondente potencial de oxidacin dos aceites de peixe vara entre 110 ata 262% para diferentes aceites de peixe e algas (Figura 7).
300 262 250 Oxidizability 200 150 110 100 50 0 Canola Soybean Salmon Mackerel Tuna Algea 46 69 133 178
Figura 7. Potencial de oxidacin de cidos graxos poliinsaturados n-3: (18:2 x 1) + (18:3 x 2) + (20:4 x 3) + (20:5 x 4) + (22:6 x 5)
Descomposicin dos produtos de oxidacin Un grande nmero de compostos foron identificados como produtos de oxidacin de hidroperxidos do linoleato, inclundo dmeros, polmeros, produtos secundarios (epoxi-hidroperxidos) e voltiles (aldehdos, hidrocarburos, cetonas, esteres, etc.) como produtores de olores e flavores (Figura 8.).
70
Figura 8. Produtos de descomposicin de hidroperxidos do linoleato
A descomposicin por ruptura na posicin beta d lugar ao 2,4-decadienol a partir do hidroperxido de 9-linoleato e pentano fronte ao hexanal proveniente do hidroperxido 13-linoleato (Figura 9).
9
OOH R
2,4-Decadienal Pentane
OOH
13
Hexanal
Figura 9. Principais voltiles provenientes da descomposicin de hidroperxidos do linolato
71
A descomposicin d lugar a 2, 4, 7-decatrienal a partir do 9-linolenato hidroperxido, 2,4-heptadienal a partir do 12-linolenato hidroperxido, 2- ou 3-hexenal a partir de 13-linolenato hidroperxido, e propanal a partir de 16-linolenato hidroperxido (Figura 10).
!
9
OOH R
2,4,7-Decatrienal
OOH
12
OOH
13
2,4-Heptadienal
R
2- or 3-Hexenal
OOH
16
Propanal
Figura 10. Principais voltiles provenientes da descomposicin de hidroperxidos do linolenato
Antioxidantes 1. Mecanismos. Os antioxidantes inhiben as reaccins de iniciacin e propagacin que se producen durante os fenmenos de oxidacin. Para ser efectivos nesta interrupcin do proceso oxidativo os antioxidantes dan lugar a un radical estable A que reacciona lentamente cos lpidos LH (3) e rapidamente cos radicais perxilo LOO (4). A reaccin (5) desprezable a presin atmosfrica, pero pode chegar a ser importante en condicins de baixa presin de oxxeno e elevada temperatura. O radical antioxidante A podera reaccionar de novo con radicais perxilo para dar lugar a perxidos estables LOOA mediante a reaccin (6) ou dimerizarse con outro radical antioxidante para obter A-A de acordo reaccin (7). LH L + O2 LOO + LH LOO + AH L + AH L LOO LOOH + L LOOH + A LH + A (1) (2) (3) (4/4) (5)
72
A + LOO A + A
LOOA A-A
(6) (7)
2. Mtodos antioxidantes. As publicacins relacionadas cos antioxidantes publicadas dende os ltimos anos ata a actualidade son caticas e confusas. Unha mostraxe dos traballos publicados sobre antioxidantes na revista J. Agric. Food Chem. no ano 2003 revelou a seguinte multiplicidade de mtodos e terminoloxa usada polos diferentes autores. No ttulo: Antioxidante Total: 101 publicacins: mtodos por publicacin 1 mtodo: 35 2 mtodos: 25 3 mtodos: 9 4 ou mis: 11 Sen medida de antioxidantes (contido en fenois totais): 14 Terminoloxa usada: Propiedades antioxidantes, potencial antioxidante, capacidade antioxidante, actividade captacin de radicais libres, actividade bloqueadora de cadeas, actividade antiradicalaria, capacidade quelante, equivalentes trolox, capacidade equivalente vitamina C, capacidade captadora ou secuestrantes de radicais do oxxeno. O numero de publicacins que usan os seguintes mtodos presntanse a continuacin: 35: DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, absorbancia a 517 nanmetros 20: TEAC: capacidade antioxidante en equivalents trolox (ABTS.+ :2,2-azinobis(3ethylbenzothiazoline 6-SO3Na), absorbancia a 734 nanmetros 15: Oxidacin do cido linoleico ou oxidacin do metil linoleato: Absorbancia a 234 nanmetros para dienos conxugados 7: ORAC: (oxxeno radical absorbancia capacidad), AAPH (2,2-azobis(2-amidinopropane) diHCl induced oxidation, b-phycoerythrin fluorescence loss 10: Outros mtodos diferentes. Algunhas limitacins na avaliacin de mtodos antiradicalarios son: Non existencia dun substrato biolxico ou alimentario diana para protexer Uso inapropiado de substratos (cido linoleico, metilo linoleato,-phycoerythrin) Non especfico e unidimensional: non adecuados para antioxidantes multifuncionais
73
Uso de radicais artificiais e iniciadores azo que actan de diferente forma aos metais Non datos de composicin Interferencias doutros radicais e pigmentos de plantas Non existe informacin sobre os mecanismos (Tboa 1).
Phenolics (5 M GAE) Cyanidin Catechin Delphinidin Epicatechin Rutin Gallic acid Quercetin Malvidin Pelargonin % Inhibition LDL oxidation 79.4 74.9 71.8 67.6 67.6 63.3 61.4 59.3 39.0 TEAC mM Trolox 4.4 2.4 4.4 2.5 2.4 3.0 4.7 2.1 1.3 ORAC M Trolox 2.2 2.5 1.8 2.4 0.6 1.7 3.3 2.0 1.1
Inhibition of LDL oxidation (Our work 1996-1997) TEAC = Trolox equivalent antioxidant activity (Miller e col. 1993) ORAC = Oxygen radical absorbance capacity (Cao e col. 1993)
Tboa 1. Variacins significativas na actividade antioxidante indicados por diferentes autores utilizando diferentes mtodos.
Actividade interfacial no seo do fludo e emulsins Estudos con antioxidantes fenlicos de orixe sinttica mostraron que eran mis efectivos cando todas as posicins orto estaban substitudas ou cando un ou dous son substitudos por butilos terciarios (Figura 11). En estudos de fenmenos de interfases, comparamos a actividade de antioxidantes lipoflico (alfa-tocoferol e ascorbilo de palmitato) cos seus hidroflicos anlogos (Trolox e c. ascrbico) (Figura 12).
74
a. Antioxidantes sintticos e naturais

!
OH tBu tBu OMe OMe Me 2,6-di-tert-butylp-hydroxytoluene (BHT) OH OH OH But OH tBu
2- + 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole (BHA) OH tBu HO
OH Tert-butylhydroquinone (TBHQ)
Propyl Propyl gallate (PG)
Figura 11. Antioxidantes sintticos
HO
R
R R = H or Me Me Phytyl
HO
R
R Me COOH
O
Trolox
Phytyl =
-Tocopherol -Tocopherol -Tocopherol -Tocopherol
5,7,8-trimethyl 5,8-dimethyl 7,8-dimethyl 8-methyl
HO HO
O C O CH HO CH CH2-OH
HO HO
O C O CH HO CH CH2-O-Palm
Ascorbic acid
Ascorbyl palmitate
Figura 12. Antioxidantes naturais e derivados
b. Fenmenos interfaciais. O efecto de diferentes substratos ldicos ten un impacto significativo na actividade dos diferentes antioxidantes de acordo co seu carcter
75
lipoflico ou hidroflico. Polo tanto alfa- T un antioxidante lipoflico que se comporta de xeito diferente en varios substratos lipdicos debido ao seu cido carboxlico anlogo ao trolox, o cal hidroflico. No seo dunha disolucin formada por cido linoleico, metilo linoleato e triglicridos de aceite de millo, o trolox mellor antioxidante que alfa-tocoferol, pero a tendencia oposta obsrvase nunha emulsin aceite-auga do linoleato de metilo e aceite de millo, onde o trolox foi menos efectivo que o alfatocoferol. Non obstante en emulsins de cido linoleico tivo mellor comportamento que o alfa-tocoferol. O cido linoleico constite un substrato nico debido sa tendencia a formar micelas (Figura 13) Hydroperxido In Bulk systems: Linoleic acid Methyl linoleate Corn oil Linoleic acid Methyl linoleate Corn oil formation Trolx > -Toc Trolx > -Toc Trolx > -Toc Trolx > -Toc -Toc > Trolx -Toc > Trolx decomposition Trolx > -Toc -Toc > Trolx Trolx > -Toc Trolx > -Toc -Toc > Trolx Trolx >-Toc
In Emulsion systems:
Tboa 2. Actividade antioxidante de alfa-tocoferol e trolox en diferentes substratos lipdicos.
-Tocoferol e trolox mostran complexas propiedades interfaciais entre as interfases aceite-aire e aceite-auga que afectan significativamente as sas actividades relativas en diferentes sistemas lipdicos (Tboa 2). No seo do aceite o trolox (hidroflico) protexe mellor se est situado entre a interfase aire-aceite (Figura 13). Na emulsin o tocoferol (lipoflico) protexe mellor se est situado na interfase auga-aceite. Dada a sa tendencia a formar micelas, o cido linoleico non un lpido apropiado para testar antioxidantes debido a que o comportamento neste substrato significativamente diferente do de alimentos que estn compostos principalmente por triglicridos.
76
Bulk oil
Air Oil Air
Oil-in-Water Emulsion
Oil Water Hydrophilic

Very dilute In water phase
Hydrophilic
Oil-air interface Due to insolubility More protective
Lipophilic
Very dilute In oil phase
Lipophilic
Oil-water interface Due to surface Activity More protective
Figura 13. Esquema do paradoxo polar
c. Flavonoides. Os flavonoides son uns dos compostos con maior actividade antioxidante presentes nas plantas. A sa estrutura bsica consiste nun ncleo flavn con 2 aneis bencnicos (A e B), xunto cun oxxeno contido nun anel pirano (C) (Figura 14). As diferentes substitucins no anel C definen as diferentes clases de flavonoides, entre os que se inclen os flavan-3-ol, flavonois, antocianidinas e procianidinas que inclen oligomeros do flavan-3-ol. Outros flavonoides presentes en froitas conteen un gran e diverso nmero de glicsidos, provenientes da glucosilacin na posicin 3 e 7. Nos flavonoides cocense multitude de mecanismos antioxidantes: Secuestradores de radicais ROO , RO , HO , O2- , 1O 2 Inactivadores de ins metlicos Complexadores de protenas: encimas, ApoB do LDL, Metal binding sites of proteins Sinerxismo: reduce antioxidantes oxidados (cido ascrbico) Efectos de particionamento: localization at oxidation sites
77
Figura 14. Estrutura qumica dos flavonoides
d. Antioxidantes do romeu. A actividade antioxidante dos extractos comerciais de romeu est directamente relacionada co seu contido en dous diterpenos fenlicos: cido carnosico e carnosol, os cales tamn se encontran na salvia. O cido carnosico ten unha estrutura que consta de tres a seis aneis inclundo un anel fenlico dihdrico e un cido carboxlico libre (Figura 15).
Less polar
Least polar
Most polar
Figura 15. Estruturas dos compostos antioxidantes do romeu
O carnosol un derivado do cido carnosico que contn un anel de lactona. Nunha disolucin de aceite (bulk) de aceite de millo, o extracto de romeu, o cido carnosico, o cido rosmarinico e o -tocoferol foron significativamente mis activos que
78
o carnosol. Pola contra, en emulsins aceite-auga de aceite de millo, o carnosol foi significativamente mis activo que no aceite, mentres o extracto de romeu e o cido carnsico foron menos activos e o cido rosmarinico mostrou unha actividade prooxidante (Figura 16). Os compostos polares hidroflicos do romeu foron menos activos en emulsins debido sa tendencia a dividirse na fase acuosa, polo que protexen menos que no seo do aceite.
Figura 16. Inhibicin da formacin de hidroperxidos
e. Catequinas do t verde. Os extractos de te verde compense dunha complexa mestura de galatos de catequina, que inclen (+)-catequina (+)-galocatequina (-)-epicatequina (-)-epicatequina galato (-)-epigalo-catequina, e epigalocatequina galato (Figura 17). As catequinas do t mstra diferentes comportamentos en canto actividade antioxidante en diferentes sistemas lipdicos. En aceite de millo oxidado a 50 C, a epigalocatequina, epigalocatequina galato e epicatequina galato foron mellores antioxidantes que epicatequina e catequina. Non obstante na correspondente emulsin auga-aceite de millo, as catequinas do t foron prooxidantes, as como propil galato e cido glico. Pola contra, en liposomas de lecitina epigalocatequina galato foi o mellor antioxidante, seguido pola epicatequina, epigalo-catequina epicatequin galto e catequina.
79
!
HO
O
OH
OH HO
O
OH
OH OH HO
O
OH
OH
OH OH O-OC OH
OH
OH
OH
OH
(+)- Catechin (Cat) OH HO

O
(+)- Gallocatechin (GC) OH OH HO

O
OH Epicatechin gallate (ECG) OH HO

O
OH OH
OH OH
OH OH (+)- Epicatechin (Epi)
OH OH OH
OH OH OH
O-OC
(+)- Epigallocatechin (EGC)
Epigallocatechin gallate (EGCG)
Figura 17. Estrutura das catequinas do t verde
Triglicridos de aceite de millo (50oC): EGC = EGCG = ECG > EC > Cat Emulsin aceite de millo-auga (50oC): EC, Cat e catequinas do t: prooxidantes Liposoma de lecitina de soia (50oC): EGCG = ECG > Cat = EC; EGC: prooxidante Liposoma de lecitina de soia (37oC + acetato de cobre): EC = Cat > ECG; EGCG, EGC: prooxidante
O t verde mostrou actividade antioxidante en liposomas de lecitina de soia oxidada a 37 C en presenza do catalizador de cobre. Observouse unha maior inhibicin do hexanal que a formacin de hidroperxidos, o que suxire que as catequinas do t verde poderan actuar de forma efectiva inhibindo a formacin de radicais alquilo, que se forman como precursores de aldehidos. 4. Avaliacin de antioxidantes naturais. Anda que os antioxidantes naturais presentes en extractos de plantas son xeralmente multifuncionais, un amplo abano de mtodos unidimensionais desenvolvronse para avaliar a sa actividade, entre os que se inclen DPPH, TRAP, TEAC, ORAC, FRAP (Tboa 9.19, Lipid Oxidation, 2nd edition, px. 250). Desenvolvronse varios protocolos para medir a actividade antioxidante medida pola capacidade de captacin de radicais libres. Estes mtodos usan unha ampla variedade de sistemas xeradores de radicais libres e mtodos de inducin da oxidacin, as como medida do punto final da oxidacin. A validez destes mtodos pode ser cuestionable, debido a que non teen en conta a complexidade das accins antioxidantes. Debemos de realizarnos diferentes preguntas para dar validez a eses mtodos:
80
Cal o verdadeiro impacto de oxidacin nos alimentos? Problema: a metodoloxa cuestionable Uso de metodoloxa non especfica Cales son os efectos reais dos antioxidantes? Necestase informacin qumica especifica: Que substratos son inhibidos? Varios ensaios especficos son necesarios Oxidacin de lpidos, protenas e as sas interaccins con outros produtos Accesibilidade de substratos para oxidantes e antioxidantes Oxidacin e antioxidacin interfacial
Non existe unha sinxela aproximacin para determinar a actividade antioxidante en alimentos complexos. 5. Ensaios recomendados. A efectividade dos antioxidantes depende en boa medida do tipo de test no que se proben, do estado fsico dos substratos lipdicos, das condicins de oxidacin, do substrato oxidable, localizacin dos antioxidantes, mtodo empregado para avaliar a oxidacin e dun estado da oxidacin. A metodoloxa para avaliar os antioxidantes naturais debe ser coidadosamente interpretada de acordo ao sistema, metodoloxa analtica usada para determinar a extensin e o punto final da oxidacin. Para avaliar a capacidade antioxidante de cada composto deberase realizar baixo diferentes condicins de oxidacin, usando varios mtodos que midan diferentes produtos de oxidacin que estn relacionados coa calidade do alimento ou con reaccins biolxicas crticas. Os ensaios deberan considerar os seguintes parmetros:
1.
Substratos: usar substratos relevantes de alimentos e sistemas biolxicos, entre os que se inclen triglicridos e fosfolpidos en disolucin, en emulsins ou en sistemas liposmicos. Os cidos graxos libres deberan evitarse porque forman micelas nas cales os antioxidantes teen un comportamento diferente aos triglicridos Condicins: ensaios baixo diferentes condicins de oxidacin, inclundo diferentes temperaturas (por debaixo de 60C), catalizadores ou superficies de exposicin. Anlise: a medida de niveis de oxidacin relativamente baixos (por debaixo do 1%) e a inclusin tanto de produtos iniciais (hidroperxidos, perxidos, dienos conxugados) como secundarios (carbonilos, compostos voltiles).
2.
3.
81
4.
Concentracins: comparar antioxidantes coa mesma concentracin molar de compostos activos, relacionndoo coa estrutura. Con extractos crus de plantas sen purificar o contido total de fenlicos e datos de composicin son necesarios para comparar as mostras. Clculos: cuantificacin sobre a base do perodo de inducin, porcentaxe de inhibicin ou de velocidades de formacin ou descomposicin de hidroperxidos, I50 (concentracin de antioxidante necesaria para chegar a un 50% de inhibicin), T50 (tempo para alcanzar o 50% de inhibicin).
5.
BIBLIOGRAFA
Frankel, E.N., Meyer, A.S. (2000). J. Sci. Food Agric., 80, 1925-1941. Frankel, E.N. (2005). Lipid Oxidation. Second edition. The Oily Press, Bridgwater, England. (470 pxinas). Frankel, E.N. e German, J.B. (2006). J. Sci. Food Agric., 86, 1999-2001. Frankel, E.N. (2007). Antioxidants in Food and Biology. Facts and Fiction. The Oily Press, P.J. Barnes & Assoc., Bridgwater, Inglaterra. (266 pxinas). Frankel, E.N. e Finley, J.W. (2008). J. Agr. Tood Chem, 56, 49 - 4908.
83
ANTIOXIDANTES NATURAIS NOS ALIMENTOS RICOS EN CIDOS GRAXOS -3

Isabel Medina Instituto de Investigacins Marias-CSIC O msculo de peixe e os alimentos enriquecidos en aceites de peixe son unha excelente fonte de cidos graxos poliinsaturados -3 e o seu consumo relacionouse coa prevencin de risco cardiovascular e outras enfermidades. A elevada concentracin de cidos graxos poliinsaturados confire a estes alimentos un notable valor nutricional pero simultaneamente fainos extremadamente susceptibles a sufrir o ataque do oxxeno molecular e a oxidarse dando lugar formacin de voltiles de baixo peso molecular, responsables da deteccin organolptica da rancidez. A oxidacin lipdica unha complexa reaccin que transcorre mediante a xeracin de radicais libres lipdicos e que provoca unha serie de efectos indesexables no alimento como a formacin de aromas anmalos, modificacins na textura, ou perdas de vitaminas e oxidacin de pigmentos. Existe un interese claro por parte da industria dedicada conservacin e transformacin dos produtos pesqueiros en prolongar a sa vida til mediante o uso de mtodos e condicins idneas de almacenamento. Tales mtodos deben fomentar a aceptabilidade do produto sen supoer un elevado custo ao industrial. Un dos procedementos mis eficaces na prevencin da oxidacin dos alimentos graxos a utilizacin de antioxidantes. Trtase de substancias que son capaces de inhibir ou retardar o desenvolvemento da oxidacin ben porque actan impedindo que esta se inicie ou ben impedindo que esta se propague. Contriben a aumentar a vida til do alimento sen ocasionar unha deterioracin nutritiva ou sensorial, e o seu emprego en combinacin con outros mtodos de preservacin reduce os custos de conservacin. Anda que o emprego de antioxidantes alimentarios sintticos est permitido, as normativas internacionais tenden a restrinxir o seu emprego, e, en concreto, a UE prohibe a sa utilizacin en alimentos infants e aceites envasados. Actualmente os intereses da industria alimentaria e dos consumidores exixen a utilizacin de ingredientes ou aditivos naturais en substitucin dos denominados sintticos e existe unha necesidade clara de busca, recoecemento e aplicacin de antioxidantes extrados de fontes naturais. Isto manifestouse nos ltimos anos, no crecente interese na obtencin e purificacin de antioxidantes de orixe natural que est dando lugar a numerosos traballos de investigacin, patentes e proxectos de investigacin. Entre os principais antioxidantes naturais poden citarse os extractos polifenlicos procedentes de vexetais e froitas, os extractos de plantas como o t, especialmente ricos en catequinas, de especies como o romeu caracterizados pola presenza dos derivados do cido carnosoico, e de sementes de diversos froitos.
84
Este traballo presenta a aplicacin de das familias de compostos de orixe natural, os cidos hidroxicinmicos e os polifenois procedentes das uvas, na inhibicin da rancidez de alimentos enriquecidos en aceites de peixe e de alimentos que teen como base o msculo de peixe. A investigacin presenta os mecanismos que explican a efectividade destes compostos en funcin dos seus parmetros estruturais e propiedades fisicoqumicas e da interaccin destes compostos co propio msculo, tecido ou aceite. Os resultados obtidos mostraron unha significativa eficacia antioxidante dos cidos hidroxicinmicos. De maneira particular, o cido cafeico presentou a maior efectividade antioxidante, inhibindo a oxidacin de aceites e msculo de peixe. A sa elevada eficacia relacionouse coa sa capacidade de doar electrns e coa habilidade para reducir o radical -tocoferilo rexenerando -tocoferol no msculo a travs dun ciclo redox no que participa o cido ascrbico. Entre as procianidinas extradas do bagazo da uva, o grao de polimerizacin (nmero de residuos fenolicos) e o grao de galoizacin (grupos galato) mostraron unha relacin directa coa capacidade redutora, dicir a capacidade de ceder electrns. No entanto, os estudos sobre a eficacia antioxidante no msculo de peixe mostraron a existencia dun ptimo de polimerizacin a partir do cal non se consegua unha maior inhibicin da rancidez oxidativa. Un elevado nmero de residuos fenlicos pode inducir elevadas interaccins repulsivas que reducen a eficacia da quelatacin. Pola contra, un aumento no grao de galoizacin mellorou a eficacia das procianidinas no msculo e emulsins de aceites de peixe. Os estudos realizados en aceites de peixe puxeron de manifesto a importancia da polaridade na actividade inhibidora da oxidacin. Os resultados obtidos nesta investigacin evidenciaron que a incorporacin do antioxidante nos puntos activos onde ocorre a oxidacin un factor crucial na eficacia deste. A distribucin eficaz do antioxidante as como a sa interaccin co -tocoferol presente nas membranas son factores clave na inhibicin da oxidacin dos alimentos cun elevado contido en cidos graxos poliinsaturados -3. A posibilidade de incorporar compostos de orixe natural para estabilizar produtos enriquecidos en aceites de peixe ou produtos elaborados a base de peixe permite o deseo de alimentos funcionais que contean lpidos -3,. as como compostos antioxidantes.
BLOQUE II. ASPECTOS TOXICOLXICOS
87
AVALIACIN DA TOXICIDADE DE NOVOS COMPOSTOS ANTIOXIDANTES

Guillermina Font rea de Toxicoloxa. Universidade de Valencia A avaliacin da toxicidade de novos antioxidantes, posibles nutrientes ou non, pdese enfocar desde dous aspectos distintos: a posible utilizacin como aditivos alimentarios, ou ben a sa utilizacin como complementos alimentarios en alimentos enriquecidos e os denominados alimentos funcionais. Antes de que o uso dun aditivo sexa aceptado para a alimentacin, debe ser sometido a unha adecuada avaliacin toxicolxica. Unha vez que a necesidade tecnolxica e a valoracin para o consumo dos aditivos se estableceron, necestase coecer as implicacins sanitarias da utilizacin destes. Como aditivos, a avaliacin da toxicidade formlase de xeito clsico, dicir, tratando de descubrir os efectos adversos de pequenas concentracins, mentres que no caso dos nutrientes ou suplementos dietticos a avaliacin de riscos est asociada aos niveis mximos de inxesta. A metodoloxa de avaliacin do risco xorde en EEUU nas dcadas dos 70 e 80 do sculo pasado, e consta de varias etapas como son: a identificacin do perigo por avaliacin da toxicidade e a relacin da dose e a resposta, que xunto avaliacin da exposicin permitir a caracterizacin do risco e a partir desta informacin poderase levar a cabo a toma decisins, establecendo niveis tolerables ou aceptables dunha substancia. Na UE esta metodoloxa incorprase coa Directiva 93/67/CEE sobre avaliacin de risco de novas substancias, na sa dobre vertente de avaliacin toxicolxica (sade humana) e de avaliacin ecolxica (especies salvaxes e ecosistema). A continuacin presntanse as definicins dalgns termos comunmente usados na avaliacin de riscos: -Perigo: a posibilidade de que unha substancia, mestura de substancias ou procesos que involucran substancias baixo certas condicins de producin, uso ou disposicin causen efectos adversos nos organismos ou no ambiente, polas sas propiedades inherentes e de acordo co grao de exposicin. -Exposicin: a concentracin, cantidade ou intensidade dun determinado axente que incide nunha poboacin, organismo, rgano, tecido ou clula diana, usualmente expresada en termos cuantitativos de concentracin da substancia, duracin e frecuencia (para axentes qumicos e microbiolxicos) ou de intensidade (para axentes fsicos como a radiacin). O termo tamn se pode aplicar a unha situacin na cal
88
unha substancia pode incidir, por calquera va de absorcin, nunha poboacin, organismo, rgano, tecido ou clula diana. -Risco: a probabilidade de que ocorra un dano por un determinado txico; depende das caractersticas do txico e da exposicin. -Relacins entre dose-resposta e dose-efecto: En toxicoloxa establcese unha distincin entre as curvas de dose (ou concentracin)-resposta e de dose (ou concentracin)-efecto. A curva de dose-resposta pode ser definida como a expresin grfica da relacin entre a dose e a proporcin de individuos que experimentan un efecto do todo ou nada e esencialmente a representacin da probabilidade ou a proporcin dunha poboacin que presenta un efecto fronte a unha dose. Os exemplos tpicos de tales efectos totais ou nulos son a mortalidade ou a incidencia do cancro. En cambio, a curva de dose-efecto a expresin grfica da relacin entre a dose e a magnitude do cambio biolxico producido, medido en unidades apropiadas. Aplcase a cambios que se poden medir e que dan unha resposta gradual ao aumentar a dose dun xenobitico. -Caracterizacin do risco: a cuantificacin do risco despois de considerar a exposicin e a relacin dose-resposta (efecto). Defnese como a avaliacin, con ou sen modelo matemtico, da probabilidade e natureza dos efectos da exposicin a unha substancia, a partir da cuantificacin das relacins dose-efecto e dose-resposta para a poboacin e os compoentes ambientais que poden estar expostos e da medicin dos niveis de exposicin potenciais da poboacin, os organismos e o ambiente en risco. Avaliacin de riscos Este proceso un intento cientfico de identificar e estimar os riscos reais, e resulta da consideracin dos compoentes mencionados anteriormente: o perigo, a relacin dose-resposta (efecto) e a caracterizacin do risco. Pdese definir da seguinte maneira: a identificacin e cuantificacin do risco resultante do uso ou presenza dun axente qumico ou fsico; toma en conta tanto os posibles efectos danios nas persoas ou as poboacins que usan o dito axente na cantidade e da maneira recomendada, como as vas posibles de exposicin. A cuantificacin require, idealmente, o establecemento das relacins dose-efecto e dose-resposta nos individuos e poboacins obxectivo. Se despois dunha avaliacin de riscos chgase conclusin de que anda existe un risco inherente importante que non se pode reducir mis, psase ao manexo do
89
risco, onde a decisin de proceder ou non depende dunha combinacin de factores econmicos, sociais e polticos. O proceso completo de avaliacin toxicolxica de riscos consta de tres fases: avaliacin de riscos, xestin de riscos e comunicacin de riscos. Metodoloxas para a avaliacin da toxicidade A avaliacin da toxicidade faise de acordo con metodoloxas estandarizadas, propostas por comits de expertos internacionais [OMS, 1958; OMS, 1987; OCDE, 2003 (www.oecd.org/document), European Chemicals Bureau, 2004.(http://ecb.jrc. it/testing-methods)]. As tres categoras principais de informacin empregadas polas axencias internacionais para a avaliacin e regulacin son os estudos epidemiolxicos, as exposicins clnicas controladas e os estudos con animais. Os estudos das relacins estrutura-actividade sanse como soporte s tres categoras citadas e s ocasionalmente se utilizan como fonte primaria de informacin. Os ensaios de toxicidade en animais apianse en dous principios fundamentais: - Os efectos que o txico produce en animais de experimentacin son extrapolables a humanos. Sobre a base do peso corporal, os humanos son xeralmente mis vulnerables que os animais de experimentacin (por un factor corrector de 10). Tendo en conta estas diferenzas cuantitativas pdense calcular doses relativamente seguras en humanos utilizando factores apropiados. - A exposicin de animais de experimentacin a doses altas de axentes txicos un mtodo vlido para descubrir posibles riscos en humanos. Este principio basase nas curvas dose-resposta. O deseo de modelos experimentais require un pequeno nmero de animais en comparacin co tamao da poboacin exposta ao risco. Para obter resultados estatisticamente vlidos en grupos pequenos de animais necesario administrar doses relativamente altas, de maneira que o efecto apareza cunha frecuencia tal que sexa suficiente para ser detectado. O deseo experimental un aspecto clave nos estudos de avaliacin da toxicidade. A continuacin comntanse algns dos aspectos que se van considerar. 1. Propiedades fisicoqumicas da substancia que se vai estudar. Esta informacin imprescindible antes de iniciar calquera estudo toxicolxico. Permite definir as condicins de manipulacin e almacenamento da dita substancia, os modelos experimentais (va ou modo de administracin), explicar a aparicin dalgns fenmenos txicos e comprobar que a substancia estudada tea sempre as mesmas caractersticas. 2. Eleccin das especies. A pesar das similitudes dalgunhas especies co home, a extrapolacin sempre difcil. En xeral, rato, rata, cobaia, coello, can e mono
90
3.
4.
5.
6.
7.
son as especies mis utilizadas. A eleccin dunha determinada especie depende de varios factores: tipo de efecto toxicolxico que se vai estudar, dispoibilidade nun determinado momento, facilidade de manipulacin do animal, condicins de manutencin, farmacocintica e biodispoibilidade do produto ensaiado. As, por exemplo, para os estudos de administracin por va oral, cutnea ou por inhalacin prefrense os roedores e especialmente a rata. Para os estudos de toxicidade cutnea utilzanse o coello ou o porco. Para os estudos de toxicidade crnica en especies non roedoras sanse cans ou primates. Para os estudos de carcinoxnese utilzanse usualmente o rato e a rata, etc. Eleccin dos grupos. En xeral, utilzanse tres grupos tratados e un control. Estes grupos frmanse ao azar a partir de lotes de animais da mesma orixe, de idade e peso comparable e xeralmente de ambos os dous sexos. Nos estudos de longa duracin e de carcinoxnese acostmase a utilizar dous grupos control: un control negativo ao que non se lle administra nada ou s o vehculo de administracin do txico, e un control positivo que recibe unha substancia de referencia. Eleccin da va de administracin. No campo da seguridade dos alimentos normalmente utilzase a va oral. O produto pode administrarse mediante unha sonda esofxica ou estomacal (estudos curtos) ou mesturando o txico coa comida ou bebida (estudos de longa duracin). Eleccin das doses. Sempre moi difcil. Vara en funcin do estudo que se vai realizar. En estudos de toxicidade aguda sanse doses elevadas que produzan intoxicacins claras nos animais. En estudos de toxicidade crnica aditase empregar unha gama de doses que van desde doses baixas, que corresponden utilizacin normal no home, ata doses elevadas que producen efectos txicos na especie escollida. Duracin do tratamento. moi variable, dependendo do tipo de estudo que se vai realizar. Xeralmente os estudos realzanse de forma secuencial: comezan por experimentos curtos (das-semanas), logo de 3-6 meses e, en casos especiais, podemos ter estudos de 12 meses a 2 anos, e incluso mis nos roedores. Anlise estatstica dos datos. En cada ensaio os resultados obtidos somtense a unha anlise estatstica para determinar se a distribucin das respostas nos grupos tratados difire das obtidas no grupo control. Existen numerosos mtodos estatsticos para a anlise de resultados.
Tipos de estudos da toxicidade Na avaliacin toxicolxica utilzanse ensaios in vivo e in vitro. Para aprobar a utilizacin dos aditivos nos alimentos existen dos organismos encargados de realizar a avaliacin toxicolxica e a elaboracin de normas de identidade e pureza, as como a determinacin da sa inocuidade basendose nos estudos realizados en animais de
91
experimentacin, con diversas doses e perodos prolongados, estes organismos son o Comit de Expertos de aditivos dos alimentos, da FAO/OMS (JECFA) e o Comit Cientfico dos Alimentos (SCF) da UE. Todos os aditivos que aparecen na lista positiva foron previamente avaliados pola JECFA e polo CCAH. Cando os comits consideran insuficiente a informacin dispoible poden establecer ou non unha inxesta diaria admisible (IDA) provisional, e eventualmente recomendar os novos experimentos necesarios. Desde unha perspectiva sanitaria os aditivos alimentarios presentan un problema derivado do seu potencial accin txica e ser polo tanto necesario realizar unha serie de ensaios toxicolxicos para demostrar a sa inocuidade, como son ensaios de toxicidade aguda, de dose repetidas a curto e longo prazo, as como unha serie de ensaios especiais como estudos da funcin reprodutora, carcinoxnese, mutaxnese, etc. Ensaios da toxicidade aguda Estes estudos identifican os compostos extremadamente txicos e proporcionan informacin sobre a DL50 ou CL50, natureza dos efectos txicos e relacin doseresposta, riscos por exposicin a doses elevadas do txico (accidente, intento de suicidio, etc.) e as diferenzas entre especie e sexo. Cando se ensaian varias especies en ambos os dous sexos obtense informacin que pode ser til para predicir se a toxicidade mediada pola actividade hormonal ou para establecer se unha especie debe ser investigada mis exhaustivamente. Ademais, permiten ofrecer recomendacins sobre como levar a cabo os estudos toxicolxicos de mis longa duracin. sanse grupos homoxneos de animais (rato, rata, coello) que reciben doses crecentes do txico. A va de administracin , fundamentalmente, oral. Os animais obsrvanse durante 14 das. Aos animais que morren durante o estudo ou son sacrificados ao final fiselles necropsia. Durante o ensaio antanse os sntomas de intoxicacin, mortalidade, lesins dos rganos, e toda a informacin clasifcase por dose e sexo. Por unha frmula matemtica calclase a dose que provoca a morte do 50% dos animais. Anda que estes ensaios achegan informacin valiosa, teen varias limitacins. As, por exemplo, non indican os posibles efectos que apareceran despois dunha administracin reiterada do txico. Por outra parte, a DL50 unha variable aleatoria que se pode calcular por mtodos estatsticos, sen necesidade de utilizar un nmero excesivo de animais. Dos ensaios de toxicidade aguda obteense os ndices de toxicidade aguda, o mis empregado a DE50 (dose efectiva 50) que expresa a cantidade da substancia, en
92
mg/Kg, que en determinadas condicins experimentais (moi precisas) produce efectos no 50% dunha especie animal determinada. Cando o efecto buscado a morte flase de DL50 (dose letal media). Outros ndices de toxicidade aguda son a CE50, CL50, ou CI 50 (concentracin inhibidora). A DE50 e DL50 calclanse mediante mtodos grficos ou matemticos (estatsticos) a partir das curvas dose-resposta. De forma similar poden obterse os valores de DE1, DE99, DE90, etc. Hai que destacar o feito de que os valores de toxicidade refrense exclusivamente va de entrada (oral, drmica ou respiratoria) e especie para a que se determinaron. Anda que nos ltimos tempos se puxeron en entredito a validez e utilidade da DL50, este parmetro foi clasicamente utilizado como criterio de toxicidade para os efectos comparativos entre distintos txicos. De feito, a DL50 un criterio utilizado pola UE para a clasificacin e etiquetaxe de produtos qumicos como moi txicos, txicos ou perigosos. Ensaios da toxicidade de doses repetidas de curta duracin ou subcrnicos Proporcionan informacin sobre: efectos txicos principais e relacins dose-resposta, rganos diana implicados, reversibilidade ou irreversibilidade dos efectos precisando se son acumulativos ou retardados, as doses para os estudos de mis longo prazo, que un dos principais obxectivos destes ensaios. En xeral, consisten na administracin regular ou frecuente de varias doses ou concentracins da substancia estudada. Usualmente inclense tres niveis de doses: unha dose alta que produza toxicidade, unha dose baixa que non produza toxicidade e unha dose intermedia que permita calcular a relacin dose-resposta. As especies animais utilizadas son ratas, ratos (roedores) e can, mono (non roedores). A duracin do estudo de 14 das a 3 meses. Durante o estudo os animais somtense a observacin clnica (estado xeral, comportamento, etc.) e faise unha avaliacin do crecemento ponderal, consumo de auga e alimentos. Tmanse mostras periodicamente para realizar exames hematolxicos e bioqumicos en sangue, ourios e feces. Aos animais que morren ou son sacrificados ao final realzaselles a necropsia. Por anlise dos resultados obtidos deberanse establecer os valores de nivel mis baixo estudado con efecto observable e os niveis sen efectos observable. Ensaios da toxicidade de doses repetidas de longa duracin ou de toxicidade crnica Estes estudos tratan de detectar os efectos txicos que requiren un longo tempo de latencia ou que son acumulativos. Por iso son os nicos experimentos que permiten evidenciar determinadas afeccins cardacas ou renais nos animais estudados, de
93
aparicin a mido ligada idade. Proporcionan informacin sobre o tipo e natureza dos efectos txicos (funcins danadas, rganos diana), dose sen efecto txico (dose limiar), dose con efectos txicos, tempo de aparicin dos efectos txicos (en funcin da dose ou da concentracin), reversibilidade eventual dos efectos observados. Nestes ensaios adminstrase o txico de maneira reiterada a grupos de mamferos (roedores ou non roedores) en doses variables. En xeral, utilzanse 3 grupos tratados e 1 control (20-35/grupo/sexo, en roedores e 4-10/grupo/sexo, en non roedores). As doses elxense en funcin dos resultados obtidos nos experimentos de curta duracin e xeralmente utilzase a va oral. O conxunto dos resultados somtese a un exhaustivo estudo estatstico e deberase determinar o parmetro denominado NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) ou dose sen efecto que poderiamos definir como a dose mxima diaria (expresada en mg/Kg/da) que non produce efectos observables no animal considerado LOEL e LOAEL (Lowest Observed Effect Level e Lowest Observed Adverse Effect Level) que se expresa tamn en mg/kg/da e a dose mis baixa capaz de producir efectos adversos. O parmetro que se debe utilizar para fixar a dose diaria admisible (DDA) ou inxesta diaria admisible (IDA), dos lmites de tolerancia das substancias nos alimentos e na auga de bebida ou os valores lmite de exposicin o NOAEL. De igual maneira que nos ndices de toxicidade aguda os valores obtidos dependen da especie e as condicins experimentais utilizadas no estudo, as como da va de entrada do txico. Evidentemente para cada efecto considerado teremos uns valores de NOAEL, LOAEL, etc. Normalmente considrase unha exposicin crnica de 3 meses a 2 anos. O NOAEL sen ningunha dbida o parmetro toxicolxico mis importante xa que sobre el se apoia o clculo dos lmites tolerables de exposicin e as concentracins mximas permisibles. por iso que convn facer algunhas consideracins sobre o concepto e o clculo deste. importante facer unha observacin sobre o clculo do NOAEL. O NOAEL debe ser, por definicin, unha das doses experimentais probadas. dicir, que a diferenza da DL50, aqu non se debe facer unha extrapolacin a partir dunha serie de datos. O NOAEL/LOAEL debe ser unha das doses usadas no estudo. Na prctica determnase utilizando unha serie de concentracins decrecentes e elxese aquela que non produce efectos adversos observables. s veces por moito que se dimina a dose sempre obtemos un efecto adverso sendo imposible establecer un NOAEL. Neses casos a dose mis baixa que produce un efecto adverso tmase como LOAEL. Polo tanto, o valor do NOAEL ou LOAEL un valor observado que depende do protocolo
94
e do deseo da investigacin. Entre os factores estudo-dependentes que poden influr na magnitude do valor observado podemos citar a especie, o sexo, a idade, o tamao do grupo, a sensibilidade dos mtodos utilizados para medir a resposta e a seleccin dos niveis de dose, xa que con frecuencia estn moi espazadas, de maneira que o valor observado do NOAEL pode ser, nalgns casos, considerablemente menor que o verdadeiro nivel de efecto non adverso. Lmites tolerables de exposicin O lmite tolerable de exposicin representa a dose (expresada en mg/Kg/da) dun produto que pode ingresar no organismo diariamente, durante toda a vida, sen que resulte prexudicial para a sade. Despois de considerar todos os estudos toxicolxicos dispoibles sobre unha substancia, elxese o NOAEL caracterstico mis baixo. Dselle a primeira prioridade aos estudos realizados en seres humanos; os efectuados con animais xeralmente serven para complementalos. No entanto, a maiora das anlises basanse en estudos de mamferos non humanos. Tamn se d por sentado que calquera efecto txico polo xeral independente da ruta de exposicin. Cando posible, considranse estudos toxicocinticos relativos substancia, o que podera ser significativo na seleccin dos conxuntos de datos claves usados para estimar o NOAEL. Por exemplo, a seleccin dun NOAEL apropiado para animais pdese basear nas semellanzas entre a toxicocintica humana e animal. Cando non posible decidir cal das especies ten caractersticas mis pertinentes para o ser humano, elxense os resultados das mis sensibles substancia. Logo, sase o NOAEL para determinar a dose de referencia (RfD) mediante o uso de factores de incertidume (FI) que reflicten a confianza xeral nos diversos conxuntos de datos. Nalgns casos, sanse factores de modificacin (FM), baseados no criterio cientfico. En toxicoloxa alimentaria o criterio bsico de lmite tolerable de exposicin denomnase a dose diaria admisible (DDA) ou ADI (Aceptable Daily Intake): A DDA utilizada pola OMS para os pesticidas e aditivos. Defnese como a dose dun produto que pode ser inxerido diariamente por un individuo durante toda a sa vida sen risco apreciable para a sa sade. Exprsase en mg/Kg/da. A DDA fxase a partir de ensaios experimentais con animais sobre a toxicidade aguda e crnica (investigando eventuais efectos mutxenos, teratxenos e cancerxenos). Considrase o efecto mis sensible na especie animal mis sensible. Determnase a cantidade mxima que a dita especie animal pode inxerir diariamente, durante o tempo da experiencia, sen efecto nocivo, NOAEL crnico. Para extrapolar o home (que se considera a especie mis sensible e vulnerable) divdese a dose establecida para o animal por 10, e para inclur as variacins individuais e os casos especiais (embarazadas, nenos, ancins, etc.) divdese de novo por 10. En definitiva e, de
95
forma xeral, a DDA a centsima parte do NOAEL (expresada en mg/Kg de peso e da). sase polo tanto un factor de seguridade ou incerteza para englobar diferenzas inter e intraespecficas. En caso de non existir datos concluntes sobre os estudos de toxicidade pdense usar factores mis altos. As, por exemplo, o LOAEL sase cando non existe un valor de NOAEL, anda que en tal caso sase un factor de seguridade adicional ao facer os clculos (10). Hai que ter en conta que a DDA asome un consumo durante toda a vida, polo que para o clculo hai que usar o NOAEL crnico. Se, por exemplo, o NOAEL se obtivo nun estudo subcrnico (90 das) hai que aplicar outro factor adicional de 10 (10). A EPA introduciu un quinto factor de incerteza UFD cando se trata con bases de datos incompletas, como non dispoer de datos de dous estudos de doses repetidas en mamferos, un multixeneracional e dous de toxicidade do desenvolvemento. Se os cinco estudos estn feitos hai bastante confianza de que polo menos nun se obtivo o NOAEL mis baixo posible. A aplicacin matematicamente queda: DDA= LOAEL ou NOAEL/ UFs O uso de todos podera chegar a 100.000 e isto pouco realista e se teen en conta factores de modificacin, por exemplo se un estudo se realizou con moitos animais, isto dimine a incerteza. Concentracins mximas permisibles A concentracin mxima permisible (CMP) a concentracin mxima dun txico (expresada en mg/Kg ou mg/L) que se permite nun medio determinado (alimento, auga). A partir dos valores da DDA (ou calquera dos outros parmetros equivalentes) pdense establecer as Concentracins Mximas Permisibles (CMP) nun alimento ou bebida, que se expresan como mg/Kg do produto fresco ou por litro do produto lquido. Estes valores calclanse a partir da DDA tendo en conta o peso medio dunha persoa, a cantidade media inxerida por da e a contribucin dese produto ao total da dieta. Para o clculo das concentracins mximas permisibles necesario coecer o consumo diario do alimento en cuestin ou da bebida considerada. Estes datos pdense obter das enquisas de consumo que se realizan nos diferentes pases. Os lmites tolerables de exposicin e as concentracins mximas permisibles son os valores de referencia que constiten a ferramenta bsica para a avaliacin do risco.
96
Conclusins Os valores de inxestas diarias admisibles (IDAs) usronse durante mis de 40 anos, establecidas por comits cientficos e demostraron ser tiles para previr efectos txicos, coas nicas excepcins dos nenos menores de doce anos ou persoas alrxicas. As avaliacins da inxesta proporcionan unha sobreestimacin da inxesta real ou que combinado coas IDAs, establecidas coas marxes de seguridade, aseguran unha boa proteccin dos consumidores. O establecemento das IDAs co refinamento das tecnoloxas continuar proporcionando parmetros que se van utilizar no sculo XXI. BIBLIOGRAFA
Beck, B.D., Calabrese, E.J., Slayton, T.M., Rudel, R. (2008). En: Principles and Methods of Toxicology, Fifth Ed (Ed) Hayes AW, CRC Press, New York. Benford, D. (2000). International Life Sicences Institute (ILSI series), Bruxelas. FAO/WHO. (2006). Report issued (Internet) on 13 January Fernndez-Pachn, M. S., Garca, M.D., Morales, M.L., Troncoso, A.M. (2006). En: Toxicologa Alimentaria (Ed) Camean, A., Reppeto, M., Madrid, 453-452. Lpscomb, J.C., Ohanian, E.V. (2007). Informa Healthcare, New York. Pla, A., Hernndez, A., Gil, F. (2006). En: Toxicologa Alimentaria (Ed) Camean, A., Reppeto, M., Daz de Santos, Madrid, 77-94. PNUMA/IPCS. (1999). Evaluacin de riesgos humanos. Repetto, G., Del Peso, A., Zurita, J.L. (2006). En: Toxicologa Alimentaria (Ed) Camean, A., Repetto, M., Daz de Santos, Madrid, 95-121. Ruiz, M.J., Font, G. (2007). En: Micotoxinas en Alimentos. (Ed) Soriano del Castillo, J. M., Daz de Santos, 15-27. Vilanova E. (2006). En: Toxicologa Alimentaria (Ed) Camean, A., Repetto, M., Daz de Santos, Madrid, 123-140.
97
ACCIN PROTECTORA DE ANTIOXIDANTES FRONTE TOXICIDADE DE DIOXINAS E PCBs

