Esame di fermentazioni

1. a METTI IN EVIDENZA LE DIFFERENZE ESISTENTI TRA LE DIVERSE VIE GLICOLITICHE: TIPO DI MICRORGANISMO, RUOLO FISIOLOGICO, ENZIMI CHIAVE DELLA REAZIONE CARATTERISTICA, DEFINIRE COSA SI INTENDE PER MICROORGANISMO AEROBIO E FERMENTATIVO. b EVIDENZIARE LE REAZIONI CARATTERISTICHE, LE DIFFERENZE E IL RUOLO DELLE DIVERSE VIE GLI COLITICHE, IL TIPO DI MICRORGANISMI CHE LE UTILIZZANO. DEFINIRE COSA SI INTENDE PER FERMENTAZIONE E METABOLISMO DI TIPO RESPIRATIVO

Le vie metaboliche a livello microbico sono 4,tutte costituite da 2 fasi:-degradativa del glucosio con formazione di molecola a 3 C -Porta al piruvato. Il glu pu essere internalizzato in 2 modi : -con permeasi,trasporto attivo con consumo di ATP (glu no trasformato) traslocazione di gruppo con fosfotransferasi no energia (gluglu 6P) *GLICOLISI: ubiquitaria, ruolo fisiologico produrre energia, enzima chiave fosfofrutto chinasi 1

*ESOSOMONOFOSFATO: Ubiquitaria, via anabolica con enzimi NADP+ dipendenti, che permette di ri arrangiare gli zuccheri, si divide in 3 fasi: 1formazione ribosi 2interconversione ribulosio 3riarrangiamento zuccheri. Enzima chiave deidrogenasi

*ENTNER DOWDORFF: Microorg procarioti aerobi o anaerobi facoltativi; si forma 1 ATP sconveniente energeticamente. Viene attivata in presenza di acido gluconico. Pseudomonas e xauntomonas seguono questa via perch non hanno PFK1 o l'aldolasi;lo Zymomonas mobilis (anaerobio) lo segue ed anaerobio. Enzima chiave deidratasi. acido-6-fosfogluconico--->2-cheto-3-deossi-6-fosfogluconico *FOSFOCHETOLASI: (per pentosi )enzima chiave fosfochetolasi. Microorganismi batteri latticixilulosio-5fosfato--->gliceraldeide-3P+glicoliltiamminaPP Sistema vantagioso perche per si forma 1 legame ad alta energia senza dispendio energetico. (per esosi) seguita da bifido batteri che hanno una fosfochetolasi per molecole a 6C si forma sempre acetilfosfato, non pi gliceraldeide ma eritosio che pu essere riarrangiato a dare xilulosio che pu essere convertito in acetato e lattato.

2. DEFINIRE COSA SI INTENDE PER COLTURA ALLO STATO SOLIDO, ALLO STATO LIQUIDO, STAZIONARIA E SOMMERSA EVIDENZIANDI QUALE RISULTA LA PI INDICATA PER FERMENTAZIONI AEROBIE E ANAEROBIE . Industrialmente si impiegano fermentazioni utilizzando: colture sommerse dove il microrganismo cresce in fase liquida agitata; colture stazionarie dove il microrganismo cresce in fase liquida non agitata; coltura solida (immobilizza le cellule grazie a agar) dove il microrganismo cresce sopra un supporto solido senza una vera e propria fase liquida e il composto pu essere inerte o costruire uno dei substrati di crescita. Le colture sommerse che possono essere solide o liquide vengono utilizzate per microrganismi aerobi.