Csar Ordez Pascia Dpto. Ciencias Biomdicas. Facultade de Veterinaria. Universidade de Len Co nome DLCs agrpanse compostos de tipo dioxinas, furanos e PCBs caracterizados todos eles por ser de tipo organoclorado e organobromado e tendo un alto nmero de conxneres cada uns destes grupos. A historia dos efectos contaminantes destes compostos remntase a finais dos anos 40, cando traballadores das fbricas de herbicidas clorados de Monsanto empezaron a desenvolver eccemas na pel, dores nas pernas e articulacins, debilidade, irritabilidade, nerviosismo e perda da libido. Con posterioridade o exrcito de Estados Unidos utilizou cantidades masivas de herbicidas defoliantes (axente laranxa) sobre as selvas de Vietnam. Os estudos epidemiolxicos posteriores estableceron a causalidade entre os niveis de dioxinas que contaminaban as formulacins e determinadas patoloxas (Dwyer e Flesch-Janys, 1995). A emisin de dioxinas mis coecida produciuse en Meda ao norte de Seveso (Italia) en 1976. A planta industrial de ICMESA da empresa Hoffman-A Roche liberou accidentalmente unha nube txica que contia 500 g de DLCs. O vento do sueste produciu numerosas vtimas entre os animais domsticos e obrigou a evacuacin de mis de 700 persoas. Os gases emitidos produciron vtimas mortais, as como a aparicin de casos de embriotoxicidade que se traduciron en malformacins conxnitas (Pesatori e col., 2003). Recentemente producronse alertas alimentarias por contaminacin de dioxinas en distintos pases. En febreiro de 1999 aparece en Blxica un episodio relacionado, de novo, coa contaminacin de alimentos destinados ao consumo humano. Nesta ocasin a orixe encontrbase na contaminacin de pensos destinados ao cebado de polos que contian residuos de PCBs e PCDD/Fs que excedan en mis de 250 veces os niveis de tolerancia. As denuncias recentes de alimentos de procedencia animal (polos, porcos, salmns) contaminados con dioxinas, como consecuencia da utilizacin de pensos que conteen graxas de orixe industrial contaminadas con estas substancias, reavivaron a polmica sobre a toxicidade e o risco de exposicin a estes compostos, as como o da seguridade qumica dos nosos alimentos.
98
Estrutura qumica e propiedades fisico qumicas O ncleo central das dioxinas a dibenzo-para-dioxina. Os derivados clorados deste ncleo (conxneres) denomnanse xenericamente dibenzodioxinas policloradas (PCDDs), e entre elas a 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) a molcula de referencia do grupo. Xunto s dioxinas propiamente ditas, existen outros grupos de substancias quimicamente relacionadas que estn asociadas s primeiras desde un aspecto toxicolxico. Os dibenzofuranos policlorados (PCDFs) e os bifenilos polihaloxenados, tanto nas sas versins cloradas (PCB) ou bromadas (PBB) presentan caractersticas estruturais e toxicolxicas moi parecidas, polo que sern considerados de forma semellante ao longo deste captulo.
(9)
(1)
(9)
(1)
(8)
O O
(6)
X X
(4)
(2)
(8) X
X (2)
(7) X
(3)
(7) X (6)
O X
(4)
X (3) X
Dibenzodioxinas policloradas (PCDDs) C l C l O O C l C l
Dibenzofuranos policlorados (PCDFs) C l C l O C l C l
2,3,7,8 tetraclorodibenzodioxina
2,3,7,8 tetraclorodibenzofurano
Figura 1. Estrutura qumica xeral dos compostos dioxnicos (DLCs), dioxinas policloradas (PCDDs) e furanos policlorados (PCDFs). Como exemplo a figura presenta as estruturas dos derivados tetraclorados mis representativos de cada serie
Entre as sas caractersticas fisico qumicas mis relevantes destacan a sa elevada liposolubilidade e a sa gran estabilidade qumica e trmica. Os PCBs con comportamento tipo dioxina (Figura 2) conteen entre catro e seis tomos de cloro substitudos en posicins para- e meta- (PCB non-orto ou PCBs coplanares). Anda que estrutural e toxicoloxicamente difiren destes, os conxneres mono-orto substitudos adoitan inclurse dentro deste grupo.
99
Cl Cl
A
X X
orto
B
X X
orto
Cl Cl
X
meta para meta
X X
3,3,4,4 tetraclorobifenilo (CB77) Cl Cl Cl Cl Cl
Bifenilos policlorados (PCBs)
2,3,3,4,4 pentaclorobifenilo (CB105)
Figura 2. Estrutura qumica xeral dos bifenilos policlorados (A), as como dos exemplos de PCBs coplanares con estrutura non-orto (B) e mono-orto substitudas (C). X adoita ser un tomo de cloro, anda que pode ser Br no caso dos bifenilos polibromados (PBBs)
Os conceptos de I-TEF e I-TEQ A cuantificacin de PCDD/Fs precisa dun tratamento especial coa fin de ter en conta o grao e orde de cloracin entre os diferentes conxneres. A finalidade obter o potencial toxicolxico destes compostos cando se encontran nunha mestura. En mostras reais os DLCs non se encontran por separado, senn como unha mestura de conxneres con diferente toxicidade. Con este fin introduciuse en 1988 o factor de equivalencia txica (I-TEF) que est baseado en dous supostos: (1) todos os compostos clorados en posicin 2,3,7,8 teen o mesmo mecanismo de accin (en termos cualitativos), anda que o seu potencial txico pode variar dun a outro, e (2) a resposta txica dunha mestura destas substancias o resultado da suma do comportamento de cada unha delas por separado. Baseados nestes dous principios pdese asignar un valor de I-TEF a cada composto independentemente. Xa que o composto mis txico o 2,3,7,8-TCDD, asignuselle o valor arbitrario de 1, sendo o resto fraccins deste (Tboa 1). Xunto co concepto de I-TEF introduciuse o termo de cantidade de equivalencia txica (I-TEQ) que resulta de multiplicar a concentracin de cada un dos conxneres polo seu correspondente I-TEF e sumalos todos nunha mestura. Desta maneira, a toxicidade real dunha mestura de PCDD/Fs exprsase como a suma dos I-TEQs dos seus 17 conxneres, obtendo un valor indicativo. Recentemente a OMS propuxo un novo concepto de I-TEQ que incle os factores de equivalencia para PCBs coplanares (Van den Berg e col., 1998).
100
PCDFs
2,3,7,8-TCDF 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF
I-TEF
0,1 0,05 0,5 0,1 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01
PCDDs
2,3,7,8-TCDD 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,2,3,4,,6,7,8-HpCDD
I-TEF
1 0,5 0,1 0,1 0,1 0,01 0,01
OCDF
0,01
OCDD
0,001
Os prefixos T = tetra; Pe = penta; Hx = hexa; Hp = hepta e O = octa indican o grao de cloracin dos conxneres. Tboa 1. Factores de equivalencia txica (I-TEF) dos 17 conxneres PCDDs e PCDFs
Fontes de formacin e exposicin a DLCs Salvo os PCBs, os PCDD/Fs son subprodutos non intencionados da combustin incompleta da materia orgnica, xa sexa de fontes naturais (incendios forestais) ou antropoxnicas (incineracin de lixos) (Tuppurainen e col., 2003). Os procesos industriais (fabricacin de papel ou de produtos qumicos) e biolxicos tamn contriben en menor conta sa liberacin ao ambiente. No entanto, debido resistencia dos PCBs a elevadas temperaturas utilizouse masivamente desde os anos 30 na fabricacin de transformadores, capacitadores e fludos hidrulicos, ata a sa prohibicin en 1977. A pesar da sa prohibicin, a exposicin a PCBs anda existe, debido sa elevada persistencia no aire, solos e sedimentos acuosos. Ademais anda forman parte de vellos dispositivos elctricos, luces fluorescentes e electrodomsticos antigos que anda seguen en uso. A fonte mis importante de liberacin de DLCs ao medio a incineracin de residuos slidos (lixo municipal slido, medicamentos e refugallos mdicos, residuos perigosos, etc.), a queima de combustibles fsiles (carbn e derivados do petrleo), as como os incendios accidentais incontrolados (incendios forestais, erupcins volcnicas, etc.). A elevada persistencia ambiental das dioxinas pode incrementarse ao permanecer ligadas a substratos orgnicos ou inorgnicos que serven como reservorios. Os DLCs son compostos estables e moi resistentes maiora dos procesos de degradacin ambiental. Os procesos de transformacin dos DLCs comprenden a fotoxidacin atmosfrica mediada por radicais libres, a fotlise no aire, solo e auga e a biodegradacin polos microorganismos do solo.
101
Toxicocintica A absorcin prodcese ao longo do tracto gastrointestinal. A velocidade de absorcin depende do grao de cloracin destes. Desta maneira os derivados hepta- e octo-substitudos son absorbidos mis lentamente que os que teen un menor grao de cloracin. Debido sa alta liposolubilidade prodcese unha rpida redistribucin orgnica, unidos a protenas plasmticas, concentrndose finalmente en tecidos graxos: tecido adiposo > SNC > fgado > graxa subcutnea. Unha vez acumulados nos depsitos graxos a sa biodispoibilidade orgnica acostuma ser moi baixa. Todos estes compostos son moi estables e sofren unha metabolizacin continua pero moi lenta. O aclaramento destes compostos depende do conxnere, de modo que o grao de cloracin favorece a sa acumulacin no organismo. A eliminacin pode ser urinaria ou biliar, de maneira que pode aumentar a sa biodispoibilidade orgnica ao sufrir sucesivos ciclos enterohepticos. Mecanismo de accin A semellanza dos efectos txicos causados polos PCDD/Fs e PCBs coplanares sustentan a hiptese de que estas substancias teen un mecanismo de accin comn. A unin e activacin do receptor citoslico AhR (receptor hidrocarburo de arilo ou receptor de dioxina) por estes compostos, e a inducin de xenes nucleares especficos de resposta a dioxinas, a hiptese actual de traballo (Figura 3). O receptor AhR un factor de transcricin que acta unha vez que se uniu un ligando ao seu centro activo funcionando como un sensor biolxico de sinais externos e internos (Bock, 1994).
102
Figura 3. A maora dos efectos do TCDD son mediados pola sa unin ao receptor citoslico AhR (1). A formacin do complexo de estabilizacin coas protenas HSP90 e XAP2 (2) permite a sa traslocacin nuclear (3) onde formar un heterodmero coa protena ARNT (4), cuxa unin aos elementos de resposta a dioxinas (ERDs) xenmicos (5) aumenta a transcricin dos xenes presentes corrente abaixo
Os DLCs e outras substancias semellantes nense reversiblemente ao receptor AhR que ten que ser previamente estabilizado no citoplasma por unha protena de 90 kDa (HSP 90) e pola chaperona XAP2. Este complexo estabilizado desprzase cara ao ncleo celular coa axuda dunha importina onde o AhR queda libre unndose a un translocador nuclear (ARNT). O heterodmero AhR/ARNT identifica certas rexins do ADN cromosmico denominadas Elementos de Resposta a Dioxinas (ERDs), e induce a transcricin dos xenes situados corrente abaixo, entre eles diferentes isoencimas CYP1A1 con actividades hidrocarburo aromtico hidroxilasa (AHH) e etoxiresorufina O-desetilasa (EROD) (Figura 4).
103
Figura 4. Posibles consecuencias da expresin dos xenes ligados aos elementos de resposta a dioxinas (ERDs), relacionados co metabolismo de xenobiticos
O receptor AhR est presente nos tecidos de multitude de especies animais cun elevado grao de conservacin filoxentica (Hahn, 2002) e estruturalmente semellante aos receptores citoslicos para esteroides. No entanto, ningunha hormona ten capacidade de unirse a este receptor, nin reciprocamente, os derivados clorados teen afinidade polos receptores esteroideos. A unin dos PCDDs ao receptor AhR non garante unha resposta biolxica. Deste modo, os hidrocarburos aromticos policclicos, flavonas substitudas e cumarinas poden unirse ao receptor AhR, pero non producen os seus efectos txicos e son axia metabolizados. Toxicidade Mentres que os PCDD/Fs se encontran entre os compostos de orixe antropoxnica mis txicos a dose nica, non ocorre as cos PCB.
104
1. EFECTOS DRMICOS
Cloracn Hiperqueratose Hiperpigmentacin Elastose
4. EFECTOS SISTMICOS
Fibrose heptica suave Incremento das transaminasas sricas Hipercolestereolemia
2. EFECTOS NEUROLXICOS
Hipertrigliceridemia Alteracins sexuais Apetito reducido e perda de peso Dores de cabeza Neuropatas Problemas dixestivos Alteracins visuais Dor en msculos e articulacins Diminucin dos sentidos do odo e do Glndulas linfticas inchadas olfacto Problemas cardacos 3. EFECTOS PSICOLXICOS Alteracin do soo Depresin Enerxas reducidas Arranques de mal humor Problemas do tracto urinario Dificultades respiratorias Problemas pancreticos
Tboa 2.Signos e sntomas da exposicin a elevadas concentracins de TCDD en humanos
En animais de experimentacin, a morte prodcese despois dunha progresiva perda de peso acompaada por unha reducin drstica do consumo de alimento. Os efectos somticos son moi semellantes en todas as especies estudadas, independentemente da sa susceptibilidade e inclen neuropata perifrica, fatiga, depresin, cambios da personalidade, adelgazamento, hepatite, hepatolia, porfiria cutnea tarda e erupcins cutneas acneiformes (Mukerjee, 1998). Os efectos agudos da intoxicacin son unha consecuencia da interaccin das dioxinas co receptor AhR. Ratos transxnicos nos que se anulou o xene codificante do receptor AhR (ratos AhR-) son 10 veces menos susceptibles administracin de TCDD (DL50 = 2000 g/kg de peso corporal), non presentando ningn dos sntomas de intoxicacin descritos con anterioridade (Gonzlez e Fernndez-Salguero, 1998). Non entanto, son os efectos a longo prazo, os que resultan mis perigosos e difciles de controlar (Hays e Aylward, 2003). Entre os efectos mis relevantes inclense: cloracn, inmunotoxicidade, hepatotoxicidade carcinoxenicidade e efectos embriotxicos e da reproducin e inducin do estrs oxidativo. Dioxinas, PCBs e furanos estrs oxidativo e antioxidantes O estrs oxidativo pode definirse como unha alteracin no sistema antioxidante, o cal non capaz de contrarrestar adecuadamente os radicais libres e as especies reactivas do oxxeno (ROS) e deter as reaccins en cadea de peroxidacin lipdica
105
Entre os principais mecanismos de toxicidade das dioxinas e os seus bioisosteres est o estrs oxidativo que pode ser a causa do dano tisular producido pola exposicin a estes compostos. Distintos estudos demostraron que tras a administracin de doses agudas de TCDD a animais de experimentacin indcense ROS, probablemente a travs da interaccin co receptor AhR (Bagchi e Stohs, 1993; Alsharif e col., 1994b), peroxidacin lipdica (Stohs e col., 1983, 1990; Mohammadpour e col., 1988) e dano no ADN (Wahba e col., 1988; Stohs e col.,1990) e decrece a fluidez da membrana e o glutatin heptico, ademais de noutros tecidos (Stohs e col., 1990). Estudos posteriores demostraron incrementos significativos na producin de anin superxido en fgado aumentando tamn a peroxidacin lipdica, ademais de supresins significativas nos niveis de glutatin e de alfa-tocoferol (Slezak e col. 1999) tras a exposicin a estes compostos. Efecto protector dos antioxidantes fronte a dioxinas Para evitar a accin dos radicais libres, as clulas dos mamferos posen sistemas de defensa antioxidante tanto de natureza encimtica como non encimtica. Se consideramos o dano oxidativo como unha posible consecuencia da exposicin s DLCs, a incorporacin na dieta de axentes antioxidantes deberan exercer un efecto protector, existen estudos que demostran o efecto beneficioso dos antioxidantes fronte toxicidade das dioxinas. En ensaios realizados con animais de experimentacin pidose observar como aqueles animais pretratados con Butil Hidroxi Anisol (BHA), coecido antioxidante de orixe sinttica, resistan doses letais de TCDD, debndose este efecto protector non s ao seu efecto antioxidante (Stohs e col., 1984; Hassan e col., M.Q. 1987). Outros antioxidantes como a vitamina A e E non obstante exercen unha proteccin limitada contra a toxicidade destes xenobiticos (Alsharif e Hassoun, 2004). Conclusins, evolucin e riscos futuros Diminur a exposicin a residuos de DLCs na dieta como resultado da restricin das fontes de liberacin ambiental o obxectivo prioritario das administracins europeas. A drstica reducin nos ltimos 30 anos unha consecuencia do descenso substancial na exposicin aos ditos compostos (estmase que entre un 90-95% desde finais dos anos 60 e comezos dos 70). Xa que as cargas corporais diminuron significativamente neste perodo, as previsins para os prximos anos non tern o impacto das dcadas anteriores. Estimacins feitas ata o ano 2030 suxiren que incluso unha reducin de 10 veces nos valores actuais de exposicin (unha diminu-
106
cin pouco posible basendose co coecemento actual das fontes de contaminacin por DLCs en alimentos) afectara s marxinalmente a os niveis sricos destes compostos. Un estudo comparativo da evolucin da carga ambiental e corporal de DLCs nos ltimos 70 anos demostrou que ambos os dous parmetros diminuron drasticamente nos ltimos 30 anos e que tal cada continuar nun futuro prximo sen ningunha necesidade adicional de medidas reguladoras (Aylward e Hays, 2002). Desde os anos 70, as emisins de dioxinas desde fontes cuantificables vertedoiros, incineradores e combustin de gasolinas con chumbo- diminuron drasticamente e as seguir no futuro prximo. Os datos toxicocinticos para o TCDD indican que a inxestin desta dioxina diminuu en mis dun 95% desde os niveis anteriores a 1972 e que a inxesta para todos os demais conxneres diminuu polo menos en 10 veces neste mesmo perodo. Reflexo da diminucin na exposicin e inxesta de TCDD as cargas corporais de TCDD diminuron nun 90% entre 1970 e 2000, e se os niveis de exposicin continan diminundo mesma velocidade que en 2000, as cargas corporais caern nun 50 % das actuais en 2010. Para o resto dos conxneres a carga corporal diminuir algo mis lentamente debido a que as vidas medias dalgns deles son superiores s do TCDD. S mediante o cumprimento estrito das medidas reguladoras establecidas polas administracins, e o control peridico das fontes potenciais de liberacin ao medio e das rutas de entrada na dieta humana, poderase garantir a seguridade dos alimentos, ameazada por estes contaminantes insidiosos pola sa persistencia e a sa toxicidade. BIBLIOGRAFA
Alsharif, N.Z., Schlueter, W.J., Stohs SJ. (1994). Arch. Environ. Contam Toxicol, 26, 392-397. Alsharif, N.Z., Hassoun, E.A. (2004). Basic. Clin. Pharmacol. Toxicol, 95, 131-138 Bock, K.W. (1994). Rev Physiol Biochem Pharmacol, 125, 1-42. Dwyer, J.H. Flesch-Janys, D. (1995). Am J Public. Health, 85, 476-478 Gonzlez, F.J., Fernndez-Salguero, P. (1998). Drug. Metab. Dis, 26, 1194-1198. Hahn, M.E. (2002). Chem. Biol. Interact, 141, 131-160. Hays, S.M., Aylward, L.L. (2003). Regul. Toxicol. Pharmacol, 37, 202-217. Hassan, M.Q. Mohammadpour, H. Hermansky, S.J. e col. (1987). Gen. Pharmacol, 18, 547-550 Mohammadpour, H., Murray, W.S., Stohs, S.J. (1988). Arch. Environ. Contam. Toxicol, 17, 645-650. Mukerjee, D. (1998). J. Air Waste Manag. Assoc, 48, 157-165. Pesatori, A.C., Consonni, D., Bachetti, S. e col. (2003) Ind. Health, 41, 127-138. Taylor, P.H., Lenoir, D. (2001). Sci. Total. Environ, 269, 1-24. Stohs, S.J., Hassan, M.Q., Murray, W.J. (1984). Xenobiotica, 14, 533-537. Stohs, J.S. (1990). Free Radical Biology and Medicine, 9, 79-90
107
Tuppurainen, K., Asikainen, A., Ruokojarvi P., e col.. (2003). Acc. Chem. Res, 36, 652-658. Van den Berg M., Birnbaum L., Bosveld AT, e col (1998). Environ Health Perspect, 106, 775-792. Wahba, Z.Z., Lawson, T.A., Stohs, S.J. (1988). Cancer Lett, 39, 381-386.
109
MICOTOXINAS, ESTRS OXIDATIVO E ANTIOXIDANTES

Teresa Cabaleiro Laboratorio de Toxicoloxa. Facultade de Ciencias. Universidade de Vigo Micotoxinas: aspectos xerais As micotoxinas [do grego mykes (fungos) e toksicon (veleno)] son metabolitos secundarios sintetizados por fungos ao final da fase de crecemento sobre diversos alimentos, fundamentalmente cereais e froitas, baixo determinadas condicins. Os principais xneros produtores de micotoxinas son Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Claviceps e Alternaria (Bennett e Keller, 1997). Entre as micotoxinas mis comns, distribudas por todo o mundo, encntranse as aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos, zearalenona e fumonisinas. Constiten un risco importante en seguridade alimentaria, xa que a sa presenza en niveis superiores aos tolerables representa unha ameaza para a inocuidade dos alimentos e ademais reducen o valor nutritivo destes. As necesidades xerais para o crecemento fnxico inclen: un substrato facilmente utilizable, carbohidratos (proporcionados polo amidn ou a celulosa); humidade elevada no alimento (10-18%) e no ambiente (polo menos do 70%); xeralmente condicins aerobias; adecuada temperatura (vara co fungo, anda que adoitan estar nun rango entre 12C a 25C); pH alcalino; etc. A contaminacin de alimentos por micotoxinas e o transporte destas a travs da cadea alimenticia teen que ser controlados con precaucin, xa que a baixas concentracins poden inducir alerxias, erupcins cutneas, neurotoxicidade e outros trastornos. A inxesta de micotoxinas pode levar consigo efectos agudos, crnicos a longo prazo, efectos teratoxnicos, carcinoxnicos (principalmente en fgado e ril), estroxnicos ou inmunosupresores en animais e en humanos, sendo normalmente os animais os que sofren mis os seus efectos txicos debido inxesta de alimentos de menor calidade. O consumo de pensos preparados con ingredientes como as sementes oleaxinosas de cacahuete, algodn, coco ou grans de millo contaminados con micotoxinas non s provocan micotoxicose nos animais, senn que crean tamn problemas de residuos de micotoxinas en produtos animais destinados ao consumo humano, tales como o leite, a carne e os ovos. O estrs oxidativo acontece nas clulas como consecuencia dos procesos fisiolxicos normais e interaccins co medio natural, e os sistemas de defensa antioxidante xogan un papel na proteccin contra o dano oxidativo. O mecanismo de accin das micotoxinas est mediado pola producin de radicais libres e especies reactivas de oxxeno (ROS). As micotoxinas desenvolven os seus efectos biolxicos a travs da
110
sa unin aos fosfolpidos que conforman a membrana celular. Esta unin activa as encimas fosfolipasas que degradan os lpidos da membrana dando lugar a cidos graxos poliinsaturados, que son un substrato para a peroxidacin lipdica e xeracin de ROS, o que finalmente conduce aparicin de efectos citotxicos. Os antioxidantes inhiben as reaccins de radicais libres mediante a captacin ou scavenging de radicais e a formacin dun radical antioxidante mis estable. As micotoxinas alteran a membrana celular mediante peroxidacin lipdica, e as substancias antioxidantes posen propiedades protectoras fronte toxicidade destes xenobiticos. importante destacar o papel da dieta, xa que achega antioxidantes implicados nos procesos de detoxificacin e reducen a toxicidade e o dano ocasionado por radicais libres producidos por micotoxinas. Ademais, as reaccins implicadas na detoxificacin estn conducidas por encimas que requiren cofactores, coencimas e outras molculas, proporcionadas a travs da dieta. O estrs oxidativo como mecanismo de accin txica na toxicodinamia das micotoxinas a. Ocratoxinas As ocratoxinas -toxina mis estudada e representativa na ocratoxina (OTA)- son sintetizadas por fungos dos xneros Aspergillus e Penicillium (Kuiper-Goodman e Scott, 1989). A exposicin no home provn da inxesta de produtos vexetais contaminados, tales como cereais, pan, cervexa, caf, especias, froitas, zume de uva, vio e derivados do porco. A dita exposicin est confirmada pola deteccin de OTA en plasma e ourios en concentracins nanomolares (Scott, 2005). O rgano diana das ocratoxinas o ril. A ocratoxina A nefrotxica, sendo un factor determinante no desenvolvemento da nefropata endmica dos Balcns. As mesmo, esta micotoxina citotxica, xa que inhibe a sntese de protenas por competicin co aminocido fenilalanina e induce apoptose. Est clasificada como carcinxeno do grupo 2B (posible carcinxeno humano) pola Axencia Internacional de Investigacin sobre o Cancro (IARC, 1993), sendo o dano oxidativo ao DNA o seu mecanismo de carcinoxenicidade. O estrs oxidativo pode ser debido a un descenso do sistema de defensa antioxidante ou ben por un aumento na producin de ROS, e evidenciouse que a OTA aumenta os niveis de ROS, malondialdehdo (MDA) e a expresin da encima hemooxixenasa 1 (HO-1) (Baudrimont e col., 1997; Rahimtula e col., 1988), e, por outro lado, descende os niveis de glutatin reducido (GSH) e tocoferol (Schaaf e col., 2002; Gautier e col., 2001). A xeracin de ROS est mediada pola formacin dun complexo OTA-Fe3+ (Omar e Rahimtula, 1993). A OTA facilita a reducin de Fe3+ a Fe2+ pola NADPH-citocromo p450 redutasa (Omar e col., 1991), e o Fe2+ en presenza de O2 proporciona as especies activas que inician a peroxidacin
111
lipdica. Ademais, a inhibicin do mecanismo de defensa antioxidante celular contribe carcinoxenicidade da OTA en ril (Fig. 1). A OTA dimine a expresin xenes regulados polo factor de transcricin Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2), que est implicado na defensa antioxidante e a detoxificacin, o cal reduce a capacidade de resposta ao estrs oxidativo, e en consecuencia as clulas do ril son mis vulnerables toxicidade inducida por OTA, favorecendo o desenvolvemento de tumor (Marin-Kuan e col., 2006).
Figura 1. Figura do mecanismo de carcinoxenicidade da ocratoxina A (adaptado de Marin e col., 2006)
b. Aflatoxinas As aflatoxinas son micotoxinas sintetizadas polas especies Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus. O representante mis txico a aflatoxina B1(AFB1). As aflatoxinas poden contaminar alimentos como cereais, sementes oleaxinosas, especias, froitos secos, leite, etc. O rgano diana o fgado, sendo hepatocarcinoxnica (Shen e col., 1996). A correlacin positiva entre o consumo de alimentos contaminados con AFB1 e o incremento da incidencia do cancro de fgado nalgunhas poboacins de Asia e frica levou clasificacin da AFB1 como carcinxeno do grupo 1 (carcinxeno para o ser humano) pola Axencia Internacional de Investigacin sobre o Cancro (IARC, 2002). O seu principal mecanismo de accin implica a formacin de aductos entre o ADN e o metabolito carcinxeno da AFB1, o AFB-8,9-epxido (McGlynn e col., 2003) (Fig. 2). A AFB1 metabolzase por oxixenasas do sistema citocromo p-450 heptico ao intermediario AFB1-8,9-epxido, o cal ataca residuos de guanina no ADN de dobre cadea, causando roturas na febra de ADN e mutacins puntuais do tipo transversin G:C a T:A, o que leva consigo a substitucin de serina no residuo 249 de p53 (protena implicada no control do ciclo celular) no carcinoma hepatocelular.
112
Figura 2. Formacin de aductos entre o AFB1-8,9epxido e o ADN (McGlynn e col., 2003)
Ademais, evidenciouse que a AFB1 induce a formacin de 8-hidroxidiguanina (8-OHdG) (Shen e col., 1995), que est considerado marcador do dano oxidativo ao ADN, indicando o papel importante de ROS na citotoxicidade deste hepatocarcinxeno. c. Zearalenona A zearalenona sintetizada por fungos do xnero Fusarium sp. Contamina principalmente o millo, outros cereais e derivados (cervexa). A sa citotoxicidade manifstase pola inhibicin da proliferacin celular e a sntese de protenas. Ademais, xenotxica e carcinoxnica en animais de experimentacin, hepatotxica e inmunotxica. As mesmo, estroxnica, activa o receptor de estrxenos, o que est asociado con desordes reprodutivas en animais. Ademais, altera o metabolismo dos fosfolpidos da membrana e libera altas cantidades de cidos graxos insaturados, o que conduce formacin de perxidos lipdicos. Evidenciouse que esta micotoxina induce estrs oxidativo no ril e fgado, xa que aumenta os niveis de MDA e dimine os de glutatin reducido (GSH) (Hassen e col., 2007). Ademais, diferentes toxinas de Fusarium sp. son capaces de danar o ADN (fragmentacin e metilacin do ADN) e inducir citotoxicidade (inhibicin da proliferacin celular e a sntese de protenas) (Kouadio e col., 2007). Todo iso apunta ao dano oxidativo como posible va implicada na toxicidade da zearalenona. Por outro lado, a zearalenona induce a expresin de Hsp 70 (Galvano e col., 2002), o que constite un mecanismo de defensa celular importante, xa que o Hsp 70 pose efectos citoprotectores. d. Fumonisinas A fumonisina B1 (FB1) o representante mis txico dentro do grupo das fumonisinas, sendo sintetizada polo fungo F. verticillioides, que contamina millo e outros cereais. Ademais dunha exposicin diettica, tamn hai que ter en conta a exposicin area en humanos a cepas produtoras de FB1, debido a que F. verticillioides pode crecer en edificios con humidade. A FB1 induce estrs oxidativo e a perda de mecanismos protectores. Entre os efectos txicos mis sobresantes destas mico-
113
toxinas encntranse a neurotoxicidade, inmunotoxicidade e hepatotoxicidade. Concretamente, na neurotoxicidade inducida por FB1 est implicado o estrs oxidativo e a apoptose (Stockmann-Juvala e col., 2004). As, a FB1 aumenta peroxidacin lipdica e a producin de ROS, dimine os niveis de GSH e a actividade superxido dismutasa (SOD), reduce a viabilidade celular e induce apoptose. A fumonisina FB1 inmunotxica, xa que incrementa a permeabilidade de membrana en linfocitos, o que as fai mis susceptibles oxidacin (Yin e col., 1998). Por outro lado, existe unha relacin entre as fumonisinas e o aumento da incidencia de cancro de fgado en humanos (Sun e col., 2007). e. Tricotecenos Os tricotecenos son micotoxinas producidas por Fusarium sp., que se caracterizan pola presenza dun ncleo 12,13-epoxitricoteceno na sa molcula. Detectronse catro tricotecenos como contaminantes naturais en alimentos, principalmente trigo e derivados (faria, pan e cereais para o almorzo), millo, avea, cebada, centeo e arroz: toxina T-2, nivalenol, desoxinivalenol e diacetoxiscirpenol, sendo os mis importantes a toxina T-2 e o desoxinivalenol. e.1. Desoxinivalenol.- O desoxinivalenol (DON) o tricoteceno que se detecta con maior frecuencia. producido por F. graminearum e F. culmorum, patxenos vexetais que causan o brote de golpe branco do trigo. O DON hepatotxico e causa desordes gastrointestinais. Recibe o seu nome comn, vomitoxina, polos vmitos que normalmente acompaan a intoxicacin por tricotecenos. Ademais, un factor determinante da Aleukia Txica Alimentaria (ATA), debida ao consumo de trigo almacenado ao aire libre infectado con Fusarium. A dita enfermidade cursa coa aparicin de puntos na pel, anxina necrtica, leucopenia e mltiples hemorraxias. En relacin xeracin de estrs oxidativo, o DON aumenta peroxidacin lipdica (Kouadio e col., 2005) e dimine os niveis de GSH e a actividade SOD e catalasa (Rizzo e col., 1994). e.2. Toxina T-2.- A toxina T-2 o tricoteceno mis txico. Est sintetizado por Fusarium sp., e un contaminante natural en cereais, sementes e vexetais. A toxina T-2 hepatotxica, e o seu mecanismo de hepatotoxicidade est baseado na inducin de peroxidacin lipdica por xeracin de radicais libres, alterando a estrutura das membranas celulares (Rizzo e col., 1994). Ademais, a toxina T-2 pode unirse ao grupo-SH do glutatin, reducindo os seus niveis, e altera actividade encimas antioxidantes (Suneja e col., 1989). Antioxidantes e toxicidade de micotoxinas As propiedades protectoras dos antioxidantes son probablemente debidas sa capacidade de captar radicais libres actuando como scavengers, de reducir a xeracin de ROS e diminur a peroxidacin lipdica, protexendo as as membranas celulares
114
do dano inducido por micotoxinas. Demostrouse a capacidade que presentan algunhas substancias naturais con propiedades antioxidantes na prevencin dos efectos oxidativos inducidos polas micotoxinas (Zourgui e col., 2008; Costa e col., 2007a; Guerra e col., 2005). a. Carotenoides Os carotenoides (carotenos e xantofilas) son un grupo de antioxidantes lipdicos baseados nun esqueleto carbonado isoprenoide, con propiedades antimutaxnicas e anticarcinoxnicas. Estn presentes naturalmente nalgns alimentos, como cenorias, tomates encarnados, manteiga, queixo, aceite de palma, salmn vermello, pemento e grans de millo. Son scavengers de radicais libres, preveen a peroxidacin lipdica, e son precursores da vitamina A (retinol), que tamn ten propiedades antioxidantes. Os carotenoides diminen o dano no DNA de hepatocitos inducido por AFB1 en ratas debido a que transforman a AFB1 nun metabolito menos txico, a AFM1, reducindo o desenvolvemento de cancro de fgado inducido por AFB1 (Gradelet e col., 1998). Ademais, o carotenoide licopeno, un pigmento encarnado presente principalmente no tomate, reduce o estrs oxidativo inducido pola toxina T-2 (Leal e col., 1999), observndose un descenso dos niveis de MDA e un incremento do contido de GSH. b. Vitaminas A, C e E Atriburonse accins protectoras s vitaminas A (retinol), C (ascorbato) e E (alfatocoferol) fronte exposicin a micotoxinas. Estas vitaminas poden actuar como scavenger do radical superxido, perxido de hidrxeno, radical peroxilo, cido hipocloroso e oxxeno de singlete. b.1. Proteccin fronte toxicidade de ocratoxinas. As vitaminas A, C e E reducen os aductos entre OTA e ADN no ril e fgado de rato (Grosse e col., 1997) preveen a reducin da viabilidade celular e descenden a producin de ROS (Baldi e col., 2004). Ademais, en ratos expostos a esta micotoxina evidenciouse que a vitamina C reduce as alteracins tanto en cromosomas mitticos e meiticos como na morfoloxa da cabeza de espermatozoides (Bose e Sinha, 1994). Por outro lado, suplementos de vitamina E administrada a polos contrarrestan parcialmente a formacin de perxidos lipdicos debido exposicin a OTA (Hoehler e Marquardt, 1996). b.2. Proteccin fronte toxicidade de aflatoxinas. As vitaminas C e A son efectivas en reducir a unin AFB1-DNA e o dano ao ADN inducido pola dita micotoxina (Yu e col., 1994). O diferente estatus de vitamina A est fortemente relacionado coa hepatocarcinoxenicidade da AFB1 en ratas (Webster e col., 1996). De feito, observouse un incremento do dano do DNA inducido por AFB1 durante unha deficiencia de vitamina A, mentres que o dano foi revertido con suplementos de vitamina A. Ademais, a
115
administracin de vitamina E inhibe a peroxidacin lipdica no fgado inducida por AFB1 (Cassand e col., 1993). b.3. Proteccin fronte toxicidade da zearalenona. As vitaminas A, C e E reducen os aductos co ADN e o dano oxidativo ao ADN no ril e fgado de rato expostos a zearalenona (Grosse e col., 1997). A vitamina E capaz de previr a xenotoxicidade inducida pola zearalenona, actuando como anlogo estrutural desta micotoxina ou como antioxidante (Ouanes e col., 2003). O pretratamento con vitamina E reduce o dano oxidativo inducido por zearalenona en hepatocitos (Hassen e col., 2007). A especificidade da proteccin atribeselle similitude estrutural da vitamina E e zearalenona (Ghdira-Chkir e col., 1998). b.4. Proteccin fronte toxicidade de tricotecenos. As vitaminas E e C presentan actividade antioxidante e protexen o bazo e o cerebro contra o dano inducido pola toxina T-2 e DON nas membranas celulares, feito observado na rata (Rizzo e col., 1994). Por outro lado, evidenciouse en polos que a administracin de suplementos de vitamina E contrarresta parcialmente a formacin de perxidos lipdicos debido exposicin toxina T-2 (Hoehler e Marquardt, 1996). c. Catequinas As catequinas son compostos fenlicos presentes nas follas de t verde, chocolate e algunhas plantas. Posen propiedades anticancerxenas e antioxidantes, xa que teen capacidade para quelar Fe+3 e Cu+2 (Kuo e col., 1998). As catequinas poden mostrar un carcter lipoflico parcial e penetrar no interior das membranas, onde o principal iniciador acuoso da oxidacin lipdica, o radical hidroxilo, atrapado facilmente e accesible para radicais peroxilo iniciadores da cadea. As catequinas preveen a citotoxicidade inducida por OTA, xa que reducen a producin de ROS inducida pola dita micotoxina (Costa e col., 2007a). Ademais, estes compostos fenlicos inducen a actividade da glutatin S-transferasa citoslica, que estimula a formacin do conxugado AFB1/glutatin, evitando que a dita aflatoxina se una ao ADN (Aboobaker e col., 1994). d. Cianidin-3-glucopiransido (C-3G) O cianidn-3-glucopiransido (C-3-G) un polifenol, concretamente un antociano, presente en laranxas, silva, amorodos, arandos e outras froitas e vexetais, o responsable da sa pigmentacin. Pose un gran poder antioxidante debido presenza na sa estrutura qumica de varios grupos hidroxilos fenlicos. Demostrouse que o tratamento con C-3-G ten efectos citoprotectores fronte ao dano celular inducido por AFB1 e OTA, xa que inhibe a citotoxicidade, reduce a producin de ROS e contrarresta a inhibicin da sntese de ADN e protenas e a apoptose causadas por ambas as das micotoxinas (Guerra e col., 2005).
116
e. Melatonina A melatonina unha indolamina con actividade antiproliferativa e potencialmente anticarcinoxnica (Garca-Navarro e col., 2007), considerada un scavenger de radicais libres e antioxidante. Protexe fronte ao dano oxidativo causado por micotoxinas, feito demostrado pola inhibicin da producin microsomal de H2O2 inducida por AFB1 no fgado (Awney e col., 2002), a reducin da peroxidacin lipdica inducida por OTA (Fig. 3) e a restauracin dos niveis das actividades glutatin peroxidasa, catalasa e superxido dismutasa no fgado e soro de rata alterados tras a exposicin a OTA (Soyz e col., 2004). Ademais, tamn reduce a apoptose causada por AFB1 no fgado (El-Gibaly e col., 2003).
Figura 3. A melatonina (MEL) reduce a peroxidacin lipdica (LPO) inducida por ocratoxina A (OTA). (Adaptado de El-Gibaly e col., 2003)
f. N-acetil-serotonina A N-acetil-serotonina un precursor da melatonina que protexe fronte ao dano oxidativo. De feito, reduce a peroxidacin lipdica inducida por ascorbato-Fe2+ en microsomas e mitocondrias de testculo (Gavazza e Catal, 2004) e de fgado de rata (Leaden e Catal, 2007). Gesing e Karbownik-Lewinska (2008) observaron que a administracin de N-acetil-serotonina dimine a peroxidacin lipdica (MDA) inducida por AFB1 no cerebro, figado e pulmn. g. Romeu O cido carnsico un composto polifenlico presente no romeu (Rosmarinus officinalis), con capacidade como scavenger de radicais libres e de reducin dos niveis de ROS. O pretratamento con cido carnsico ten un efecto citoprotector, xa que reduce a morte celular inducida pola exposicin a AFB1 (Costa e col., 2007b) e inhibe a formacin de aductos de ADN con AFB1 (Offord e col., 1997).
117
h. cido rosmarnico O cido rosmarnico un composto fenlico natural presente na salvia, albahaca e menta. Renzulli e col. (2004) demostraron o seu efecto citoprotector fronte OTA e AFB1, ademais de atenuar a producin de ROS, a inhibicin da sntese de ADN e protenas e a apoptose, nunha lia celular de hepatoma humano. i. Caf O caf pose compostos con capacidade antioxidante, como os diterpenos cafestol e kahweol, e o cido cafeico. Estes compostos protexen fronte unin de AFB1 e ADN (Cavin e col., 2001). No entanto, a cafena potencia a xenotoxicidade de AFB1. j. Cactos O extracto de cactos efectivo na proteccin fronte ao dano oxidativo causado pola zearalenona. De feito, observouse que a administracin de extracto de cactos reverte o incremento de peroxidacin lipdica inducida por zearalenona no fgado e ril (Zourgui e col., 2008). k. Vio tinto O vio tinto contn unha serie de compostos que lle confiren un efecto protector fronte nefrotoxicidade por OTA, mediante a limitacin do dano oxidativo. Os ditos compostos son o resveratrol, o cido cafeico, as catequinas e a quercetina. A ocratoxina A aumenta os niveis de perxidos lipdicos no ril e descende a actividade SOD e a ratio GSH/GSSG. Se se administra con vio tinto, a OTA menos nefrotxica, redcese o dano oxidativo, restaurando os niveis de GSH e preservando a ratio GSH/ GSSG (Bertelli e col., 2005). l. Pementa A pementa negra contn un alcaloide, a piperina, que un axente protector fronte aos efectos carcinoxnicos da AFB1, xa que reduce a actividade das monoxixenasas do citocromo p-450 e contrarresta a toxicidade de AFB1 (Reen e col., 1997). m. Aspartamo Compostos prometedores na prevencin dos efectos txicos da OTA son os anlogos estruturais e/ou compostos cunha alta afinidade de unin por protenas plasmticas, entre eles o aspartamo, un edulcorante. Os efectos protectores do aspartamo sobre a nefrotoxicidade inducida por OTA poderan estar baseados na unin competitiva a protenas plasmticas, transporte ou distribucin a tecidos ou a eliminacin da toxina nos ourios (Creppy e col., 1998). Ademais, o aspartamo reduce o incremen-
118
to dos niveis de MDA (peroxidacin lipdica) e contrarresta a inhibicin da sntese proteica inducidos pola exposicin a OTA (Baudrimont e col., 1997), prevendo os seus efectos txicos, inclundo a xenotoxicidade. n. Glucomananos Os glucomananos son polisacridos presentes na parede celular de lvedos. Cando se administran nunha dieta contaminada, como estes produtos non son dixeridos, a micotoxina adsorbida excretada a travs das feces. A exposicin combinada de glucomananos e alimentos con toxina T-2 restaura a concentracin de GSH e reduce a peroxidacin lipdica inducidas pola micotoxina (Dvorska e col., 2007). o. Herbas medicinais e extractos de plantas Hai algunhas plantas que conteen compostos con efectos beneficiosos para a proteccin fronte toxicidade inducida por micotoxinas. Actan como antioxidantes, scavengers de radicais libres e inhibindo a peroxidacin lipdica. Entre elas podemos destacar: Cassia senna: A administracin dun extracto de etanol dun concentrado de C. senna inhibe o efecto mutaxnico da AFB1 (al-Dakan e col., 1995). Noz de anacardo: O extracto de noz de anacardo efectivo en reducir o hepatocarcinoma inducido por AFB1 (Premalatha e Sachdanandam, 1999). Follas de pementa: A administracin de extracto de metanol de follas de pementa dimine o efecto xenotxico de AFB1 (Hashim e col., 1994). A administracin dun extracto do froito de Schisandra chinensis proporciona unha accin hepatoprotectora contra AFB1 pola estimulacin do sistema heptico antioxidante e de detoxificacin (Ip e col., 1996). Finalmente, importante ter en conta que nalgns casos os posibles axentes protectores tamn son unha va potencial de intoxicacin. Este o caso do caf, t, uvas e herbas medicinais. De feito, dbese ter precaucin na promocin da accin antimicotxica das substancias discutidas anteriormente, xa que algunhas delas poden ser carcinoxnicas e/ou ter propiedades txicas a doses concretas e en determinadas circunstancias. BIBLIOGRAFA
Aboobaker, V.S., Balgi, A.D., Bhattacharya, R.K., (1994). In Vivo, 8, 1095-1098. al-Dakan, A.A., al-Tuffail, M., Hannan, M.A., (1995). Pharmacol Toxicol, 77, 288-292. Awney, H.A., Attih, A.M., Habib, S.L., e col. (2002). Toxicology, 172, 143-148. Baldi, A., Losio, M.N., Cheli, F., e col. (2004). Br. J. Nutr, 91, 507-512. Baudrimont, I., Ahouandjivo, R., Creppy, E.E. (1997). Chem. Biol. Interact, 104, 29-40.
119
Bennett, J.W., Keller, N.P. (1997). En: Fungal Biotechnology (Ed. T. Anke). Chapman & Hall, Weinheim, 265-273. Bertelli, A.A., Migliori, M., Filippi, C. (2005). J. Agric. Food Chem, 53, 6924-6929. Bose, S., Sinha, S.P. (1994). Food Chem. Toxicol, 32, 533-537. Cassand, P., Decoudu, S., Lvque F. (1993). Mutat. Res, 319, 309-316. Cavin, C., Mace, K., Offord, E.A. (2001). Food Chem. Toxicol, 39, 549-556. Costa, S., Utan, A., Cervellati, R., e col. (2007a). Food Chem. Toxicol, 45, 1910-1917. Costa, S., Utan, A., Speroni, E., e col. (2007b). J. Appl. Toxicol, 27, 152-159. Creppy, E.E., Baudrimont, I., Anne-Marie (1998). Toxicol. Sci. 23Suppl, 2, 165-172. Dvorska, J.E., Pappas, A.C., Karadas, F., e col. (2007). Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 145, 582-587. El-Gibaly, I., Meki, A.M., Abdel-Ghaffar, S.K. (2003). Int. J. Pharm, 260, 5-22. Galvano, F., Russo, A., Cardile, V., e col. (2002). Food Chem. Toxicol, 40, 25-31. Garca-Navarro, A., Gonzlez-Puga, C., Escames, G., e col. (2007). J. Pineal Res,, 43, 195-205. Gautier, J.C., Holzhaeuser, D., Markovic, J., e col. (2001). Free Radic. Biol. Med., 30, 1089-1098. Gavazza, M.B., Catal, A. (2004). J. Pineal Res., 37, 153-160. Gesing, A., Karbownik-Lewinska, M. (2008). Cell Biochem. Funct., 26, 314-319. Ghdira-Chkir, L., Maaroufi, K., Zakhama, A., e col. (1998). Chem. Biol. Interact, 113, 15-25. Gradelet, S., Le Bon, A.M., Bergs, R., e col. (1998). Carcinogenesis, 19, 403-411. Grosse, Y., Chekir-Ghedira, L., Huc, A., e col. (1997). Cancer Lett, 114, 225-229. Guerra, M.C., Galvano, F., Bonsi, L., e col. (2005). Br. J. Nutr., 94, 211-220. Hashim, S., Aboobaker, V.S., Madhubala, R. e col. (1994). Nutr. Cancer, 21, 169-175. Hassen, W., Ayed-Boussema, I., Oscoz, A.A., e col. (2007).Toxicology, 232, 294-302. Hoehler, D., Marquardt, R.R. (1996). Poult Sci, 75, 1508-1515. IARC, (1993). IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, vol. 56. Some Naturally Occurring Substances: Food Items and Constituents, Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins, 489. IARC, (2002). IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, vol. 82. Some Naturally Occurring Substances: Food Items and Constituents, Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins, 171. Ip, S.P., Mak, D.H., Li, P.C., e col. (1996). Toxicol, 78, 413-416. Kouadio, J.H., Mobio, T.A., Baudrimont, I., e col. (2005) Toxicology, 213, 56-65. Kouadio, J.H., Dano, S.D., Moukha, S. e col. (2007). Toxicon., 49, 306-317. Kuiper-Goodman, T., Scott, P.M. (1989). Environ. Sci, 2, 179-248. Kuo, S.M., Leavitt, P.S., Lin, C.P. (1998). Biol. Trace Elem, Res., 62, 135-153. Leaden, P.J., Catal, A. (2007). Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 77, 29-35. Leal, M., Shimada, A., Ruz, F., e col. (1999). Toxicol. Lett., 109, 1-10. Marin-Kuan, M., Nestler, S., Verguet, C., e col. (2006). Toxicol. Sci,. 89, 120-34. McGlynn, K.A., Hunter, K., LeVoyer, T., e col. (2003). Cancer Res., 63, 4594-4601. Offord, E.A., Mac, K., Avanti, O., e col. (1997).Cancer Lett., 114, 275-281. Omar, R.F., Rahimtula, A.D., Bartsch, H. (1991). J. Biochem. Toxicol, 6, 203-209.
120
Omar, R.F., Rahimtula, A.D. (1993). Biochem. Pharmacol. 46, 2073-2081. Ouanes, Z., Abid, S., Ayed, I., e col. (2003). Mutat. Res., 538, 63-70. Premalatha, B., Sachdanandam, P. (1999). J. Ethnopharmacol, 66, 131-139. Rahimtula, A.D., Brziat, J.C., Bussacchini-Griot, V., e col. (1998). Biochem. Pharmacol, 37, 4469-4477. Reen, R.K., Wiebel, F.J., Singh, J. (1997). J. Ethnopharmacol, 58, 165-173. Renzulli, C., Galvano, F., Pierdomenico, L., e col. (2004). J. Appl. Toxicol, 24, 289-296. Rizzo, A.F., Atroshi, F., Ahotupa, M., e col. (1994). Zentralbl. Veterinarmed. A., 41, 81-90. Schaaf, G.J., Nijmeijer, S.M., Maas, R.F., e col. (2002). Biochim. Biophys. Acta, 1588, 149-158. Scott, P.M. (2005). Food Addit. Contam. 22 Suppl, 1, 99-107. Shen, H.M., Ong, C.N., Lee, B.L. e col. (1995). Carcinogenesis, 16, 419-422. Shen, H.M., Shi, C.Y., Shen, Y., e col. (1996). Free Radic. Biol. Med., 21, 139-146. Soyz, M., Ozelik, N., Kilin, I., e col. (2004). Cell Biol. Toxicol, 20, 213-219. Stockmann-Juvala, H., Mikkola, J., Naarala, J., e col. (2004). Free Radic. Res., 38, 933-942. Sun, G., Wang, S., Hu, X., e col. (2007). Food Addit. Contam., 24, 181-185. Suneja, S.K., Wagle, D.S., Ram, G.C. (1989). Toxicon., 27, 995-1001. Webster, R.P., Gawde, M.D., Bhattacharya, R.K. (1996). In Vivo, 10, 113-118. Yin, J.J., Smith, M.J., Eppley, R.M., e col. (1998). Biochim. Biophys Acta, 1371, 134-142. Yu, M.W., Zhang, Y.J., Blaner, W.S., e col. (1994). Cancer, 73, 596-604. Zourgui, L., Golli, E.E., Bouaziz, C., e col. (2004). Food Chem. Toxicol., 46, 1817-1824.
121
TOXICOLOXA DE METAIS E ANTIOXIDANTES NATURAIS: CADMIO E MELATONINA