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3. DEFINIRE COSA DEVE CONTENERE UN TERRENO COLTURALE, COSA SI INTENDE PER TERRENO VEGETATIVO, FERMENTATIVO, A COMPOSIZIONE CHIMICAMENTE DEFINITA O COMPLESSO. EVIDENZIARE I VANTAGGI E GLI SVANTAGGI NELL UTILIZZO DEI TERRENI. DEFINIRE COSA DEVE CONTENERE UN TERRENO COLTURALE, COSA SI INTENDE PER TERRENO VEGETATIVO, FERMENTATIVO, A COMPOSIZIONE CHIMICAMENTE DEFINITA O COMPLESSO ED EVIDENZIARE I VANTAGGI E GLI SVANTAGGI NELL UTILIZZO DI TALI TERRENI. IPOTIZZARE UN TERRENO COLTURALE COMPLESSO (PH, OSSIGENO, FONTE DI CARBONIO, DI AZOTO E DI ELEMENTI MINERALI O VITAMINE) PER LA PRODUZIONE DI UN METABOLITA (SECONDARIO) PRODOTTO DA UNA MUFFA CHE NON POSSIEDE GLUCOAMILASI, POSSIEDE GALATTOSIDASI, NECESSITA DI COFATTORI NECESSARI ALLE REAZIONI DI CARBOSSILAZIONE, NECESSITA DI CONTROLLO DI PH PER LA PRODUZIONE, RISENTE DI FENOMENI DI REPRESSIONE DA CATABOLITA DA PARTE DEL GLUCOSIO. Terreni di coltura: soluzioni solide o liquide contenenti sostanze nutritive su cui possibile crescere cellule eucariotiche e procariotiche. Per microrganismi autotrofi fotolitotrofi come i cianobatteri, la componente principale di un terreno di coltura ad esempio la CO2. Un terreno pu essere reso solido semplicemente aggiungendo agar all1,5%. Se sappiamo quale organismo dobbiamo isolare e conosciamo il suo metabolismo, possiamo allestire il terreno di coltura con tutti i nutrienti di cui il microrganismo ha bisogno. (Non si deve trascurare n il pH n la temperatura) Gli elementi fondamentali per la crescita dei microrganismi sono: C, H, O, N, S, P (contenuti in amminoacidi, zuccheri ed acidi nucleici); ci sono altri elementi che non sono facilmente solubili e devono essere aggiunti sottoforma di sale (forma pi solubile di tali elementi): N, P, S, Mg; altri ancora sono aggiunti solo in tracce: Fe, Ca, Co, Mn (che fungono da cofattori enzimatici di alcune reazioni) I TERRENI COMPLESSI sono quei terreni di cui non si conosce in maniera dettagliata la composizione chimica. Sono di estrema utilit in quanto permettono di crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali diverse fra loro o non conosciute. Oltre alle sostanze standard i terreni complessi contengono:Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica (questi particolari proteine son parzialmente idrolizzate altrimenti denaturerebbero ad alte temperature); Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi, peptidi, nucleotidi, acidi organici, vitamine e sali minerali; Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dellazoto. I TERRENI DEFINITI sono quelli di cui si conosce lesatta composizione. Questi tipi di terreno vengono impiegati nella ricerca, dato che spesso si rende necessario conoscere il substrato che viene metabolizzato dal microrganismo che si desidera coltivare. TERRENI VEGETATIVI: crescita tanta massa cellulare. TERRENO FERMENTATIVI: produzione. RECUPERO A. MICOFENOLICO + ESTRAZIONI estrazione dissociativa: alcuni gruppi funzionali possono ionizzarsi. Si agisce sul ph cambiando il grado di ionizzazione. Utile per purificare parzialmente. Estrazione reattiva si utilizza con metaboliti molto idrofili che tendono a restare in acqua. Si cerca di modificare le

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caratteristiche del metabolita. Estrazione fisica si sfrutta la capacit di ripartirsi tra fase organica e fase acquosa. Separazione coltura (porzione liquida da solida) grazie allacidificazione spostiamo il metabolita dalla fase acquosa ad organica la fase organica viene anidrificata, il metabolita va in fase acquosa e in fase organica ci sono impurezze neutre e basichesi acidifica per portare in fase organica estrazione con etilacetato e poi si anidri fica per eliminare acquasi filtra la soluzione su carbonio attivo soluzione decolorata

4. a PRODUZIONE ACIDO GLUTAMMICO: CARATTERISTICHE DEI CEPPI IMPIEGATI IN PRODUZIONE, RUOLO DELLE REAZIONI ANAPLEROTICHE E DELLA BIOTINA, TECNICHE DI FERMENTAZIONE. b PRODUZIONE DI ACIDO GLUTAMMICO: MICRORGANISMI IMPIEGATI, STRATEGIE PER LACCUMULO DEL METABOLICA, VIA METABOLICA, FERMENTAZIONE (TERRENO ECC.), RUOLO DELLA BIOTINA. c DESCRIVERE IL RUOLO DELLA BIOTINA NELLA BIOSINTESI E PRODUZIONE DELLACIDO GLUTAMMICO (FENOMENI COMPETITIVI) E LE STRATEGIE FERMENTATIVE IMPIEGABILI ALLO SCOPO DI INCREMENTARE LACCUMULO DEL METABOLITA

Produzione glutammato/glutammina. Questa capacit deriva da un meccanismo di fissazione dell'N inorganico. La biotina necessaria per inserire NH4+ e N sulle molecole. 1- glutammato DH dove NADP+ accompagna la reazione Sistema attivato solo [NH4+]=1mM no consumo di ATP. Con [NH4+] <1 mM si attiva il sistema Gogat, interviene una GLUTAMMINA SINTETASI, trasformando glutammato in glutammina (NH4+ incorporato), necessita ATP per attivare il COOH, avviene anche l'amminazione riduttiva. Se voglio accumulare glut. devo fare in modo che glutam DH lavori pi veloce della alfa-chetoglutarato DH-->succinil CoA. Devono essere ceppi con sistemi anaplerotici come gliossilato e PIRUVATO CARBOSSILASI (necessita biotina). Tanto glutammato=tanta biotina: era ci che si pensava ma non cos. Si accumula glutammato in quanto la biotina lavora anche con Acetil CoA carbossilasi che d un aumento di fosfolipidi e una diminuzione di glutammato secreto; per evitare questo si pu usare penicillina che rimuove la parete e rende il sistema pi permeabile, oppure aggiungendo acidi grassi al sistema cos che non vengano prodotti o si aggiungono tensioattivi che facilitano l'uscita di glutammato oppure si pu creare un auxotrofo per il glicerolo; di conseguenza si avr crescita di membrana non corretta. Microorganismo utilizzato cosimo bacterium glutammico anaerobio facoltativo. Si lavora in anabolismo (cos non ho prodotti secondari), la[NH2], il ph, la[biotina]sono controllati. Melasso come fonte di C, NH4+ come fonte di N/urea che controlla il pH. Per recuperare si separa liquido/solido per filtrazione,concentrazione,separazione,precipitazione isoelettiva. Le reazioni anaplerotiche sono quell'insieme di reazioni che servono per rifornire il Ciclo di Krebs dagli intermedi sottratti per la sintesi di vari composti (glucosio da Acido Ossalacetico, acidi grassi e steroli da Acido Citrico, etc.) senza passare attraverso la formazione di Acetil-CoA. Esse richiedono la fissazione dell'anidride carbonica. Solo gli autotrofi utilizzano come unica fonte di atomi di carbonio l'anidride carbonica. La fissazione fotosintetica dell'anidride carbonica richiede molta energia, ricavata negli autotrofi dalla fotosintesi (organismi fototrofi) o dall'ossidazione di molecole organiche o inorganiche (organismi chemiotrofi). Questo processo molto importante perch fornisce le basi organiche utilizzate degli organismi eterotrofi. I microrganismi possono fissare l'anidride carbonica inorganica, trasformarla in carbonio organico e assimilarlo in tre modi diversi. La maggior parte utilizza il Ciclo di Calvin (o ciclo riduttivo del pentoso fosfato)