Alejandro Romero Martnez Dpto. de Farmacoloxa e Teraputica. Facultade de Medicina. Instituto de Investigacin Tefilo Hernando. Universidade Autnoma de Madrid Introducin O cadmio (Cd) foi descuberto en 1817 polo qumico alemn Friedrich Stromeyer nas incrustacins dos fornos de zinc. Anda que tamn pode estar asociado a outros metais como o chumbo ou o cobre (Zubera-Cosano, 1993), ou formando compostos inorgnicos solubles na auga como cloruros, sulfuros e acetatos (Reilly, 1991). Trtase dun elemento non esencial para os seres vivos e est considerado como un dos 126 contaminantes principais pola Axencia de Proteccin Ambiental dos Estados Unidos (Waisberg e col., 2003). Presenta unha longa semivida no home; entre 10 e 30 anos (Satarug e col., 2004), anda que outros autores o estiman entre 15 e 20 anos (Jin e col., 1998). Presenza do cadmio no ambiente O cadmio un dos maiores axentes txicos asociado contaminacin ambiental e industrial, pois rene catro das caractersticas mis temidas dun txico: a) efectos adversos para o home e o medio, b) bioacumulacin, c) persistencia no medio e d) dispersin (Ramirez, 2002). O cadmio obtense como subproduto do tratamento metalrxico do zinc e do chumbo, a partir de sulfuro de cadmio; no proceso hai formacin de xido de cadmio, composto moi txico. Ademais de contaminar o ambiente desde a sa fundicin e refinacin, contamina tamn polos sas mltiples aplicacins industriais. Os principais usos e aplicacins do cadmio ou os seus compostos son: como pigmento en pinturas, esmaltes, plsticos, textiles, vidros, tintas de impresin, caucho, lacas, na producin de pilas de cadmio-nquel, como estabilizador de termoplsticos (PVC), como endurecedor de rodas e lamias de autombil (Zubera-Cosano, 1993). Exposicin ao cadmio a travs da dieta As principais fontes de exposicin ao cadmio para o home son atmosferas profesionais concretas, a dieta, a auga de bebida e o tabaco (Repetto e Lpez-Artguez, 1995; Llobet e col., 1998; Chan e col., 2000). Ademais, presenta unha longa semivida no home, principalmente debido sa baixa ratio de excrecin e sa acumulacin no organismo.
122
A absorcin oral do cadmio a travs da inxesta alimentaria foi estimada nun 5% en humanos (I.P.C.S., 1992), cunha variabilidade interindividual dun 20-30% (Satarug e col., 2004), determinada por distintos factores como a inxesta de fibra, a cal inhibe a absorcin intestinal do metal (Berglund e col., 1994). Segundo o Internacional Programme on Chemical Safety, da Organizacin Mundial da Sade, a inxesta media do cadmio inferior inxesta semanal provisional tolerable (PTWI) (Galal-Gorchev, 1993), sendo a PTWI 1g Cd/Kg peso/da (C.A.C., 2003). No entanto, segundo Nasreddine e Parent-Massin (2002), os europeos estamos expostos a concentracins de cadmio superiores PTWI. A auga de bebida tamn pode constitur unha fonte de exposicin ao cadmio. Anda que a concentracin media inferior a 1g Cd/L, en fogares con tubaxes de cobre pode chegar a 2g Cd/L no caso de tubaxes galvanizadas (Sharret e col., 1982). Aspectos moleculares da toxicoloxa do cadmio O cadmio induce a formacin de especies reactivas de oxxeno (ROS) (Filipi e col., 2006). Ademais, induce a producin de radicais hidroxilo (OBrien e Salacinski, 1998), anins superxido, xido ntrico e perxido de hidrxeno (Stohs e col., 2001) e induce peroxidacin lipdica (El-Maraghy e col., 2001). As ROS son continuamente xerados durante o metabolismo do oxxeno. Posteriormente son transformados en radicais hidroxilo, altamente reactivos, que atacan o ADN, producindo a rotura das febras e alterando as bases, o que leva consigo a aparicin de mutacins e o desenvolvemento de tumores (Waalkes, 2002). O mecanismo polo cal o cadmio inicia a formacin de ROS pode deberse fundamentalmente a que este metal provoca un descenso intracelular do contido de glutatin e reduce a actividade dos encimas antioxidantes, superxido dismutasa, peroxidasa e catalasa, permitindo a acumulacin de ROS e un incremento do estrs oxidativo intracelular en clulas expostas ao cadmio (Waisberg e col., 2003). Tamn se observou que o cadmio induce peroxidacin lipdica en diversas rexins cerebrais (Mndez-Armenta e col., 2003). De feito, relacionouse a toxicidade neuroendocrina deste metal co estrs oxidativo (Poliandri e col., 2006; Lpez e col., 2006), situacin na que existe unha alteracin no balance de axentes oxidantes e antioxidantes nas clulas (Lpez e col., 2006). Por outro lado, o aumento de especies reactivas de oxxeno pode levar consigo diversas perturbacins fisiolxicas: maior permeabilidade da barreira hematoenceflica, alteracins na transmisin sinptica, etc. (Evans, 1995). Ademais, a nivel cerebral, o estrs oxidativo o responsable de numerosas enfermidades dexenerativas como a esclerose lateral amiotrfica (Hirano, 1991) e alzheimer (Sinet e Ceballos-Picot, 1992).
123
Neurotoxicoloxa do cadmio O cadmio, ao igual que outros metais pesados, como o chumbo e o mercurio, presenta unha elevada neurotoxicidade (Pohl e col., 2006). Atravesa a barreira hematoenceflica (Murphy, 1997) e pode acumularse nas distintas rexins cerebrais (Lafuente e col., 2003; Ong e col., 2006). Tamn se pode depositar no plexo coroideo que constite a barreira hematoenceflica (Manton e col., 1984). Este feito leva consigo alteracins morfolxicas na sa estrutura, o que permite que os metais e outros xenobiticos neurotxicos se difundan cara ao cerebro (Zheng, 2001). Concretamente, o cadmio unido a metalotionena (formando un complexo cadmiometalotionena) fxase no plexo coroideo (Zheng, 2001) e destre a ultraestrutura do plexo (Zheng, 2001). Segundo diversos autores (Wong e Klaassen, 1982; Choudhuri e col., 1996) algunhas patoloxas neurolxicas poderan ser debidas a un aumento na permeabilidade da barreira hematoenceflica ao cadmio. A neurotoxicidade asociada exposicin ao cadmio podera ser debida ao efecto global dunha serie de pequenas perturbacins no metabolismo cerebral e do estrs oxidativo en particular, xa que este metal parece intensificar a peroxidacin lipdica a travs da inhibicin da superxido dismutasa e outros encimas relacionados (Gutirrez-Reyes e col., 1998). Os efectos txicos do cadmio no SNC inclen alteracins na sntese e/ou metabolismo das aminas bixenas e dos aminocidos neurotransmisores. As se observou en diversas rexins cerebrais, baixo heteroxneas condicins experimentais (in vivo e in vitro, diversas doses do metal, diferentes vas de administracin do txico), en diversas especies animais e de distintas idades (Williams e col., 1978; Arito e col., 1981; Nation e col., 1989; Das e col., 1993; Lafuente e Esquifino 1999; Lafuente e col., 2001; 2002; 2003; 2004; 2005a e b). Melatonina A melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) foi caracterizada por primeira vez despois de procesar cromatograficamente miles de glndulas pineais de orixe bovina (Lerner e col., 1958). Denominouse co termo melatonina debido aos seus efectos sobre a pigmentacin da pel de ras e pola sa relacin qumica coa serotonina (5-hidroxitriptamina) (Lerner e col., 1960). Actualmente sbese que esta indolamina o principal produto secretado pola glndula pineal en mamferos, inclundo o home. Benot e col. (1998 e 1999) evidenciaron na rata e no home que tanto os niveis en sangue de melatonina como a capacidade antioxidante total dese fludo corren paralelos. Desta maneira, o incremento fisiolxico nocturno dos niveis de melatonina acompase dun concorrente ascenso na capacidade do fludo para neutralizar os radicais libres. O forte paralelismo entre a concentracin sangunea de melatonina e
124
a sa capacidade antioxidante foi tamn confirmado por Albarran e col. (2001) nas aves. Cardinali e col. (2001) consideraron a importancia das concentracins subcelulares de melatonina. Cabe destacar que como substancia lipoflica atravesa facilmente as membranas celulares, e que baixo condicins fisiolxicas e farmacolxicas pode ser moito mis elevada a concentracin intracelular da hormona que os seus niveis circulantes. Hai das dcadas cuantificouse por radioinmunoensaio a concentracin hipotalmica de melatonina en rata, obtendo valores de 1-4 pg/mg de tecido (Catala e col., 1987). Posteriormente, ao utilizar tcnicas cromatogrficas, observouse que a concentracin nocturna de melatonina nesta mesma rexin cerebral era superior: 10 pg/ mg de tecido (Cardinali e col., 2001). Destes datos desprndese que os niveis de melatonina nos tecidos poidan estar dentro dun elevado rango nanomolar, asumindo unha distribucin homoxnea de melatonina en varios compartimentos subcelulares. Estes valores poderan ser substancialmente mis elevados se a melatonina se distribe de forma distinta dentro dos compartimentos subcelulares. De feito, os niveis mis elevados encontrronse no ncleo celular e na mitocondria, nun rango micromolar (Cardinali e col., 2001). Funcins da melatonina e o seu posible papel protector fronte toxicidade dos xenobiticos A melatonina presenta a capacidade de paliar, polo menos en parte, o dano molecular e celular orixinado polo estrs oxidativo (Reiter, 1998). Entre os diversos mecanismos de actuacin, neste sentido, destacan os seguintes (Figura 1):
1.
un potente scavenger (axente neutralizante) de radicais libres (Tan e col., 2002), como son as ROS e do nitrxeno (RNS) e os radicais peroxilo (LOO ). Acta como un antioxidante indirecto:
a.
2.
Inducindo encimas antioxidantes (Reiter e col., 2000; Rodrguez e col., 2004). Estimulando a sntese de glutatin (Urata e col., 1999). Incrementando a actividade doutros antioxidantes (Gitto e col., 2001). Protexendo as encimas antioxidantes do dano oxidativo (Mayo e col., 2003), aumentando a eficiencia da cadea de transporte electrnico mitocondrial, reducindo as a fuga de electrns e a xeracin de radicais libres (AcuaCastroviejo e col., 2002).
b. c. d.
125
Cruza todas las barreras morfofisiolgicas
Incrementa la eficiencia de la fosforilacin oxidativa
Amplia distribucin intracelular
Inhibe enzimas prooxidativas
Estimula enzimas antioxidantes Estabiliza membranas celulares
Detoxifica especies reactivas basadas en radicales de oxgeno y nitrgeno
Reduce los niveles de citoquinas proinflamatorias y molculas de adhesin
Figura 1. Nesta figura resmense os diversos mecanismos a travs dos cales a melatonina protexe as clulas do dano oxidativo (Reiter, 2003)
Algunhas destas accins son mediadas va receptor, mentres que outras non o son. En primeiro lugar habera que citar a sa actividade endocrina, tanto autocrina como paracrina, e a sa funcin de scavenger (axente neutralizante) directo de radicais libres (Tan e col., 2003). Mis concretamente, esta hormona capaz de reducir a peroxidacin lipdica inducida por cadmio en diversos rganos, ao administrarse intraperitonealmente a doses farmacolxicas (Karbownik e col., 2001). Ademais das sas propiedades antioxidantes, a melatonina tamn pode formar complexos in vitro con cadmio e outros metais (Limson e col., 1998). Nesta mesma lia, a melatonina reverte as alteracins que induce o cadmio na expresin xnica de encimas implicados na peroxidacin lipdica e no estrs oxidativo (xido ntrico sintasa 1 e 2 e hemo oxixenasa-1) no eixe hipotalmico-hipofisario (Poliandri e col., 2006). O efecto protector da melatonina fronte neurotoxicidade do cadmio que se observa a nivel de neurotransmisores podera ser debido, polo menos, en parte, a que a neurohormona dimine a retencin do metal no organismo (Chwelatiuk e col., 2006) e reduce o estrs oxidativo inducido polo cadmio (Poliandri e col., 2006). Ademais, os efectos protectores da melatonina fronte ao dano oxidativo inducido por metais foron evidenciados principalmente en estudos in vitro (Karbownik e col., 2001; Parmar e col., 2002; Ortega-Gutirrez e col., 2002, Daniel e cols., 2004; Eybl e col., 2006), polo que os efectos txicos do cadmio que escapan proteccin da melatonina, poderan ser debidos a outros factores que existen in vivo e que non se dan nos experimentos in vitro.
126
BIBLIOGRAFA
Acua-Castroviejo, D., Escames, G., Carozo, A., e col. (2002). Curr. Topics Med. Chem., 2, 133-152. Albarran, M.T., Lopez-Burillo, S., Pablos, M.I., e col. (2001). J. Pineal Res., 30, 227-233. Arito, H., Sudo, A., Suzuki, Y. (1981). Toxicol. Lett., 7, 457-461. Benot, S., Molinero, P., Soutto, M., e col. (1998). J. Pineal Res., 25, 1-4. Benot, S., Goberna, R., Reiter, R.J., e col. (1999). J. Pineal Res., 27, 59-64. Berglund, M., Akesson, A., Nermell, B., e col. (1994). Environ. Health Perspect., 102, 1058-1066. C.A.C. (Codex Alimentarius Commission) (2003). Joint FAO/WHO Food Standards Programme. Document ALINORM 03/12, Appendix XIV. Rome, CAC. Cardinali, D.P., Cutrera, R.A., Brusco, L.I., e col. (2001). En: The Pineal Gland and Cancer, Bartsch, C., Bartsch, H., Blask, D.E., Cardinali, D.P., e col. Eds., Springer, Berlin, 50-65. Catala, M.D., Quay, W.B., Timiras, D.S. (1987). Int. J. Dev. Neurosci., 5, 313-318. Chan, D.Y., Black, W., Hale, B. (2000). Bull. Environ. Contam. Toxicol., 64, 526-533. Choudhuri, S., Liu, W.L., Berman, N.E., e col. (1996). Toxicol. Lett., 84, 127-133. Chwelatiuk, E., Wlostowski, T., Krasowska, A., e col. (2006). J. Trace Elem. Med. Biol., 19, 259-265. Daniel, S., Limson, J.L., Dairam, A., e col. (2004). J. Inorg. Biochem., 98, 266-275. Das, K.P., Das, P.C., Dasgupta, S., e col. (1993). rat. Biol. Trace Elem. Res., 36, 119-127. El-Maraghy, S.A., Gad, M.Z., Fahim, A.T., e col. (2001). J. Biochem. Mol. Toxicol., 15, 207-214. Evans, P.H. (1995). Br. Med. Bull., 49, 577-587. Eybl, V., Kotyzova, D., Koutensky, J. (2006). Toxicology, 225, 150-156. Filipi, M., Fatur, T., Vudrag, M. (2006). Hum. Exp. Toxicol., 25, 67-77. Galal-Gorchev, H. (1993). Food Addit. Contam., 10, 115-128. Gitto, E., Tan, D.X., Reiter, R.J., e col. (2001). J. Pharm. Pharmacol., 53, 1393-1401. Gutirrez-Reyes, E.Y., Albores, A., Ros, C. (1998). Toxicology, 131, 145-154. Hirano, A. (1991). Adv. Neurol., 56, 91-101. I.P.C.S. (International Programme on Chemical Safety) (1992). Cadmium. Environmental Health Criteria 134. Geneva, World Health Organization. Jin, T., Lu, J., Nordberg, M. (1998). Neurotoxicology, 19, 529-535. Karbownik, M., Gitto, E., Lewinski, A., e col. (2001). Cell Biol. Toxicol., 17, 33-40. Lafuente, A., Fernndez-Rey, E., Seara, R., e col. (2001). Neurochem. Int., 39, 187-192. Lafuente, A., Gonzlez-Carracedo, A., Mrquez, N., e col. (2002). J. Trace. Elem. Med. Biol., 16, 249-254. Lafuente, A., Gonzlez-Carracedo, A., Romero, A., e col.. (2003). Exp. Brain Res., 149, 200-206. Lafuente, A., Gonzlez-Carracedo, A., Romero, A., e col. (2004). Toxicol. Lett., 146, 175-182. Lafuente, A., Gonzlez-Carracedo, A., Romero, A., e col. (2005a). Toxicol. Lett., 155, 87-96. Lafuente, A., Gonzalez-Carracedo, A., Cabaleiro, T., e col. (2005b). J. Physiol. Biochem., 61, 439-446. Lerner, A.B., Case, J.D., Takahashi, E. (1958). Journal of the American Chemical Society, 80, 2587-2589. Lerner, A.B., Case, J.D., Takahashi, E. (1960). J. Biol. Chem., 235, 1992-1997. Limson, J., Nyokong, T., Daya, S. (1998). J. Pineal Res., 24, 15-21. Llobet, J.M., Granero, S., Schuhmacher, M., e col. (1998). Trace Elem. Electroly., 15, 136-141. Lpez, E., Arce, C., Oset-Gasque, M.J., e col. (2006). Free Radic. Biol. Med., 40, 940-951.
127
Manton, W.I., Kirkpatrick, J.B., Cook, J.D. (1984). Lancet, 2 ,351. Mayo, J.C., Tan, D.X., Sainz, R.M., e col. (2003). Free Radic. Res., 37, 543-553. Murphy, V.A. (1997). En: Yasui, M., Strong, M.J., Ota, K, e col., eds. Mineral and metal, neurotoxicology. Boca Raton, CRC, 229-240. Nasreddine, L., Parent-Massin, D. (2002). Toxicol. Lett., 127, 29-41. Nation, J.K., Frye, G.D., Von Stulz, J., e col. (1989). Behav. Neurosc., 103, 1108-1114. OBrien, P., Salacinski, H.J. (1998). Arch. Toxicol., 72, 690-700. Ong, W.Y., He, X., Chua, L.H., e col. (2006). Exp. Brain Res., 173, 468-474. Ortega-Gutirrez, S., Garca, J.J., Martnez-Ballarn, E. (2002). Neurosci. Lett., 323, 55-59. Parmar, P., Limson, J., Nyokong, T., Daya, S. (2002). J. Pineal Res., 32, 237-242. Pohl, H. R., Abadin, H., Risher, J. F. (2006). En: Neurodegenerative diseases and metal ions. Vol 1. Sigel, A., Sigel, H., Sigel, R.K.O. (Eds) John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, England, 474. Poliandri, A.H., Esquifino, A.I., Cano, P., e col. (2006b). J. Pineal Res., 41, 238-246. Ramirez, A. (2002). Anales de la Facultad de Medicina, 63, 51-64. Reilly, C. (1991).. Elsevier Applied Science., 3-151. Reiter, R.J. (1998). Prog. Neurobiol., 56, 359-384. Reiter, R.J., Tan, D.X., Osuna, C., e col. (2000). J. Biomed. Res., 7, 444-458. Reiter, R.J. (2003a). Best Practice & Research Clinical Endocrinology and Metabolism, 17, 273-285. Repetto, M., Lpez-Artguez, M. (1995). En: Toxicologa avanzada. Repeto, M. (Ed.), Daz de Santos, Madrid, 393-418. Rodrquez, C., Mayo, J.C., Sainz, R.M., e col. (2004) J. Pineal Res., 36, 1-9. Satarug, S., Ujjin, P., Vanavanitkun, Y., e col. (2004). Toxicol. Lett., 148, 177-185. Sharret, A. G., Carter, A. P., Orhein, R. M., e col. (1982). Environ. Res., 28, 456-475. Sinet, P.M., Ceballos-Picot, I. (1992). Springer Verlag, Berlin 91-98. Stohs, S.J., Bagchi, D., Hassoun, E., e col. (2001). J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol., 20, 77-88. Tan, D.X., Reiter, R.J., Manchester, L.C., e col. (2002). Curr. Topics Med. Chem., 2, 181-198. Tan, D.X., Manchester, L.C., Hardeland, R., e col. (2003). J. Pineal Res., 34, 75-78. Urata, Y, Honma, S., Goto, S., e col. (1999). Free Radic. Biol. Med., 27, 838-847. Waalkes, M.P. (2002). En: Sarkar, B. Ed. Handbook of heavy metals in the environment. Marcel Dekker, 121-146. Waisberg, M., Joseph, P., Hale, B., e col. (2003). Toxicology, 192, 95-117. Williams, B.J., Laubach, D.J., Nechay, B.R., e col. (1978). Life Science, 23, 1929-1924. Wong, K.L., Klaassen, C.D. (1982). Toxicol. Appl. Pharmacol. 63, 330-337. Zheng, W. (2001). Microscopy research and technique, 52, 89-103. Zubera-Cosano, G. (1993). Encyclopaedia of Food Science, Food Technology and Nutrition. Macrae, R., Robinson, R. K., Sadler, M. J. (Eds.), Academic Press Ltd, London, 557-561.
129
TOXICOLOXA DE INSECTICIDAS ORGANOCLORADOS E RADICAIS LIBRES: METOXICLORO E XIDO NTRICO

Ana Caride Laboratorio de Toxicoloxa. Facultade de Ciencias. Universidade de Vigo Oxido ntrico O xido ntrico un mensaxeiro biolxico cunha vida media duns poucos segundos debido ao seu carcter gasoso. Foi descuberto en 1987 nas clulas endoteliais e denominouse inicialmente factor relaxante derivado do endotelio, xa que induca a relaxacin da musculatura lisa precontrada farmacoloxicamente, implicando a sa importancia no sistema cardiovascular e na maiora dos demais sistemas biolxicos. Por este motivo foi elixida como molcula do ano en 1992 pola revista Science e mereceu que se lle outorgase o premio Nobel en Medicina e Fisioloxa en 1998 aos investigadores pioneiros deste descubrimento (Ferid Murad, Robert Furchgott e Louis Ignarro). O xido ntrico, a temperatura ambiente e presin atmosfrica, un gas que pose un electrn desapareado, polo que se comporta como un radical libre e en consecuencia moi reactivo. Debido a isto ten unha vida media de segundos. Unha vez liberado, exerce os seus efectos e descomponse para producir dous metabolitos estables, os radicais nitrito e nitrato. sintetizado a partir de L-arxinina mediante unha reaccin encimtica catalizada polo xido ntrico sintasa (NOS), encima que contn catro cofactores: FAD, FMN, tetrahidrobiopterina e hemo. Ata o momento foron identificadas tres isoformas de NOS, que fan referencia ao tecido no que se purificaron inicialmente: endotelial (eNOS), neuronal (nNOS) e inducible (iNOS). A isoforma endotelial do xido ntrico sintasa atpase nas clulas endoteliais vasculares, onde, activada por estimulacin colinrxica, promove a relaxacin da musculatura lisa. A nNOS atpase principalmente no cerebro e, ao igual que a eNOS, calcio-dependente. Estas das isoformas median a producin de xido ntrico a concentracin fisiolxica, para actuar como sinalizador molecular. A expresin da isoforma inducible de NOS sintetizada en diferentes tipos de clulas, tales como macrfagos, hepatocitos, neutrfilos, msculo liso e endotelio, e calcio-independente. Esta isoforma cataliza a sntese de gran cantidade de xido ntrico, que pode ser txico en determinadas circunstancias. O xido ntrico participa nunha gran variedade de importantes funcins biolxicas. Ata o momento existen mis de 30.000 publicacins que versan sobre o papel biolxico deste composto. importante destacar que un neurotransmisor que pose propiedades diferentes aos dous neurotransmisores clsicos debido sa natureza gasosa: non se acumula en vesculas sinpticas; non require de receptores de mem-
130
brana para exercer a sa accin, xa que penetra na clula diana por difusin lipdica; e non metabolizado por encimas especficos, senn que degradado espontaneamente por oxidacin ou ben por compostos tales como o anin superxido ou a oxihemoglobina. A nivel do sistema nervioso central desempea funcins tan importantes como a regulacin da liberacin doutros neurotransmisores [glutamato, cido gamma-aminobutrico (GABA), dopamina, acetilcolina, norepinefrina e adrenalina, entre outros], a regulacin do fluxo vascular, e intervn nos mecanismos de defensa cerebral e en procesos de aprendizaxe e memoria. O xido ntrico atpase ademais presente no sistema nervioso perifrico, participando na trasmisin sensorial. Ademais, est involucrado noutras funcins fisolxicas, moi diversas entre si, como a inhibicin da agregacin e a adhesin plaquetaria, a citotoxicidade producida por macrfagos, a relaxacin intestinal non colinrxica, a regulacin da secrecin hormonal e o control do apetito. importante ter en conta que o xido ntrico pode presentar capacidade antioxidante ou prooxidante. Por unha parte, algunhas das especies reactivas do nitrxeno derivadas do xido ntrico poden reaccionar con protenas, ADN e cidos graxos poliinsaturados. Entre estes compostos cabe destacar o peroxinitrito pola sa capacidade oxidante, sintetizado cando se encontran simultaneamente no medio xido ntrico e o anin superxido. Por outra parte, o xido ntrico potencialmente inhibe a peroxidacin lipdica inducida por especies reactivas do oxxeno e do nitrxeno, posto que reacciona con radicais lipdicos dando lugar a produtos non radicais do tipo nitrosolpidos. Tamn se demostrou que modula o efecto prooxidante do ferro e de metais de transicin en estado inico ao reaccionar con eles. Este efecto antioxidante ou prooxidante depende da concentracin de cada especie e do microambiente biolxico no que liberado o xido ntrico. O seu principal composto diana a guanilato ciclasa soluble (GCs) que desencadea a producin de guanosina monofosfato cclica (GMPc). Este ltimo aparece como composto mediador de moitas das accins fisiolxicas do xido ntrico, ao estar implicado na transducin de sinais va unha kinasa. Outra das molculas diana do xido ntrico a citocromo oxidasa, xa que ao competir co oxxeno pola unin a esta molcula na cadea de transporte electrnico modula a respiracin mitocondrial. Por outra parte, forma o complexo GSNO ao unirse a glutatin oxidado, que orixina posteriormente glutatin reducido (GSH) con gran actividade antioxidante. Ademais, as tres formas redox do xido ntrico reaccionan con oxxeno, dixido de carbono, perxido de hidrxeno, anin superxido e metais de transicin en estado inico, dando lugar a especies reactivas do nitrxeno, entre os cales cabe destacar o perxinitrito pola sa capacidade oxidante.
131
Insecticidas organoclorados: metoxicloro Os insecticidas organoclorados son compostos aril, carbocclicos ou heterocclicos de peso molecular entre 291 e 545 dalton, que actan como insecticidas de inxestin e de contacto. Estes compostos pdense clasificar segundo a sa estrutura molecular en: Derivados de hidrocarburos alicclicos, como o hexaclorociclohexano ou o lindano. Derivados de hidrocarburos ciclodinicos, tales como o aldrn, endrn, dieldrn, clordano, endosulfn e heptacloro. Derivados de hidrocarburos terpnicos, entre os que destacan o toxafeno e a clordecona. Derivados de hidrocarburos aromticos. Neste grupo encontraranse o diclorodifenil-tricloroetano (DDT) e o metoxicloro, no cal nos centramos a continuacin. O nome qumico do metoxicloro o 1,1,1-tricloro-2,2-bis (4-metoxifenil) etano. Sintetizouse coa finalidade de substitur o DDT, posto que presenta menor toxicidade e curta persistencia nos sistemas biolxicos. O metoxicloro eficaz contra unha ampla variedade de insectos como moscas, mosquitos e cascudas. un praguicida amplamente utilizado en cultivos agrcolas, en silos de almacenamento de cereais, en xardinera e en animais domsticos.
Figura 1. Estrutura qumica do metoxicloro
As vas mis frecuentes de exposicin ao insecticida son a inhalatoria, a drmica e a inxesta alimentaria. A sa presenza foi evidenciada no 1,2% das mostras de alimentos analizadas en EEUU, o cal representa un consumo diario de 0,1 a 0,8 g de metoxicloro neste pas (Gunderson, 1988). Ademais, encontrronse residuos deste praguicida en mostras biolxicas, concretamente en tecido adiposo e sangue de mulleres do sur de Espaa (Botella e col., 2004). Este xenobitico exerce a sa principal accin txica sobre o sistema nervioso ao interferir no fluxo de ins a travs das membranas das clulas nerviosas, prolongando o tempo de apertura das canles de sodio. A intoxicacin aguda por metoxicloro ca-
132
racterzase por tremores, convulsins e outros signos neurolxicos de estimulacin. En canto exposicin crnica, o sistema reprodutor a principal diana deste praguicida. Presenta actividade estroxnica e induce diversos efectos sobre o sistema reprodutor. Concretamente, observronse cambios histopatolxicos nos rganos do sistema reprodutor e glndulas accesorias e alteracins dos niveis das hormonas sexuais (Borgeest e col., 2002). As mesmo, este praguicida un depresor do sistema nervioso central, observndose alteracins diversas na concentracin de neurotransmisores nas distintas rexins cerebrais (Lafuente e col., 2007). Metoxicloro, estrs oxidativo e xido ntrico O estrs oxidativo foi amplamente estudado como mecanismo de toxicidade dos pesticidas entre os que se encontra o metoxicloro (Koner e col., 1998; Kale e col., 1999; McCormack e col., 2005). Neste sentido, diversos grupos de investigacin evidenciaron alteracins do sistema reprodutor a travs dun aumento do estrs oxidativo inducido pola exposicin a este ltimo pesticida. Mis concretamente, o tratamento con este xenobitico implica un descenso da actividade das encimas antioxidantes superxido dismutasa, catalasa, glutatin redutasa e glutatin peroxidasa, as como un aumento dos niveis de peroxidacin lipdica en testculo (Latchoumycandane e Mathur, 2002), epiddimo e esperma de rata (Latchoumycandane e col., 2002). Algns destes efectos poden observarse nas figuras 2 e 3 que se presentan a continuacin.
Figura 2. Efecto do metoxicloro sobre a actividade da encima superxido dismutasa en testculo de rata adulta (adaptado de Latchoumycandane e Mathur, 2002)
133
Figura 3. Efecto do metoxicloro sobre a peroxidacin lipdica en epiddimo de rata adulta (adaptado de Latchoumycandane e col., 2002)
Estes mesmos efectos foron observados no ovario de rato por Gupta e col. (2006). Neste ltimo estudo avaliouse, ademais, a producin de nitrotirosina, un marcador da producin de especies reactivas do oxxeno, mediante inmunohistoqumica en ovario de animais tratados co praguicida.
Figura 4. Efecto do metoxicloro sobre a producin de nitrotirosina en ovario de rato control (panel A) e exposto a metoxicloro (panel B). Pdese observar unha tinguidura positiva para nitrotirosina (cor vermella) nos animais tratados (adaptado de Gupta e col., 2006)
No sistema nervioso central, ao igual que ocorre no sistema reprodutor, o metoxicloro induce efectos txicos a travs dos mecanismos nos que est implicado o estrs oxidativo. De feito, Schuh e col. (2005) evidenciaron, tanto in vitro como in vivo, que a exposicin a este xenobitico inhibe a respiracin mitocondrial no cerebro da
134
rata (Figura 5), resultando nun incremento da producin de especies reactivas do oxxeno.
Figura 5. Representacin grfica dos cambios no potencial de membrana mitocondrial, medido a travs da fluorescencia do tetrametil rodamina metil ster (TMRM), en mostras de cerebro de rata tras sucesivas adicins de metoxicloro (mxc) (adaptado de Schuh e col., 2005)
Recentemente foi estudado o papel do xido ntrico na inmunotoxicidade do metoxicloro. Neste sentido, Kim e col. (2005) demostraron que este praguicida altera a funcin inmune a travs dun aumento da expresin xnica de iNOS e da producin de xido ntrico en macrfago de rato. Este incremento da sntese de xido ntrico levara consigo unha sobreproducin de especies reactivas do nitrxeno, tales como peroxinitrito, relacionado coa patoxnese de numerosas enfermidades (Chirino e col., 2006).
135
Figura 6. Efecto do metoxicloro sobre a producin de xido ntrico en macrfago de rato. Os niveis de producin de xido ntrico determnanse mediante a medida da acumulacin de nitrito no medio do cultivo (adaptado de Kim e col., 2005)
Por outra parte, tras o tratamento con este mesmo txico observronse diversas alteracins da secrecin episdica de prolactina a travs de cambios na sntese de xido ntrico no eixe hipipotlamo-hipofisario (Lafuente e col., 2006).
Figura 7. Patrn episdico de prolactina. Os asteriscos indican os pulsos de prolactina durante o perodo estudado. Mstrase o patrn de prolactina en ratas control (panel I); en animais tratados con N-nitro-L-arxinina metil ster (L-NAME), un bloqueante da sntese de xido ntrico (panel II); en ratas expostas a metoxicloro (panel III); e en animais tratados con metoxicloro e L-NAME (panel IV) (adaptado de Lafuente e col., 2006)
136
BIBLIOGRAFA
Borgeest, C., Symonds, D., Mayer, L. P., e col. (2002). Toxicol. Sci., 68, 473-478. Botella, B., Crespo, J., Rivas, A., e col. (2004). Environ. Res., 96, 34-40. Chirino, Y. I., Orozco-Ibarra, M., Pedraza-Chaverri, J. (2006). Rev. Invest. Clin., 58, 350-358. Fernndez-lvarez, A., Abudara, V., Morales, F. R. (1999). Actas Fisiol., 5, 39-77. Gunderson, E. (1988). J. Assoc. Off. Anal. Chem., 71, 1200-1209. Gupta, R. K., Schuh, R. A., Fiskum, G., e col. (2006). Toxicol. Appl. Pharmacol., 216, 436-445. Hogg, N., Kalyanaraman, B. (1999). Biochim. Biophys. Acta, 1411, 378-384. Kale, M., Rathore, N., John, S., e col. (1999). Toxicol. Lett., 105, 197-205. Kim, J. Y., Oh, K. N., Han, E. H., e col. (2005). Biochem. Biophys. Res. Commun., 333, 1234-1240. Koner, B. C., Bannerjee, B. D., Ray, A. (1998). Ind. J. Exp. Biol., 36, 395-398. Lafuente, A., Cabaleiro, T., Cano, P., e col. (2006). J. Circadian Rhythms, 4, 3. Lafuente, A., Cabaleiro, T., Caride, A., e col. (2007). J. Physiol. Biochem., 63, 171-177. Latchoumycandane, C., Chitra, K. C., Mathur, P. P. (2002). Reprod. Toxicol., 16, 161-172. Latchoumycandane, C., Mathur, P. P. (2002). Arch. Toxicol., 76, 692-698. McCormack, A. L., Atienza, J. G., Johnston, L. C., e col. (2005). J. Neurochem., 93, 1030-1037. Schuh, R. A., Kristin, T., Gupta, R. K., e col. (2005). Toxicol. Sci., 88, 495-504.
137
RADICAIS LIBRES E MORTE CELULAR PROGRAMADA