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che manca negli archea, negli anaerobi obbligati e nei microaerofili. Questi utilizzano una delle altre due vie, ovvero riduzione degli acidi tricarbossilici o la via dell'Acetil-CoA. La prima catalizzata dalla piruvato carbossilasi, avviene nel mitocondrio e produce ossalacetato. irreversibile. La seconda catalizzata dall'enzima malico, reversibile, avviene nel citoplasma e produce Acido Malico che, entrando nel mitocondrio, pu rifornire il ciclo di Krebs.

5.a DEFINIRE COSA SI INTENDE PER MUTANTE AUXOTROFO E PER REGOLATORE EVIDENZIANDI IL RUOLO DI TALI MUTANTI NELLA RIPRODUZIONE DEI METABOLICI B DEFINIRE COSA SI INTENDE PER MUTANTE AUXOTROFO E REGOLATORE EVIDENZIANDO IL RUOLO DI TALI MUTANTI NELLA PRODUZIONE DI METABOLITI B) EVIDENZIARE IL RUOLO DI TALI MUTANTI NELLA PRODUZIONE DI LISINA C) NORMALMENTE I METABOLITI NON VENGONO ACCUMULATI, DESCRIVERE LE STRATEGIE CHE SI POSSONO ATTUARE PER ACCUMULARE GLI STESSI.

I Mutanti auxotrofi sono mutanti che mancano di uno o pi enzimi coinvolti nel cammino biosintetico di un dato AA, il che significa che non sono in grado di sintetizzarlo e necessitano della sua presenza nel terreno colturale. SELEZIONE MUTANTI AUXOTROFI Mutanti auxotrofi si selezionano per arricchimento mettendo una sospensione cell in condizioni colturali nelle quali gli auxotrofi non sono in grado di crescere, cio in assenza del metabolita che non sono pi in grado di sintetizzare e che essenziale per la loro crescita. A questo punto si sottopone la piastra al trattamento con agenti che colpiscono cellule in accrescimento e non in quiescenza. Dopo la rimozione dell'agente letale, i mutanti auxotrofi sono quindi messi in condizione di crescere (terreno + componente mancante). Gli auxotrofi permettono la produzione di un unico metabolita, evitando le vie ramificate in quanto mancano di uno o pi enzimi necessari per la produzione di altri eventuali metaboliti.

SELEZIONE MUTANTI REGOLATORI Mutanti regolatori si selezionano invece usando analoghi strutturali dell'AA, sono mutanti che non hanno feedback o repressione dovuto all'AA sono anche in generale resistenti all'analogo strutturale e quindi vengono selezionati facendo crescere la sospensione cell in presenza dell'analogo che non viene utilizzato per scopi biosintetici. Questi mutanti non subiscono inibizione feedback quindi permettono una produzione di metoboliti continua.

6. DEFINIRE COSA SI INTENDE PER ESTRAZIONE DI TIPO FISICO, DISSOCIATIVO O REATTIVO. INDICARE LO SCOPO E LE FASI TRAMITE LE QUALI POSSIBILE RECUPERARE E PURIFICARE UN METABOLITA. Il principio di estrazione pu essere fisico, dissociativo e reattivo ESTRAZIONE FISICA: il soluto si ripartisce in funzione delle sue caratteristiche fisico-strutturali, ovvero soprattutto in funzione della sua polarit e della polarit del solvente. La polarit/apolaritit ovvero idrofilicit/idrofobicit, di una molecola una caratteristica complessiva della molecola e pu essere descritta in diversi modi: il parametro piu comunemente impiegato logP dove P il coeff di ripartizione che una determinata molecola mostra nel sistema a due fasi liquide acqua/ottanolo.

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ESTRAZIONE DISSOCIATIVA: molecole con gruppi funzionali ionizzabili si ripartiscono in funzione delle caratteristiche di dissociazione. Il pH della fase acquosa cruciale per determinare il log P a parit di solvente. Questo permette estrazioni selettive variando il pH. Per fae cisi definisce un log , il log del coeff di distribuzione D ad un particolare pH. Log D varia in funz del pH della molecola. ESTRAZIONE REATTIVA il soluto si ripartisce dopo aver interagito con un agente capace di modificarne le caratteristiche complessive, la reazione devessere reversibile. Es gli acidi carbossilici complessano con derivati contenenti legami P-O. il complesso formatosi rende lac carb molto idrofobico, il complesso pu essere estratto in un solvente molto idrofobico, il complesso viene distrutto a pH estremi e permette il riciclo del complessante.

Laboratorio A RECUPERO DELLACIDO MICOFENOLICO: SPIEGARE IL SIGNIFICATO DELLE OPERAZIONI SVOLTE ATTE A RECUPERARE E PURIFICARE TALE METABOLICA. DEFINIRE COSA SI INTENDE PER ESTRAZIONE DISSOCIATIVA, FISICA E REATTIVA. B PROPORRE UN SISTEMA DI RECUPERO PER UN METABOLICA INSTABILE A PH BASICO, PRODOTTO DA UNA MUFFA, ENDOCELLULARE IDROFOBICO E PRESENTE IN MISCELA CON IMPUREZZE ACIDE E BASICHE. GIUSTIFICARE LE SCELTE FATTE, DEFINIRE COSA SI INTENDE PER ESTRAZIONE DI TIPO FISICO, DISSOCIATIVO O REATTIVA. INDICARE LO SCOPO E LE FASI TRAMITE LE QUALI POSSIBILE RECUPERARE E PURIFICARE UN METABOLITA. Se dovessi proporre un sistema di recupero per un metabolita instabile a pH basico utilizzerei l'esperimento fatto in laboratorio sulla determinazione dell'acido micofenolico partendo da penicillum compatto, seguendo le varie fasi dell'esperimento. L Acido Micofenolico un metabolita secondario, di interesse farmaceutico perch immunosoppressore. Servono circa 10 giorni per la fermentazione e di conseguenza per il suo recupero. Questo avviene attraverso due step : -1 Le spore vengono inoculate in terreno vegetativo .-2 Inoculato in terreno fermentativo, dove si ha la produzione del metabolita e dove si aggiungono gli ingredienti con funzione tecnologica, cio Celite, che in particolare frammento il micelio. Essendo l Acido Micofenolico acido, possiede gruppo funzionale ionizzabile e quindi possibile recuperarlo tramite estrazione. L'estrazione avviene partendo dall'acidificazione del brodo di coltura con Acido Solforico 10%, grazie al quale si eliminano le impurezze basiche. Successivamente filtro per eliminare i residui cellulari, questo permette di visualizzare meglio le due fasi. Separo la fase organica dalla fase acquosa e successivamente in quest' ultima riaggiungo le cellule pi 30 ml di Etilacetato. Filtro il tutto su buckner, la soluzione cos ottenuta viene nuovamente separata recuperando la fase organica, poich la fase contenente lacido Micofenoilico. Si deposita quindi la prima fase organica in TLC. Si prosegue basificando con Bicarbonato saturo la fase organica, permettendo quindi all acido Micofenolico di passare dalla forma indissociata a quella dissociata, quindi ripartirsi nella fase acquosa. Dopo una prima separazione con 25 ml di bicarbonato, si risepara nuovamente la fase organica con altri 25 ml di bicarbonato. Raccolgo le fasi organiche delle due separazioni e le deposito in TLC.