Rafael Balaa Fouce Dpto. Ciencias Biomdicas. Facultade de Veterinaria. Universidade de Len A apoptose unha forma de morte celular programada (PCD do ingls programmed cell death) propia dos organismos pluricelulares. Trtase dun dos principais tipos de PCD e comprende unha serie de procesos bioqumicos que inducen cambios morfolxicos especficos nas clulas anteriores sa morte. Estes cambios morfolxicos inclen a vacuolizacin, cambios na membrana celular como a perda da asimetra e do acoplamento, colapso celular, fragmentacin nuclear, condensacin da cromatina e fragmentacin do ADN xenmico. Durante a apoptose, as clulas desempean un papel activo e controlado da sa propia morte (polo que se falou de suicidio celular), mentres que na necrose a morte celular un proceso descontrolado que conduce lise das clulas e inducin dunha resposta inflamatoria. A investigacin en apoptose experimentou un substancial desenvolvemento durante a dcada dos noventa. Ademais da sa importancia como fenmeno biolxico, establecronse relacins entre procesos apoptticos defectuosos e unha gran variedade de enfermidades que non tiveran explicacin sen o coecemento do dito proceso. A importancia deste campo de investigacin foi recoecida o 7 de outubro de 2002 co Premio Nobel de Medicina concedido polas investigacins sobre crecemento e apoptose no nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans (Metzstein e col., 1998). O premio compartrono os Doutores H. Robert Horvitz do Instituto de Tecnoloxa de Massachusetts (EEUU), Sydney Brenner do Instituto de Ciencias Moleculares Berkeley, CA (EEUU) e John E. Sulston, Instituto Wellcome Trust Sanger en Cambridge (GB). Dada a novidade deste campo de investigacin, moitos dos termos que se utilizan proceden da literatura anglosaxona, o que os fai, frecuentemente, ilexibles para o lector non acostumado. Por esta razn recompilamos un amplo glosario de termos ao final do captulo. A apoptose como proceso fisiolxico. A apoptose prodcese durante o desenvolvemento normal dos organismos pluricelulares e contina durante toda a sa vida adulta (Lockshin e Zakeri, 2007). A combinacin da apoptose e a proliferacin celular a encargada de dar forma a tecidos e rganos no desenvolvemento embrionario (Penaloza e col., 2008). A diferenza da necrose, que unha forma traumtica de morte celular resultante dunha lesin celular aguda, a apoptose confire vantaxes ao organismo durante o seu ciclo vital. Por exemplo, a diferenciacin dos dedos e os ps dun embrin humano en desenvolvemento prodcese grazas a que as clulas
138
dos espazos interdixitais sofren un proceso de apoptose; como resultado aparecen dedos separados. Calclase que entre 50-70 x 109 clulas morren cada da nun humano adulto medio debido apoptose. Isto equivale proliferacin e posterior destrucin dunha masa celular igual ao peso do corpo dun individuo nun ano. A apoptose tamn unha parte importante da regulacin do sistema inmunolxico. Os linfocitos T son clulas do sistema inmunolxico responsables da destrucin de clulas infectadas ou danadas no corpo (Everett e McFadden, 1999). Os linfocitos T maduran no timo pero, antes de que poidan entrar no torrente sanguneo, son postas a proba para asegurarse de que son eficaces contra antxenos estraos e para evitar que reaccionen fronte a clulas sas. Calquera linfocito T inefectivo ou auto-reactivo elimnase a travs da inducin da apoptose (Brenner e col., 2008). As alteracins da regulacin da apoptose relacionronse con procesos patolxicos. O cancro unha enfermidade que a mido se caracteriza por unha inhibicin do proceso apopttico. As clulas cancerosas adoitan ter certo tipo de mutacins que lles permiten eludir os sinais celulares de regulacin do seu crecemento e proliferacin. En circunstancias normais, as clulas danadas somtense naturalmente apoptose, a diferenza das clulas cancerosas, cuxas mutacins poden ter ocorrido nos lugares que controlan este proceso. Nestes casos non hai control da proliferacin celular e, en consecuencia, a enfermidade pode progresar a un tumor. Entender como se regula a apoptose en procesos tumorais de gran interese no desenvolvemento dos tratamentos contra esta enfermidade (Engelmann e Bauer, 2000; Pietsch e col., 2008). Hai outras enfermidades relacionadas cunha exacerbacin do proceso apopttico. Por exemplo, as enfermidades neurodexenerativas como o prkinson ou o alzheimer son procesos morbosos onde un exceso de apoptose est relacionado coa perda progresiva de neuronas (Nunomura e col., 2007). A apoptose tamn importante para o desenvolvemento normal da placenta. No trofoblasto as clulas da placenta invaden o contorno uterino co fin de remodelar os vasos sanguneos maternos e axudar a establecer e manter a xestacin (Dash e col., 2005). Para lograr este obxectivo necesario un control estrito sobre a proliferacin celular e a apoptose. Nalgns casos este proceso pode verse comprometido e un exceso de apoptose das clulas de trofoblasto pode estar implicado en certas complicacins da xestacin como a preeclampsia (Allaire e col., 2000). A apoptose desempea un papel importante na progresin de moitas enfermidades autoinmunes. Por exemplo, na artrite reumatoide unha excesiva proliferacin de clulas sinoviais pode ser debida en parte resistencia destas clulas aos estmulos apoptticos. Noutros casos, a falta de regulacin da apoptose dos linfocitos T pode
139
orixinar clulas auto-reactivas que ao entrar na circulacin sangunea contriben aparicin de enfermidades autoinmunes (Ortona e col., 2008). O proceso da apoptose. Tras a recepcin de sinais especficos que inducen s clulas a someterse apoptose, vanse producir unha serie de cambios morfolxicos programados. Unha familia de protenas coecidas como caspasas (do ingls cysteine-aspartic acid proteases") actvase normalmente nas primeiras etapas da apoptose (Chowdhury e col., 2008). Estas proteasas encrganse de romper compoentes celulares necesarios para a funcin normal da clula inclundo protenas estruturais do citoesqueleto, protenas nucleares e encimas de reparacin do ADN. As caspasas tamn poden activar outras encimas degradativas, como certas endonucleasas, que desintegran o ADN xenmico en pequenos fragmentos (Chen e Wang, 2002). As clulas apoptticas cambian a sa morfoloxa durante o proceso, empezando por unha diminucin no seu volume, como consecuencia da destrucin das lminas e os filamentos de actina do citoesqueleto. A ruptura da cromatina no ncleo conduce a mido condensacin nuclear (cariorrese) que en moitos casos d lugar a que os ncleos apoptticos adquiran forma de ferradura. Por ltimo, a clula fragmntase en pequenos corpos apoptticos que facilitan a sa eliminacin polos macrfagos sen inducir un proceso inflamatorio (Jin e El-Deiry, 2005). Estas clulas fagocticas son as responsables da limpeza das clulas apoptticas dos tecidos dunha forma limpa e ordenada, evitando moitos dos problemas relacionados coa morte celular necrtica. Co fin de promover a sa fagocitose, as clulas apoptticas xeran cambios na membrana plasmtica que desencadean a resposta dos macrfagos. Un deses cambios a translocacin de fosfatidilserina (PS) desde a cara interior da membrana plasmtica ao exterior (Kagan e col., 2000). Os estmulos que inducen a unha clula a entrar en apoptose poden ser extrnsecos, relacionados coa unin de ligandos indutores de morte a receptores de membrana (Zimmermann e col., 2001). Estes ligandos poden ser factores solubles ou poden estar expresados na superficie das clulas como os linfocitos T citotxicos. Estes ltimos prodcense cando as clulas T recoecen clulas danadas ou infectadas con virus e poen en marcha a apoptose co fin de evitar que se convertan en neoplsicas (cancro) ou que favorezan a propagacin da infeccin. Noutros casos a apoptose pode iniciarse seguindo sinais intrnsecos que se producen como consecuencia dunha situacin de estrs. As alteracins da fisioloxa celular que conducen apoptose xorden en resposta da exposicin a radiacins, txicos, deprivacin de factores de crecemento ou estrs oxidativo causado por radicais libres. En xeral, os sinais intrnsecos inician a apoptose por un proceso mediado pola mitocondria (Schultz e Harrington, 2003).
140
A protena p53: arresto celular ou apoptose. A protena p53 un importante factor de transcricin dos organismos pluricelulares que participa activamente na regulacin do ciclo celular e acta, por conseguinte, como supresor tumoral na prevencin do cancro (Kern e col., 1991). A protena p53 pode restrinxir o crecemento celular inducindo a senescencia, parando o ciclo celular (nas fases G1 e G2) ou inducindo a apoptose. Os mecanismos bioqumicos utilizados por p53 para desencadear estes procesos s se entenden parcialmente e son obxecto de constante estudo. Entre os factores que interveen na activacin de p53 inclense os niveis de expresin da protena, o tipo de sinal de estrs, o tipo de clulas e o contexto celular no momento do estrs (Haupt e col., 2003). En condicins normais p53 unha protena de curta duracin. O inhibidor Mdm2 da p53 (Hdm2 nos seres humanos) o responsable da conservacin de p53 neste estado. Mdm2 inhibe a actividade transcricional de p53 e, o que mis importante, promove a sa degradacin polo proteosoma (Chen e col., 1995). No entanto, a actividade transcricional de p53 pode alterarse drasticamente cando as clulas estn expostas a diferentes tipos de estrs, como a producin de radicais libres, o dano ao ADN, a expresin inoportuna de oncoxenes, a hipoxia e o esgotamento de nucletidos, entre outros. A activacin de p53 supn a estabilizacin da protena e o incremento da sa unin ao ADN e, por conseguinte, a sa actividade transcricional. A participacin da protena p53 nas diferentes rutas apoptticas un dos obxectivos que se comentarn nas diferentes seccins do presente captulo. A ruta extrnseca. Papel dos receptores de morte. Os receptores de morte (DR do ingls death receptor) son protenas da superficie celular que transmiten os sinais externos de morte ao unrselles ligandos especficos, tales como Fas, TNF- e TRAIL. Desempean un papel importante na apoptose e poden activar a cascada de caspasas en cuestin de segundos. A inducin da apoptose a travs deste mecanismo polo tanto moi rpida (Schtze e col., 2008). Describronse seis DRs: FasR, TNFR1, DR3, TRAIL-R1 (ou DR4) TRAIL-R2 (ou DR5) e DR6. Estes receptores estn compostos por tres cadeas polipptidicas idnticas, teen elementos de sinalizacin e unin comns, as como caractersticas individuais nicas. Cada un dos seis DRs ten un dominio de morte (DD do ingls death domain) intracelular que funciona como un mdulo de unin protena-protena que recruta diversas molculas de sinalizacin citoslica que conforman as rutas apoptticas (Fig. 1).
141
Figura 1. Figura das rutas de regulacin e control da apoptose
Anda que hai diferenzas nas vas de sinalizacin activadas polos distintos DR, posible desear un esquema xeral deste proceso. A unin dos ligandos de morte aos seus DR promove o seu agrupamento a gran escala na superficie celular. Este agrupamento de receptores importante porque axuda a completar a sinalizacin da apoptose. En ausencia da dita agrupacin, algunhas clulas como os linfocitos T son capaces de desencadear a apoptose, pero na maiora dos casos a amplificacin da va de sinalizacin necesaria para activar unha resposta apopttica completa. Despois da unin do ligando prodcese un cambio conformacional nos DD intracelulares dos receptores que permite o recrutamento de varias protenas apoptticas citoslicas ao receptor. Este complexo de protenas denomnase DISC (do ingls Death-Inducing Signalling Complex). O paso final deste proceso o recrutamento da pro-caspasa 8 por DISC que promove o seu autoprocesamento e como consecuencia a iniciacin da apoptose (Peter e Krammer, 2003). Sinalizacin ligada ao receptor TNF-. As clulas T activadas e os macrfagos producen o Factor de Necrose Tumoral alfa (TNF-) como resposta infeccin. Mediante a activacin do seu receptor, TNFR1, TNF- pode inducir varios efectos (Chen e Goeddel, 2002). TNF- pode inducir por si s a apoptose, pero a diferenza do ligando Fas, TNF- pode promover en certo tipo de clulas a activacin de NF-kB
142
e AP-1, que son factores de transcricin primarios involucrados na proliferacin e supervivencia celular. A unin de TNF- ao seu receptor provoca a sa trimerizacin e a consecuente agrupacin dos seus DD. Isto permite a unin dunha molcula adaptadora chamada TRADD (do ingls Tumor necrose factor Receptor-1-Associated Death Domain protein) a travs das interaccins entre os DD (Shakibaei e col., 2005). TRADD tamn pode asociarse con FADD (do ingls Fas-Associated Death Domain), o que conduce inducin da apoptose a travs do recrutamento e activacin da pro-caspasa 8. Sinalizacin por Fas (CD95). O ligando Fas (chamado tamn CD95L) activa a apoptose de forma similar do receptor de TNF-. A unin de Fas ao seu receptor (FasR) provoca a sa trimerizacin ou establecemento intracelular do seu correspondente DISC e a activacin da cascada de caspasas (Schtze e col., 2008). No entanto, a sinalizacin mediada por FasR lixeiramente mis sinxela que a de TNFR1. A protena adaptadora FADD pode ser recrutada directamente polo DD sen que sexa necesaria a presenza de TRADD. FADD servir para recrutar molculas de pro-caspasa 8 ao complexo de sinalizacin Fas por interaccins homotpicas entre os dominios efectores de morte de cada protena (Scaffidi e col., 1998). A inducin da apoptose por TRAIL. A inducin da apoptose por TRAIL (do ingls TNF-Related Apoptose-Inducing Ligand) similar de Fas ao unirse ao seu receptor (Bedi, 2002). A unin de TRAIL aos seus receptores DR4 ou DR5 desencadea axia a apoptose na maiora das clulas estudadas. Ademais, describronse receptores reclamo que poden competir pola unin de TRAIL a DR4 e DR5. Estes reclamos chmanse DcR1 e DcR2, e son capaces de competir con DR4 ou DR5 para a unin do seu ligando, no entanto a unin a estes receptores non desencadea a apoptose. Por un lado, DcR1 carece de DD, mentres que DcR2 ten truncado un fragmento de 4 a 6 aminocidos no DD necesarios para o recrutamento de protenas adaptadoras (Ashkenazi e Dixit, 1999). A ruta intrnseca. Papel da mitocondria na apoptose. A mitocondria o lugar onde se realiza o metabolismo oxidativo dos eucariotas, proporcionando ATP a travs da fosforilacin oxidativa e o citocromo c. A funcin mitocondrial parece ser crtica na execucin do programa da morte dalgunhas clulas, e a activacin destes orgnulos celulares un elemento crucial para a coordinacin e integracin da apoptose (Smith e col., 2008). A mitocondria contn moitas protenas pro-apoptticas tales como o Factor Indutor da Apoptose (AIF do ingls Apoptose Inducing Factor), Smac (do ingls Second Mitochondria-derived Activator of Caspases)/DIABRO e o citocromo c. Estes factores son liberados ao citoplasma a travs dos denominados poros de permeabilidade transitoria (poros PT) que se forman na membrana externa. Os poros PT frmanse pola accin de certos membros pro-apoptticos da familia
143
de protenas Bcl-2, que sa vez son activados por factores tales como o estrs, os radicais libres de oxxeno (ROS) e nitrxeno ou a deprivacin de factores de crecemento (Orrenius, 2007). A mitocondria participa tamn amplificando a sinalizacin apopttica dos receptores de morte mediante a activacin da protena Bid (un membro pro-apopttico da familia Bcl-2) mediada pola caspasa 8. O papel das protenas Bcl-2. As protenas da familia Bcl-2 participan de distintas maneiras na ruta intrnseca da apoptose. Algns dos seus membros (Bcl-2 e Bcl-XL) son protenas anti-apoptticas, mentres que outros (como Bad, Bax ou Bid) son, pola contra, protenas pro-apoptticas (Youle e Strasser, 2008). A sensibilidade das clulas aos estmulos apoptticos intrnsecos vai depender do balance na expresin dos membros desta familia. Cando hai un exceso de protenas pro-apoptticas as clulas son mis sensibles a experimentar apoptose, pola contra, cando existe un exceso de protenas anti-apoptticas as clulas son mis resistentes a sufrir este proceso (Adams e Cory, 2001). A familia Bcl-2 comprende tanto a protenas anti-apoptticas (pro-supervivencia) como pro-apoptticas (pro-morte). Os membros da familia clasifcanse sobre a base da sa semellanza estrutural cos dominios de homoloxa (BH) a Bcl-2 (BH1, BH2, BH3 e BH4) e un dominio de transmembrana. Os membros con funcin anti-apopttica son Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1, conteen os catro dominios BH conservados. Ademais dos dominios externos, os membros desta familia conteen dominios transmembrana que serven para a sa suxeicin membrana externa da mitocondria. Os membros pro-apoptticos da familia Bcl-2 conteen tres dominios BH (BH1, BH2 e BH3) pero carecen do dominio BH4; entre estas protenas destacaremos Bak, Bax e Bok. A pesar de que todos os membros da familia Bcl-2 conteen un dominio BH3, este parece ser especialmente importante nas protenas con funcin pro-apopttica. A sobreexpresin de Bak promove a morte por apoptose en contraposicin de Bcl-2 expresado en condicins salvaxes. O dominio BH3 suficiente, anda que non necesario, para a liberacin de citocromo c e a activacin das caspasas. O terceiro grupo de protenas Bcl-2 son aquelas que teen soamente en comn o dominio BH3, e que se comportan como protenas pro-apoptticas: Bad, Bid, Bik, Bim, Blk e Hrk. Bad e Bid carecen de dominio transmembrana, e polo tanto estn dispersas no citoplasma. Estas das protenas parecen exercer a sa accin pro-apopttica formando heterodmeros con Bcl-2 e Bcl-XL (Wong e Puthalakath, 2008). Os membros da familia Bcl-2 asociados coa membrana externa da mitocondria non s teen actividade ligada ao receptor mediada polos seus dominios BH, senn que tamn poden afectar a integridade da mitocondria alterando o trfico de ATP, o potencial da membrana () e configurando poros PT polos que o citocromo c se vai liberar ao citoplasma. A liberacin do citocromo c ao citosol vai acompaada
144
dunha disipacin do mitocondrial que se atribe apertura dos poros PT, cuxa composicin bioqumica anda descoecida. En funcin da composicin en dominios BH as protenas da familia Bcl-2 homodimerizarn ou heterodimerizarn, dando lugar sa funcin pro- ou anti-apopttica, respectivamente. As protenas pro-apoptticas da familia Bcl-2 teen localizacin citoplasmtica e actan como sensores de estrs e/ou dano celular. Tras un sinal de estrs, estas protenas relocalzanse na superficie da mitocondria onde interaccionan cos seus homlogos anti-apoptticos alterando a sa funcin inhibitoria e orixinando a formacin de poros PT (Murphy e col., 2000). A liberacin de citocromo c da mitocondria un proceso particularmente importante na inducin da apoptose, xa que conduce formacin do apoptosoma, un complexo de proteasas moi activo nas fases finais de execucin da apoptose (Ow e col., 2008). Bid unha unin entre as rutas extrnseca e intrnseca. A protena pro-apopttica Bid distnguese doutras por conectar a activacin dos DR da ruta extrnseca coa activacin dos procesos asociados cos trastornos mitocondriais da ruta intrnseca. A activacin de Bid supn o seu procesamento citoplasmtico pola caspasa-8 para expor un novo N-terminal de residuos de glicina que se somete miristoilacin posttraducional (Belka e col., 2000). A protena Bid miristoilada trasldase mitocondria, insrese na membrana e activa Bax e Bak para iniciar a ruta intrnseca que conduce formacin do apoptosoma. O xene BID regulado post-transcricionalmente por p53 como resposta radiacin- a travs de elementos reactivos no primeiro intrn do xene humano ou no promotor do xene do rato. A quimiosensibilidade celular aos compostos xenotxicos adriamicina e 5-fluorouracilo parece depender da presenza de p53 e Bid inalterados. Mutantes nulos en Bid son resistentes aos efectos destes frmacos. A fase de execucin: caspasas e apoptose. As caspasas son unha familia de protenas encargadas da execucin final da apoptose. As caspasas pertencen a un grupo de encimas coecidas como cisten-proteasas que existen dentro da clula como zimxenos inactivos. A hidrlise destes zimxenos orixina as formas encimaticamente activas que participan nas fases finais da apoptose (Budihandjo e col., 1999). A inducin da apoptose a travs dos DR provoca a activacin de caspasas iniciadoras 8 e 10 na fase extrnseca. Pola sa parte, a activacin das caspasas 9 e 2 responde aos cambios no mitocondrial na ruta intrnseca. A activacin das caspasas iniciadoras produce o procesamento das caspasas executoras 3, 6 e 7, que son as responsables da destrucin das protenas do citoesqueleto e orixinan os cambios morfolxicos tpicos observados nas clulas apoptticas.
145
A protena p53 estimula a activacin da cascada de caspasas por mecanismos dependentes e independentes de transcricin. Como resposta irradiacin- de extractos de clulas S100 (libres de ncleos) a p53 pode activar por si soa a caspasa-8. No entanto, a morte mediada polo composto xenotxico etopsido en fibroblastos procedentes de ratos deficientes en caspasa-8 non se ve afectada. Polo tanto, a caspasa-8 pode contribur, anda que non sempre esencial, a inducir a morte por apoptose en clulas co ADN danado. Ademais, a protena p53 estimula a caspasa-6 ao interaccionar cun elemento de resposta no terceiro intrn do seu xene codificante (MacLachlan e El-Deiry, 2002). A caspasa-6 destre a protena da lmina nuclear A e varios factores de transcricin (Galande e col., 2001). Ademais, a caspasa-6 xoga un papel importante na morte neuronal inducida por p53 e a principal protena implicada na destrucin da protena precursora amiloide (LeBlanc e col., 1999). O apoptosoma. Ademais da activacin dos DR, existen outros mecanismos moleculares para activar a cascada de caspasas. Por exemplo, ao engadir granzima B a linfocitos-T citotxicos, actvanse as caspasas 3, 7, 8 e 10. As mitocondrias son tamn reguladores principais da cascada de caspasas e da apoptose. A liberacin do citocromo c das mitocondrias pode conducir activacin da caspasa 9 e logo da caspasa 3. Este proceso est mediado pola formacin do apoptosoma, un complexo protenico composto por citocromo c, Apaf-1 e pro-caspasa 9 (DAmelio e col., 2008). A unin desta ltima facilita o seu autoprocesamento, dando lugar forma activa de caspasa-9, que unha caspasa iniciadora capaz de activar caspasas executoras tales como a caspasa 3 (Fig. 1). A protena Apaf-1 (do ingls Apoptose protease-activating factor-1) un regulador clave da va apopttica mitocondrial, sendo o elemento central do apoptosoma. A protena p53 induce liberacin de citocromo c da mitocondria mediante a inducin de xenes diana que codifican protenas cun nico dominio BH3. importante destacar que p53 induce tamn a expresin do xene codificante APAF-1 a travs dun elemento de resposta dentro do seu promotor (Schuler e Green, 2001). Caspasas e a destrucin da cromatina. Unha das caractersticas da apoptose a degradacin do ADN cromosmico en unidades nucleosomais. As caspasas xogan un papel importante neste proceso mediante a activacin de endonucleasas que dixiren o ADN en secuencias concretas, intervindo ademais na inhibicin de encimas de reparacin do ADN e a destrucin de protenas estruturais do ncleo. En primeiro lugar, a fragmentacin do ADN en unidades nucleosomais producida por unha endonucleasa coecida como CAD (do ingls Caspase Activated DNAse). CAD existe normalmente como un complexo inactivado pola protena ICAD (do ingls Inhibitor of CAD). Durante a apoptose, ICAD dixerido pola caspasa 3 liberando CAD activo que produce a rpida fragmentacin do ADN nuclear. En
146
segundo lugar, prodcese unha inactivacin de encimas de reparacin do ADN (Nagata, 2000). A encima poli (ADP-ribosa)-polimerasa- que unha importante encima de reparacin- foi unha das primeiras protenas identificadas como substrato da caspasa 3 (Chiarugi e Moskowitz, 2002). Por ltimo, as caspasas executoras van dixerir as protenas da envoltura nuclear, como a lmina A, que manteen a forma do ncleo e interveen nas interaccins entre a cromatina e a membrana nuclear. A degradacin da lmina A pola caspasa 6 orixina a condensacin da cromatina e a fragmentacin do ncleo (Utz e Anderson, 2000). Recoecemento e eliminacin das clulas apoptticas. Despois de todos os procesos descritos con anterioridade vanse producir unha serie de cambios na membrana plasmtica que conducen exposicin da PS desde a cara interna da membrana plasmtica ao exterior da clula. Dos lpidos que compoen a membrana plasmtica, unicamente a PS se encontra na sa cara interna, non estando en contacto cos compoentes do sangue. Ademais, vanse producir cambios internos que afectan a morfoloxa do ncleo e a desintegracin do ADN xenmico por CAD en fragmentos de 180 a 200 kpb (escaleiras de ADN) que se separarn nos corpos e/ou vesculas apoptticas. As vesculas apoptticas son eliminadas por fagocitose, polo que para ser recoecidas polos macrfagos non suficiente con que invertan a posicin da PS, senn que deben existir outro tipo de receptores expresados especificamente para o seu recoecemento. O anticoagulante Anexina V unido a unha tinguidura fluorescente nese PS traslocada ao exterior da clula apopttica permitindo unha fcil deteccin mediante tcnicas de citometra de fluxo e/ou microscopa de fluorescencia (Blankenberg, 2008). Os corpos apoptticos son axia eliminados por macrfagos ou clulas dendrticas antes de que poidan necrotizar e comezar un proceso inflamatorio; desta xeito evtanse procesos autoreactivos e autoinmunes.
Abreviaturas: PCD: Programmed Cell Death; PS: fosfatidilserina; DR: Death Receptor; DD: Death Domain; DISC: Death-Inducing Signalling Complex; TNF-; Factor de Necrose Tumoral alfa; TRADD; Tumor Necrose Factor Receptor-1-Associated Death Domain; FADD: Fas-Associated Death Domain; TRAIL: TNFRelated Apoptose-Inducing Ligand; AIF: Apoptosis Inducing Factor; SMAC: Second Mitochondria-derived Activator of Caspases; poros PT: poros de Permeabilidade Transitoria; ROS: Reactive Oxygen Species; : potencial de membrana mitocondrial; Apaf-1: Apoptosis protease-activating factor-1; CAD: Caspase Activated DNAse; ICAD: Inhibidor de CAD
Glosario de termos por orde alfabtica

Anexina V: Protenas que se unen a fosfolpidos en presenza do calcio. Cando se establece a apoptose, a fosfatidil serina traslcase cara externa da membrana plasmtica quedando exposta ao medio externo. Este movemento da fosfatidil serina un indicador de apoptose temper. A anexina V nese forte e especificamente fosfatidil serina e serve como indicador de apoptose por mtodos de microscopia e/ ou citometra de fluxo. Apaf-1: Factor activador de proteasas apotsicas-1. Apaf-1 unha protena adaptadora asociada ruta intrnseca da apoptose que se une pro-caspasa 9 a travs do dominio de activacin e recrutamento,
147
orixinando a activacin da caspasa 9 en presenza de citocromo c e ATP conducindo cascada de proteasas apoptticas. AIF: Factor indutor da apoptose. Flavoprotena mitocondrial con homoloxa coas oxidoredutasas bacterianas. Pode inducir cambios morfolxicos apoptticos no ncleo por unha ruta independente das caspasas. Bad: Membro pro-apopttico da familia de protenas Bcl-2. Bad comparte identidade con Bcl-2 unicamente no dominio BH3 e forma heterodmeros con Bcl-2 e Bcl-XL previndo a accin anti-apopttica destas e promovendo a apoptose. Familia de protenas Bcl-2: Os membros desta familia teen tanto propiedades pro- como anti-apoptticas. Todos os membros teen polo menos un dos catro motivos de homoloxa con Bcl-2 ou dominios BH (BH1 a BH4), que interveen na interaccin entre protenas. Os membros con propiedades anti-apoptticas inclen: Bcl-2, Bcl-XL e Mcl-1. Pola sa parte os membros con propiedades pro-apoptticas incle a: Bax, Bak e Bok e comparten tres dominios BH (BH1, BH2, BH3). Unha subfamilia adicional cun nico dominio BH3 en comn son as protenas pro-apoptticas: Bik, Hrk, Bim Blk, Bad, e Bid. O domino BH3 o que confire propiedades pro-apoptticas ao unirse e antagonizar coas protenas antiapoptticas Bcl-2 e Bcl-XL. CAD: ADNasa activada por caspasas. Endonucleasa endxena que fragmenta o ADN celular e que se utiliza como marcador da apoptose. Caspasas 1-14: Cisten proteasas activadas por aspartato. As caspasas existen como zimxenos inactivos e teen que ser activadas de forma progresiva formando unha cascada. Despois da sa activacin, as sas dianas son o ADN e o citoesqueleto da clula, intervindo de maneira decisiva na formacin dos corpos ou vesculas apoptticas. Citocromo c: Protena mitocondrial asociada normalmente fosforilacin oxidativa. Durante a ruta intrnseca da apoptose o citocromo c librase ao citoplasma a travs dos poros PT, onde se une a Apaf-1 inducindo o autoprocesamento da pro-caspasa 9 no apoptosoma. A liberacin do citocromo c ao citoplasma est regulada polos membros da familia de protenas pro- e anti-apoptticas Bcl-2. DD: Dominio de morte. Fragmento intracelular dos DR, que crtico nos procesos de sinalizacin da ruta extrnseca da apoptose. DISC: Complexo de sinalizacin indutor de morte. un complexo de protenas que incorpora aos DD citoslicos dos DR (por exemplo de FasR), unha protena adaptadora (por exemplo FADD) e a caspasa 8 na ruta apopttica extrnseca. DR: Receptores de morte. Membros da superfamilia de receptores do TNF. Interveen na sinalizacin da ruta extrnseca da apoptose. FADD: Protena adaptadora asociada ao DD Fas. FADD unha molcula esencial no recrutamento da procaspasa 8 durante a inducin da apoptose polo ligando Fas. Fas: (Chamado tamn CD95 e Apo-1) Ligando de Fas, protena homotrimrica pertencente familia de TNF. FasR: Receptor do ligando Fas da superficie celular membro da superfamilia de receptores TNF. O DD citoplasmtico de Fas asciase con FADD que acta como adaptador no recrutamento da pro-caspasa 8 que se autoprocesar para iniciar a ruta extrnseca da apoptose. Granzima B: Sern proteasa presente nos grnulos das clulas NK (natural killers) e dos linfocitos T citotxicos. Granzima B pertence a unha familia de 11 sern proteasas que degradan protenas inducido
148
PCD pola activacin de diferentes cascadas de caspasas. A granzima B promove a liberacin do citocromo c da mitocondria ICAD: Inhibidor da endonucleasa CAD. Ten a funcin dunha chaperona activada por caspasas durante a sa sntese. Permanece acomplexada a CAD inhibindo a sa actividade endonucleasa. As caspasas activadas durante a apoptose degradan ICAD liberando a endonucleasa no ncleo e permitindo a degradacin do ADN xenmico en fragmentos de 180 a 200 kpb. p53: Supresor proteico nuclear do cancro humano que acta como regulador crtico na supervivencia e proliferacin celular. Esta fosfoprotena nuclear de 393 amino cidos regula a expresin dos xenes codificantes DR na inducin da apoptose. Estes inclen Fas e o TNF relacionado coa inducin de apoptose ligada a DR5. Nalgns tipos de tumores (como no cancro de mama) pode establecerse unha relacin entre o funcionamento anormal de p53 e un pronstico adverso. PoroPT: Poro de permeabilidade transitoria da mitocondria: poro reversible da membrana interna mitocondrial inducido por Ca2+ que permite a liberacin de compoentes mitocondriais presentes no espazo intermembranoso. PS: Fosfatidil serina. Lpido situado na cara interna da membrana plasmtica que se externaliza durante a apoptose e serve como criterio diagnstico. Smac/DIABRO: Activador secundario de caspasas derivado da mitocondria humana. O equivalente murino, DIABRO un inhibidor directo da apoptose por unin a protenas con baixo punto isoelctrico. Tras a liberacin das mitocondrias, elimina o efecto inhibitorio de moitos inhibidores de protenas apoptticas. TNF: Familia de ligandos do factor de necrose tumoral. Foron identificados polo menos 16 membros. A maora dos membros sintetzanse como precursores transmembrana de tipo II. Os seus dominios extracelulares poden ser escindidos por metaloprotenas formando citoquinas solubles. Tanto as formas solubles como as de membrana nense aos receptores da familia de receptores TNF. TNFR1: Membro da superfamilia de receptores do TNF que pose un DD. Outros membros desta superfamilia: FasR, DR3, TRAIL1, TRAIL2 e DR6. Cada un destes receptores pode iniciar directamente a apoptose. TRADD: Dominio de morte asociado ao receptor de TNF. nese TFR1, pero a diferenza do DD asociado a Fas, o TRADD non leva un dominio efector de morte, e o seu DD responsable da apoptose mediada. Acta como unha plataforma adaptadora no recrutamento de varias molculas de sinalizacin para a activacin do receptor. TRAIL: TNF relacionado co ligando indutor de apoptose (tamn chamado Apo-2), un tipo de protena transmembrana de tipo II que pertence superfamilia do TNF, que inducen a apoptose nunha ampla gama de clulas transformadas pero non en clulas normais. Describronse dous DR (TRAILR1/DR4 e TRAILR2/DR5) e outros dous receptores non indutores de morte (TRAILR3/DcR1 e TRAILR4/DcR2). Participan de maneira crucial na supresin da metstase tumoral e inhiben a activacin dos linfocitos T, progresin do ciclo celular, e producin de citoquinas en clulas T autoreactivas.
BIBLIOGRAFA
Adams, J.M., Cory, S. (2001). Trends in Biochem. Sc., 26, 61-66. Allaire, A.D., Ballenger, K.A., Wells, S.R., e col. (2000). Obstet. and Gynecol., 96, 271-276. Ashkenazi, A., Dixit, V.M. (1999). Curr. Opin. Cell Biol., 11, 255-60. Bedi, A. (2002). Cancer Biol. Ther., 1, 638-639.
149
Belka, C., Rudner, J., Wesselborg, S., e col. (2000). Oncogene, 19, 1181-1190. Blankenberg, F.G. (2008). J. Nucl. Med., 49, 81S-95S. Brenner, D., Krammer, P.H., Arnold, R. (2008). Crit. Rev. Oncol. Hemat., 66, 52-64. Budihardjo, I., Oliver, H., Lutter, M., e col. (1999). Ann. Rev. of Cell Develop. Biol., 15, 269-290. Chen, G., Goeddel, D.V. (2002). Science, 296, 1634-1635. Chen, J., Lin, J., Levine, A.J. (1995). Mol. Med., 1, 142-152. Chen, M., Wang, J. (2002). Apoptosis, 7, 313-319 (2002). Chiarugi, A., Moskowitz, M.A. (2002). Science, 297, 259-263. Chowdhury, I., Tharakan, B., Bhat, G.K. (2008). Comp. Biochem. and Physiol. B, 151, 10-27. DAmelio, M., Tino, E., Cecconi, F. (2008). Pharma. Res., 25, 740-751. Dash, P.R., Whitley, G.S., Ayling, L.J., e col. (2005). Cell. Signall., 17, 571-580. Engelmann, I., Bauer, G. (2000). Anticancer Res., 20, 2297-2306. Everett, H., McFadden, G. (1999). Trends Microbiol., 7, 160-165. Galande, S., Dickinson, L.A., Mian, I.S., e col. (2001). Mol. Cell. Biol., 21, 5591-5604. Haupt, S., Berger, M., Goldberg, Z., e col., (2003). J. Cell Sc., 116, 4077-4085. Jin, Z., El-Deiry, W.S. (2005). Cancer Biol. Ther., 4, 139-163. Kagan, V.E., Fabisiak, J.P., Shvedova, A.A., e col. (2000). FEBS Lett., 477, 1-7. Kern, S.E., Kinzler, K.W., Bruskin, A., e col. (1991). Science, 252, 1708-1711. LeBlanc, A., Liu, H., Goodyer, C., e col. (1999). J. Biol. Chem., 274, 23426-23436. Lockshin, R.A., Zakeri, Z. (2007). J. Cell. Mol. Med., 11, 1214-1224. MacLachlan, T.K., El-Deiry, W.S. (2002). Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 99, 9492-9497. Metzstein, M.M., Stanfield, G.M., Horvitz, H.R. (1998). Trends Genet., 14, 410-416. Murphy, K.M., Ranganathan, V., Farnsworth, M.L., e col. (2000). Cell Death Differ., 7, 102-111. Nagata, S. (2000). Exp. Cell Res., 256, 12-18. Nunomura, A., Moreira, P.I., Lee, H.G., e col. (2007). CNS Neurol. Disord.- Drug Targets, 6, 411-423. Orrenius, S. (2007). Drug Metab. Rev., 39, 443-455 Ortona, E., Margutti, P., Matarrese, P., e col. (2008). Autoimmun. Rev., 7, 579-584. Ow, Y.P., Green, D.R., Hao, Z., e col. (2008). Nature Rev. Mol. Cell Biol., 9, 532-542. Penaloza, C., Orlanski, S., Ye, Y., e col. (2008). Curr. Pharma. Design, 14, 184-196. Peter, M.E., Krammer, P.H. (2003). Cell Death Differ., 10, 26-35. Pietsch, E.C., Sykes, S.M., McMahon, S.B., e col. (2008). Oncogene, 27, 6507-6521. Scaffidi, C., Fulda, S., Srinivasan, A., e col (1998). EMBO J., 17, 1675-1687. Schuler, M., Green, D.R. (2001). Biochem. Soc. T., 29, 684-688. Schultz, D.R., Harrington, W.J. Jr. (2003). Seminars in Arthritis and Rheumatism, 32, 345-369. Schtze, S., Tchikov, V., Schneider-Brachert, W. (2008). Nature Rev. Mol. Cell Biol., 9, 655-662 Shakibaei, M., Schulze-Tanzil, G., Takada, Y., e col (2005). Antiox. Redox Sign., 7, 482-496. Smith, D.J., Ng, H., Kluck, R.M., Nagley, P. (2008). IUBMB Life, 60, 383-389. Utz, P.J., Anderson, P. (2000). Cell Death Differ., 7, 589-602. Wong, W.W., Puthalakath, H. (2008). IUBMB Life, 60, 390-397.
Youle, R.J., Strasser, A. (2008). Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 9, 47-59. Zimmermann, K.C., Bonzon, C., Green, D.R. (2001). Pharma. Therapeut., 92, 57-70.
151
NEUROTOXICIDADE, ESTRS OXIDATIVO, ENFERMIDADES NEURODEXENERATIVAS E ANTIOXIDANTES