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Acidifico con Acido Solforico la fase acquosa, aggiungo etilacetato (20x2), ed estraggo 2 volte. Anidrifico la fase organica con Solfato di Sodio, che un sale idroscopico, e aggiungo Carbone che tender a decolorare la mia soluzione. Filtro, recuperando la soluzione. Cristallizzo, utilizzando Isopropanolo, che in grado di solubilizzare bene l acido Micofenolico. Aggiungo un eccesso di Esano, rispetto all Isopropanolo, che porta alla formazione di due strati di solvente. Raffreddando si pu osservare un' inizio di cristallizzazione. Una volta ottenuto il cristallizzato, filtro su bucnker e utilizzo il cristallizzato come standard che viene successivamente depositato in TLC. Una volta che la TLC pronta la si fa correre in una camera contenente Etilacetato. Per estrazione fisica si usa la capacit di ripartirsi tra fase acquosa e fase organica. L'estrazione dissociativa si basa sul fatto che alcuni gruppi funzionali possono ionizzarsi, si va ad agire quindi sul pH variando il grado di ionizzazione. utile per purificare parzialmente. L'estrazione reattiva si utilizza con metaboliti molto idrofili che tendono a restare in H2O. Si cerca di modificare le caratteristiche del metabolita con COOH creando un complesso con TOPO (triotilfosfinossido) complesso distrutto a pH estremi.

7. DESTINO ANAEROBIO DELLACIDO PIRUVICO: DESCRIVERE NEI DIVERSI GRUPPI MICROBICI PRESI IN ESAME (LIEVITI, LATTICI, ENTEROBATTERI, CLOSTRIDI) IL DESTINO DI TALE INTERMEDIO METABOLICO EVIDENZIANDO I POSSIBILI ENZIMI CHE ENTRANO IN COMPETIZIONE PER LO STESSO Destino anaerobio dellacido piruvico: descrivere il destino di tale intermedio metabolico nei microrganismi fermentativi: lieviti, batteri lattici, clostridi ed enterobatteri evidenziando la possibile competizione che si pu instaurare tra i differenti enzimi in gardo di agire su tale substrato Metabolismo anaerobio: A) definire cosa si intende per fermentazione B) descrivere il destino dellacido piruvico in microrganismi di tipo fermentativo (lieviti, enterobatteri clostridi e propionobatteri) evidenziando le eventuali competizioni tra le diverse attivit enzimatiche

Dal punto di vista strettamente chimico, la fermentazione un processo ossidativo anaerobico svolto da numerosi organismi a carico di carboidrati (o raramente di amminoacidi) per la produzione di energia. Dal momento che in anaerobiosi non disponibile l'ossigeno come accettore finale di elettroni, lo stesso substrato viene in parte ossidato ed in parte ridotto. Le fermentazioni sono quindi delle disproporzioni. Nella maggior parte delle fermentazioni il metabolita di partenza uno zucchero o un altro composto in cui il numero di ossidazione medio del carbonio zero in quanto il carbonio stesso verr in parte ossidato ed in parte ridotto.Nelle fermentazioni conviene distinguere due parti: la glicolisi, comune alla maggior parte delle fermentazioni; la rigenerazione del NAD ridotto, specifica delle varie fermentazioni

I lieviti degradano il glucosio attraverso la glicolisi / esosomonofosfato a dare Ac. Piruvico. I lieviti aerobi fanno respirazione e fermentazione in base alla [glu], anaerobi solo fermentazione. Effetto Pasteur ( determinato dalla [O2]):Se un lievito che cresce in aereobiosi, viene spostato in