M. Anunciacin Lafuente Laboratorio de Toxicoloxa. Facultade de Ciencias. Universidade de Vigo Estrs oxidativo e neurotoxicidade Durante a evolucin dos organismos, a supervivencia nun ambiente aerbico pasou pola xeracin de respostas de adaptacin, tanto para o metabolismo oxidativo endxeno como para os produtos qumicos e radiacin de baixo nivel a que se encontraban expostos e que levaban consigo a xeracin de radicais libres, o que deu lugar a diversos sistemas de defensa antioxidantes (Genestra, 2007). No organismo prodcese un estado de estrs oxidativo debido xeracin excesiva de radicais libres e/ou ao dficit nestes mecanismos antioxidantes, co conseguinte dano celular e tisular, lesins agudas ou dexenerativas, necrose, morte celular, etc. (Sies, 1991). A maior parte das especies reactivas do oxxeno (ROS) xeradas na clula estn relacionadas coa reducin incompleta do oxxeno na cadea de transporte electrnico mitocondrial, estimndose que o 1% do fluxo de electrns mitocondrial intervn na formacin de radicais superxido (Lass e col., 1997). Como podemos observar na Figura 1 (Sayre e col., 2008), a producin mitocondrial de ROS parte da formacin do anin superxido ao captar o O2, un electrn da cadea de transporte electrnico. Este anin pode transformarse en perxido de hidrxeno (H2O2) mediante unha reaccin catalizada pola encima superxido dismutasa (SOD). Posteriormente, o H2O2 dar lugar ao radical hidroxilo mediante a reaccin de Fenton (na que participan metais de transicin en estado inico). En ausencia de SOD, a dismutacin do anin superxido d lugar xeracin do oxxeno singlete, ou ben pode reaccionar con xido ntrico (NO) para formar peroxinitrito.
152
O dano oxidativo producido nas macromolculas biolxicas por ROS foi vinculado fisiopatoloxa de numerosas enfermidades, tales como a ateroesclerose, cancro, cataratas, enfermidade de parkinson (EP), enfermidade de alzheimer (EA), diabetes, artrite, enfermidades autoinmunes e inflamacins crnicas, entre outras, e acelera o proceso biolxico do envellecemento. No caso do cancro, as ROS producen unha oxidacin do material xentico e en lpidos, dando lugar a produtos como o malondialdehdo e o 4-hidroxi-2-nonenal, que son potentes mutxenos e modulan as vas de sinalizacin implicadas na proliferacin e a apoptose dos procesos relacionados co desenvolvemento do cancro (Mrquez e col., 2007).
Figura 1. Producin mitocondrial de ROS
O sistema nervioso central (SNC) particularmente sensible ao estrs oxidativo debido ao seu gran consumo de O2, e presenta concentracins relativamente baixas de antioxidantes endxenos (vitamina C, catalasa, superxido dismutasa, etc.), e niveis elevados de lpidos poliinsaturados, os cales son moi susceptibles oxidacin. A nivel de SNC, os radicais libres pdense xerar como resultado da respiracin mitocondrial, como consecuencia de procesos inflamatorios, ou ben por unha excesiva exposicin a radiacins ou compostos txicos (Blass e Gibson, 1999). Durante os procesos inflamatorios o sistema mieloide, que constite un mecanismo de defensa fronte a infeccins a travs da producin de radicais libres e ROS, actvase e sofre cambios morfolxicos transformndose en microgla ameboide (Kreutzberg, 1996; Aloisi e col., 1999). Esta secreta factores solubles, a maiora dos cales son proinflamatorios e neurotxicos, como o factor de necrose tumoral- (TNF-), interleuquina-1 (IL-1), prostaglandina E2 (PGE2), NO e ROS (Blanco e col., 2008).
153
A sobreproducin e acumulacin destes factores proinflamatorios ten carcter neurotxico (Block e Hong, 2005) e xoga un papel fundamental na patoxnese de diversas enfermidades neurodexenerativas. Outro aspecto que hai que ter en conta a excitotoxicidade inducida por glutamato. O glutamato un aminocido neurotransmisor, responsable da maior parte da actividade sinptica excitatoria no cerebro dos mamferos (Fonnum, 1984), involucrado nos procesos de estrs oxidativo que teen lugar no cerebro a travs de dous mecanismos. O primeiro deles est mediado polos seus receptores ionotrpicos, cuxa sobreactivacin induce unha entrada masiva de calcio ao citosol e consecuentemente mitocondria, provocando estrs oxidativo e activacin de mecanismos moleculares responsables de desencadear a morte neuronal apopttica, tales como:
Proteasas, nucleasas e lipasas. A peptidasa calpaina I cataliza a conversin de xantino deshidroxenasa a xantino oxidasa, que participa en reaccins a travs das cales se producen ROS. xido ntrico sintasa. Fosfolipasa A2, encima que induce un aumento dos niveis de cido araquidnico, a cal activa a prostaglandina H sintetasa, xerndose ROS neste proceso. Ademais, esta encima estimula a autooxidacin da dopamina, que leva consigo a producin de ROS.
O segundo mecanismo a travs do cal o glutamato induce neurotoxicidade est mediado pola sa unin ao transportador de cistena, posto que a privacin deste ltimo aminocido causa un descenso da concentracin intracelular de glutatin e unha acumulacin de ROS (Bannai e Kitamura, 1980). sa vez, o aumento nos niveis de ROS relacionouse cun incremento da secrecin de glutamato (PellegriniGiampietro e col., 1990). Por outra parte, o glutamato pode ter un papel neuroprotector (Frade e col., 2008). Tal e como se mostra na Figura 2 (Frade e col., 2008), este aminocido neurotransmisor regula a liberacin de glutatin reducido desde os astrocitos, xa que induce extracelularmente un incremento dos niveis deste, que pode ser empregado polas neuronas para incrementar o contido intracelular de glutatin reducido (Dringen, 2000), facndoas mis resistentes ao estrs oxidativo inducido por glutamato (Gegg e col., 2005). Ademais o glutatin reducido podera competir pola unin aos receptores de glutamato (Oja e col., 2000).
154
Figura 2. Regulacin dos niveis de glutatin reducido por glutamato (Frade e col., 2008)
Envellecemento e enfermidades neurodexenerativas Existen multitude de teoras sobre o envellecemento. Medvedev, na sa revisin de 1990, describiu mis de 300 mecanismos para explicar este proceso. Na actualidade acptanse das destas teoras:
Teoras deterministas. Segundo as cales os procesos de envellecemento estn programados dentro da informacin do material xentico. Teoras estocsticas. O envellecemento estara ligado a alteracins xenticas e desorganizacin celular inducidas polo estrs oxidativo.
Ligadas ao proceso de envellecemento encntranse as enfermidades neurodexenerativas, entre as que destacan a EA e a EP por ser as que presentan unha maior incidencia. Na patoxnese destas enfermidades est implicado o estrs oxidativo, considerado a principal causa de dano neuronal, anda que non est claro se unha causa, un resultado ou un epifenmeno do proceso patolxico ao estar intimamente ligado a outros compoentes da evolucin dexenerativa. Inicialmente o estrs oxidativo promove a formacin de pptido -amiloide no caso da EA e a agregacin da protena -sinuclena en EP. Posteriormente, en ambas as das patoloxas obsrvase neurotoxicidade inducida por glutamato e un aumento da concentracin intracelular de calcio coa conseguinte activacin de encimas calcio-dependentes (NADPH oxidasa, fosfolipasa A2 citoslica, xantino oxidasa e xido ntrico sintasa neuronal), producndose un aumento de ROS e RNS. Ao mesmo tempo, o dano mitocondrial inducido por estas especies induce unha activacin da sntese de ROS e da liberacin
155
de calcio. O estrs oxidativo pode tamn estimular os astrositos e a microglia, o que inducira un aumento da secrecin de citoquinas e o inicio da resposta inflamatoria (Shibata e Kobayashi, 2008). Nas reas cerebrais afectadas en EA e a EP observouse unha perda da homeostase de metais de transicin redox-activos (como cobre e ferro) e redox-inactivos (como zinc). Estes metais que son esenciais nos sistemas biolxicos (por exemplo, participan na reaccin de Fenton), en situacins patolxicas acumlanse en tecidos e poden ter propiedades neurotxicas, xa que median reaccins de estrs oxidativo (Sayre e col., 2000), e poden producir danos estruturais en pptidos e protenas. A EP caracterzase por unha alteracin no control motor debido dexeneracin de neuronas dopaminrxicas na substancia negra pars compacta (SNpc). Existen diversas hipteses para explicar a dexeneracin neuronal nesta estrutura cerebral. A hiptese do estrs oxidativo basase en estudos nos que se demostra a potencial xeracin de H2O2 e doutras ROS durante o metabolismo da dopamina (DA) (Graham, 1978). Este neurotransmisor pode ser metabolizado por encimas endxenos como as monoamina oxidasas (MAO), ou ben espontaneamente mediante autooxidacin, xerndose H2O2 e quinonas (Sulzer e Zecca, 2000), con capacidade de danar protenas con grupos sulfhidrilo como o caso do glutatin. Estes feitos foron corroborados en anlise postmortem de cerebros de enfermos de EP, nos que se observaron niveis elevados de estrs oxidativo e de ferro na SNpc, baixas concentracins de glutatin, un aumento da peroxidacin lipdica e oxidacin de ADN e protenas (Sian e col., 1994; Alam e col., 1997). importante mencionar o descenso na actividade do complexo I na cadea de transporte electrnico mitocondrial observado en enfermos de EP (Schapira e col., 1990), o que levara consigo un incremento da xeracin de ROS, que podera alterar a cadea respiratoria, coa conseguinte producin de ROS e dano mitocondrial (Zhang e col., 1990). Ao mesmo tempo, a consecuente deplecin enerxtica podera alterar o almacenamento vesicular de DA, incrementndose a concentracin citoslica de DA autooxidable (Dauer e Przedborski, 2003). A inflamacin foi tamn implicada na patoxnese da EP. Neste sentido, observronse niveis elevados de ciclooxixenasa-2 e microgla reactiva en cerebros de enfermos de EP (Teismann e col., 2003). Por outra parte, a activacin da microglia est asociada cunha alteracin da regulacin do xido ntrico sintasa inducible (iNOS), que resultara nun aumento da producin de NO. Isto suxire que o estrs nitrosativo podera xogar un papel importante nesta enfermidade. Ademais, estes enfermos presentan unha maior concentracin de glutamato en SNP.
156
En canto EA, esta caracterzase por unha perda progresiva de memoria debido deposicin extracelular do pptido -amiloide nas placas sens, e a aparicin de nobelos neurofibrilares. O pptido -amiloide prodcese a partir da divisin encimtica da protena precursora de amiloide, mentres que os nobelos neurofibrilares estn compostos por unha protena do citoesqueleto, denominada TAU. O pptido -amiloide induce unha neurodexeneracin a travs dun aumento extracelular de glutamato, un incremento da concentracin intracelular de calcio, apoptose e a xeracin de radicais libres. En enfermos de alzheimer atopronse niveis elevados de zinc, ferro e cobre no cerebro, que poderan participar na agregacin de pptidos -amiloide (Connor e col., 2001). Datos epidemiolxicos e estudos experimentais recentes indican que a exposicin a diversos txicos ambientais, como herbicidas, metais pesados e o composto metilfenil-tetrahidropiridina (MPTP), estn relacionados coa patoxnese de enfermidades neurodexenerativas. No caso do paraquat, a exposicin a este herbicida relacionouse cunha perda de neuronas dopaminrxicas e morte celular por apoptose (Peng e col., 2004). Evidenciouse tamn que o funxicida rotenona induce unha dexeneracin do sistema dopaminrxico nigroestriatal, alteracins motoras (Inden e col., 2007) e unha inhibicin do complexo I da cadea de transporte electrnico mitocondrial, o que conduce a un esgotamento do glutatin e un incremento do estrs oxidativo (Schuler e Casida, 2001). O cadmio est tamn implicado na etioloxa das enfermidades neurodexenerativas a travs dun incremento na producin de ROS (Chen e col., 2008). Antioxidantes Os antioxidantes poderan protexer contra a neurotoxicidade inducida polo estrs oxidativo (Quintanilla e col., 2005). De feito, viuse nun estudo in vitro que a oxidacin de protenas, peroxidacin lipdica e neurotoxicidade inducidos polo pptido -amiloide son inhibidos tras o tratamento con vitamina E (Behl, 1999). Melatonina A melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) unha neurohormona sintetizada fundamentalmente nos pinealocitos a partir do aminocido triptfano. Est implicada en numerosas funciones, como a regulacin dos ritmos circadianos, do sono, a funcin inmune, a presin sangunea, etc. tamn un potente antioxidante, podendo actuar directamente como scavenger de radicais libres, ou indirectamente, a travs da inducin de encimas antioxidantes, a estimulacin da sntese de glutatin, o incremento da actividade doutras substancias antioxidantes, a proteccin de encimas antioxidantes fronte ao dano oxidativo e o aumento da eficiencia da cadea de transporte electrnico mitocondrial (Reiter e col., 1998). unha substancia de carcter lipofli-
157
co con capacidade para atravesar a barreira hematoenceflica. De feito, o cerebral o tecido do organismo cunha maior concentracin deste composto, concentracin que depende dos niveis circulantes desta neurohormona. Durante o envellecemento descenden os niveis de melatonina (Iguchi e col., 1982). Isto importante xa que se viu que mitiga algns dos cambios indesexables asociados co dito proceso fisiolxico, as como os ligados a enfermidades neurodexenerativas e exposicin a axentes txicos implicados na patoxnese destas enfermidades (Mayo e col., 2005). O seu uso ten interese na prevencin e tratamento da EA (Pappolla e col., 2000), xa que, ademais de presentar propiedades antioxidantes, potencialmente antiinflamatorio, ao regular a actividade da ciclooxixenasa-2, e ten un papel protector fronte a excitotoxinas (Hardeland, 2005). As mesmo regula os efectos do metabolismo da protena precursora amiloide mediante a inhibicin da sa secrecin e a reducin da sntese e deposicin do pptido -amiloide (Lahiri e col., 2004), e prevn a fosforilacin da protena TAU. Tamn foron descritos efectos beneficiosos do tratamento con melatonina na EP, posto que pode evitar a acumulacin de radicais libres na mitocondria e o dano do ADN mitocondrial (Chen e col., 2005), e promove a reparacin do citoesqueleto (Benitez-King e col., 2004). Demostrouse que protexe o sistema nigro-estriatal do estrs oxidativo causado pola toxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina no rato (Thomas e Mohanakumar, 2004) e pola 6-hidroxidopamina en rata (Dabbeni-Sala e col., 2001). As mesmo, exerce un posible papel protector fronte neurotoxicidade do cadmio (Romero e col., 2008). Taurina A taurina (cido 2-aminoetano sulfnico) inxerida a travs da dieta e sintetizada a partir da cistena. un aminocido con funcins importantes no SNC, xa que neurotransmisor (Kuriyama e col., 1983), osmoregulador (Sols e col., 1988), mellora a integridade da membrana (Wright e col., 1986), modula a diferenciacin, migracin e desenvolvemento neuronal (El Idrissi e col., 1998), e un neuroprotector fronte morte celular por excitoxicidade (Huxtable, 1989). Non se coecen con claridade os mecanismos a travs dos cales exerce o seu papel protector, pero podera actuar directamente como antioxidante ao ser scavenger de radicais libres, ou indirectamente debido ao seu papel protector fronte aos cambios na permeabilidade da membrana causados polo estrs oxidativo e reducin da peroxidacin lipdica (Banks e col., 1992). Nos ltimos anos estudouse o valor teraputico da taurina no tratamento da enfermidade de Huntington (El Idrissi e col. 2003), e o seu papel protector fronte
158
neurotoxicidade de numerosos xenobiticos, tales como a micotoxina cido 3-nitropropinico (Tadros e col., 2005) e o cadmio (Sinha e col., 2008). Estradiol O estradiol atena o dano neuronal debido a traumatismos (Dubal e col., 2006), excitotoxicidade (Perrella e Bhavnani, 2005) e estrs oxidativo (Behl e col., 1995), isto ltimo debido sa capacidade antioxidante, evidenciada tanto in vitro (Vedder e col., 1999) como in vivo (Rontu e col., 2004), debida tanto capacidade antioxidante endxena da molcula do estradiol (ou grupo libre fenil hidroxilo presente no anel A da molcula interrompe a cadea de reaccins que conduce formacin de radicais libres), as como activacin de factores de transcricin que leva consigo un aumento da expresin e da actividade de encimas antioxidantes (Strehlow e col., 2003). A proteccin ten lugar mediante mecanismos dependentes e independentes do receptor, tales como o descenso da producin de ROS (Prokai e col., 2003), atenuacin de correntes de calcio (Hilton e col., 2006) e activacin de cascadas de transducin de sinais para a promocin da supervivencia (Honda e col., 2000). A administracin de estrxenos demostrou ser eficaz no tratamento de numerosos modelos de patoloxas neuronais, como a esclerose mltiple, EP, epilepsia e EA (Leranth e col., 2000; Sribnick e col., 2003; Sierra e col., 2003; Heikkinen e col., 2004). Concretamente, protexe fronte toxicidade inducida polo pptidos -amiloide (Pike, 1999), fronte toxicidade inducida por glutamato (Zaulyanov e col., 1999), por H2O2 (Moosmann and Behlm, 1999), da privacin de oxxeno e glicosa (Regan e Guo, 1997), ferro (Blum-Degen e col., 1998), hemoglobina e txicos que actan a nivel mitocondrial (Regan e Guo, 1997). De feito, estudos epidemiolxicos demostraron que a terapia estroxnica tras a menopausia est relacionada cun descenso da incidencia de enfermidades neurodexenerativas (Zandi e col., 2002), anda que esta accin neuroprotectora non se limita a femias, senn que tamn foi observada en machos (Hawk e col., 1998; Toung e col., 1998). BIBLIOGRAFA
Alam, Z. I., Jenner, A., Daniel, S. E., e col. (1997). J. Neurochem., 69, 1196-1203. Aloisi, F., Ria, F., Columba-Cabezas, S., e col. (1999). Eur. J. Immunol., 29, 2705-2714. Banks, M.A., Porter, D.W., Martn, e col. (1992). En: Lombardini JB, Schaffer SW, Azuma J, eds. Taurine: Nutritional Value and Mechanisms of Action. New York: Plenum Press, 341-359. Bannai, S., Kitamura, E. (1980). J. Biol. Chem., 255, 2372-2376. Behl, C., Widmann, M., Trapp, T., e col. (1995). Biochem. Biophys. Res. Commun., 216, 473-482. Behl, C. (1999). Int. J. Vitam. Nutr. Res., 69, 213-219. Bentez-King, G., Ramrez-Rodrguez, G., Ortiz, L., e col. (2004). Curr. Drug Targets CNS Neurol. Disord., 3, 515-533. Blanco, P., Palucka, A.K., Pascual, V., e col. (2008). Cytokine Growth Factor Rev., 19, 41-52. Review.
159
Blass, .JP., Gibson, G.E. (1999). Dement. Geriatr. Cogn. Disord., 10, 335-358. Block, M.L., Hong, J.S. (2005). Prog. Neurobiol., 76, 77-98. Review. Blum-Degen, D., Haas, M., Pohli, S., e col. (1998). Toxicol. Appl. Pharmacol., 152, 49-55. Chen, L., Liu, L., Huang, S. (2008). Radic. Biol. Med., 45, 1035-1044. Chen, L.J., Gao, E.Q., Li, X.J., e col. (2005). J. Pineal. Res., 39, 34-42. Connor, J. R., Milward, E.A., Moalem, S., e col. (2001). J. Alzheimers. Dis., 3, 471-477. Dabbeni-Sala, F., Di Santo, S., Franceschini, D., e col. (2001). FASEB J., 15, 164-170. Dauer, W., Przedborski, S. (2003). Neuron., 39, 889-909. Dringen, R., Gutterer, J.M., Hirrlinger, J. (2000). Eur. J. Biochem., 267, 4912-4916. Review. Dubal, D.B., Rau, S.W., Shughrue, P.J., e col. (2006). Endocrinology., 147, 3076-3084. El Idrissi, A., Harris, C., Trenkner, E. (1998). Adv. Exp. Med. Biol., 442, 385-396. El Idrissi, A., Messing, J., Scalia, J., (2003). Adv. Exp. Med. Biol., 526, 515-525. Fonnum, F. (1984). J. Neurochem, 42, 1-11. Review. Frade, J., Pope, S., Schmidt, M., e col. (2008) J. Neurochem., 105, 1144-1152. Graham, D.G. (1978). Mol. Pharmacol., 14, 633-643. Gegg, M.E., Clark, J.B., Heales, S.J. (2005). Brain. Res., 1036, 1-6. Genestra, M. (2007). Cell. Signal., 19, 1807-1819. Hawk, T., Zhang, E.Q., Rajakumar, G., e col. (1998). Brain. Res., 796, 296-298. Hardeland, R. (2005). Endocrine., 27, 119-130. Heikkinen, T., Kalesnykas, G., Rissanen, A., e col. (2004). Exp. Neuro., 187, 105-117. Hilton, G.D., Bambrick, L.L., Thompson, S.M., e col. (2006). Endocrinology., 147, 1246-1255. Honda, K., Sawada, H., Kihara, T., e col. (2000). J. Neurosci. Res., 60, 321-327. Huxtable, R.J. (1989). Prog. Neurobiol., 32, 471-533. Iguchi, H., Kato, K.I., Ibayashi, H. (1982). J. Clin. Endocrinol. Metab., 55, 27-29. Inden, M., Kitamura, E., Takeuchi, H., e col. (2007). J. Neurochem., 101, 1491-1504. Jenner, P. (2003). Ann. Neurol, 53, 26-36. Kuriyama, K., Ida, S., Nishimura, C., Ohkuma, S. (1983). Prog. Clin. Biol. Res., 125, 127-140. Kreutzberg, G.W. (1996). Trends. Neurosci., 19, 312-318. Review. Lahiri, D.K., Chen, D., Ge, E.W., e col. (2004). J. Pineal. Res., 36, 224-231. Lass, A., Agarwal, S., Sohal, R.S. (1997). J. Biol. Chem., 272, 19199-19204. Leranth, C., Roth, R.H., Elsworth, J.D., e col. (2000). J. Neurosci., 20, 8604-8609. Mrquez, A., Villa-Trevio, S., Guraud, F. (2007). Redox. Rep., 12, 35-39. Mayo, J.C., Sainz, R.M., Tan, D.X., e col. (2005). J. Neuroimmunol., 165, 139-149. Moorsmann, B., Behlm, C. (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 8867-8872. Pellegrini-Giampietro, D.E., Cherici, G., Alesiani, M. (1990). J. Neurosci., 10, 1035-1042. Prokai, L., Prokai-Tatrai, K., Perjesi, P., e col. (2003). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 100, 11741-1176. Oja, S.S., Janky, R., Varga, V., e col. (2000). Neurochem. Int., 37, 299-306. Pappolla, M.A., Chyan, E.J., Poeggeler, B., e col. (2000). J. Neural. Transm., 107, 203-231. Peng, J., Mao, X.O., Stevenson, F.F., e col. (2004). J. Biol. Chem., 279, 32626-3232. Perrella, J., Bhavnani, B.R. (2005). BMC. Neurosci., 6, 34.
160
Pike, C.J. (1999). J. Neurochem., 72, 1552-1563. Quintanilla, R. A., Munoz, F.J., Metcalfe, M.J., e col. (2005). J. Biol. Chem., 280, 11615-11625. Reiter, R.J., Garca, J.J., Pie, J. (1998). Restor. Neurol. Neurosci., 12, 135-142. Regan, R.F., Guo, E. (1997). Brain. Res., 764, 133-140. Romero, A., Cabaleiro, T., Caride, A., e col. (2008). Revista de Toxicologa, 25, 3-11. Rontu, R., Solakivi, T., Teisala, K., e col. (2004). Free. Radic. Res., 38, 129-137. Sayre, L.M., Perry, G., Atwood, C.S., e col. (2000). Cell. Mol. Biol., 46, 731-741. Schapira, A.H., Cooper, J.M., Dexter, D., e col. (1990). J. Neurochem., 54, 823-827. Schuler, F., Casida, J.E. (2001). Pest. Manag. Sci., 57, 932-940. Shibata, N., Kobayashi, M. (2008). Brain. Nerve., 60, 157-170. Sian, J., Dexter, D.T.. Lees, A.J., e col. (1994). Ann. Neurol., 36, 348-355. Sierra, A., Azcoitia, I., Garcia-Segura, L. (2003). Endocrine., 21, 43-51. Sies, H. (1991). Klin Wochenschr, 69, 965-968. Review. Sinha, M., Manna, P., Sil, P.C. (2008.) J. Appl. Toxicol., 28, 974-986. Sols, J.M., Herranz, A.S., Herreras, O., e col. (1988). Neurosci. Lett., 91, 53-58. Sribnick, E.A., Wingrave, J.M., Matzelle, D.D., e col (2003). Ann N Y Acad Sci, 993, 125-133. Strehlow, K., Rotter, S., Wassmann, S., e col. (2003). Circ. Res., 93, 170-177. Sulzer, D., Zecca, L. (2000). Neurotox. Res., 1, 181-195. Tadros, M.G., Khalifa, A.E., Abdel-Naim, e col. (2005). Pharmacol. Biochem. Behav., 82, 574-582. Teismann, P., Tieu, K., Choi, D.K., e col. (2003). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 5473-5478. Thomas, B., Mohanakumar, K.P. (2004). J. Pineal. Res., 36, 25-32. Toung, T.J., Traystman, R.J., Hurn, P.D. (1998.) Stroke., 29, 1666-1670. Vedder, H., Anthes, N., Stumm, G., e col. (1999). J. Neurochem., 72, 2531-2538. Wright, C.E., Tallan, H.H., Lin, Y.Y., e col. (1986). Annu. Rev. Biochem., 55, 427-453. Zandi, P.P., Breitner, J.C., Anthony, J.C. (2002). Expert .Opin. Pharmacother., 3, 365-380. Zaulyanov, L.L., Green, P.S., Simpkins, J.W. (1999). Cell. Mol. Neurobiol., 19, 705-718. Zhang, E., Marcillat, O., Giulivi, e col. (1990). J. Biol. Chem., 265, 16330-16336.
161
RADICAIS LIBRES, ESTRS OXIDATIVO E CARCINOXNESE

Arturo Hardisson de la Torre rea de Toxicoloxa. Universidade da Laguna Un radical libre unha estrutura qumica capaz de existir independentemente, de vida media curta e que pose un ou mis electrns desapareados no seu orbital mis externo. Os radicais libres poden formarse pola ruptura homoltica dun enlace molecular. Unha vez formados, poden iniciar un variado nmero de reaccins que se producen en cadea. Estrs oxidativo: o mecanismo de estres oxidativo ou mecanismo de autooxidacin explcase mediante tres tipos de reaccins secuenciais:
1.
Reaccin de INICIACIN:
Y + RH R. + YH RR R. + R RH unha estrutura que ten cidos graxos poliinsaturados.
2.
Reaccin de PROPAGACIN (ocorre en presenza de oxxeno):

R. + O2 R OO. (Radical Peroxilo) ROO. + RH ROOH (Hidroperxido) + R.
3.
Reaccin de TERMINACIN:
ROO. + ROO. ROOR + O2 ROO. + R. ROOR R. + R. RR Pode existir, as mesmo, unha reaccin de iniciacin secundaria orixinada pola ruptura homoltica de hidroperxidos: ROOH RO. + OH. 2ROOH ROO. + RO. + H2O Tamn de sumo interese o papel que xogan os metais pesados na catlise das reaccins do estrs oxidativo. Se representamos as especies metlicas como Mn+, as reaccins que se poden producir son: M n+ + ROOH RO. + OH- + M (n+1) + M (n+1) + + ROOH ROO. + H+ + M n+1 Os metais que mis frecuentemente son catalizadores deste tipo de reaccins son Fe e Cu.
162
Principais especies reactivas de oxxeno que se producen nos sistemas biolxicos Na tboa 1 descrbense as especies oxxeno activas coas sas respectivas vidas medias temperatura corporal (37C). Na Tboa 2 presntanse as especies nitrxeno activas que tamn se forman nos organismos e que teen capacidade oxidante. A molcula de oxxeno O2 pode reducirse secuencialmente segundo as reaccins seguintes:
1. 2. 3. 4.
O2 + e- O2 .- Anin superxido. O2 .- + e- +2 H+ H2 O2. Perxido de hidrxeno. H2 O2 + e- + H+ H2 O + OH.. Radical hidroxilo. OH. + e- + H+ H2O Vida media (37C)
O2 HO2 [H2O2] OH RO ROO [ROOH] [1 O2 ] O2 [-R-R]-O Radical anin superxido Radical perhidroxilo Perxido de hidrxeno Radical hidroxilo Radical alcoxilo Radical peroxilo Hidroperxido Oxxeno singlete Oxxeno molecular Epxido >10-6 Inestable 10-9 10-6 10-2 10-8 >102
Tboa 1. Principais especies reactivas de oxxeno que se producen nos sistemas biolxicos
Como se observa, se a reducin non completa ata a formacin de auga, prodcense especies oxxeno activas moi oxidantes e danias para os tecidos como son o radical superxido, a auga oxixenada e o radical hidroxilo, este ltimo o radical mis oxidante de todos. Vida media (37C/S)
NO NO2 ONOO Radical xido ntrico Radical dixido de nitrxeno Perxinitrito >1-10 0,05-1
Tboa 2. Especies reactivas de nitrxeno que se producen nos sistemas biolxicos
163
Propiedades das principais especies de oxxeno activas

a.
Oxxeno singlete ou singulete.
O oxxeno singlete presntase en das formas; o oxxeno singulete delta 1g O2 e o oxxeno singlete sigma 1g O2. O mis importante bioloxicamente o delta, xa que ten unha longa vida media fronte ao sigma, que unha especie con vida media moi curta e alta reactividade.
b.
Radical superxido.
O radical superxido resulta da captacin dun electrn por parte da molcula de oxxeno. sa vez, a reaccin entre dous radicais superxido con dous protns e catalizada pola superxido dismutasa (SOD) d lugar a auga oxixenada. Se o pH dimine, pdese formar o radical perhidroxilo.
c.
Perxido de hidrxeno.
O perxido de hidrxeno ou auga oxixenada un potente oxidante dos sistemas biolxicos que acta sobre macromolculas orgnicas disoltas na auga. Difndese pasivamente a travs das membranas celulares e convrtese nun oxidante citotxico. Como se viu no apartado anterior, pode formarse na reaccin entre dous radicais superxido catalizada pola superxido dismutasa.
d.
Radical hidroxilo.
o radical mis oxidante. A principal fonte de radicais OH. a denominada reaccin de HABER-WEISS. Producin de especies oxxeno activas nos tecidos A producin de radicais libres de oxxeno pdese levar a cabo nos sistemas biolxicos mediante:
1.
A accin de radicais sobre molculas como o retinol, a riboflavina, a clorofila ou a bilirrubina. As reaccins REDOX con metais de transicin como o Fe. As reaccins REDOX catalizadas por encimas.
2. 3.
Fontes exxenas e endxenas de radicais libres de oxxeno As fontes que proceden do medio exterior ao organismo son mltiples e variadas. Podemos destacar inflamacins, fume do tabaco, exceso de exercicio fsico, os con-
164
taminantes atmosfricos (SO2, NO2), as radiacins ionizantes e ultravioleta, certos medicamentos como anestsicos, antimicrobianos e citostticos, unha dieta moi rica en PUFAs,e a presenza de xenobiticos. As fontes intracelulares ou endxenas de radicais libres de oxxeno son tamn diversas. Entre elas pdense citar os compostos de baixo peso molecular presentes no citosol (flavinas, catecolaminas, quinonas, tiois e difenois), as molculas que conteen pigmentos como a hemoglobina e a mioglobina; as protenas encimticas (monoaminooxidasa (MAO), aldehidooxidasa ou ciclooxixenasa); os peroxisomas que son orgnulos que forman H2O2 pois teen moitas oxidasas e as cadeas de transporte electrnico mitocondrial e microsomal. Dano molecular dos radicais libres de oxxeno A producin de radicais libres de especies oxxeno activo conduce a unha interaccin coas principais molculas do organismo, tales como protenas, lpidos, hidratos de carbono e cidos nucleicos. Iso provoca unha alteracin do metabolismo celular con dano subcelular, orixinando unhas alteracins da homeostase celular (citotoxicidade) que pode conducir ao envellecemento e enfermidade (enfermidades coronarias, cancro, cataratas, etc.). Normalmente, as especies oxxeno activas e entre elas o radical OH desnaturalizan as protenas por escisin das cadeas polipeptdicas, despolimerizan os polisacridos, escinden as febras de ADN ou modifican as sas bases e peroxidan os lpidos. As mesmo, as molculas de baixo peso molecular perden a sa funcionalidade.
a.
Dano radicalario s protenas.
Os radicais actan sobre molculas proteicas que teen dobres enlaces e sobre molculas con grupos axofrados. Deste xeito, as protenas cos aminocidos triptfano, tirosina, fenilalanina, histidina, metionina e cistena, son as mis sensibles ao ataque radicalario. Un potente carcinxeno como o fume do tabaco cando entra en contacto reiterado cos pulmns incrementa os neutrfilos e cando estes se activan xeran mis radicais libres. Estes radicais A actan preferentemente sobre os grupos tilicos das protenas (-SH).
RSH + A RS + AH; RS RADICAL TIILO RS + RS R-SS-R
165
b.
Dano radicalario aos lpidos.
Os radicais libres actan sobre a fraccin insaturada dos lpidos orixinando perxidos. Os perxidos son potentes oxidantes que actan sobre a membrana celular e sobre biomolculas tales como protenas, cidos nucleicos, etc. O fenmeno de peroxidacin lipdica iniciado polos radicais OH e polos hidroperxidos ROOH. Non intervn o radical O2 -, este capaz de reaccionar cos hidroperxidos orixinando radicais alcoxilos:
O2 - + ROOH O2 + OH- + RO RO Radical alcoxilo.
O indicador da peroxidacin lipdica o aldehido malnico ou malondialdehido (O = CH-CH2-CH = O). Este pode reaccionar con bases nitroxenadas (R-NH2) do ADN.
R1-NH2+ O = CH-CH2-CH=O + H2N-R2 R1-N=CH-CH= CH-NH- R2 + 2H2O
c.
Dano radicalario aos cidos nucleicos.
O dano radicalario aos cidos ADN e ARN implica a posible aparicin de cancro. Sbese que o radical mis activo sobre estas molculas o OH . Mutacins e morte celular ascianse s reaccins de radicais libres co ADN. Cocense os lugares mis sensibles do ADN, que son: pirimidinas (timina e citosina), purinas (adeninas e guanina) e o monosacrido desoxirribosa. A exposicin do ADN aos radicais libres de oxxeno pode provocar a ruptura das cadeas deste cido nucleico, ou ben xeran sitios apurnicos ou apirimidnicos. As mesmo, e indirectamente, a rotura das febras de ADN pode deberse activacin de endonucleasas (proteasas e fosfolipasas) mediante o calcio, debido a unha alteracin da homeostase deste in divalente por dano aos canais de calcio da membrana celular. Tamn, o ADN mitocondrial unha diana moi sensible aos radicais de oxxeno reactivos, xa que a mitocondria a principal fonte de anins superxido e de auga oxixenada.
d.
Dano radicalario aos carbohidratos.
O dano aos hidratos de carbono por parte dos radicais libres abrangue desde os monosacridos ata as macromolculas polimricas. As, poden verse afectados monosacridos como a glicosa, o manitol e os desoxiazucres; os nucletidos que reaccionan co radical OH , producndose novos radicais libres altamente reactivos e os hidratos de carbono complexos que poden sufrir fragmentacins nas sas estruturas polimricas.
166
O cido hialurnico un composto formado por unidades de cido glicurnico e de N- acetilglicosamina. A sa funcin manter a viscosidade do lquido sinovial. Cando o cido hialurnico se despolimeriza, perde a sa accin lubricante. Outra enfermidade das articulacins, como a artrite reumatoide, tamn parece ter a sa orixe nun mecanismo radicalario. Sistemas de defensa antioxidante Existen no organismo diversos sistemas que nos defenden das agresins dos radicais e que manteen a homeostase do medio interno. Podemos clasificar estes sistemas en dous grupos: os sistemas defensivos primarios que son preventivos e reaccionan cos radicais directamente xerados do oxxeno bloqueando a fase de iniciacin e os sistemas defensivos secundarios que son scavenger de radicais propagadores. Os sistemas primarios poden ser de tipo encimtico ou non encimtico. Entre os primeiros atpanse as encimas superxido dismutasa (SOD), catalasa, glutatin peroxidasa, glutatin redutasa, glicosa-6-fosfato-deshidroxenasa e DT-diaforasa. Os secundarios non encimticos son: protenas, glutatin, a vitamina C, o cido rico e a taurina. Os sistemas de defensa antioxidante secundarios tamn, ao igual que os primarios, poden ser de tipo encimtico e de tipo non encimtico. As especies mis representativas na defensa antioxidante de carcter secundario son: oxidoredutasas especficas de protenas, proteasas, glutatin peroxidasa non selenio dependente, fosfolipasas e diversos sistemas de reparacin do ADN. Dentro dos non encimticos atopmonos cos tocoferois, os carotenoides, a bilirrubina e a ubiquinona. Mecanismo da carcinoxnese A aparicin de cancro nos individuos pode deberse a factores xenticos e a factores ambientais. Os factores dependentes do ambiente son probablemente dominantes na xnese do cancro. Algns autores consideran que os factores nutricionais e outros factores englobados no denominado estilo de vida poden ter relacin coa aparicin do 30% dos cancros. Na carcinoxnese considranse tales fases sucesivas, desde que unha clula normal se transforma en maligna.
167
A fase de iniciacin, na cal se produce unha mutacin (alteracin da informacin xentica) nunha molcula normal. Cabe a posibilidade da reparacin do ADN. Nesta iniciacin interveen factores xenotxicos ou carcinxenos como os hidrocarburos aromticos polinucleares, as nitrosaminas ou as aminas heterocclicas. A fase de promocin, unha fase de proliferacin celular cun perodo de latencia moi longo, que abrangue entre 10 e 30 anos. Tratarase de clulas premalignas que poden retornar normalidade ou, pola contra, converterse lentamente nunha neoplasia. Nesta fase as clulas premalignas poden pasar a clulas iniciadas mediante a utilizacin de vitaminas antioxidantes. dicir, pode ser posible a reversin. A fase de progresin, unha fase co cancro en estado constitunte, onde se produce metstase, ben por invasin dos tecidos vecios, ou ben por metstases sistmicas. Nesta fase xa non posible a prevencin e o que procede o tratamento con cirurxa, radioterapia e/ou quimioterapia. Nutrientes antioxidantes Os nutrientes antioxidantes son fundamentalmente catro: a vitamina E, a vitamina C, os carotenoides e o selenio. Vitamina E Esta vitamina est composta por 8 estruturas, 4 tocoferois e 4 tocotrienois. Destes 8 vitmeros, o de maior actividade vitamnica o -tocoferol. Esta vitamina est presente nalgns froitos secos, no xerme de trigo en aceites de sementes (aceite de oliva, xirasol, etc.). Tamn est presente en verduras, hortalizas e cereais. As propiedades da vitamina E consisten en actuar como antioxidante neutralizando os radicais libres. A vitamina E estabiliza as membranas biolxicas e protxeas da peroxidacin lipdica. Ademais, intervn na agregacin plaquetaria, a hemlise e na activacin de certas encimas. Tamn mellora a resposta inmunolxica do organismo. A vitamina E un antioxidante sinrxico con certos sistemas antioxidantes endxenos como a glutatin peroxidasa, a catalasa e a superxido dismutasa (SOD). sa vez, a vitamina C e o glutatin reducido poden rexenerar o -tocoferol a partir do radical tocoferilo. Tamn a vitamina E protexe a vitamina A e inhibe a conversin de nitritos en nitrosaminas potencialmente cancerxenos. Vitamina C O ser humano necesita vitamina C para evitar unha enfermidade carencial chamada escorbuto. Quimicamente o cido L-ascrbico, a forma D inactiva. O cido Lascrbico atpase fundamentalmente nos vexetais frescos. Os alimentos que con-
168
teen mis vitamina C son a acerola, a grosella e o amorodo. No entanto, as fontes mis importantes para a poboacin son os ctricos (laranxa, limn, lima e kiwi). A vitamina C un potente axente redutor e como se trata dunha vitamina hidrosoluble, atribenselle as mellores propiedades antioxidantes do lquido extracelular, anda que tamn ten efectos no lquido intracelular. Carotenoides Estes compostos de cor amarela avermellada ou laranxa divdense en dous grupos: os carotenos e as xantofilas. Dentro dos carotenos, atopamos compostos provitamina A, tales como o -caroteno, o -caroteno e o -caroteno e outros non provitamnicos, tales como o licopeno, o fitoeno e o fitoflueno. sa vez, as xantofilas teen compostos provitamnicos como a -criptoxantina e non provitamnicos como a lutena, a zeaxantina, a cantaxantina e a equinenona. Os mecanismos de proteccin que exercen os carotenoides sobre as clulas fundamntanse na sa accin fotoprotectora fronte aos efectos masivos das radiacins solares, ou tamn actuando sobre os radicais de oxxeno activo responsables do estrs oxidativo celular. Non todos os carotenoides teen accin antioxidante, pero os que teen actividade son os seguintes: o -caroteno, o -caroteno, a -criptoxantina, a lutena e o licopeno, este ltimo o captador de radicais mis potente do grupo, que non ten actividade provitamnica e que se encontra presente en cantidades altas no tomate. Selenio O selenio forma parte do sistema defensivo do corpo e un protector do dano orixinado polos radicais libres do oxxeno. O selenio un compoente da encima glutatin-peroxidasa que destre os perxidos dos cidos graxos. Unha molcula desta encima contn 4 tomos de selenio, por iso se considera unha encima selenio dependente. Dada a capacidade que ten o Se para substitur o S dos aminocidos axofrados, este oligoelemento atpase predominantemente presente nos alimentos proteicos. Polo tanto, atpase maioritariamente en alimentos de orixe animal, como a carne, as vsceras e os mariscos. Tamn est presente en alimentos vexetais do grupo dos legumes, cereais e froitos secos. Obviamente, estes ltimos ao consumrense en pouca cantidade non achegan suficiente selenio dieta. Outros alimentos vexetais como as froitas e as hortalizas apenas teen selenio. Os grupos de risco que presenten achegamentos subclnicos de selenio son persoas novas con dietas desequilibradas, vexetarianos, ancins que viven sos e non coidan a sa dieta, mulleres xestantes e lactantes, fumadores e enfermos crnicos. Os efectos do selenio son os seguintes:
169
un antioxidante que prevn a peroxidacin dos lpidos celulares. Prevn a formacin de cogulos inhibindo a formacin plaquetaria. Aumenta a resistencia do sistema inmune. Inhibe o dano aos cromosomas, as infeccins e o cancro. fundamental para a producin de hormonas tiroideas. Ten un efecto antitxico contra os efectos prexudiciais dos metais pesados.
O selenio activa os linfocitos T e os macrfagos, polo que se considera un potente estimulador do sistema inmune. Hai zonas do mundo con moi baixos niveis de selenio, como Escandinavia ou a rexin de Keshan en China, onde se presentou unha enfermidade que afecta o msculo cardaco sobre todo en mulleres novas e nenos. Antioxidantes non nutrientes Est composto por grupos fenlicos e polifenlicos, entre os que destacan os bioflavonoides. Tamn debemos destacar ubiquinona, que un antioxidante liposoluble sintetizado polas clulas animais. Os bioflavonoides non teen accin vitamnica, pero reducen a permeabilidade e/ou fraxilidade capilar. Tamn forman complexos con metais divalentes tales como o Fe2+ e o Cu2+, o que evitara o papel cataltico destes ins no estrs oxidativo. Atpanse en alimentos estimulantes como o t ou o caf, o vio tinto, as olivas, a soia, etc. A ubiquinona o coencima Q de tanta importancia no metabolismo intermediario, acta como molcula antioxidante e rexeneradora da vitamina E, unha vez que o tocoferol reaccionou cunha especie radicalaria. Exemplos de xenobiticos con mecanismo de toxicidade radicalario Tetracloruro de carbono: un potente axente hepatocarcinxeno que geneta o radical Cl3C , que un potente axente alquilante, fortemente electroflico e capaz de reaccionar con molculas nucleoflicas como o ADN. Aflatoxina B1: outro potente hepatocarcinxeno, que se atopa en cereais e pensos contaminados polo fungo do xnero Aspergillus. Esta molcula metabolzase seguindo reaccins de oxidacin. A sa biotransformacin orixina varios metabolitos, un dos cales a aflatoxina B1 Epxido, que capaz de reaccionar con macromolculas celulares como o ADN. Na Figura 1 presntanse os metabolitos da aflatoxina B1 que se producen na sa biotransformacin.
170
Figura 1. Metabolismo da aflatoxina B1
Nitrosaminas: son compostos presentes nos alimentos que resultan da reaccin dos nitritos con aminas secundarias ou terciarias. Son cancerxenos de diversos rganos e o seu mecanismo de toxicidade dexenera na formacin de 3 axentes alquilantes, que son: diazoalcano, sal de diazonio e in carbonio. Na Figura 2 mstrase o proceso de formacin e descomposicin das nitrosaminas coa aparicin de axentes alquilantes.
Figura 2. Formacin e descomposicin de nitrosaminas
171
3,4-Benzopireno: este hidrocarburo aromtico policclico un composto presente no fume do tabaco e en alimentos afumados. Considrase o axente produtor do cancro de pulmn nos fumadores. O seu mecanismo de toxicidade provn da sa biotransformacin oxidativa en metabolitos epoxi. O epxido-benzopireno nese guanina do ADN, colocndose entre a dobre hlice deste cido nucleico, o que leva consigo a unha replicacin defectuosa desta molcula e na posterior aparicin de cancro. A Figura 3 representa a interaccin do 3,4-benzopireno e a dobre hlice do ADN.
Figura 3. Interaccin do benzopireno co ADN
BIBLIOGRAFA
Gil, A. (2005). Tratado de nutricin (Tomo I). Accin mdica. Madrid. Pokorny, J., Yanishlieva, N., Gordon, M. (2005). Aplicaciones prcticas. Ed. Acribia, S.A. Zaragoza. Tolonen, M. (1995). Vitaminas y minerales en la salud y la nutricin. Ed. Acribia, S.A. Zaragoza. Rojas, E. Vitaminas y accin antioxidante. Merk. Madrid (1996). Mijavila, M.T., Lpez, D., Saiz, M.P. (2001). Los radicales libres y su implicacin en procesos fisiolgicos y patolgicos. NCP Documenta. N 258, 1-7. Steven, S.I. (1997). Salemh. Oxidants, antioxidants, and free radicals. Taylor and Francis. Washington DC. Hardisson, A., Gonzlez Weller, D.M., Revert, C. (2006). En: Camen, A.M., Repetto, M. ed. Toxicologa alimentaria. Daz de Santos. Madrid, 593-608.
BLOQUE III. APLICACINS
175
QUIMIOMETRA E ANTIOXIDANTES
Carlos Herrero Latorre Dpto. Qumica Analtica, Nutricin e Bromatoloxa. Facultade de Ciencias. Universidade de Santiago de Compostela A quimiometra unha rama da qumica analtica que se define como a utilizacin de tcnicas estatsticas, matemticas e de lxica formal para: (a) desear ou seleccionar procedementos experimentais ptimos, (b) extraer a mxima informacin relevante mediante a anlise de datos qumicos e (c) obter calquera coecemento de sistemas qumicos. Nos ltimos anos, a quimiometra converteuse nunha ferramenta fundamental na investigacin sobre os antioxidantes: In the research on the antioxidant capacity, the improvent of the current methods and the development of new evaluation tools are clarly prime objectives for the future One very recent solution looks highly promising, it envolves subjecting a set of samples to various analysis methods and then procesing the results trhough chemometric procedures... (Laguerre e col., 2007). Os aspectos de maior utilizacin de tcnicas quimiomtricas na investigacin en antioxidantes son os seguintes:
Propoer, desenvolver e optimizar metodoloxas analticas para a determinacin de compostos con capacidade antioxidante. Avaliar e modelizar a capacidade antioxidante de diferentes compostos. Caracterizar diferentes tipos de alimentos (pola sa orixe xeogrfica, calidade) en relacin coa sa composicin qumica e, en especial, en funcin da sa achega en compostos antioxidantes.
Esta ponencia divdese en das partes: 1. Fundamentos quimiomtricos e 2. Aplicacins quimiomtricas na investigacin sobre antioxidantes. Fundamentos quimiomtricos Os procedementos agrupados segundo as diferentes tcnicas foron as seguintes: Tcnicas de visualizacin Anlise en compoentes principais Anlise de clusters Tcnicas de regresin multivariada PLS (Partial least squares regression) PCR (Principal component regression) Redes neuronais
176
Tcnicas de recoecemento de modelos supervisadas Anlise discriminante KNN (K-nearest neighbours) SIMCA (Soft independent modelling of class analogy) Redes neuronais
No presente resumo non se pretende profundar na explicacin destes procedementos matemticos, polo que unicamente se recomenda un conxunto de textos bsicos de quimiometra que poden servir ao interesado para coecer as bases matemticas e estatsticas das tcnicas antes indicadas. Vxanse por exemplo: Meloun e col., 1992; Vandeginste e col.,1998 e Kowalski, 1984. Aplicacins quimiomtricas na investigacin sobre antioxidantes 1. Proposicin, desenvolvemento e optimizacin das metodoloxas analticas para a determinacin de compostos con capacidade antioxidante Mediante diversos exemplos ilstrase a posibilidade de desenvolver novas metodoloxas analticas nas que a medida dun conxunto amplo de variables ou sinais analticos permite calibrar e determinar simultaneamente diferentes tipos de axentes oxidantes nunha nica medida de forma rpida e eficiente. Vxanse como exemplos a determinacin de Butylated hydroxyanisole (BHA), Butylated hydroxytoluene (BHT), Propyl gallate (PG) e tert-Butylhydroquinone (TBHQ) a partir dunha medida voltamtrica e posterior calibracin multivariada (Ni e col., 2000); ou o uso doutro diferente sinal analtico como a absorcin infravermella, que serviu para a determinacin, neste caso, de antioxidantes (Irganox 1010 e Irgafos 168) en polietileno empregando unha regresin PLS para a cuantificacin dos citados antioxidantes (Camacho e Karlsson, 2002). 2. Avaliacin e modelizacin da capacidade antioxidante de diferentes compostos Os estudos de avaliacin e, no seu caso, posterior modelizacin da actividade antioxidante de diferentes compostos en diferentes condicins, constiten a aplicacin mis habitual da quimiometra investigacin nos antioxidantes. Empregronse diversas tcnicas de regresin multivariada e de clasificacin para a predicin da capacidade oxidante de certos compostos en funcin da sa estrutura molecular (estudos estrutura-actividade: QSAR). Un exemplo moi ilustrativo son os traballos de Weber e col. (2006a, 2006b); no primeiro destes desenvlvese un modelo de regresin multivariada no que, en funcin das caractersticas qumicas de diferentes flavonoides, predise con xito a sa actividade antioxidante. No segundo caso o enfoque distinto, basendose nas mesmas propiedades clasifcanse os flavonoides
177
en cuestin mediante diversos sistemas multidimensionais, quedando estes agrupados en funcin da sa actividade antioxidante. Outros exemplos poden ser: Farkas e col. (2004) que empregaron PLS para a predicin da actividade antioxidante doutro conxunto de diferentes flavoniodes; Kamal e Anderson (1997) que avaliaron a actividade antioxidante de tocoferol proveniente de diferentes aceites vexetais; e Dumarey e col. (2008) que mediante os diferentes modelos de regresin (PCR e PLS) modelizaron a actividade antioxidante de t verde en funcin dos datos cromatogrficos. 3. Caracterizacin dos diferentes tipos de alimentos en funcin da sa achega de compostos antioxidantes Neste ltimo bloque de aplicacins presentronse diversos exemplos de uso das distintas tcnicas de clasificacin para a caracterizacin e tipificacin de alimentos en funcin da sa composicin qumica, e en especial, tendo en conta a posible achega dieta de compostos con poder antioxidante. Garca e col. (2003) demostraron a diferente composicin polifenlica de catro aceites de oliva virxe procedentes de catro variedades de oliva diferentes (Picual, Arbequina, Hojiblanca e Cornicabra) e por ende, a sa diferente capacidade de achega de antioxidantes. Neste traballo desenvolveron un modelo de clasificacin que permite a diferenciacin das catro clases de aceites. Similares formulacins foron levadas a cabo por outros autores en diferentes tipos de alimentos: Betroncelj e col. (2007) en mel, Rebolo e col. (2000) en vios, Hernndez e col. (2005) en tomate, Jahan (2005) en carne de polo, entre outros. Conclusin A aplicacin de tcnicas quimiomtricas informacin qumica obtida na investigacin sobre antioxidantes unha ferramenta til. O uso de diferentes tcnicas matemticas e estatsticas permite, en base a sinais analticos apropiados, a obtencin de sistemas de predicin da actividade antioxidante de diferentes compostos e/ou produtos, as como a clasificacin destes en funcin da sa capacidade antioxidante. BIBLIOGRAFA
Betroncelj, J., Dobersek, U., Jamnik, M., e col. (2007). Food Chem., 105, 822-828. Camacho, W., Karlsson, S. (2002). Int. J. Polym. Anal. Charact., 7, 41-51. Dumarey, M., Naderkassel, A., Deconick, E., y col. (2008). J. Chromatog. A, 1192, 81-88. Farkas, O., Jakus, J. e Heberger, K. (2004). Molecules., 9, 1079-1088. Garcia, A., Brenes, M., Garcia, P., e col. (2003). Eur. Food Res. Tecnol., 216, 520-525. Hernandez M. e col. (2005). EJEAFChe., 4, 1035-1043. Jahan. K. (2005). Poultry Sci., 84, 158-166. Kamal-Eldin, A., e Andersson, R. A. (1997). JAOCS., 74, 375-380. Laguerre, M., Leconte, J. P., e Villeneuve, P. (2007). Progr. Lipid Res., 46, 244-282.
178
Nin, E., Wang, L., e Kokot, S. (2000). Anal. Chim. Acta, 412, 185-193 Rebolo, S., Pena, R. M., Latorre, M. J., e col. (2000). Anal. Chim. Acta, 417, 211-220. Weber, C., Honorio, K., Bruni, A., e col. (2006a). Struc. Chem., 17, 307-320. Weber, C., Honorio, K., Bruni, A., e col. (2006b). J. Mol. Model., 12, 915-920.
179
ASPECTOS LEGAIS DO USO DE ANTIOXIDANTES EN ENVASES DE ALIMENTOS, NOVAS FORMULACINS DE ENVASES ACTIVOS
Vctor Teruel Muoz rea de Xestin de Riscos Qumicos. Subdireccin Xeral de Xestin de Riscos Alimentarios Introducin No seu concepto inicial, os envases tian as funcins de conservar, conter, transportar e protexer os alimentos. A aparicin de novos materiais de sntese, sen un historial de uso ao longo da historia, deu lugar a que xurdise unha preocupacin da sade dos consumidores e comezouse a lexislar as substancias autorizadas para o seu uso nos materiais que forman parte dos envases, as como as sas restricins de uso. De xeito que xurdiu no ano 1976 a primeira norma comunitaria neste sentido, chegando ata o actual marco lexislativo regulado mediante o Regulamento 1935/2004 do Parlamento Europeo e do Consello, do 27 de outubro de 2004, sobre os materiais e obxectos destinados a entrar en contacto con alimentos e polo que se derrogan as Directivas 80/590/CEE e 89/109/CEE. Este Regulamento 1935/2004 introduce aspectos novidosos nas funcins dos envases, entendendo que estes poden tamn informar sobre o estado dos alimentos e alongar a sa vida til. A finalidade deste novo marco legal garantir o mercado interior e proporcionar a base para cumprir o elevado nivel de proteccin relativo sade humana e aos intereses dos consumidores. O seu mbito de aplicacin abrangue os materiais e obxectos rematados, includos os activos e intelixentes, en contacto con alimentos, tanto aqueles que estean destinados a entrar en contacto con alimentos como aqueles dos que haxa que esperar razoablemente, que entrarn en contacto con alimentos ou que transferirn os seus compoentes aos alimentos en condicins normais ou previsibles de emprego. Novos conceptos O Regulamento 1935/2004 introduce como novidade destacable a incorporacin dos materiais e obxectos activos e intelixentes. Os materiais e obxectos activos estn destinados a ampliar o tempo de conservacin dos alimentos ou a manter ou mellorar o seu estado, e para iso poden:
180
Incorporar compoentes que transmitan substancias aos alimentos envasados ou ao contorno destes ou Absorber substancias dos alimentos envasados ou do contorno destes.
Por outro lado, os materiais e obxectos intelixentes son aqueles que controlan o estado dos alimentos envasados ou o contorno deles. Requisitos xerais da lexislacin sobre os envases Os envases destinados a estar en contacto con alimentos deben ser fabricados de conformidade coas boas prcticas de fabricacin para que nas condicins normais ou previsibles de emprego non transfiran os seus compoentes aos alimentos en cantidades que poidan: Representar un perigo para a sade humana Provocar unha modificacin inaceptable da composicin dos alimentos Provocar unha alteracin das caractersticas organolpticas destes. Ademais, a etiquetaxe, a publicidade e a presentacin dos materiais ou obxectos non debern inducir a error aos consumidores. Requisitos especiais dos envases activos e intelixentes O Regulamento 1935/2004 tamn establece requisitos especiais aplicables aos materiais e obxectos activos e intelixentes: Poden ocasionar modificacins da composicin ou das caractersticas organolpticas dos alimentos a condicin de que as ditas modificacins cumpran as disposicins comunitarias aplicables aos alimentos, como poden ser as disposicins sobre os aditivos alimentarios e as medidas de aplicacin correspondentes, ou, de non existir normativa comunitaria, as disposicins nacionais aplicables aos alimentos. Deben utilizarse substancias autorizadas por disposicins comunitarias ata a adopcin das medidas especficas que se estn preparando. As substancias que se incorporen aos alimentos teen consideracin de ingredientes, polo que estn suxeitas aos requisitos de etiquetaxe previstos na Directiva 2000/13/CE. Os materiais e obxectos activos non poden ocasionar modificacins da composicin nin das caractersticas organolpticas dos alimentos, como por exemplo enmascarando a sa deterioracin, que poidan inducir a error aos consumidores Deben levar unha etiquetaxe adecuada que permita ao consumidor identificar as partes non comestibles, cando estean xa en contacto cos alimentos.
181
Deben estar convenientemente etiquetados para indicar que os ditos materiais e obxectos son activos ou intelixentes, ou ambas as das cosas.
Medidas lexislativas especficas sobre os envases activos e intelixentes O Regulamento 1935/2004 cobre aspectos globais de materiais e obxectos activos e intelixentes pero non todos os detalles necesarios, de a a necesidade de dispoer dunha medida especfica que se est debatendo a nivel europeo. A proposta que se est traballando incorpora a definicin de compoente como a substancia individual ou combinacin destas que causan a funcin activa e/ou intelixente dun material, inclundo os produtos de reaccin in situ destas substancias. Nesta definicin non se inclen as partes pasivas do envase que non son responsables da funcin activa e intelixente. Existen tres tipos de compoentes que poden formar parte destes materiais e obxectos: Os que estean na lista comunitaria de substancias que se poden usar en compoentes activos e intelixentes (que se establecen na medida especfica). Substancias incorporadas para liberarse en alimentos ou no seu contorno, que deben cumprir coa normativa nacional ou comunitaria aplicable aos alimentos. Substancias que non van entrar en contacto co alimento nin o contorno por existir unha separacin cunha barreira funcional, polo que a migracin va ser inferior a 0,01 ppm, anda que estn suxeitas a certas restricins. En canto aos aspectos de etiquetaxe, proponse inclur o texto NON COMER nas partes do envase que non sexan comestibles e, se tecnicamente posible, a incorporacin do logotipo (Figura 1).
Figura 1. Logotipo do texto "NON COMER"
182
Por ltimo, a medida especfica vai inclur a informacin que debe figurar na declaracin de conformidade que debe acompaar os envases. Esta declaracin de conformidade serve para que o fabricante certifique a conformidade do envase coa lexislacin aplicable. Estmase que a lista comunitaria de substancias que se poden usar en compoentes activos e intelixentes vai estar dispoible aos 3 anos e medio da publicacin da medida especfica, que ser un regulamento comunitario. Normativa aplicable aos alimentos A medida especfica establece que as substancias incorporadas para liberarse en alimentos ou no seu contorno deben cumprir coa normativa nacional ou comunitaria aplicable aos alimentos. A normativa actual bastante extensa e abrangue a distintos grupos de substancias en funcin da sa aplicacin. A continuacin faise un repaso dos distintos tipos de substancias que se poderan empregar con este fin, suxeitos loxicamente s condicins das sas lexislacins establecidas. Aditivos alimentarios: defnense como substancias que ordinariamente non se consomen como alimentos en si mesmas e que se engaden expresamente para que sexan compoentes dos produtos alimenticios. A sa adicin intencionada e ten un propsito tecnolxico. A utilizacin de aditivos alimentarios como compoentes en materiais e obxectos activos s se pode realizar se se atopan recollidos na lista de aditivos alimentarios autorizados e cumpren coas condicins de uso e coas especificacins de identidade e pureza. A sa utilizacin implica a sa incorporacin nos alimentos, polo que van ser ingredientes destes e deben figurar na sa etiquetaxe. Coadxuvantes tecnolxicos: calquera substancia que non se consuma como ingrediente alimenticio ou en si, que se utilice intencionadamente na transformacin de materias primas, de produtos alimenticios ou dos seus ingredientes, para cumprir un obxectivo tecnolxico determinado durante o tratamento ou a transformacin, e que poida ter como resultado a presenza non intencionada, pero tecnicamente inevitable, de residuos da dita substancia ou dos seus derivados no produto acabado sempre que os ditos residuos non presenten risco sanitario e non tean efectos tecnolxicos sobre o produto acabado. Non teen consideracin de ingrediente, polo que non van a figurar na etiquetaxe dos alimentos. Aromas alimentarios: a sa funcin dar a os alimentos olor e/ou sabor. Encimas alimentarios: son un tipo de coadxuvante tecnolxico que obxecto dunha regulacin especfica.
183
Produtos fitosanitarios: unha das funcins dos produtos fitosanitarios mellorar a conservacin dos produtos vexetais, sempre e cando as ditas substancias ou produtos non estean suxeitos a disposicins particulares do Consello ou da Comisin sobre conservantes. Axentes descontaminantes: o Regulamento 853/2004 establece que os operadores da empresa alimentaria non utilizarn para eliminar a contaminacin de superficie dos produtos de orixe animal ningunha substancia distinta da auga potable, salvo que se autorice o seu uso polo Comit Permanente da Cadea Alimentaria e Sanidade Animal. A utilizacin deste tipo de substancias en materiais activos estara condicionada sa autorizacin previa e sempre e cando exista unha eliminacin tras o seu uso impoan indicacins de etiquetaxe.
Por ltimo indicar que os biocidas, regulados pola Directiva 98/2/CE, non teen cabida nos materiais activos, posto que o seu uso non est contemplado en alimentos. Procedemento de autorizacin do uso de substancias O esquema de autorizacin do uso de substancias para o seu uso nos materiais e obxectos destinados a estar en contacto cos alimentos atpase recollido no Regulamento 1935/2004. A solicitude presntase ante a autoridade competente dun Estado membro da Unin Europea, que se remite para a opinin da Autoridade Europea de Seguridade Alimentaria (EFSA). O ditame de EFSA vai inclur: Designacin da substancia e as sas especificacins Recomendacins sobre as condicins ou restricins de uso da substancia avaliada e do material ou obxecto en que se utiliza Avaliacin da adecuacin do mtodo analtico proposto para os fins de control previstos. Finalmente, a Comisin Europea, co ditame favorable dos Estados membros da UE a travs do Comit Permanente da Cadea Alimentaria e Sanidade Animal, adopta unha medida coa autorizacin, se procede, da substancia. A Autoridade Europea de Seguridade Alimentaria (EFSA) establecer unhas directrices coa documentacin necesaria para a avaliacin do risco dos materiais e obxectos activos e intelixentes, que deber estar dispoible antes de que se abra o prazo de presentacin das solicitudes de acordo coa medida especfica destes materiais que se est tramitando.
185
INTERESE DOS ANTIOXIDANTES NA INDUSTRIA DOS ALIMENTOS

Nick Hedges Unilever. Colworth House. UK Unilever unha das maiores compaas industriais dedicadas alimentacin no mundo. A sa misin engadir vitalidade vida tendo en conta as necesidades diarias de nutricin, hixiene e coidado persoal que axudan s persoas a sentirse ben e saudables. Unilever realiza unha extensiva investigacin internacional para establecer as necesidades dos consumidores e focaliza as sas capacidades investigadoras e innovadoras para abordar estas necesidades. Simultaneamente, a empresa ten o obxectivo de transmitir valor desde a ciencia e a tecnoloxa cara aos consumidores, sendo as sas principais lias de investigacin e desenvolvemento a ciencia de consumidores, as ciencias de materiais e nanotecnoloxa, as biociencias, a enxeara de procesos, as ciencias de datos e medicins e a nutricin. Dado que vitalidade e nutricin son significativamente importantes en Unilever, os produtos pesqueiros son unha parte importante da producin da empresa, que ademais ten presente a sustentabilidade na producin de alimentos. Nesta rea de mercado, Unilever traballa fundamentalmente no produto pesqueiro conxelado. A empresa considera que a investigacin sobre a calidade nutricional, os ingredientes naturais e a preservacin de orixe natural son cruciais. A prevencin da oxidacin das graxas e a perda de textura fundamental para manter os compoentes saudables e a calidade dos produtos pesqueiros. Neste sentido, Unilever participou no proxecto europeo SeafoodPlus: Health promoting, safe seafood of high eating quality in a consumer driven fork-to-farm concept, en concreto no subproxecto LIPIDTEXT: Preventing seafood lipid oxidation and texture softening to maintain healthy components and quality of seafood. No marco deste proxecto, Unilever colaborou co Instituto de Investigacins Marias de Vigo no desenvolvemento de antioxidantes naturais baseados en cidos hidroxicinmicos para estabilizar as perdas de calidade de filetes de peixe conxelados debidas ao desenvolvemento da rancidez oxidativa e a perda de textura. A oxidacin das graxas do peixe provoca a aparicin de aromas e sabores rancios, cambios en cor e textura, e a perda de importantes compostos desde o punto de vista nutricional como cidos graxos poliinsaturados e antioxidantes naturais. Durante o desenvolvemento deste proxecto de investigacin estudouse a prevencin da oxidacin lipdica e dos cambios de textura mediante a adicin de compostos antioxidantes. Os compostos estudados demostraron unha significativa inhibicin da oxidacin, especialmente nos ensaios realizados en peixe refrixerado. A efectividade antioxidante mostrou unha elevada dependencia coa estrutura molecular dos compostos. A orde de efectividade antioxidante determinada
186
nos ensaios efectuados en msculo refrixerado foi similar orde calculada nos ensaios en msculo en conxelado. Nestes ltimos a eficacia antioxidante alcanzada foi menor probablemente debido a unha menor difusin dos compostos na matriz do peixe, e polo tanto a unha menor interaccin cos compostos que interveen na reaccin de oxidacin lipdica. No entanto, os estudos efectuados sobre as alteracins nas protenas asociados a unha perda na capacidade de retencin de auga e modificacins na textura do msculo de peixe demostraron que non houbo diferenzas entre as mostras tratadas con antioxidantes e polo tanto, non oxidadas, fronte a aquelas non tratadas con antioxidantes e que mostraban un elevado grao de oxidacin. dicir, non se encontraron evidencias que suxiran que os tratamentos antioxidantes reduzan os cambios en textura do msculo de peixe durante a conservacin en conxelado. As mesmo, a agregacin proteica que se produciu durante o almacenamento a baixa temperatura e evidenciada no estudo dos cambios na solubilidade das protenas, non foi acompaada dunha significativa desnaturalizacin proteica determinada mediante calorimetra diferencial de varrido. Pode conclurse que posible empregar compostos de orixe natural para protexer o msculo de peixe da oxidacin durante a conservacin a baixa temperatura e que os ensaios realizados no msculo refrixerado poden empregarse para predicir a eficacia dos antioxidantes no msculo conxelado. Agradecimientos Ao Proxecto Integrado SEAFOODplus, financiado pola Unin Europea, contrato No 506359.
187
ENVASES ACTIVOS ANTIOXIDANTES. DESENVOLVEMENTO E PERSPECTIVAS DE USO NO ENVASADO DE CARNE FRESCA

Pedro Roncals Rabinal Dpto. Producin Animal e Ciencia dos Alimentos. Facultade de Veterinaria. Universidade de Zaragoza As formas tradicionais de comercializacin e venda de carne deron paso axia a outros sistemas baseados no autoservizo nos que, por unha parte, o consumidor non dispn xa do consello profesional do carniceiro, e por outra, a que o establecemento de venda deba asegurar unha longa conservacin da carne nos liniais dos supermercados. A iso smase o feito de que os consumidores demandan cada vez mis calidade, seguridade e comodidade nos alimentos que compran, sen esquecer que se compra cos ollos. Para acadar estas metas desenvolvronse sistemas de mellora da etiquetaxe e rastrexabilidade e, o que mis importante, sistemas de envasado que permiten manter a carne en boas condicins sensoriais e hixinicas durante mis tempo. A implantacin das atmosferas modificadas no envasado da carne foi un fito crucial na mellora da conservacin desta. No entanto, a necesaria presenza de oxxeno no envase d lugar oxidacin da carne. As, a vida til da carne non todo o extensa que sera de desexar. A utilizacin de antioxidantes pode contribur a diminur a velocidade de oxidacin e aumentar polo tanto a vida til da carne. De feito, o uso de extractos de plantas e outros antioxidantes naturais demostrouse de gran utilidade para este propsito. Os desenvolvementos actuais neste campo fan prever un novo avance; os envases activos, tanto antioxidantes como antimicrobianos, son un bo exemplo diso. S falta que a lexislacin ao respecto estea altura que as novas circunstancias requiren. Envasado en atmosfera modificada con antioxidantes O estado actual dos sistemas de envasado da carne permite manter a vida til da carne durante perodos de tempo relativamente longos. No entanto, as formas de distribucin reclaman tempos anda mis estendidos que permitan unha rotacin mis lenta das bandexas expostas nos lineais. En todo caso, os cambios deteriorativos que se producen son resultado de reaccins de oxidacin. Tales reaccins teen como substrato, ben a mioglobina, o que d lugar formacin de cores pardas, ou ben os cidos graxos, o que leva consigo a formacin de olores a carne vella. A oxidacin, por outra parte, vese favorecida pola presenza da elevada presin de oxxeno no envase, que necesaria sa vez para que a mioglobina estea oxixenada
188
e tea polo tanto a cor vermella tpica da carne fresca. A iluminacin a que deben ser sometidos os envases para a sa exposicin nos lineais dos supermercados tamn contribe oxidacin. sabido que a luz, e en particular as radiacins ultravioletas, son un forte catalizador das reaccins oxidativas. As pois, o lmite da vida til da carne envasada nas atmosferas modificadas usadas comunmente vn determinado pola velocidade das reaccins de oxidacin, anda que esta velocidade est influda tamn pola poboacin microbiana da carne. Os antioxidantes naturais foron utilizados desde antigo para mellorar a conservacin dos alimentos; os exemplos son innumerables: especias, condimentos e todo tipo de herbas. Nos ltimos anos o noso grupo de investigacin dedicou un gran esforzo para avaliar o efecto da adicin directa de diversos antioxidantes a carnes frescas e algns elaborados crnicos frescos.
Resumen de la extensin de la vida til
L.R.T.P. Carnitina T rojo Pimienta Vit. C Vit. E Taurina T verde
L.O.M.
Carnosina
Borraja Pim. Dulce Pim. Cay. Organo Romero 200 250
50
100
150
% de extensin
Figura 1. Extensin da vida til da carne envasada en atmosfera modificada por diversos antioxidantes
A Figura 1 mostra de maneira resumida a extensin da vida til de varias carnes frescas, avaliada pola medida sensorial da cor e olor, por accin dalgns dos antioxidantes naturais avaliados. Obsrvase o extraordinario efecto do romeu, ourego, pemento doce e picante e borraxe. Todos eles dan lugar a unha inhibicin da oxidacin, medida como substancias reactivas ao cido tiobarbitrico, superior ao 90% durante os das de conservacin da carne envasada. No entanto, tanto os pementos, que proporcionan unha cor vermella e sabor forte, como a faria de borraxe, que confire unha cor esbrancuxada, modifican substancialmente as caractersticas da carne.
189
Pola contra, o romeu e o ourego, que poden ser utilizados na sa forma desodorizada, exercen a sa accin sen modificar practicamente as propiedades sensoriais da carne ou do elaborado crnico. En consecuencia, a maior parte do desenvolvemento centrouse nestes extractos de plantas da familia das Labiadas. de destacar que a extensin da vida til conseguiuse incluso nas condicins habituais de exposicin da carne nos supermercados, dicir, con forte iluminacin nas vitrinas frigorficas. Os aspectos legais relativos utilizacin de condimentos en carnes frescas, non obstante impiden a sa adicin nestes alimentos non elaborados. As pois, o uso de antioxidantes est limitado aos preparados de carne, sexa en forma de elaborados ou en forma de mariados, adubados, etc. Este un campo de desenvolvemento en clara expansin, en especial en mercados evolucionados e abertos como son os EEUU ou o Reino Unido. Envases activos antioxidantes Nos ltimos anos asistimos ao desenvolvemento dun novo tipo de envases, deseados para frear as reaccins oxidativas por unha va indirecta. Estes novos envases son os envases activos antioxidantes, que poden ser definidos como aqueles que exercen sobre a carne unha accin inhibidora da oxidacin sen que o axente activo estea en contacto directo co alimento. dicir, as molculas antioxidantes estn contidas no material do envase e actan sobre a carne a travs da atmosfera protectora. Anda est en discusin se as ditas molculas actan na carne ao ser liberadas do material de envasado, ou no propio envase, secuestrando molculas de oxidacin que proceden da carne (Pezo e col., 2008). Nin que dicir ten que os axentes antioxidantes en estudo son substancias naturais; en xeral, extractos de plantas ben coecidas e utilizadas desde antigo: romeu, ourego e outras similares. As investigacins levadas a cabo polo noso grupo utilizan un dos varios posibles sistemas de xeracin do envase activo. No noso caso, un extracto de ourego ou romeu inmobilzase en primeiro lugar nun verniz, aprobado para estar en contacto cos alimentos (Garcs e col., 2003). O dito verniz co axente antioxidante incorprase cara interna do material plstico usado para construr o envase, normalmente un material barreira multilaminado, cuxa cara interna est constituda por polietileno. Este polmero necesario, sa vez, para asegurar o selado do material plstico bandexa que contn a carne e asegurar as a estanquidade do envase. Os primeiros resultados obtivronse en carne de vacn fileteada e envasada nunha atmosfera modificada rica en oxxeno, utilizando unha versin preliminar do envase activo, que foi mellorada con posterioridade. Previamente, demostrrase que o envase activo deseado era capaz de exercer unha accin antioxidante significativa
190
sobre diversas molculas susceptibles de sufrir oxidacin, en particular a mioglobina (Nern e col., 2003). O efecto do envase activo sobre a carne de vacn mstrase nas figuras 2 e 3. A Figura 2 demostra o efecto de inhibicin da oxidacin de mioglobina con envases contendo concentracins crecentes de axente activo (verniz con romeu); os resultados estn expresados en porcentaxe de metamioglobina (forma oxidada) na superficie do filete. A utilizacin do envase activo deu lugar a que a dita porcentaxe fose inferior ao 40% os 14 das de conservacin da carne; esta porcentaxe aproximadamente o necesario para que o aspecto do filete apareza como pardo ao ollo humano (Djenane e col., 2002; Martnez e col., 2006). A Figura 3, pola sa parte, demostra o efecto inhibidor da oxidacin de cidos graxos, responsable da aparicin de olores a carne vella. Neste caso, os resultados represntanse como ndice TBARS (substancias reactivas ao cido barbitrico, expresadas en forma de malonaldehido), forma habitual de medir a oxidacin lipdica. Este ndice apenas chegou a 1,5 ao cabo dos 14 das, lmite a partir do cal os olores anormais empezan a percibirse polo nariz humano (Green and Cumuze, 1981; Snchez-Escalante e col., 2003). A conclusin do estudo foi que, nas condicins utilizadas, a carne no noso envase activo tivo unha vida til de 12-14 das, fronte aos 9 da mostra control.
80 70 60 50 40 30 20 10 0
% MetaMb
5 Das
10
15
Control
romero
PR2
PR4
PR8
Figura 2. Evolucin da porcentaxe superficial de metamioglobina en filetes de vacn envasados en atmosfera modificada cun material activo contendo concentracins crecentes de extracto de romeu
191
3 2,5 2
TBARS
1,5 1 0,5 0
0
Control
5 das
Romero PR2
10
PR4
15
PR8
Figura 3. Evolucin das substancias reactivas a TBA en filetes de vacn envasados en atmosfera modificada cun material activo contendo concentracins crecentes de extracto de romeu
Unha vez demostrado o efecto antioxidante do envase activo, estudamos comparativamente a accin de romeu ou ourego como axente activo e aplicmolo carne de ao fileteada. Para iso, envasronse costeletas de perna de ao en envases control ou activos cun ou outro axente en presenza dunha atmosfera modificada de 80% O2 e 20% CO2, e mantivronse nun expositor frigorfico a 11C sometidas a iluminacin; dicir, en condicins similares s de venda habitual nun supermercado (Camo e col., 2008). preciso lembrar que a luz un forte catalizador das oxidacins (Djenane e col., 2001). Incluronse ademais costeletas cun nebulizado superficial de extracto de romeu, para comparar o efecto do axente activo en contacto ou non coa carne.
192
Figura 4. Evolucin da porcentaxe superficial de metamioglobina en filetes de ao envasados en atmosfera modificada cun material activo contendo extractos de romeu ou ourego
A Figura 4 mostra os resultados da formacin de metamioglobina. Aprciase claramente nela o efecto inhibidor da oxidacin por parte de ambos os dous envases activos, moi similar por outra parte ao do extracto de romeu engadido en superficie. O lmite do 40% de metamioglobina alcanzouse despois dos 11 das.
193
Figura 5. Evolucin do ndice de vermello (a*) en filetes de ao envasados en atmosfera modificada cun material activo contendo extractos de romeu ou ourego
A Figura 5 representa a evolucin do ndice de vermello (a*). En concordancia co anterior, a carne mantivo un valor de a* mis elevado nos envases activos; no entanto, o ourego pareca ser moito mis eficaz que o romeu. Neste caso, os valores de a* mantivronse por enriba de 10, lmite aproximado da cor vermella tpica da carne fresca, ata os 13 das de exposicin.
Figura 6. Evolucin das substancias reactivas a TBA en filetes de ao envasados en atmosfera modificada cun material activo contendo extractos de romeu ou ourego
194
Na Figura 6 recllense os resultados da evolucin da oxidacin lipdica. A dita oxidacin foi moi eficazmente inhibida polo envase activo con ourego, mentres que o que contia romeu tia s un lixeiro efecto; de feito, o primeiro deu lugar a que as costeletas alcanzaran un valor superior a 1,5 s ao final da exposicin, fronte aos 6-7 das que tardaron en alcanzalo as costeletas control.
Figura 7. Evolucin da poboacin de psicrotrofos aerobios en filetes de ao envasados en atmosfera modificada cun material activo contendendo extractos de romeu ou ourego
A Figura 7 mostra a evolucin da poboacin microbiana na superficie da carne. A utilizacin dos envases activos deu lugar tamn a unha inhibicin significativa da poboacin microbiana habitual na superficie das costeletas, en particular cando se utilizou ourego. A dita inhibicin deu como resultado uns recontos inferiores en 1-2 ordes de magnitude, aproximadamente, aos dous controis. Por outra parte, no caso do envase activo con ourego, os recontos non chegaron a 106 nin sequera ao final do perodo de exposicin. Este efecto antimicrobiano dos extractos de romeu e ourego, xa coecido, contribuir tamn extensin da vida til da carne, pois os cambios deteriorativos da carne estn relacionados, non s coa oxidacin, senn tamn coa poboacin microbiana presente.
195
Tboa 1. Evolucin dos valores sensoriais de filetes de ao envasados en atmosfera modificada cun material activo contendo extractos de romeu ou ourego
Por ltimo, a Tboa 1 recolle as puntuacins sensoriais dadas por un panel de expertos para os parmetros cor vermella, decoloracin e off-odour (olor a carne vella), utilizando unha escala de 1 a 5, na que 1 o valor caracterstico da carne fresca e 5 o da carne totalmente deteriorada. Debe facerse fincap en que, de acordo con esta escala, valores iguais ou superiores a 3 en cada atributo significan que esa carne chegou ao final da sa vida til, dicir, non vendible. Obsrvense as notables diferenzas entre as mostras. A vida til das carnes control non pasa de 8 das, mentres que a do envase activo con ourego alcanza unha vida til de 13 das. En conclusin, a utilizacin dun envase activo con extracto de ourego deu lugar a unha extensin moi significativa da vida til da carne de ao, en condicins similares s que se usan na sa comercializacin, que pasou de 8 a 13 das. Estes resultados, evidentemente, significan un gran avance na mellora dos mtodos de conservacin na distribucin e venda da carne de ao. Na actualidade prosguese cos experimentos para mellorar e optimizar esta forma de envasado activo, coa vista posta na sa utilizacin industrial. Non obstante, a situacin legal destes envases activos confusa e ter que ser desenvolvida nun futuro prximo.
196
BIBLIOGRAFA
Camo, J., Beltrn, J. A. e Roncals, P. (2008). Meat Sci., 80, 1186-1191. Djenane, D., Snchez-Escalante, A., Beltrn, J.A., e col. (2001). J. Food Sci., 66, 181-186. Djenane, D., Snchez-Escalante, A., Beltrn J.A. (2002). Food Chem., 76, 407-415. Djenane, D., Snchez-Escalante, A., Beltrn J.A., e col. (2003). Meat Sci., 64, 417-426. Djenane, D., Montas, L., e Roncals, P. (2005). Eurocarne, 133, 153-180. Garcs, O., Nern, C., Beltrn, J. A., e col. (2003). Pat. Eur., 03380302.4 Martnez, L., Cilla, I., Beltrn, J. A., e col. (2006). J. Food. Sci., 71, 48-53. Martnez, L., Cilla, I., Beltrn, J. A., e col. (2007). Meat Sci., 75, 443-450. Nern, C., Tovar, L., Djenane, D., e col. (2006). J. Agric. Food Chem., 54, 7840-7846. Pezo, D., Salafranca, J., e Nern, C. (2008). J. Chromat., A 1178, 126-133. Snchez-Escalante A., Djenane D., Torrescano, G., e col. (2001). Meat Sci., 58, 421-429. Snchez-Escalante A., Djenane D., Torrescano, G., e col. (2003). J. Food Sci., 68, 339-344.
197
APLICACIN DE ANTIOXIDANTES PARA A MELLORA DA SEGURIDADE E A CALIDADE SENSORIAL E TECNOLXICA DA CARNE E PRODUTOS CRNICOS
Jos Antonio Garca Regueiro IRTA. Tecnoloxa dos Alimentos A oxidacin dos alimentos un dos problemas mis importantes que afectan a sa calidade e seguridade. Desde hai mis de 60 anos estase estudando como previr o principal problema: a rancidez. A oxidacin un fenmeno que se atribe formacin de radicais que nunha reaccin en cadea e despois de varias fases finaliza na formacin de compostos que dan un flavor caracterstico aos alimentos e que provoca o rexeitamento dos consumidores. Esta resposta pdese asociar prevencin da inxesta dun alimento que perdeu a sa estabilidade e que pode danar a sade da persoa. Unha forma de evitar ou de reducir a oxidacin a utilizacin de antioxidantes ou de procesos que a limiten. O noso metabolismo emprega procesos oxidativos para obter enerxa, o que leva consigo un control da formacin de radicais e da sa eliminacin mediante varios mecanismos nos que interveen antioxidantes, encimas e outras molculas de modo coordinado. No entanto, se se produce un desequilibrio nesta regulacin as clulas sofren danos nos seus compoentes que poden chegar a desenvolver ou contribur aparicin de enfermidades. Demostrouse a importancia do control da oxidacin dos alimentos para a sade humana. Un grupo de antioxidantes actan de modo coordinado formando unha rede: vitaminas C e E que son esenciais e os producidos no organismo: glutatin (Glu, Cys, Gly), cido lipoico (recicla glutatin), coencima Q10 (relacionada coa funcin da vitamina E). Estes antioxidantes actan de modo distinto a outros antioxidantes (como os polifenois). A vitamina E localzase nas membranas celulares e nas lipoprotenas de transporte para previr a oxidacin de lpidos. Os cidos graxos libres non son compoentes maioritarios, por iso a accin dos antioxidantes in vivo est destinada a protexer as estruturas crticas para a funcin celular e metablica. Os antioxidantes que non realizan est funcin poden contribur, pero en xeral actan na reducin de radicais libres de modo menos especfico nos tecidos. Esta lia de investigacin ten un desenvolvemento moi activo. Entre os anos 20032008 pdense encontrar mis de 1200 artigos relacionados coa oxidacin e a carne. Neles evidnciase que o antioxidante mis estudado con aplicacins prcticas a vitamina E (-tocoferol). Un factor que contribuu a reducin do custo da producin sinttica deste antioxidante, anda que se obtn en forma all-rac que menos activa. Os organismos vivos posen sistemas para controlar a oxidacin provocada
198
pola xeracin de radicais libres mediante sistemas de alta eficacia e complexidade. Na producin de carne, cando cesa o metabolismo pola morte do animal, a accin dos mecanismos fisiolxicos nula ou mnima e a oxidacin pode progresar. Se un alimento pode sufrir un proceso de deterioracin pola accin de oxidantes tense que protexer sobre todo se o seu consumo non inmediato. A efectividade dun antioxidante depende da sa estrutura molecular e da polaridade da molcula. Os antioxidantes sintticos desbotronse para o seu uso na alimentacin. Como indica Frankel (2000), esta decisin presenta certa arbitrariedade sobre todo se se considera que moitos antioxidantes naturais non foron estudados para determinar posibles efectos secundarios cando se usan en concentracins superiores s dunha dieta de referencia. Os factores que se consideran no uso de antioxidantes en producin animal: xentica, metabolismo dos lpidos, composicin da dieta, fonte de graxa. Os antioxidantes mis utilizados son: vitamina E, carotenos, polifenois, extractos de ctricos e doutras plantas. Producin animal e antioxidantes A producin de carne de calidade require, nas condicins actuais, asegurar o seu valor nutritivo en procesos de conservacin e elaboracin que poden modificar a calidade sensorial e a sa seguridade. A comercializacin da carne en lascas envasadas en diferentes formas, sobre todo en atmosferas modificadas, necesita aumentar a estabilidade oxidativa para manter a cor e a calidade sensorial. A forma mis sinxela de lograr un aumento da estabilidade oxidativa a adicin nos pensos de -tocoferol. Este composto incorprase no tecido muscular e, en particular, nas membranas celulares onde exerce o seu efecto protector de modo eficaz. Numerosos traballos mostraron a sa eficacia e a acumulacin no tecido muscular con aumentos respecto ao grupo control de entre 3-5 veces. O custo desta prctica foi durante un tempo unha limitacin pero o prezo reduciuse de modo que viable. A reducin da aparicin de olores relacionados coa rancidez durante o cociado da carne e o seu posterior consumo foi demostrada. Outros antioxidantes pdense empregar en producin animal, pero a sa efectividade non a mesma que a do -tocoferol. O emprego do -caroteno en concentracins superiores a 15 mg/Kg mostrou en polos unha accin pro-oxidante, dependente do tipo de graxa ou aceite vexetal utilizado. Un grao elevado de instauracin induce un maior estrs oxidativo, e por iso resulta mis crtico o seu control. O -caroteno un precursor de vitamina A e dos seus derivados, con efectos filolxicos complexos, como o caso do cido retinoico. Isto provoca que a cantidade subministrada deba ser axustada para evitar efectos non desexados. Unha dificultade para interpretar
199
de modo adecuado os efectos dalgns antioxidantes a determinacin analtica no tecido muscular. A concentracin de -caroteno e licopeno, no tecido muscular de animais alimentados con suplementos destes antioxidantes, moi baixa polo que ou ben a metodoloxa analtica non ptima ou ben a sa concentracin tan baixa que resulta difcil poder explicar os seus efectos antioxidantes ou pro-oxidantes. Os antioxidantes lutena e zeaxantina acumlanse na mcula da retina nalgns animais, o que mostra as diferenzas de accin dos posibles antioxidantes que se van empregar en producin animal. A accin do -tocoferol e o -caroteno na composicin dos cidos graxos do tecido muscular mnima e por iso o tipo de graxa ou aceite usado na dieta determina, xunto coas condicins de manexo, a composicin dos lpidos corporais. Determinacin da estabilidade antioxidante A avaliacin da estabilidade antioxidante aditase efectuar na maior parte dos estudos mediante a determinacin dos TBARS (substancias que reaccionan co cido tiobarbitrico). Este procedemento un ndice global que indica o grao de oxidacin producida despois da formacin de perxidos. A sa aplicacin, en practicamente todos os traballos publicados, permite unha comparacin efectiva dentro dun estudo, pero en menor grao entre estudos. Cando se realizaron exercicios de intercomparacin, os valores obtidos entre diferentes laboratorios presentaban unha dispersin demasiado elevada. Un dos problemas radica en que o fundamento do mtodo reside na reaccin do cido tiobarbitrico co malonaldehdo que se forma a partir da oxidacin do cido linolnico (C18:3). No entanto, esta reaccin ocorre con outros aldehdos ou compostos que poidan reaccionar co cido tiobarbitrico. A pesar destes problemas, o TBARS est aceptado como un parmetro esencial nos estudos relacionados coa oxidacin. Outras medidas basanse na actividade dos encimas antioxidantes SOD, CAT e GSPHx. Na figura podemos observar a actividade destes encimas na peituga de polo. Pdese apreciar como a actividade da GSPHx a mis elevada en relacin s actividades da CAT e da SOD (Carreras e col., 2005).
200
Actividad de enzimas antioxidante pechuga

4,50 4,00 3,50
Unidades
GSHPx CAT SOD
3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 T1 T2 T3 Tratamiento T4 T5
Figura 1. Actividades de encimas antioxidantes na peituga de polo. Adaptado de Carreras (2005)
Na Figura 2 obsrvanse as concentracins de -tocoferol; segundo isto podemos observar que, a pesar dunha maior concentracin deste composto nos tratamentos T4 e T5, as actividades dos encimas non se viron afectadas. Pdese apreciar como a concentracin de -tocoferol mis elevada no zanco que na peituga de polo. No zanco o tipo de msculos e o seu metabolismo facilitan unha maior acumulacin de -tocoferol.
!-Tocoferol
MUSLO
7 6 5
mg/Kg
PECHUGA
4 3 2 1 0 T1 T2 T3 T4 Tratamiento T5
Figura 2. Concentracin de -tocoferol no zanco e peituga de polo. Adaptado de Carreras (2005)
201
Outras formas de determinar o grao de oxidacin son o ndice de perxidos e a determinacin de voltiles, entre eles o hexanal que se asocia ao descritor sensorial de rancidez. No entanto, hai mis alternativas para determinar o grao de oxidacin e estanse investigando mtodos mis fiables e adaptados a condicins especficas en funcin do alimento que se vai estudar. A estabilidade de aceites vexetais mediante o emprego da tcnica Rancimat un exemplo deste enfoque. BIBLIOGRAFA
Carreras, I. (2005). Tese Doutoral. Universidade de Girona. Carreras, I., Castellari, M., Valero, A., e col. (2005). J. Sci. Food Agric., 85, 2407-2412.
203
ACHEGA OPTIMIZACIN DO PERFIL NUTRITIVO DO LEITE MEDIANTE A ALIMENTACIN DO GANDO: ANTIOXIDANTES

Ismael Martnez Lede Dpto. de I+D de FEIRACO Antioxidantes na alimentacin de ruminantes Un dos principais problemas ao que se enfrontan os nutricionistas de vacas de leite nas frmulas en base a cidos graxos insaturados a oxidacin destes. Os lpidos con dobres enlaces de carbono tales como os presentes nos cidos graxos insaturados (p.e. C18:1, C18:2, C18:3, EPA, DHA) e as vitaminas que son susceptibles de oxidarse. O tomo de carbono adxacente ao dobre enlace oxidado formando metabolitos reactivos con oxxeno e radicais libres que propagarn anda mis dita reaccin de oxidacin. O resultado final unha perda dos cidos graxos insaturados da graxa diettica e a xeracin de radicais libres que atacarn a outros cidos graxos insaturados. A oxidacin da graxa non s reduce o valor biolxico e enerxtico desta, senn que tamn propaga a oxidacin a outros ingredientes lipdicos, tales como graxas engadidas, sementes oleaxinosas e grans de destilacin que, en caso de non ser estabilizados, poden contribur significativamente carga de radicais libres no animal. No corpo existe un equilibrio natural entre a formacin de radicais libres durante o metabolismo normal das clulas e a capacidade antioxidante endxena do animal que evita que os radicais libres se acumulen e danen as clulas. No entanto, en situacins en que os niveis de radicais libres exceden a capacidade antioxidante do animal, pode darse unha situacin de estrs oxidativo. As vacas de alta producin son propensas a sufrir un estrs oxidativo, e a situacin pode verse incluso exacerbada en determinadas condicins ambientais, fisiolxicas e dietticas. Os radicais libres, mediante a oxidacin de cidos graxos esenciais das membranas lipdicas, poden danar as clulas e afectar a producin e o estado sanitario do animal. A capacidade antioxidante endxena do animal consiste en tres grupos principais de antioxidantes (Miller e col., 1993). O primeiro grupo, antioxidantes encimticos, est representado pola superxido dismutasa (SOD) e a glutatin peroxidasa (GSH-Px). Estas forman parte do principal sistema de defensa intracelular e o principal sistema de defensa fronte a radicais libres como son os perxidos e hidroperxidos. SOD un encima antioxidante involucrado na eliminacin de formas reactivas de oxxeno formadas nas clulas. Cu, Zn e Mn son elementos esenciais na actividade de SOD. Deficiencias en Cu, Zn e Mn resultan nunha resposta inmune comprometida en va-
204
cas de leite e gando bovino de alta producin, facendo que estes animais sexan mis propensos a sufrir un estrs oxidativo. O estrs oxidativo dse cando existe un desequilibrio entre os niveis de materias primas altamente oxidables (MPO) e a capacidade antioxidante do animal. Unha acumulacin indesexable de radicais libres dse nas clulas, inicindose entn unha reaccin oxidativa en cadea e a oxidacin lipdica. O efecto directo principalmente un dano oxidativo aos lpidos e a diferentes macromolculas. Este efecto altera a membrana celular, resultando en rutas metablicas modificadas nunha fisioloxa alterada e en patoloxas do propio animal. Debido a este motivo, o estrs oxidativo podeu ser asociado a un incremento na incidencia de desordes sanitarias tales como tetania dos prados (milk fever) e desprazamento do abomaso (Weiss, 1998; Miller e col., 1993). Os antioxidantes dietticos poden evitar a oxidacin dos lpidos dietticos o propio penso e mellorar a produtividade do animal. A literatura en aves describiu en profundidade a reducin significativa en ganancia de peso e en ndice de conversin que experimentan os animais ante a inclusin de graxa oxidada na dieta (Cabel e Waldroup, 1988; Dibner e col., 1996) e como a inclusin de aditivos antioxidantes dietticos dimine este efecto. Os antioxidantes dietticos, mediante unha reducin dos niveis de oxidacin das MPO e posterior oxidacin lipdica, son capaces de reducir o impacto negativo da graxa oxidada. Alimentar con graxa oxidada leva consigo un incremento da taxa de renovacin intestinal e compromete a resposta inmune do animal (Dibner e col., 1996). Os antioxidantes poden, mediante unha estabilizacin das MPO no medio, manter a integridade dos biles intestinais e a taxa de renovacin intestinal. No gando bovino de carne, estabulado, a integridade da parede ruminal vese comprometida cando o animal alimentado con dietas ricas en concentrado permitindo as bacterias penetrar na corrente sangunea, as como o desenvolvemento de abscesos hepticos. Nunha recompilacin de experimentos con bovino de carne, a suplementacin con antioxidantes na dieta permitiu reducir a incidencia de abscesos hepticos as como mellorar a ganancia de peso (Vzquez-An e col., 2006). A suplementacin con antioxidantes permitiu unha mellora directa do estado oxidativo do animal tal e como se puido observar nos superiores niveis sricos de vitaminas E e A e un inferior estado oxidativo lipdico da carne picada (Krumsiek e Owens, 1998). Os antioxidantes dietticos, mediante unha estabilizacin das MPO, son capaces de reducir a carga de perxidos no animal e de mellorar a capacidade antioxidante do animal. Alimentar con graxa oxidada o animal non tan s incrementa a carga de perxidos deste, senn que tamn pode afectar negativamente a fermentacin ruminal. O
205
efecto dunha alimentacin con graxa oxidada sobre a dita fermentacin ruminal foi comprobada mediante a utilizacin de sistemas de cultivo continuo de fermentacin (Vzquez-An e col., 2006). Unha alimentacin con graxa oxidada reduciu a sntese proteica microbiana, as como a sa eficiencia, e o efecto puido verse aliviado mediante a adicin de antioxidantes na dieta. A suplementacin con antioxidantes tamn mellorou a dixestibilidade da fibra neutra e o cido deterxente na graxa fresca e oxidada, suxerindo as un efecto global positivo do uso de antioxidantes sobre a microflora ruminal. A suplementacin de antioxidante na dieta capaz de mellorar a produtividade lctea e a eficacia de producin, as como a dixestibilidade de materia orgnica no rume. As vacas de alta producin alimentadas con niveis moderados a elevados de cidos graxos insaturados son propensas a sufrir estrs oxidativo. Niveis indesexables de radicais libres poden oxidar a membrana lipdica afectando os rendementos e a sade dos animais. Os lpidos dietticos tales como graxas engadidas, sementes oleaxinosas e grans de destilacin, se non son estabilizados, poden contribur significativamente a un incremento na carga de radicais libres no animal. Os antioxidantes dietticos evitan a oxidacin dos lpidos no alimento final. No gando bovino de leite, a suplementacin con antioxidantes na dieta mellora a funcin ruminal e a producin lctea. As pois, pdese conclur como a suplementacin con antioxidantes na dieta pode estabilizar o contido lipdico desta e mellorar a produtividade e estado sanitario do ruminante. Atendendo ao exposto, a alimentacin das vacas que producen o leite UNICLA suplemntase con vitamina E e complexos orgnicos de minerais (zinc e manganeso en forma de quelatos de metionina, e selenio en forma de lvados enriquecidos que achegan este mineral en forma de selenoaminocidos). Deste xeito protexemos as vacas do estrs oxidativo. Ademais, a vitamina E protexe as materias primas da oxidacin. FEIRACO cuantificou a presenza en leite do selenio incorporado alimentacin das vacas. Isto foi resultado dun proxecto de I+D realizado entre 2003 e 2005, titulado Estudo da correccin de dficit de selenio na dieta mediante a suplementacin de especies qumicas biodispoibles para mellorar a sa achega de forma natural a travs do leite. O obxectivo deste foi a obtencin do leite, de forma natural e a travs da alimentacin das vacas, enriquecido con selenio nunha forma biodispoible. No seu desenvolvemento realizouse a suplementacin do alimento do gando con distintas especies qumicas de selenio (selenio inorgnico e selenio orgnico) e concluuse que a selenometionina a forma que mis incrementa o contido de selenio no leite, ademais de ser a forma mis biodispoible para a especie humana.
BIBLIOGRAFA
Cabel, M.C. e Waldroup, P.W. (1988). Poult. Sci., 67, 1725-1730. Dibner, J.J., Atwell, C.A., Kitchell, M.L., e col. (1996). Anim. Feed Sci. Technol., 62,1-13. Krumsiek, C.L. e Owens, F.N. (1998), Oklahoma Agric. Exp. Stat. Res. Rep., 965, 6468. Miller, N.J., Diplock, A.T., Rice-Evans, C., e col. (1993). Clinical Science, 84, 407-412. Vzquez-An, M., Kratzer, D., Gonzlez-Esquerra, R., e col. (2006). Poult. Sci., 85, 693705. Weiss, W.P. (1998). J. Dairy Sci., 81, 2493-2501.
207
ANTIOXIDANTES E OXIDACCIN LIPDICA DE PRODUTOS CRNICOS

Daniel Franco Ruiz Dpto. Producion Animal. Centro Tecnolxico da Carne. Os novos retos a que se enfrontan as sociedades avanzaron de tal forma que os obxectivos que persegue unha dieta equilibrada fronse modificando desde a mera satisfaccin de necesidades nutricionais ata o punto de promover o consumo de alimentos saudables que diminan o risco de enfermidades crnicas. Cada vez son maiores os esforzos en investigacin para avaliar a influencia da alimentacin sobre a sade; entendendo esta non s como a ausencia de enfermidade, senn como un equilibrio entre benestar fsico e psicolxico. Existen probas cientficas que confirman a hiptese de que certos alimentos e/ou algns dos seus compoentes teen efectos beneficiosos sobre a sade humana. Nace as a idea dunha nutricin ptima centrada na mellora da calidade da inxesta diaria en termos de nutrientes ou non nutrientes que favorecen o mantemento da sade. Ao longo dos ltimos 20 anos diversos factores como o aumento do tempo de ocio ou a incorporacin da muller ao mercado laboral provocaron unha diminucin no tempo dedicado elaboracin e preparacin da comida. Sumado isto ao feito de que as preferencias do consumidor priorizaron a seguridade alimentaria e o valor nutritivo aos criterios exclusivamente sensoriais (Hernndez, 2002), cada da mis habitual a venda de pratos conxelados ou produtos de elevada preparacin, como o caso de carne fileteada e envasada en diferentes formatos e/ou atmosferas. En sentido comercial hai que considerar que a decisin de compra da carne por parte do cliente basebase fundamentalmente na cor (Shackelford e col., 1992), e actualmente tense ademais en conta, coa mesma importancia ou mis, os aspectos xa comentados como o valor nutricional ou a garanta sanitaria. Importancia da graxa na sade humana O consumidor intersase cada vez mis por alimentos saudables con garanta sanitaria. A incidencia do contido total e composicin da graxa sobre a obesidade e enfermidades cardiovasculares, derivadas do sedentarismo e alimentacin desequilibrada, fai que o interese sexa maior por alimentos de contido moderado en graxa. No caso da carne, valranse os esforzos que se realicen para que sexa mis saudable, como a diminucin en cidos graxos saturados (AGS) polo seu efecto prexudicial e o enriquecemento en cidos graxos polinsaturados (AGPS) 3 e pola sa accin beneficiosa en problemas cardiovasculares e tumorais (Hu e col., 2002). Consumidores preocupados por estes aspectos nutricionais agradecen que se lles informe da carne de animais que en razn de raza, peso/idade de sacrificio, alimentacin
208
e manexo tean ndices mis favorables que os recomendados como mnimos ou mximos pola Organizacin Mundial da Sade (OMS). Neste punto hai que destacar que cambios relativos producin animal como a dieta poden modificar o perfil de cidos graxos dos seus produtos, facndoos mis atractivos desde o punto de vista da sade (Scollan e col., 2001). O consumidor demanda todo isto pero sen que desmereza a calidade sensorial, xa que cando se senta mesa e para que sexa fiel a unha marca necesario que a carne satisfaga a sas expectativas de flavor, tenrura e aspecto zumarento. Vida til da carne Entndese como vida til da carne ao perodo que esta permanece no expositor a disposicin do cliente no punto de venda. Comeza cando a carne est madura e o final est marcado pola data de caducidade fixada previamente en condicins normais de transporte, almacenamento e exposicin; ou incluso antes, por descarte debido a apreciacin de zonas con degradacin ou alteracin da cor e/ou enranciamento da graxa e/ou degradacin microbiana dos aminocidos, provocando olores e sabores desagradables (Cornet e Bousset, 1990; Kato e col., 1989). A data de caducidade importante porque obriga a retirada do produto, sendo unha informacin que consultan normalmente os consumidores. O produto debe chegar a esta data, normalmente, con todas as sas caractersticas sensoriais. Pero a modificacin dos parmetros do proceso que leva desde a canal ata a data de caducidade pode determinar o descarte da carne como de calquera outro alimento perecedoiro antes de que se cumpra esta. O descarte na carne envasada en filetes realzase, fundamentalmente, debido a cambios na cor de fcil percepcin que incitan ao rexeitamento do comprador, ademais de ser o primeiro signo de alteracin da calidade da carne. Outra causa de rexeitamento pola apreciacin de viscosidade superficial, pegaenta ao tacto, que indica unha proliferacin microbiana non desexable de Pseudomonas spp., entre as que hai que destacar P. fluorescens, P. putida e P. fragi. A duracin da vida til polo tanto moi importante comercialmente porque prolonga a oportunidade de venda minimizando as perdas por descarte. Os factores que afectan a duracin da vida til son numerosos, podndose prolongar coa diminucin da contaminacin microbiana (Borch e col., 1996), a reducin do tempo de almacenamento, as baixas temperaturas (Gill e Molin 1991), a ausencia de luz ultravioleta (Djenane e col., 2001), o tipo de envasado (Borch e col., 1996) e a adicin de antioxidantes e/ou antimicrobianos (Ahn e col., 2002; Snchez-Escalante e col., 2003).
209
Influencia da graxa na vida til da carne e produtos crnicos O contido en graxa da carne de vacn depende de factores diversos como a raza ou a idade de sacrificio e, fundamentalmente, da porcentaxe de cidos graxos da alimentacin. Anda que un enriquecemento da carne en AGPI, 3 e CLA beneficioso desde o punto de vista da sade, estes compoentes reducen a estabilidade oxidativa da carne e predispena ao enranciamento. Con excepcin da carga microbiana, o dano oxidativo o factor mis importante na deterioracin da carne e vese reflectido co aumento de rancidez e perda de cor debido oxidacin da graxa e da mioglobina, respectivamente, e das das fraccins lipdicas da carne, fosfolpidos de membrana e triglicridos, os primeiros conteen maior proporcin de AGPI e por iso son responsables da iniciacin da oxidacin lipdica. Incluso as carnes magras son suspcetibles aos ditos fenmenos oxidativos, xa que anda que teen un reducido contido graxo, a que dimine a fraccin triglicrida (composta fundamentalmente por AGS), mentres que a fraccin fosfolipdica vese menos afectada (Monahan, 2002). Polo tanto o enriquecemento con antioxidantes necesario para paliar ao mximo o dano oxidativo (Jakobsen, 1999). necesario prever a presenza de suficiente contido destes compostos na alimentacin do animal e/ou engadilos carne durante o almacenamento. Adicin de antioxidantes A utilizacin de antioxidantes permite prolongar o tempo de conservacin, o que incrementa a sa oportunidade de venda sen que estean deterioradas as sas caractersticas nutritivas e sensoriais, mis anda que no momento actual en que o comercio da carne manexa partidas mis voluminosas e alcanza puntos de venda cada vez mis distantes. A estabilidade da carne pdese ver incrementada pola adicin de antioxidantes. A sa principal accin na extensin da vida til radica nas seguintes capacidades: Aumentar a estabilidade da cor => principalmente por evitar a transicin prematura de mioglobina a metamioglobina. Manter as condicins organolpticas => evitar ou retardar o enranciamento da graxa. Accin especialmente importante en carne procedente de animais aos que se lles suplementaron cidos graxos poliinsaturados, os mis facilmente oxidables. Evitar o escurecemento (ou perda de cor) inducido por radicais libres xerados pola accin da luz que exposta a carne nas condicins de venda. Esta accin non atribuble a todos os antioxidantes, pero si aos de natureza polifenlica
210
e aos extractos de plantas, que teen a capacidade de captar a radiacin ultravioleta. Ampliar a resistencia ao crecemento bacteriano, pois os antioxidantes de natureza polifenlica posen frecuentemente actividade antimicrobiana.
Procesos oxidativos en carne e produtos crnicos Un dos paradoxos da vida neste planeta que unha molcula que sustenta a vida aerbica, o O2, esencial para o metabolismo enerxtico e a respiracin, poida constitur o punto de partida para un tipo de dano celular coecido como estrs oxidativo, consecuencia dun desequilibrio entre a producin de especies reactivas e os mecanismos de defensa antioxidante (Marx, 1985). Estas substancias xranse tanto a nivel intracelular como extracelular e son capaces de difundir polo citosol e a travs das membranas deteriorar os distintos compoentes celulares (Chihuailaf e col., 2002). Os lpidos, as protenas e os cidos nucleicos constiten o seu principal branco de actuacin. Accin sobre os lpidos precisamente sobre estas biomolculas onde recae o maior dano derivado do estrs oxidativo, nun proceso coecido como peroxidacin lipdica. Afecta os cidos graxos poliinsaturados, e as consecuencias son evidentes cando estes forman parte dos lpidos das membranas celulares xa que se ve alterada a sa adhesin, fluidez, permeabilidade e funcin metablica (Yu, 1994). A peroxidacin lipdica e os cambios asociados a ela constiten a principal causa de deterioracin (Sevanian e Hochstein, 1985) xa que provoca a aparicin de olores e flavores estraos, alteracin da cor e, en xeral, unha reducin da calidade organolptica da carne. Por outro lado, provoca unha diminucin do valor nutritivo da carne e a xeracin de compostos potencialmente nocivos para a sade relacionados co risco de padecer diversas patoloxas. De forma xeral, cabe destacar que os produtos de oxidacin mis estudados son os voltiles polos seus efectos a nivel sensorial e a maior facilidade de anlise; no entanto, os produtos non voltiles poden ser mis importantes cuantitativamente e con efectos, en xeral, descoecidos sobre a seguridade alimentaria e a calidade sensorial da carne, como poidan ser os xidos de colesterol (Maraschiello, 1998). Accin sobre as protenas Anda que tamn constiten un branco para as especies reactivas, o efecto sobre elas menos intenso que no caso dos lpidos a causa da lenta progresin das reaccins. O ataque oxidativo s protenas pode provocar modificacins en aminocidos
211
especficos, fragmentacin da cadea peptdica, agregacins ou entrecruzamentos, alteracins da carga elctrica ou incremento da susceptibilidade proteolise (Shacter, 2000). O termo oxidacin proteica fai referencia modificacin dunha protena inducida de forma directa mediante ROS ou ben indirectamente por reaccin con produtos secundarios do estrs oxidativo. As principais consecuencias sobre a calidade da carne e produtos crnicos aprcianse na cor. A mioglobina, protena conxugada constituda por unha parte proteica (globina) e un grupo prosttico non peptdico (grupo hemo), a principal responsable da cor vermella do msculo. Na carne fresca d unha cor vermella prpura, en contacto co aire oxixnase dando lugar oximioglobina de cor vermella brillante e cando a mioglobina se oxida xrase a forma frrica (Fe3+), denominada metamioglobina, responsable da coloracin marrn da carne. As proporcins relativas das formas oxixenadas e oxidadas na carne dependen da presin parcial do oxxeno, sendo favorecida a formacin de metamioglobina por presins de oxxeno baixas (Bodwell e McClain, 1971). Accin sobre outras biomolculas O ADN mitocondrial constite o principal branco de ataque xa que pola sa localizacin encntrase exposto a un fluxo constante e elevado de especies reactivas provenientes da cadea respiratoria. Tamn se observou que algns produtos de oxidacin poden producir unha gran variedade de efectos biolxicos adversos como a cooxidacin de vitaminas e carotenoides, a inhibicin da biosntese do colesterol, ateroxnese, citotoxicidade ou carcinoxnese (Kanner, 1994). Antioxidantes endxenos presentes en produtos crnicos Natureza proteica: carnosina e taurina Illronse diferentes pptidos a partir de diversas fontes proteicas crnicas con actividades quelantes no aparato dixestivo e no sistema inmunolxico (como antimicrobianos e inmunomodulantes). Estes pptidos poderan utilizarse como aditivos funcionais alimentarios. Illronse pptidos con actividade antioxidante in vitro e psicolxica (efecto antifatiga) in vivo a partir de carne de porco (Arihara e col., 2005), polo (Arihara, 2006) e de becerro (Jang e Lee, 2005). A carnosina un dipptido, abundante no tecido muscular, que xoga un papel importante como antioxidante na oxidacin lipdica (Boldryrev e col., 1997), xa que acta capturando radicais libres no sarcoplasma e como axente quelante de metais (Decker e Crum, 1993). As sas propiedades antioxidantes basanse na sa habilidade para actuar como quelante, como inactivador de radicais libres e como doador de H+. hidrosoluble, polo tanto pode actuar na fase acuosa do msculo onde se en-
212
contran moitos catalizadores da oxidacin lipdica. Ademais, protexe a cor da carne inhibindo a oxidacin da mioglobina. Mantn a sa eficacia antioxidante nun rango de pH de 5,1 a 7,1, incluso despois do tratamento trmico, polo que ofrece un bo potencial como antioxidante en carnes procesadas (Kendler, 2002). A taurina, un aminocido que se encontra en forma libre, polo que non constitutivo da protena, e un potente antioxidante. Natureza lipdica: cido dihidrolipoico (DHLA) Recibe este nome pola sa solubilidade en lpidos. Factor crtico no metabolismo enerxtico mitocondrial, producido endoxenamente anda que en condicins de estrs fisiolxico pode non xerarse en proporcins adecuadas e por iso se clasifica como un nutriente esencial. O cido dihidrolipoico un forte redutor capaz de interaccionar con especies reactivas de oxxeno como os radicais hidroxilos, peroxilo e superxido, o cido hipocloroso e o oxxeno singlete. Tamn capaz de quelar ins metlicos e de rexenerar o ascorbato que, sa vez, intervn na reciclaxe da vitamina E (Kendler, 2002). Vitaminas: Vitaminas A, C e E Vitamina A As mis importantes fontes de vitamina A son as froitas e os vexetais, pero a carne e o fgado tamn o son debido a que a eficacia de conversin de -caroteno en vitamina A menor en vexetais que se a tomamos directamente do fgado ou carne. Con 100 gramos de carne ou fgado diarios cbrese o 100 % da RDA. Segundo Biesalski (2005) se o -caroteno dos vexetais e froitas a nica fonte de vitamina A (p.e. dietas vexetarianas estritas), necestanse mis de 500 g de vexetais ricos en -caroteno diarios para alcanzar 1 mg de retinol (debido ao seu baixo ndice de conversin 1:12). Isto pdese conseguir con 100 g de fgado consumidos 2 veces ao mes; este autor tamn opina que a inxesta diaria de vexetais achega mis contaminantes que os supostos ou cuestionables que poida ter o fgado (p.e. hormonas, metais ou xenobiticos, etc). Os animais e os humanos non son capaces de sintetizalos e absrbenos a travs da dieta (Olmedilla, 2002). O -caroteno podera complementar o papel antioxidante da vitamina E xa que esta efectiva a presins parciais de oxxeno superiores. Pola contra, a altas presins parciais de oxxeno, o -caroteno xera especies radicalarias capaces de promover a oxidacin. Estudos de suplementacin deste carotenoide na dieta animal poen de manifesto que o -caroteno pode manifestar a capacidade antioxidante ou prooxidante en funcin da concentracin que se encontre e do tipo de graxa subministrada na dieta (Ruiz e col., 1999; Maraschiello, 1998).
213
Vitamina C O mecanismo antioxidante do cido ascrbico (vitamina C) complexo debido s sas mltiples funcins. Por un lado, ten capacidade de reducir Fe3+ a Fe2+ que, sa vez, pode descompoer hidroperxidos lipdicos (ROOH) ou perxido de hidrxeno (H2O2), xerando radicais libres alcoxilo ou hidroxilo, respectivamente. Polo tanto, en presenza de ferro, perxidos lipdicos e/ou perxido de hidrxeno, o cido ascrbico pode actuar como prooxidante (Niki, 1987). Por outro lado, o cido ascrbico considrase o antioxidante hidrosoluble mis importante nos fludos extracelulares. Reacciona de forma directa cos radicais superxido, hidroxilo e con hidroperxidos lipdicos (Chihuailaf e col., 2002). Ademais, participa na reciclaxe da vitamina E, reducindo o radical tocoferil e rexenerando o -tocoferol nativo (Niki, 1987). Cando os radicais libres se xeran na fase acuosa, os antioxidantes hidrosolubles como a vitamina C actan en primeiro lugar e cando os radicais chegan s membranas, acta a vitamina E; neste caso, a vitamina E e a vitamina C teen un efecto aditivo. En cambio, cando os radicais libres se xeran a nivel da membrana, a vitamina E acta sobre eles en primeiro lugar e a funcin da vitamina C consiste en rexenerar o -tocoferol, permitindo as que este volva actuar; neste caso, as das vitaminas teen un efecto sinrxico (Niki, 1987). En xeral, o cido ascrbico tende a ser prooxidante a baixas concentracins e antioxidante a concentracins elevadas (Morrissey e col., 1998). Vitamina E O termo vitamina E fai referencia a unha familia de compostos relacionados estruturalmente e que incle todos os derivados tocol e tocotrienol que manifestan a actividade biolxica do -tocoferol. De forma xeral, o termo vitamina E utilzase para referirse ao -tocoferol. un composto minoritario, pero que est presente entre os constituntes lipdicos das membranas celulares e as lipoprotenas. A vitamina E un nutriente esencial que non pode ser sintetizado polos animais, polo que a sa presenza nos tecidos destes reflicte a inxestin a travs da dieta. Debido s sas caractersticas liposolubles, a absorcin da vitamina E depende da capacidade do animal para absorber e dixerir a graxa da dieta. Debido s sas caractersticas hidrofbicas, a vitamina E localzase principalmente nos depsitos de graxa e as membranas celulares. esta localizacin preferencial a que fai que a vitamina E sexa tan eficaz no seu papel antioxidante e estabilizador das membranas celulares (Wang e Quinn, 1999). O fgado, msculo esqueltico e tecido adiposo son os tecidos con mis capacidade de acumulacin de -tocoferol (Bjorneboe e col., 1990). A vitamina E o principal antioxidante liposoluble capaz de romper a cadea de propagacin da oxidacin lipdica. Protexe principalmente os AGPI dos fosfolpidos das membranas e das lipoprotenas plasmticas. O seu principal papel consiste en capturar radicais peroxilo antes de que estes ataquen un substrato lipdico diana e propaguen a peroxidacin lipdica. Acta cedendo o H do grupo hidroxilo do carbono 6
214
ao radical peroxilo e frmase o radical -tocoferoxil. O incremento da concentracin tisular de -tocoferol protexe da oxidacin, non soamente aos lpidos de membrana, senn tamn a mioglobina, importante para o mantemento da estabilidade da cor especialmente en carnes vermellas (Liu e col., 1995). A acumulacin de vitamina E msculo-dependente. A capacidade de almacenar -tocoferol difire segundo a composicin do msculo. Observouse que os msculos esquelticos con mis capacidade oxidativa (ricos en fibras do tipo I e IIA) teen mis capacidade de almacenaxe. Isto podera deberse a que estes tipos de msculos posen mis capilares sanguneos, polo que a achega de vitamina E superior, conteen mis mitocondrias e mis membranas onde acumular a vitamina e o contido lipdico tamn superior, o que supn mis capacidade de almacenaxe da vitamina (Jensen e col., 1998). O -tocoferol incorporado ao tecido muscular non se degrada durante a almacenaxe nin a coccin da carne, polo que o seu efecto protector se mantn (Jensen e col., 1998). O suplemento de alfa-tocoferol empregouse como tratamento para manter a cor da carne, as como aumentar a estabilidade oxidativa da graxa. A sa principal influencia o mantemento da cor. Sistema encimtico endxeno (Catalasa, SOD e GSPHx) Glutatin peroxidasa (GSHPx) unha selenoprotena que se encontra na matriz mitocondrial e no citosol das clulas. Considrase o encima con maior capacidade para eliminar perxidos. Acta sobre o perxido de hidrxeno e perxidos lipdicos. A GSHPx necesita selenio (Se) en forma de seloenocysteina, no centro activo, anda que se describiu outra glutatin peroxidasa independente de Se que reactiva unicamente fronte a perxidos lipdicos (Lawrence e Burk, 1976). Algns estudos con animais demostraron que a actividade GSHPx dependente de Se est moi relacionada coa inxestin diettica de Se (DeVore e col., 1983). Catalasa (CAT) unha hemoprotena de ampla distribucin intracelular, pero encntrase principalmente nos peroxisomas e nas mitocondrias. Descompn o perxido de hidrxeno en H2O e O2 (Schwimmer, 1981). En xeral, baixas concentracins de H2O2 estimulan a actividade de peroxidasas como a GSHPx, mentres que a CAT acta a concentracins superiores de H2O2 (Yu, 1994). Superxido dismutasa (SOD) unha metaloprotena presente nas clulas (citosol, mitocondrias, lisosomas, ncleo) e fludos extracelulares. A biosntese deste encima encntrase fortemente regulada pola concentracin do substrato sobre o cal acta (Yu, 1994).
215
Estratexias de control da oxidacin lipdica Existen tres fenmenos principais que diminen a calidade da carne (desde o punto de vista organolptico, nutricional e de seguridade) durante as etapas de producin, transformacin, envasado, transporte e posterior exposicin; en definitiva, o que se coece como vida til dun produto como son a oxidacin proteica e lipdica e a contaminacin microbiana. Anda que o factor limitante na vida til da carne fresca a carga microbiana, a oxidacin lipdica e proteica son causas importantes de perda da calidade e son aspectos cruciais para consumidores e produtores. A oxidacin proteica nas carnes frescas (oxidacin da oximioglobina ata metamioglobina) leva consigo a perda de coloracin desde o vermello brillante ata unha coloracin marrn e unha das principais causas de rexeitamento do consumidor (Faustman e Cassens, 1990). Por outra parte, a oxidacin lipdica en principio nos fosfolpidos de membrana por ser de contido mis insaturado provoca a aparicin de olores e flavores estraos e incluso a xeracin de compostos potencialmente nocivos para a sade, como poidan ser aldhedos, cetonas..., etc. Ambos os dous tipos de oxidacin estn intimamente relacionadas (Kanner e Harel, 1985). Hai diferentes estratexias para o control da oxidacin lipdica, como pode ser o control de substancias prooxidantes, como radicais ou catalizadores ou intermediarios das reaccins de perooxidacin. Outras estratexias poden basearse en alterar os substratos da oxidacin, como podera ser aumentar a estabilidade oxidativa da carne aumentando a proporcin de cidos graxos saturados na dieta, pero isto non do todo desexable desde un punto de vista nutricional. Se pensamos en alimentos como a carne, encontrmonos con das opcins hora de aplicar antioxidantes para estender a vida til desta: alimentar o animal in vivo con estes ou suplementar a carne co antioxidante. A primeira opcin ten como principais limitacins a dispoibilidade e custo do antioxidante, pero non limitacins legais especiais. De feito, o suplemento pdese realizar non empregando concentrados de antioxidante ou antioxidante puro, senn empregando materias vexetais onde se concentra a substancia (como os carotenoides, por exemplo). A segunda opcin ten mis implicacins desde o punto de vista legal e de seguridade alimentaria, se se pretende empregar un antioxidante mis ou menos purificado ou concentrado, que , entn un aditivo. Antioxidantes na dieta animal. Etapa in vivo O pastoreo incrementa o contido en 3 da carne de vacn debido alta porcentaxe de cido linolnico da herba, mellora a relacin PUFA:SFA e os ndices 6/ 3 (Realini e col., 2005). Este aumento da instauracin da fraccin graxa leva consigo un maior estrs oxidativo in vivo pero que tamn compensado na dieta propia do pastoreo, xa que rica en antioxidantes, como cido ascrbico, -caroteno e -tocoferol, aumentando os seus niveis a nivel tisular (Descalzo e col., 2005) res-
216
pecto a unha alimentacin mis intensiva. Cunha alimentacin intensiva rica en PUFAS tamn se pode paliar cunha maior suplementacin de vitamina E (-tocoferol) na dieta. Sloan (2000) logrou aumentar en 7 veces respecto ao seu nivel normal os niveis de vitamina E en becerros. Hai moitas situacins nas que a adicin postmorten de antioxidantes non do todo efectiva debido a que estes compostos non se sitan no lugar ptimo para bloquear as reaccins de oxidacin (Schaefer e col., 1995), iso debido a que a adicin do antioxidante no produto final pode resultar dificultosa, no entanto a suplementacin de antioxidantes na dieta de forma continuada permite a sa incorporacin nas membranas do tecido muscular e adiposo. Un claro exemplo da actuacin sinrxica de antioxidantes in vivo o formado pola parella -caroteno e -tocoferol, pois mentres o primeiro se localiza dentro da rexin hidrofbica das membranas celulares, a vitamina E est preto das superficies das ditas membranas, e sendo a vitamina E mis efectiva contra a oxidacin, ambos os dous protexen da oxidacin as membranas celulares desde diferentes posicins (Tsuchihashi e col., 1995). Antioxidantes no produto final. Etapa posmorten A vida til da carne pode prolongarse coa adicin de antioxidantes e/ou antimicrobianos (Ahn e col., 2002; Snchez-Escalante e col., 2003). Finaliza coa sa data de caducidade, fixada pola apreciacin de zonas con degradacin da cor, xa que incitan o rexeitamento do comprador, e polo enranciamento e dano oxidativo das protenas que poden sufrir cambios conformacionais e fragmentacin da cadea peptdica liberando aminocidos, o que provoca olores e sabores desagradables (Cornet e Bousset, 1990). Na prevencin do enranciamento dos alimentos utilizronse antioxidantes sintticos, a maiora son derivados de estruturas fenlicas, sendo os mis comns: Butilato hidroxianisol (BHA), Butilato hidroxitolueno (BHT), steres do cido glico e Tertbutilhidroxiquinona (TBHQ). O uso destes antioxidantes est limitado a certas cantidades e actualmente estase cuestionando desde o punto de vista da seguridade alimentaria xa que se sospeita do seu posible rol como promotores do cancro e/ou teratxenos (Van Esch 1996). Se a estes feitos se suma unha lexislacin en seguridade alimentaria, cada vez mis restritiva e complexa, comprndese que o interese se centrase en antioxidantes de orixe natural, cuxa aplicacin inmediata sera o campo alimentario (Moure e col., 2001). Cocense un gran nmero de produtos naturais, con propiedades antioxidantes, sendo os mis comns derivados de estruturas polifenlicas como flavonoides, tocoferois, etc. Destaca o extracto de romeu, debido presenza de carnosol, rosmanol, isorosmanol e rosmaridifenol, compostos con elevado poder antioxidante. Comercialzase como aceite que contn estes compostos concentrados e que non presenta o olor nin o flavor caractersticos da planta, os cales modificaran as propiedades sensoriais dos produtos aos que se lles aplicase. Utilizouse con xito en diversos alimentos como salsas, maionesas, carnes procesadas e polo. Nun estudo de Snchez Escalante (2002) sobre os diver-
217
sos sistemas antioxidantes para prolongar a vida til de hamburguesas de vacn envasadas en atmosfera modificada, o romeu mostrou unha gran capacidade antioxidante ademais de certo efecto antimicrobiano. BIBLIOGRAFA
Ahn, J., Grn, I. U., e Fernando, L.N. (2002). J. Food Sci., 67, 1364-1369. Arihara, K., Tomita, K., Ishikawa, S., e col. (2005). Japan patent, submitted to government. Arihara, K. (2006). En: Advanced technologies for meat processing (pp. 245-274). N.M.L. Nollet e F. Toldr (Eds.). Boca Raton, FL: CRC Press. Biesalski, H.-K., (2005). Meat Sci., 70, 509-524. Bjorneboe, A., Bjorneboe, G. A. e Drevon, C. A. (1990). Am. Inst. Nutr., 233-242. Bodwell, C. E. e McClain, P. E. (1971). En: Ciencia de la carne y de los productos crnicos (Price, J.F., Schweigert, B.S., eds.) p.80-211, Editorial Acribia, Zaragoza, Espaa. Boldyrev, A. A., Stvolinsky, S. L., Tyulina, O. V., e col. (1997). Cell. Molecul. Neurobiol., 17, 259-271. Borch, E., Kant-Muemansb, M.-L., e Blixt, Y. (1996). Int. J. Food Microbiol., 33, 103-120. Chihuailaf, R. H., Contreras, P. A. e Wittwer, F. G. (2002). Vet. Mx. 33, 265-283. Comet, M. e Bousset, J., (1990). Proceedings of the 36th ICOMST, Havana pp. 22623 1. Decker, E. A. e Crum, A. D. (1993). Meat Sci., 34, 245-253. Descalzo, A. A., Insani, E. M., Biolatto, A. e col. (2005). Meat Sci., 70, 35-44. DeVore, V. R., Colnago, G. L., Jensen, L. S. e col. (1983). J. Food Sci., 48, 300-301. Djenane, D., Snchez-Escalante, A., Beltrn, J. A., e col. (2001). J. Food Sci., 66, 181-186. Faustman, C. e Cassens, R. G. (1990). J. Mus. Foods, 1, 217-243. Gill. C. D. e Molin. G. (1991). In. N. J. Rusell and G. W. Gould (editors). Food Preservatives. Blackie, Glasgow, 172-199. Hernndez, J. M. (2002). Eurocarne, 106, 33-44. Hu, F. B., Bronner, L., Willett, W. C., e col. (2002). J. Am. Med. Assoc., 287, 1815-1821. Jacobsen, C., Hartvigsen, K., Lund, P., e col. (2001). Eur. Food Res. Technol., 212, 308-318. Jang, A., e Lee, M. (2005). Meat Sci., 69, 653-661. Jensen, M., Essen-Gustavsson, B. e Hakkarainen, J. (1988). J. Vet.Med., A35, 487-497. Kanner, J. (1994). Meat Sci., 36, 169-189. Kanner, J., e Harel, S. (1985). Arch. Biochem. Biophys., 237, 314-319. Kato, H., Rhue, M. R. e Nishimura, T. (1989). En: Flavor Chemistry. TrenaLs and developments. eds. R. Teranishi, R. G. Buttery e F. Shahidi, ACS Symp Series 388, 158-174. ACS, Washington DC. Kendler, B. S. (2002). Nutr., 18, 700-701. Lawrence, R.A. e Burk, R.F. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 71(4), 952. Liu, Q., Lanari, M. C. e Schaefer, D. M. (1995). J. Anim. Sci., 73, 3131-3140. Maraschiello, C. (1998). Tese doutoral. Universidade Autnoma de Barcelona, Barcelona, Espaa. Marx, J. L. (1985). Sci., 235, 529-531. Monahan, F. J. (2002). Eurocarne, 109, 89-96. Morrissey, P. A., Sheehy, P. J. A., Galvin, K., e col. (1998). Meat Sci., 49, S73-S86. Moure, A, Cruz, J. M., Franco, D., e col. (2001). Food Chem., 72, 145-171.
218
Niki, E. (1987). Chem. Phys. Lipids, 44, 227-253. Olmedilla, B. (2002). Alimentaria, 11-19. Realini, C. E., Duckett, S. K., Brito, Q. W., e col. (2005). Meat Sci., 66, 567-577. Ruiz, J. A., Prez-Vendrell, A. M. e Esteve-Garca, E. (1999). J. Agric. Food Chem., 47, 448-454. Snchez-Escalante, A., Djenane, D., Torrescano, G., e col. (2003). J. Food Sci., 68, 339-344. Schaefer, D. M., Liu, Q., Faustman, C., e col. (1995). J. Nutr., 125, 1792-1798. Schwimmer, S. (1981). En: Source Book of Food Enzymology, 202-217, The AVI Publishing Company, INC Westport, Connecticut, USA. Scollan, N. D., Choi, N. J., Kurt, E., e col. (2001). Br. J. Nutr., 85, 115-124. Sevanian, A. e Hochstein, P. (1985). Ann. Rev. Nutr., 5, 365-390. Shackelford, S.D.; Purser, D.E.; Smith, (1992). J. Anim.Sci., 70, 465-469. Shacter. (2000). Drug Metab. Rev., 32 (3&4), 307-326. Sloan, E. A. (2000). Food Trends. Food Technol., 54, 33-58 Tsuchihashi, H., Kigoshi, M., Iwatsuki, M., e col. (1995). Arch. Biochem. Biophys., 323, 137-147. Van Esch, G. T. (1996). Food Chem Toxicol., 24, 1063-1066. Wang, X. e Quinn, P. J. (1999). Prog. Lipid Res., 38, 309-336. Yu, B. P. (1994). Physiol. Rev., 74, 139-162.
219
EXTRACCIN DE COMPOSTOS FENLICOS DA UVA RELACIONADOS COAS CARACTERSTICAS TECNOLXICAS E FUNCIONAIS

Celestino Santos-Buelga Dpto. de Nutricin e Bromatoloxa. Facultade de Farmacia. Universidade de Salamanca Introducin Os compostos fenlicos son os produtos mis importantes do metabolismo secundario dos vexetais e encntranse amplamente distribudos en hortalizas, froitas e produtos derivados destas, inclundo a uva e o vio. Quimicamente trtase de substancias que conteen polo menos un anel aromtico cun ou mis substituntes hidroxilo, que derivan biosinteticamente das rutas metablicas do siquimato, que d lugar a estruturas fenilpropanoide (C6-C3), e da dos poliqutidos (C6) ou de ambas as das conxuntamente. Nas plantas existen, non obstante, outras substancias que poden conter substituntes fenlicos na sa estrutura, pero que non se clasifican dentro das familias de compostos fenlicos ao derivar doutras vas metablicas, como o caso dalgns produtos de natureza terpenoide ou de alcaloides. Trtase de compostos que xogan importantes papeis nas plantas superiores, participando en funcins defensivas (fronte a radiacin UV, patxenos, patoloxas vexetais ou distintos tipos de estrs fisiolxico), nodulacin (leguminosas), proteccin fronte a herbvoros (como disuasores), pigmentacin, etc. (Lattanzio e col., 2008). Nos alimentos contriben definicin dalgunhas caractersticas organolpticas, como a cor, o sabor ou a astrinxencia, e relacionronse tamn con potenciais beneficios para a sade humana ao tratarse de substancias capaces de exercer distintos tipos de actividades biolxicas, ben establecidas en estudos in vitro, en particular, actividade antioxidante e captadora de radicais libres, capacidade para secuestrar metais de transicin ou para interaccionar con protenas e modular a actividade dalgns encimas. Clasificacin Dentro dos compostos fenlicos inclense un grupo amplo de substancias con estruturas diversas, que van desde molculas sinxelas ata complexas estruturas polimricas, sendo habitual clasificalos de acordo ao seu esqueleto bsico en: fenois simples (C6), cidos benzoicos (C6-C1), cidos fenilacticos (C6-C2), fenilpropanoides (C6-C3; cidos hidroxicinmicos, cumarinas, cromonas), estilbenos (C6-C2-C6) e flavonoides (C6-C3-C6), as como derivados oligo/polimricos destes, como ligninas (C6-C3)n ou taninos hidrolizables (C6-C1)2 e condensados (C6-C3-C6)n. O nmero
220
de substancias fenlicas identificadas supera xa as 8000 e contina aumentando (Andersen e Markham, 2006). No caso particular da uva, os compostos fenlicos mis representativos pertencen s familias dos cidos hidroxibenzoicos (cido glico), derivados hidroxicinmicos (que se encontran maioritariamente esterificados con cido tartrico), flavonoides, entre os que encontramos antocianos, flavanois (catequinas e proantocianidinas ou taninos condensados) e flavonois; e, en cantidades menores, estilbenos (resveratrol e piceido). Ademais dos anteriores, no vio pdense encontrar tamn taninos hidrolizables (galo- e elagitaninos) procedentes da madeira das barricas. Na Figura 1 recllense os grupos de compostos fenlicos mis representativos da uva (e o vio).
COMPOSTOS FENLICOS NON FLAVONOIDES n
OH OH O O DERIVADOS HIDROXICINMICOS (cido cafeoil-tartrico o caftrico) O OH ESTILBENOS (Resveratrol) HO
HO HO OH
COOH
O HO HO HO
OH
ACIDOS BENZOICOS (cido glico)
FLAVONOIDES
OCH3 OH HO O + OH OH ANTOCIANOS (Malvidina) OH OH HO O OH OH FLAVANOLES (Catequinas) OH OH HO O OH OH O FLAVONOLES (Quercetina) FLAVANOLES (Taninos condensados o proantocianidinas) OH OH HO OH O HO O OH OH OCH3 OH OH
OH
Figura 1. Compostos fenlicos representativos da uva e o vio
221
Composicin fenlica da uva e o vio As substancias fenlicas encntranse irregularmente distribudas dentro da uva, cada unha de cuxas partes presenta unha composicin mis ou menos especfica (Figura 2). As, encontramos taninos condensados tanto nos raspns, como na pel e sementes, mentres que antocianos e flavonois se encontran case exclusivamente na pel e derivados hidroxicinmicos na polpa.
RASPN Taninos PULPA (83-91%) Hidroxicinamatos HOLLEJO (7-12%) Antocianos, flavanoles, Flavonoles, estilbenos
SEMILLAS (0-6%) Flavanoles (catequinas, taninos condensados)
Figura 2. Distribucin dos principais tipos de compostos fenlicos na uva
Na tboa 1 recllense os intervalos aproximados de concentracin de compostos fenlicos nas distintas partes da uva. Estes contidos deben considerarse exclusivamente orientativos, xa que existen notables diferenzas dependendo da variedade de uva, grao de maduracin, condicins climticas ou caractersticas do cultivo (solo, orientacin, modo de conducin do viedo, etc.). En principio, salvo pola presenza de antocianos, presentes exclusivamente en variedades tintas, non existen diferenzas relevantes en canto composicin fenlica en uvas brancas e tintas.
Flavanois monmeros (catequinas) Flavanois condensados (taninos) Oligmeros Polmeros Antocianos Flavonois cidos fenlicos Estilbenos Peles 14-100 35-200 20-750 200-5000 20-200 25-200 Tr-20 Sementes 50-1000 120-1400 >1200 Polpa Tr Tr * 40-500
*As variedades tintureiras, como Garnacha tintureira e Alicante-Bouchet, presentan tamn certas cantidades de antocianos na polpa. Tboa 1. Concentracins aproximadas de compostos fenlicos nas distintas partes da uva (mg/Kg uva, expresado en peso fresco). Fonte: elaboracin propia
222
O tipo e concentracin de compostos fenlicos presentes no vio van depender da composicin cualitativa e cuantitativa da uva e do proceso de vinificacin empregado, que determinar os fenmenos de difusin e extraccin dos compostos desde as partes slidas da uva (e desde a madeira das barricas, se hai crianza) ao mosto. Tamn a modo orientativo, na tboa 2 recllense os contidos medios habituais que poden ser encontrados nun vio novo.
Non flavonoides totais cidos hidroxibenzoicos Derivados hidroxicinmicos Estilbenos (resveratrol) Flavonoides totais Antocianos Flavanois Flavonois Substancias fenlicas totais Vio tinto 240-500 0-250 60-330 Tr-15 750-1100 20-500 50-450 10-200 900-2500 Vio branco 160-260 0-100 130-150 Tr-4 25-30 Tr 15-30 Tr 190-290
Tboa 2. Concentracin (mg/L) de substancias fenlicas no vio. Fonte: elaboracin propia
Influencia dos compostos fenlicos nas caractersticas sensoriais do vio As substancias fenlicas xogan un papel determinante na definicin das propiedades organolpticas e funcionais dos vios. De maneira xeral, asmese que as caractersticas de cor, astrinxencia e calidade global dos vios tintos estn positivamente relacionadas co contido de compostos fenlicos de natureza flavonoide. Nos vios brancos os compostos fenlicos xogan, salvo excepcins, un papel sensorial menor, estando mis ben na orixe de defectos de cor e estabilidade, de modo que a calidade se asocia a outros parmetros, como frescura ou compoentes aromticos. De particular interese para a calidade sensorial dos vios tintos son os antocianos e flavanois (catequinas, proantocianidinas ou taninos condensados). Os primeiros son os principais responsables da cor do vio tinto, mentres que os segundos inflen sobre o amargor e a astrinxencia e resultan determinantes para a estrutura, complexidade e sensacin en boca dos vios; ademais, contriben tamn estabilidade e expresin da cor dos antocianos, a travs da sa implicacin en procesos de copigmentacin. Da concentracin e tipo de taninos presentes e o seu balance en relacin cos antocianos depende, en gran medida, a aptitude dos vios para o envellecemento. Outros flavonoides, como os flavonois, poden ter tamn certa influencia sobre a cor e o amargor dos vios, anda que a sa concentracin nestes moito mis baixa; igualmente, poden contribur compoente amarela da cor nos vios brancos. Os derivados hidroxicinmicos da uva (e tamn os flavanois) son substra-
223
tos preferentes en procesos de apardazamento encimtico, que poden deteriorar a calidade dos vios, especialmente no caso dos brancos. Anda que incoloros, todos estes compostos poden influr indirectamente sobre a cor a travs das sas interaccins cos antocianos (copigmentacin). Pola sa parte, os cidos fenlicos e taninos hidrolizables, extrados da madeira das barricas, poden tamn influr sobre o sabor e a cor dos vios. O vio, non obstante, un medio dinmico sometido a unha evolucin constante na sa composicin fenlica, que se vai volvendo progresivamente mis complexa. Ao longo da vinificacin, conservacin e envellecemento, sucdense unha serie de procesos encimticos, microbiolxicos e qumicos que afectan os compostos fenlicos e que conducen a produtos de oxidacin, degradacin e condensacin destes. Os novos compostos formados posen propiedades sensoriais diferentes s dos seus precursores, influndo deste modo sobre a calidade e caractersticas dos vios. A modo de exemplo, pdese comentar o caso dos antocianos. coecido que ao longo da vida do vio, a cor vai modificndose, pasando dos tons vermello prpura inicial dos vios tintos novos a tonalidades tella, alaranxadas ou pardas, propias dos vios envellecidos. Estes cambios teen a sa orixe nas caractersticas estruturais e de estabilidade dos antocianos, os cales existen baixo distintas formas dependendo do medio disolvente no que se encontren a composicin e a acidez deste. Os antocianos adoitan representarse como catins flavilio, que posen unha coloracin avermellada; estas formas en medios acuosos experimentan reaccins de transferencia de protn, que levan formacin de bases quinoidais azuladas e procesos de hidratacin, que xeran aductos hemiacetal incoloro en equilibrio con estruturas calcona (Figura 3). A proporcin de cada forma est determinada polo pH, de modo que os catins flavilio s predominan en disolucins moi cidas (Brouillard e col., 1977), mentres que en medios acuosos ou hidroalcohlicos debilmente cidos, como o vio, existiran basicamente formas hemiacetal incoloras. Por outra parte, a normal presenza nos vios de sulfitos, cos que os catins flavilio forman tamn aductos incoloros, achega motivos adicionais para a decoloracin dos antocianos. No entanto, a pesar de todo iso, os vios tintos continan mostrando unha mis ou menos intensa cor vermella, o que se atribe existencia no vio de, polo menos, dos mecanismos de estabilizacin da cor: (1) a asociacin non covalente dos cromforos antocinicos con outros compoentes do vio (fundamentalmente compostos fenlicos), a travs dun proceso denominado copigmentacin que os protexera da sa hidratacin e decoloracin, e (2) a substitucin progresiva dos antocianos da uva por pigmentos mis estables resultantes da sa transformacin. O primeiro proceso tera particular importancia en vios tintos novos, mentres que o segundo participara principalmente na cor dos vios envellecidos. Todos estes cambios non s teen repercusins sobre a cor, senn que inflen tamn sobre outras caractersticas sensoriais, como a astrinxencia, ao implicar nestes a outras
224
substancias fenlicas e, en particular, aos flavanois (Santos-Buelga e de Freitas, 2009).
R1 OH HO + O OH R2 O-Gluc HO O
R1 OH
-H+/H2O
R2 O-Gluc
OH
OH
Catin flavilio (Rojo)

-H+
R1 OH O O HO
Hemiacetal (incoloro)
R1 OH OH O
R2 O - Gluc
R2 O-Gluc
OH
OH
Base quinoidal (azul)
Calcona (incolora-amarillenta)
Figura 3. Equilibrios entre formas estruturais dos antocianos
Compostos fenlicos do vio e propiedades saudables Nos ltimos anos difundronse estudos onde se relaciona o consumo moderado e responsable de bebidas alcohlicas con beneficios para a sade en determinados individuos. En particular, estes beneficios refrense a unha mellor sade cardiovascular (St. Leger e col., 1979; Renaud e de Lorgeril, 1992), anda que hai traballos que suxiren que podera tamn protexer fronte a outras patoloxas, como diabetes (Koppes e col., 2005), dficits cognitivos ou demencias (Letenneur, 2004). coecido que o alcohol (etanol) favorece o aumento nos niveis circulantes de lipoprotenas de alta densidade (HDLs), exerce actividade fibrinoltica e dimine a agregacin plaquetaria (Pellegrini e col., 1996), o que, en certa medida, podera explicar un posible efecto protector cardiovascular. No entanto, a maior parte dos estudos prospectivos realizados por distintos investigadores apuntan a que existe un maior efecto protector no caso do vio que o doutras bebidas alcohlicas, como cervexa ou bebidas espirituosas. Unha razn que se achegou para xustificar o maior efecto protector observado entre consumidores de vio que nos pases onde o seu consumo tradicional existen hbitos dietticos mis saudables (p.e. dieta mediterrnea) e
225
inxerido xunto coas comidas. Por outra parte, en poboacins onde non tradicional, o vio adoita ser mis consumido por xente de maior nivel cultural e econmico e con estilos de vida mis saudables (Johansen e col., 2006). Deste modo, os potenciais beneficios non derivaran tanto dos efectos do vio senn dos patrns de vida asociados ao seu consumo. No caso doutras bebidas alcohlicas acostuma ter maior tendencia a pautas de consumo irregular, concentrado e excesivo, estando establecido que este tipo de consumidores mostran taxas de mortalidade coronaria e global mis elevadas que os bebedores que realizan un consumo lixeiro e regular de alcohol (Rehm e col., 2003). Non obstante, a razn mis comunmente apuntada para xustificar os maiores efectos protectores do vio a presenza neste, ademais do alcohol de compostos fenlicos, ausentes ou presentes en menor cantidade noutras bebidas. Neste sentido, cabe esperar efectos mis positivos por parte dos vios tintos que dos brancos ou rosados, moito menos ricos neste tipo de substancias. Moitos compostos fenlicos que se poden encontrar na uva e no vio comprtanse como potentes antioxidantes en ensaios in vitro e encontrronse, de feito, relacins entre a capacidade antioxidante dos vios e o seu contido en substancias fenlicas (Burns e col., 2001; Paixo e col., 2007). As mesmo, en distintos estudos observouse que extractos polifenlicos obtidos da uva ou vio tinto son capaces de diminur a agregacin plaquetaria, inducir vasorrelaxacin, inhibir a peroxidacin lipdica, regular os niveis plasmticos de triglicridos, modular a expresin da sintasa de xido ntrico endotelial (eNOS) inducindo a liberacin de NO de maneira dose dependente ou inhibir a sntese de endotelina-1, un pptido vasoactivo cuxa sobreproducin un factor clave no desenvolvemento de enfermidade vascular e aterosclerose (revisado por DellAgli e col., 2004). Estes efectos asocironse sobre todo s proantocianidinas (Corder e col., 2006), que constiten, en xeral, a fraccin polifenlica maioritaria nos vios tintos. Outro composto fenlico tamn presente no vio o estilbeno resveratrol, para o cal tamn se demostrou unha ampla variedade de actividades biolxicas. Recentemente viuse que o resveratrol a travs da sa actuacin sobre as sirtuinas, unha familia de encimas deacetilasas implicadas na regulacin celular, era capaz de aumentar ata nun 40% a duracin de vida en diversos organismos habitualmente utilizados en ensaios de laboratorio, como Saccharonmyces cerevisiae, Caernohabditis elegans, Drosophila melanogaster ou rato (Baur e Sinclair, 2006). De confirmarse estes efectos estariamos ante un composto con gran potencialidade teraputica, anda que parece improbable que coas concentracins s que se encontra no vio se poidan chegar a inducir efectos similares aos encontrados en animais de experimentacin. A modo de exemplo pdese indicar que un vio tinto cunha concentracin media (optimista) de resveratrol de 5 mg/L achegara ~27 g/kg peso nunha persoa de 70 kg cunha inxesta de 375 mL/da, concentracins de magnitude arredor de oitocentas veces inferior s ensaiadas en ratos (22,4 mg/kg peso/da).
226
Con relacin aos posibles efectos beneficiosos do vio, dbese ter en conta que os datos cientficos de que se dispn ao respecto son incompletos e indirectos, derivados de ensaios en modelos in vitro ou con animais de experimentacin, sendo difcil que poidan chegar a obterse evidencias definitivas en humanos, toda vez que a realizacin de estudos de intervencin debe descartarse por razns ticas. Por iso, as evidencias dispoibles basanse en observacins epidemiolxicas que, anda que slidas e consistentes, non constiten unha proba definitiva sobre a existencia de efectos beneficiosos do vio, dada a diversidade de factores que poden influr sobre estas. BIBLIOGRAFA
Andersen, O.M. e Markham, K.R., eds., (2006). Flavonoids. Chemistry, biochemistry and applications. CRC Press, Boca Raton, FL, USA, 1237 pp Baur, J. A. e. Sinclair, D.A. (2006). Nature Reviews, 5, 493-506. Brouillard, R., Delaporte, B. e Dubois, J. E. (1977). Journal of the American Chemical Society, 99, 84618468. Corder, R.. Mullen, W., Khan, N. Q., e col. (2006). Nature, 444, 566. DellAgli, M., Busciala, A. e Bosisio. E. (2004). Cardiovascular Research, 63, 593-602. Johansen, D., Friis, K., Skovenborg, E., e col. (2006). British Medical Journal, 332, 519-522 Koppes, L. L., Dekker, J. M., Hendriks, H. F. J., e col. (2005). Diabetes Care, 28, 719-725. Lattanzio, V., Kroon, P.A., Quideau, S., e col. (2008). En: Recent Advances in Polyphenols Research. Vol II. (F. Daayf & V. Lattanzio, eds.), Wiley-Blackwell, Oxford, UK., 1-35. Letenneur, L. (2004). Biological Research, 37, 189-193. Paixo, N., Perestrelo, R., Marques, J.C., e col. (2007). Food Chemistry 105, 204-214. Pellegrini, N., Pareti, F., Stabile, F., e col. (1996). European Journal of Clinical Nutrition, 50, 209-213. Rehm, J., Sempos, C.T. e Trevisan, M. (2003). Journal of Cardiovascular Risk, 10, 15-20. Renaud, S. e de Lorgeril, M. (1992). The Lancet, 1, 1523-1526. St. Leger, A. S., Cochrane, A. L. e Moore, F. (1979). The Lancet, 1, 1017-1020. Santos-Buelga, C. e de Freitas, V. (2009). En: Wine Chemistry and Biochemistry (C. Polo & M.V. MorenoArribas, eds.), Springer Science. N. York, USA, 527-569.
227
INFLUENCIA DO NIVEL DE MADURACIN DA UVA E DAS TCNICAS DE VINIFICACIN SOBRE A COMPOSICIN EN COMPOSTOS FENLICOS DO VIO
Fernando Zamora Grupo de Investigacin en Tecnoloxa Enolxica (TECNENOL). Dpto. de Bioqumica e Biotecnoloxa. Facultade de Enoloxa de Tarragona. Universidade Rovira i Virgili O concepto de madurez fenlica non un tema novo senn que un dos temas que durante as ltimas das dcadas suscitaron maior interese aos elaboradores de vios tintos. Non cabe a menor dbida de que a concentracin e extractibilidade dos antocianos presentes na pel da uva, as como a proporcin de tanino das sementes, son algns dos principais factores que condicionarn a futura calidade do vio tinto (Ribreau-Gayon e col., 1999). Por esta razn, durante os ltimos anos falouse- e continuarase falando- da necesidade de dispor de metodoloxas eficaces para determinar o nivel de madurez fenlica real das uvas, para deste modo dispor dun criterio mis adecuado para decidir a data ptima de vendima (Glories e Agustn, M., 1993; Lamadon, 1995; Izcara e Gonzlez, 2001; Zamora, 2002). Para ilustrar estes conceptos necesario mostrar a evolucin dos compostos fenlicos da uva ao longo do proceso de maduracin (Figura 1).
Taninos de la piel Concentracin Taninos de las semillas Antocianos
Envero
Madurez de la pulpa
Figura 1. Evolucin dos compostos fenlicos durante a maduracin
Na maduracin pdese ver que a concentracin de antocianos aumenta ata alcanzar un valor mximo. Posteriormente obsrvase un lixeiro descenso. Pola sa parte os taninos da pel aumentan durante o proceso de maduracin, mentres que os das sementes diminen (Ribreau-Gayon e col., 1999). Como se pode ver na Figura 2, a astrinxencia dos taninos da pel tende a diminur, mentres que a dos taninos das sementes mantense constante ao longo do proceso
228
de maduracin. No seu conxunto, a uva verde pose menos taninos que a madura, pero en cambio a contribucin de taninos das sementes, e polo tanto a sa astrinxencia global, ser maior (Delteil, 1998; Ribreau-Gayon e col., 1999).
90 80 70 60 50 Envero Piel Maduracin Semilla
A principal razn pola cal os taninos das sementes son mis astrinxentes que os das peles est relacionada co feito de que os taninos das sementes e os das peles non presentan a mesma composicin. Basicamente, os taninos das peles son ricos en prodelfinidinas e apenas posen unidades galoiladas, mentres que os das sementes son especialmente ricos en unidades galato de epicatequina, o que lles confire a sa maior astrinxencia (Vidal e col., 2003). Outro factor importante a ter en conta o feito de que o grao de madurez da uva tamn infle sobre a extractibilidade da cor durante a vinificacin. Na Figura 3 mstrase un esquema ilustrativo deste fenmeno (Zamora, 2003).
ndice de gelatina
Figura 2. Evolucin da astrinxencia dos taninos durante a maduracin
229
Inicio fermentacin; Medio acuoso; temperatura moderada Piel Uva verde: Poco color Uva madura: Mucho color Intercambio nicamente por la cara interna
R HO + O O 1 OH R2 O CH2OH
R1 HO + O O
O H R 2
OH
C H2OH
R HO + O O
1 OH R2
OH
O CH2OH
OH
- Uva verde: Dficil extraccin del color - Uva madura: Facil extraccin del color
R1 HO + O O
OH R2 HO
R1 + O O
OH R2
OH
CH O H 2 + O O
O H R1 HO
CHOH 2
Pruna (impermeable)
OH R2
O H
CH OH 2
Fermentacin avanzada; Medio hidroalcohlico; Pruina temperaturas altas

R1 HO + O O OH R
O H
CH2OH
Capa de clulas de la pulpa - Uva verde: Capa gruesa - Uva madura: Capa fina
R 1 HO + O O
OH R 2 HO
R1 + O O
OH R 2
Solubilizacin de la pruna Intercambio por las dos caras
OH
CH2OH
OH
CH2OH
R1 H O + O O
OH R HO
R1 + O O
OH R
OH
CH2OH R 1 HO + O O OH R
OH
CH2OH
OH
CH OH 2
Figura 3. Influencia do grao de madurez sobre a solubilizacin dos antocianos
A pel do gran de uva esta recuberta cunha capa impermeable dunha substancia ceroide, a pruna. Ao comezo da fermentacin/maceracin, o medio acuoso e as temperaturas son polo xeral baixas. Nestas condicins a pruna acta impedindo a solubilizacin de substancias pola capa externa da pel. Nestas condicins a solubilizacin dos antocianos unicamente poder ter lugar pola cara interna do gran da uva. Non obstante, a medida que a fermentacin avanza, librase etanol e sobe a temperatura. Ambos os dous factores provocan a solubilizacin da pruna e fan posible que o intercambio tamn tea lugar pola cara externa da pel. Resumindo todo o exposto, a uva verde pose unha baixa concentracin de antocianos que ademais sern de difcil extraccin. As mesmo, a uva verde presenta unha gran concentracin de taninos das sementes, polo que se se forza a maceracin co fin e efecto de extraer a suficiente cor, extraerase tamn tanino astrinxente e herbceo. Pola contra, a uva madura ter unha alta concentracin de antocianos facilmente extrables e dar lugar a vios con corpo e de taninos suaves. Por todo o exposto resulta evidente que o grao de madurez fenlica da uva un factor determinante da calidade do vio tinto, e polo tanto a determinacin da data de vendima deber de ser efectuada utilizando este criterio.
230
A Figura 4 mostra a cintica de solubilizacin dos compostos fenlicos ao longo da maceracin.
Maceracin prefermentativa
Maceracin durante la fermentacin alcohlica
Maceracin postfermentativa
Intensidad colorante Taninos de la piel Antocianos Taninos de la semilla Polisacridos
Figura 4. Cintica de extraccin dos compostos fenlicos durante a fermentacin/ maceracin
Como se ve, os antocianos extrense relativamente rpido, anda que a velocidade de solubilizacin depender, tal e como xa se comentou, do nivel de madurez fenlica da uva, as como de diversos factores tecnolxicos. De feito, a mxima extraccin dos antocianos ten lugar en poucos das, para despois observarse unha tendencia diminucin, debido principalmente a fenmenos de oxidacin, precipitacin e adsorcin. Un comportamento similar obsrvase na intensidade colorante, anda que a sa diminucin en ocasins mis marcada, debido a que a aparicin do etanol dimine os fenmenos de copigmentacin e a que se forman combinacins antociano-flavanol, algunhas das cales son inicialmente incoloras. Os taninos solubilzanse mis lentamente. De feito durante a maceracin prefermentativa, ao non haber etanol no medio e ao ser as temperaturas moderadas, a sa extraccin moi limitada. Posteriormente ao aparecer alcohol no medio durante a fermentacin alcohlica e aumentar a temperatura do medio, favorecerase a sa solubilizacin. necesario tamn distinguir entre os taninos da pel e os das sementes, xa que a sa cintica de extraccin diferente. Os taninos da pel comezan a solubilizarse conxuntamente aos antocianos, anda que a sa extraccin se prolongase mis tempo. Pola contra, os taninos das sementes non se solubilizarn ata a metade da fermentacin, cando o alcohol disolva a cutcula. Por todo iso, a tanicidade do vio incremntase a medida que se alonga a maceracin.
231
Finalmente, durante a vinificacin pdese aplicar tcnicas que permiten modificar a extraccin dos diferentes compostos fenlicos. A Figura 5 incle os puntos clave, dentro do diagrama de fluxo da vinificacin en tinto, onde se pode incidir para mellorar a extraccin.
Estado sanitario Nivel de madurez Uva tinta Enzimas Pectolticas Taninos Maceracin en Fro Chips Levaduras Estrujadora-Despalilladora
Pasta de vendimia Sangrado parcial
Raspn Bomba de vendimia Microoxigenacin Adicin de SO2 bajo sombrero Remontado; Bazuqueo; Inundacin; Sombrero sumergido Delestage con o sin eliminacin de semillas
Fermentacin-Maceracin Tiempo de maceracin Temperatura de maceracin
Figura 5. Vinificacin en tinto. Puntos crticos para a extraccin e estabilizacin da cor
BIBLIOGRAFA
Delteil, D. (1995). Les macerations en rouge: Lart du dtail. Rev. Enol., 77, 23-25. Glories, Y. e Agustn, M. (1993). Actes du Colloque Journ technique du CIVB, Bordeaux, 56-61. Izcara, E. e Gonzlez, M.L. (2001). Enlogos, 14, 14-18. Lamadon, F. (1995). Rev. nolog. Techniq. Vitvinic. nol., 76, 37-38. Ribreau-Gayon, P., Glories, Y., Maujean, A., e col. (1999). En: Handbook of enology, Vol 2, John Wiley & sons, Ltd, Chichester, 129-186. Vidal, S., Francis L., Guyot S., e col. (2003) J. Sci. Food Agric., 83, 564-573. Zamora, F. (2002). Enlogos, 18, 24-28 Zamora, F. (2003). Elaboracin y crianza del vino tinto; aspectos cientficos y prcticos. Mundi-Prensa. AMV Edicins, Madrid.
233
APLICACIN DA EXTRACCIN SUPERCRTICA NO APROVEITAMENTO DOS SUBPRODUTOS DE VINIFICACIN

Miguel Rodrguez Rodrguez Dpto. de Enxeera Qumica. Tecnoloxa dos Alimentos e Tecnoloxas do Medio Ambiente. Universidade de Cdiz Os fludos supercrticos Un fludo supercrtico (FSC) pode considerarse como un estado de agregacin da materia en condicins de presin e temperatura superiores s do seu punto crtico. Os fludos supercrticos exhiben propiedades intermedias entre gases e lquidos. Presentan unha viscosidade relativamente baixa (prxima dos gases) e unha difusividade alta, polo que poden penetrar nos materiais slidos porosos de forma mis eficaz que os solventes lquidos. O poder disolvente dun FSC depende da sa densidade, a que a diferenza dos solventes lquidos se controla por cambios de presin e/ou temperatura. Este feito permite optimizar o proceso de extraccin cambiando simplemente unha ou ambas as das variables. A extraccin supercrtica (ESC) emerxe como unha operacin competitiva respecto doutras operacins de separacin convencionais como destilacin, extraccin con disolventes, evaporacin, etc., que requiren con frecuencia operar nunhas condicins de temperaturas que poden afectar as substancias termolbiles e/ou a utilizacin de disolventes que pola sa natureza tamn poden incidir negativamente sobre o ambiente, a calidade dos produtos e a sade dos consumidores. Actualmente, a maiora dos procesos de extraccin de produtos naturais utilizan disolventes lquidos como axentes extractantes. As principais vantaxes que presentan as ditas substancias estn asociadas alta solubilidade que presentan os diversos solutos nestes disolventes. Agora ben, o feito de que, en xeral, haxa que eliminar o disolvente do produto extrado, require operacins de evaporacin ou destilacin que implican a utilizacin de temperaturas elevadas. Nestas condicins pode producirse a degradacin trmica de substancias termolbiles. Ademais a necesidade de adicionar unha nova operacin encarece o proceso de producin. Como alternativa, xorde a extraccin con disolventes en condicins supercrticas e, mis concretamente, con dixido de carbono. Os procesos de extraccin con dixido de carbono en condicins supercrticas son mis rpidos que os convencionais debido s excelentes propiedades difusionais
234
deste. O feito de que a temperatura crtica do dixido de carbono estea prxima aos 30C permite que o proceso de extraccin se poida realizar a temperaturas relativamente baixas. Ademais, gasoso en condicins ambientais, o que facilita enormemente a separacin do produto extrado. O principal inconveniente da utilizacin desta substancia como disolvente a sa baixa polaridade que o fan pouco adecuado para a extraccin de substancias polares. No entanto, xorde a posibilidade de realizar a extraccin en condicins supercrticas con codisolventes. Esta tcnica consiste en adicionar ao dixido de carbono unha pequena cantidade dunha substancia modificadora da sa polaridade. Esta adicin permite aumentar a polaridade da mestura disolvente provocando un incremento do rendemento na extraccin de substancias polares. Finalmente, investigacins recentes utilizan mesturas lquidas a alta presin, tcnica anloga anterior cuxa diferenza estriba en que a porcentaxe de codisolvente na mestura maior. Ao aumentar esta porcentaxe, psase a condicins subcrticas, dicir, utilizaranse mesturas de dixido de carbono en estado lquido e un disolvente lquido convencional. ESC de suprodutos de vinificacin De forma xenrica, o proceso de vinificacin produce un residuo denominado bagazo. Este subproduto da vinificacin est constitudo, fundamentalmente, por sementes, raspns e pel. Por un lado, as sementes poden ser aproveitadas polo seu contido en aceite que ten un alto valor diettico e nutricional, mentres que o residuo pode ser destinado a alimentacin animal. Por outra parte, a pel, pode sufrir unha fermentacin para a obtencin de etanol, e o residuo resultante pode someterse a un proceso de extraccin para a recuperacin de antocianos e tartratos, dependendo do tipo de vinificacin. De todas as substancias que se poden recuperar, os antocianos son as substancias que teen maior interese debido s sas aplicacins como colorantes naturais e s sas propiedades antioxidantes. Extraccin de antocianos Os experimentos realizados dividronse en funcin do proceso de extraccin utilizado: Proceso de extraccin supercrtica con CO2 + codisolventes Proceso de extraccin con mesturas lquidas de CO2 + codisolventes a alta presin Proceso de extraccin convencional con metanol.
235
Os disolventes utilizados foron en cada caso dixido de carbono e un 5% de metanol ou auga para as probas supercrticas con codisolventes, dixido de carbono e un 20% de metanol ou auga, no caso das probas lquidas a alta presin e metanol para a extraccin convencional. Os valores das variables de operacin foron os seguintes: 100 e 500 bar, para as probas a alta presin, e presin atmosfrica, para a extraccin convencional. 40 e 60C de temperatura para garantir que se est por encima do punto crtico do dixido de carbono e evitar a posible degradacin trmica dos antocianos. Con respecto ao caudal, diversos estudos preliminares indicaron que a zona onde se encontra o mximo rendemento est comprendida entre 12 e 22,6 mmol/min. Os resultados mostran que, en xeral, o rendemento do proceso maior a 100 bar que a 500 bar. Mentres que parece claro que a solubilidade dun soluto aumenta coa presin, debido ao aumento de densidade que experimenta o disolvente, os resultados obtidos por diversos autores estudando o proceso de extraccin de carotenoides con codisolventes amosan unha clara diminucin do rendemento da extraccin coa presin. Esta diverxencia pode atriburse a un aumento coa presin da solubilidade dos diversos cosolutos presentes na pel, con respecto ao aumento de solubilidade dos antocianos, o cal se traduce nunha diminucin da solubilidade efectiva destes. Con respecto ao efecto da temperatura o rendemento do proceso de extraccin mis alto obtense a 60C. Este feito pode ser atribudo a varios factores: por un lado, ao aumento da presin de vapor do soluto coa temperatura, o que facilita a sa disolucin, e por outro, a un aumento da difusividade do disolvente e a unha diminucin da viscosidade coa temperatura, mellorando enormemente as propiedades de transferencia de materia deste. Para avaliar cal dos dous sistemas disolvente-codisolvente utilizados mellor, compranse os rendementos obtidos tras das horas de extraccin. Os resultados mostran claramente que as probas realizadas utilizando metanol como codisolvente presentan un rendemento moito maior que cando se utiliza auga, debido s mellores propiedades difusionais do dito sistema disolvente fronte ao formado coa auga.
236
Extraccin de resveratrol, catequina e epicatequina Realizronse probas coa pel de uva de das variedades: tempranillo e garnacha a 100 bar e 400 bar de presin e a 35C e 55C de temperatura, utilizando CO2 como disolvente e auga e etanol como codisolvente Os resultados obtidos mostran que: Para as substancias estudadas, os mellores resultados obtense cando se opera a 400 bar de presin e 55 C de temperatura. Das das variedades estudadas, as mostras de tempranillo proporcionan mellores resultados que as de garnacha en, practicamente, todas as extraccins realizadas para as condicins de presin e temperatura anteriores. No caso dos residuos de uva palomino realizronse extraccins a mostras de sementes, raspn, pel e bagazo nas mesmas condicins de presin e temperatura. Os datos obtidos sobre contido en resveratrol indican que cando se utiliza como sistema disolvente CO2 + etanol a 400 bar e 55C obtense resultados mellores que os obtidos coa extraccin convencional.
237
RECUPERACIN E CONCENTRACIN DE ANTIOXIDANTES DOS RESIDUOS DE ALCOHOLEIRA

Beatriz Daz Reinoso Dpto. Enxeera Qumica. Universidade de Vigo Dende un punto de vista xenrico, o proceso de vinificacin produce un residuo denominado bagazo, o cal est constitudo, fundamentalmente, por sementes, raspns e pel. Este residuo somtese a un proceso de fermentacin para posteriormente mediante un proceso de destilacin deste bagazo fermentado obter bebidas espirituosas. A informacin existente sobre a presenza e extraccin de antioxidantes usando este substrato moi escasa, sobre todo se se compara con todas as publicacins relacionadas co bagazo de vinificacin e o seu emprego para a obtencin de antioxidantes. Este residuo un dous mis estudados como fonte alternativa de antioxidantes naturais, mesmo autores como Saura-Calixto (1998) propoen o seu uso directo. A producin de bebidas espirituosas leva consigo a xeracin dun bagazo fermentado esgotado, o cal habitualmente empregado como fertilizante nos propios viedos das empresas produtoras, no entanto as elevadas producins anuais deste tipo de bebidas elevan a xeracin destes residuos e fan que esta reutilizacin non sexa suficiente para a sa completa eliminacin e os produtores necesitan os servizos de empresas xestoras que se encarguen da sa eliminacin. Algns estudos (Cruz e col., 2004; Pinelo e col., 2005, Diaz-Reinoso e col., 2009) demostraron que os compostos fenlicos presentes nestes residuos son mis activos que os presentes en bagazos non destilados, ao mesmo tempo que se formula o aproveitamento de compostos presentes no disolvente embebido no substrato despois da destilacin (Cruz e col., 2004, Daz-Reinoso e col., 2009). Nestes licores identificronse unha ampla variedade de compostos fenlicos dende procianidinas, flavan-3-oles monomericos como (catequina, epicatequina, epigalocatequina, quercetina e quercetina-3- glicsidos), cido galicos esterificados con unidades de catequina (galatos de epigaloatequina) e cidos benzoicos. O emprego da tecnoloxa de membranas para concentrar e purificar compostos bioactivos presentes en correntes de procesado de industrias agroalimentarias un campo de traballo que adquiriu un grande interese por parte da comunidade investigadora nos ltimos anos. Exemplos neste campo empregando residuos similares encontramos a Nawaz e col. (2006), que procesa extractos hidroalcohlicos de sementes de uva, e a Santamara e col. (2002) e Kalbasi e Cisneros-Zavallos (2007) que fracciona proantocianos e antiocinanos.
238
O fraccionamento de compostos fenlicos presentes en extractos acuosos de champin (Cheung e Cheung, 2005) foi realizado logrando a sa separacin en compostos de alto e baixo peso molecular. Este tipo de procesos e a separacin de compostos presentes en correntes lquidas poden ser melloradas empregando un tipo de membranas que presenten interaccins cos compostos que se van separar. Un exemplo disto a separacin de flavonoides de extractos de Ginkgo biloba empregando membranas de PVP modificado que interaccionan cos compostos presentes establecendo pontes de hidrxeno e favorecendo a sa separacin (Xu e col., 2005). Unha alternativa tecnoloxa de membranas para a separacin e purificacin de compostos fenlicos, en xeral, e de antocianos, flavonoides e hidroxicinnamatos, en particular, o emprego de resinas polimricas (Llorach e col., 2004, Saleh e col., 2008; Scordino e col. 2005). Alternativas como a proposta neste traballo, na cal se unen tecnoloxa de membranas e tecnoloxa de adsorcin foi usada por Li e col. (2005) e DAlvise e col. (2000) para recuperar ou eliminar compostos fenlicos de licores de t e concentrados proteicos de alfalfa. A Figura 1 mostra diferentes alternativas para o aproveitamento do residuo de alcoholeira mediante a obtencin de diferentes produtos finais con diferentes caractersticas antioxidantes. O bagazo destilado foi cedido pola Cooperativa Vitivincola do Ribeiro (Ourense). Os licores embebidos no bagazo extrense por prensado e obtense unha media de 0,3 L de licores por cada kg de bagazo hmido. Estes licores obtidos por prensado conteen 4,4 g de compostos fenlicos por litro determinados como equivalentes en cido glico. O dispositivo experimental empregado consta de membranas comerciais de diferentes tamaos de corte, traballando sobre as condicins optimizadas en anteriores traballos do grupo (Daz-Reinoso e col., 2009). Os pasos de concentracin e fraccionamento por membranas levronse a cabo operando de xeito pechado recirculando ao tanque de operacin a corrente de permeado e rexeitamento, deste xeito consguense optimizar as condicins hidrulicas que conducen a un mellor rendemento do proceso. E operando en modo aberto, recirculando a corrente de rexeitamento e eliminando a corrente de permeado conseguindo unha reducin do volume de alimentacin concentrado o efluente en compostos bioactivos. Mediante este procedemento obtvose o produto 1 (Figura 1).
239
Distilled grape pomace pressing liquors (DGPPL)
Centrifugation Centrifugation
Solid phase
Nano/ultrafiltration Nano/ultrafiltration
Adsorption Adsorption
Concentrate Concentrate
Permeate Permeate Adsorption Adsorption Desorption Desorption

Ethanol
Desorption Desorption
Ethanol
Vacuum evaporation Vacuum evaporation
Solvent Extraction Solvent Extraction

Ethyl acetate
Vacuum evaporation Vacuum evaporation Freeze-drying Freeze-drying Freeze-drying Freeze-drying
Vacuum evaporation Vacuum evaporation
Product 1
Product 2
Product 3
Figura 1. Alternativas para o aproveitamento do residuo de alcoholeira
Os licores procedentes do proceso de filtracin por membranas operando en aberto anda presentan un alto contido en compostos polifenlicos de baixo peso molecular. Este tipo de compostos poden presentar alta actividade antioxidante en funcin do grao de substitucin do anel fenlico. Estes compostos son susceptibles de aproveitamento mediante unha recuperacin destes compostos en resinas adsorbentes tipo polimricas. Neste traballo empregouse a resina Sepabeads SP700, unha resina comercial de grao alimentario subministrada por Resindion, S.R.L. (Mitsubishi Chemical Corporation).
240
Na Tboa 1 mstrase a caracterizacin de diversos produtos obtidos mediante as secuencias mostradas na Figura 1.
Contido fenlico
(g GAE1/100 g produto)
TEAC
(g Trolox/g produto)
DPPH (EC50)
g produto/L
FRAP
(mM cido Ascrbico/g produto)
Poder reducto
(mM cid. ascrbico/g produto)
b-caroteno (AAC)
(2 g produto/L)
a) Liofilizado Nanomax 95 9,5 0,385 1,51 Nanomax 50 10,3 0,395 1,64 Inside Cram 10,2 0,410 1,58 b) Extrado en acetato de etilo 2 (Produto 13) Nanomax 95 37,1 1,83 0,613 Nanomax 50 42,5 2,09 0,293 Inside Cram 38,6 2,00 0,533 c) Adsorcin-desorcin DGPPL (Produto 33) Nanomax 50 Inside Cram
1 2
0,413 0,464 0,444 1,76 1,84 1,79 (mMol Fe/g produto) 5,48 5,37 4,99
0,207 0,232 0,222 2,81 2,97 2,70
189 213 209 24 176 126 1 gr/L 230 177 163
49,9 53,6 39,4
9,9 10,3 10,5
0,255 0,218 0,229
2,12 1,94 2,07
Gallic acid equivalents (GAE)
Rendementos de extraction: Nanomax 95: 3,79 g slidos solubles/ 100 g slidos iniciais; Nanomax 50: 2,91 g slidos solubles / 100 g slidos iniciais; Inside Cram: 3,51 g slidos solubles / 100 g slidos iniciais
3
De acordo coa nomenclatura presentada na Figura 1 Tboa 1. Caracterizacin de rexeitamentos procesados mediante a) liofilizacin, b) extraccin con acetato de etilo e c) adsorcin- desorcin
O comportamento das diferentes membranas seleccionadas neste traballo pdese ver na Figura 2. O coeficiente de rexeitamento aparente calclase a partir dos datos experimentais obtidos nos experimentos en aberto e nos cales se operou ata alcanzar un factor de reducion de volume (VRF, polas sas siglas en ingls) de entre 3 e 5. Cando se opera en condicins de concentracin (modo aberto) durante un perodo diferencial de tempo, no cal o volume de retido decreceu dende Vr ata Vr- dVr, un volume de permeado dVP (numericamente igual a dVr) pasa a travs da membrana. Se se considera que a concentracin de solutos no permeado e o retido son Cp e Cr respectivamente, pdese establecer un balance de materia aos solutos do xeito seguinte (Moure e col., 2006),
Cp dVr = d(Vr Cr) [1]
241
Se se asume que R independente da concentracion de retido, Cr obtense como unha funcin de Cr, e a ecuacin pdese resolver para obter unha expresin como a que segue:
ln [Cr/Cr0] = Rln [Vr0/Vr] [2]
Na cal Cr0 e Vr0 son a concentracin e o volume da alimentacin, e o termo Vro/Vr o denominado con anterioridade factor de reducin de volume (VRF). Baixo esta hiptese ln(Cr/Cr0) vara linealmente con ln(VRF) e R pode ser calculada como a pendente da curva representada, como se mostra na Figura 2. Para a membrana Nanomax este valor do coeficiente de rexeitamento foi de 96,6%, mentres que para unha membrana do mesmo material pero cun tamao de corte lixeiramente menor, o valor do coeficiente de rexeitamento encontrado foi do 51,5%. sa vez o efecto do tipo de material de construcin da membrana quedou reflectido no valor do coeficiente de rexeitamento encontrado para unha membrana de material cermico (Inside ceram), 71,7% cun tamao de corte similar membrana nanomax 50. As capacidades como captadores de radicais libres dos produtos procesados por membranas mstranse na Tboa 1. En xeral, estes valores para o catin ABTS foron menores que a actividade dada por un antioxidante sinttico (trolox), mentres que a actividade como captadores de radical DPPH foi intermedia entre a actividade encontrada para BHA e BHT. Os resultados para estes extractos resultaron ser lixeiramente menores aos achegados para antioxidantes sintticos, non obstante comparados con extractos metanlicos obtidos de uva por Jayaprakassha e col. (2001) a actividade mostrada foi da orde de 2,5- 3 veces superior.
1.4 1.2
C r/ r )o C ( N L
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
! "#$%"& ) '( ! "#$%"& * ') + -. /' 0/ 1"% #,
LN (VRF)
Figura 2. Coeficientes de rexeitamento aparente estimados mediante a linealizacin de Ln (Cr/Cr0) vs Ln (VRF) para os compostos fenlicos presentes nos licores de bagazo destilado obtidos por prensado
242
Nun intento de mellorar estes resultados, estes extractos foron extrados con acetato de etilo (Figura 1) e os rendementos da extraccin e as actividades antioxidantes dos extractos obtidos mstranse na Tboa 1. Os extractos de acetato de etilo obtidos a partir do concentrado producido coa membrana Nanomax 50 o que presenta unha maior actividade de captacin do radical DPPH, tendo unha actividade similar de antioxidantes comerciais. O seguinte paso para mellorar os resultados obtidos ata o momento foi probar os procesos de adsorcin-desorcin sobre resinas dos compostos activos anda presentes no permeado das correntes filtradas (Figura 1). Na Tboa 2 presntanse os datos obtidos para a resina Sepabeads SP700 cando se adsorbeu sobre ela o material de partida (DGPPL) ou os permeados obtidos dos procesos de filtracin deste efluente inicial (DGPPL) polas membranas Nanomax 50 e Inside Cram. De acordo cos datos aqu mostrados, a capacidade de adsorcin da resina, representada por q.
q.
(mg GAE/g resina)
Adsorcin
(g GAE adsorbidos/ 100 gr GAE iniciais)
Desorcin
(g GAE desorbidos/100 gr GAE adsorbidos)
TEAC
(mMol Trolox)
DGPPL Nanomax 50 (Produto 22) Inside Cram (Produto 22)

1 2
13,3 8,23 5,41
83,3 91,7 91,3
Total desorbido 61,6 65,0 57,6
Pico principal 56,8 56,3 46,3
108,3 57,0 50,2
Porcentaxe de desorcin do pico principal recuperado e identificado como extracto purificado De acordo coa nomenclatura mostrada na Figura 1 Tboa 2. Capacidade de adsorcin, porcentaxe de adsorcin-desorcin (referenciado fraccin adsorbida) e capacidade varredora do radical ABTS dos permeados
significativamente diferente en funcin da corrente de alimentacin empregada. O diferente comportamento entre o uso da corrente inicial (DGPPL) ou os permeados est relacionado cos cambios producidos polo tratamento de membranas na composicin qumica das correntes. A adsorcin de compostos fenlicos determinada como porcentaxe de adsorcin maior cando se emprega os permeados que para a corrente inicial, non obstante a actividade antioxidante do produto desorbido a partir da corrente inicial da orde de das veces superior aos valores de actividade antioxidante encontrada para os produtos desorbidos cando a mostra empregada para o proceso de adsorcin son os permeados do proceso de filtracin.
243
Na Tboa 1, apartado c, mstranse o contido fenlico e as actividades antioxidantes para estes produtos de desorcin. O produto final presenta concentracins de compostos fenlicos 4-5 veces superiores dos produtos obtidos unicamente mediante tecnoloxa de membranas (Tboa 1c), e lixeiramente superiores aos extractos de acetato de etilo (Tboa 1b). A actividade antioxidante como captadores de radicais libres (ABTS) vinte veces mellor que a dos produtos obtidos unicamente por membranas e 5 veces que os extractos de acetato de etilo. Como conclusin pdese dicir que 1 gramo de extracto obtido mediante liofilizacin das mellores condicins dos procesos de desorcin ten unha capacidade antioxidante comparable de case 10 gramos de Trolox e un valor de FRAP equivalente a 0,5 g de cido ascrbico. Isto quere dicir que a inxestin de 0,18 g do concentrado podera chegar a ser equivalente ao efecto da vitamina C contida en 100 g de kiwi, 100 g de goiaba, 600 g de limn ou 250 gramos de pemento encarnado. BIBLIOGRAFA
Cruz, J. M., Domnguez, H., Paraj. J. C. (2004). J. Agric. Food Chem., 52, 5612-5620 DAlvise, N., Lesueur-Lambert, C., Fertin, B., e col. (2002). Sci. Technol., 35, 2453-2472. Daz-Reinoso, B., Moure, A., Domnguez, H., e col. (2009). J. Food Eng., 91, 587-593. Jayaprakasha, G. K., Singh, R. PX., e col. (2001). Food Chem., 73, 285-290. Kalbasi, A., Cisneros-Zevallos, L. (2007). J. Agric. Food Chem. 55, 7036-7042. Llorach, R.,Toms-Barbern, F. A., Ferreres, F. (2004). J. Agric. Food Chem., 52, 5109-5116. Nawaz, H., Shi, J., Mittal, G. S., e col. (2006). Pur. Technol., 48, 176-181. Pinelo. M., Rubilar, M., Sineiro, J., e col. (2005). Eur. Food Res. Technol., 221, 284-290. Saleh, Z. S., Wibisono, R., Lober, K. (2008). Int. J. Food Eng., 4, 13. Saura-Calixto, F. (1998). J. Agric. Food Chem., 46, 4303-4306. Scordino, M., Di Mauro, A., Passerini, A., e col. (2005). J. Agric. Food Chem., 53, 651-658.

Antioxidantes Naturais. Aspectos Saudables, Toxicolóxicos e Aplicacións Industriais

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Antioxidantes Naturais. Aspectos Saudables, Toxicolóxicos e Aplicacións Industriais

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

00

Andrs Moure Varela Daniel Franco Ruiz

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Unin Europea FEDER

101030 Cuberta Galego.indd 1

AntioxidAntes nAturAis. Aspectos sAudAbles, toxicolxicos e AplicAcins industriAis

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Xunta de Galicia Consellera do Medio Rural Santiago de Compostela 2010

presentacion herminia 101213.indd 1

presentacion herminia 101213.indd 2

In memoriam Francisco Orallo Cambeiro Mercedes Sonia Garca Falcn

BLOQUE I. ASPECTOS SAUDABLES

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

PODEN OS ANTIOXIDANTES NATURAIS ALONGAR A VIDA?

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Figura 1. Mecanismo de producin/eliminacin de radicais libres na clula eucariota

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Figura 2. Fontes e estruturas de compostos antioxidantes

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

CONTRIBUCIN DAS BEBIDAS INXESTA DE ANTIOXIDANTES NA DIETA MEDITERRNEA

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Figura 1. Composicin da fibra antioxidante da uva (FAU)

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

6,9 265,2 330,7 22,2 221,6 504,8 31,3 20,8 TOTAL

176,4 341,5 271,6 134,7 33,4 2575,7 12,8 2,4 3548,6

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS COMPOSTOS FENLICOS DO VIO

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

POSIBLE EFECTO PROTECTOR DOS VIOS TINTOS FRONTE AO ESTRS OXIDATIVO

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

BENEFICIO CARDIOVASCULAR DALGNS ANTIOXIDANTES PRESENTES NO T

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

EFECTOS VASODILATADORES DO TRANSRESVERATROL

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

EFECTOS ANTITUMORAIS DE ANTIOXIDANTES NATURAIS

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

Antioxidantes naturais. Aspectos saudables, toxicolxicos e aplicacins industriais

1 semana 17,8 1,8 12,0 0,9 p<0,01

4 semanas 18,5 2,2 12,4 0,6 p<0,01

8 semanas 19,2 1,9 11,5 0,6 p<0,01