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anareobiosi,si osserva una velocit maggiore di degradazione di glucosio. Effetto osservabile nei respirativi dove c' competizione tra PDH, pi affine al piruvato, e la PDC che lavora con alte [piruvato] o quando PDH satura. Il tutto regolato da PFK1, che inibisce ATP e citrato. Quando le [ATP e citrato] sono alte si blocca PKF1 e lavora PDH. Effetto Crabtree : A basse[glucosio] c' sia respirazione che fermentazione indipendentemente dalla [O2], all'aumentare della [glucosio] si avr solo fermentazione. Al di sopra di una certa soglia si avr solo fermentazione in quanto gli zuccheri danno repressione da catabolita, bloccano la sintesi di citocromo A della catena respiratoria per cui si accumula il NADH e l'unico modo per scaricarlo convertire il piruvato in acetaldeide e poi etanolo. In caso di accumulo di ac piruvico pu essere trasformato in diacetile. I lieviti possono anche effettuare la fermentazione MALOALCOLICA : Malato a dare Ossalacetato a dare Piruvato a dare PDC a dare DH, Acetaldeide e etanolo. Alcuni batteri lattici crescono meglio in presenza di O2 perch hanno la PIRUVATOSSIDASI che permette loro di formare acetilCoA con il quale si pu ottenere acetilfosfato e quindi acetato + ATP. L'O2 in questo caso serve solo per OX FADH2. I batteri lattici omofermentativi ricavano acido lattico dal glucosio attraverso la glicolisi classica: Piruvato a dare Lattato con formazione di NAD+ dal NADH. I batteri lattici sono in grado anche di usare l'ac citrico per produrre ac piruvico in quanto possono fare fermentazione malolattica: malato a dare piruvato a dare lattato. I Clostridi fanno fermentazione gli anaerobi obbligati e alcuni aereotolleranti. Il glucosio attraverso la glicolisi dar piruvato da cui si otterranno Ac organici, alcoli, acetone, i quali derivano da substrato su cui vengono scaricate cariche negative. Pur non avendo PDH , i clostridi, possono trasformare CH3C=OCOOH in CH3C=OOSCoA tramite un sistema ENZIMA/PIRUVATO FERROLOSSINASSIDORIDUTTASI. Gli enterobatteri fanno fermentazione acido mista o del butandiolo, sono anaerobi facoltativi. Usano il ciclo di Krebs per scaricare il potere riducente e seguono una glicolisi classica. Sull' ac. Piruvico agiscono la : -piruvato DH enzima che compete con piruvato carbossilasi negli aerobi obbligati e in quelli facoltativi anche con piruvato decarbossilasi (compete con formiato liasi ) -piruvato DCpiruvato formiatoliasi, con la quale si ha una vera e propria competizione. In anaereobiosi non si ha la piruvato DH e la piruvato formiatoliasi viene sintetizzata solo in mancanza di O2 in quanto O2 inibisce l'enzima. La PIRUVATOFORMIATOLIASI determina la formazione di CH3C=OSCoA+ ac formico partendo da piruvato (la CO2 prodotta viene convertita in HCOOH). L'ac. Formico viene OX ad CO2 con produzione H2(idrogenasi) attraverso la formiato DH. Alcuni generi di enterobatteri seguono la fermentazione acida mista.

8. DESCRIVERE LE DIFFERENZE DELLE DIVERSE DECARBOSSILAZIONI CHE SI VERIFICANO A LIVELLO DEL CICLO DI KREBS Il ciclo di krebs importante per molti microrganismi fermentativi che hanno bisogno degli intermedi di tale ciclo, ma non necessitano della produzione di NADH e FADH2 dato che non utilizzano la catena respiratoria. Per queste ragioni il ciclo di Krebs trasformato da ciclo OX a ciclo RID. Questi batteri hanno in genere una

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carenza di (alfa) CHETOGLUTARATODEIDROGENASI e quindi non si forma succinil-CoA secondo il normale ciclo ma mediante una fumarato riduttasi FAD dipendente. Il ciclo di Krebs diventa una via ramificata: da una parte alfa cheto glutamato e dallaltra sucinato. Per cui il ramo degradativo avr una degradazione in meno e quello sinistro sar riduttivo. Questo sistema nei fermentativi consente di accumulare NAD+ da utilizzare come riducente per le molecole organiche. Ciclo del gliossilato fondamentale per micror. che usano acetato o a.grassi per crescere. Ruolo anaplerotico.

9. deidrogenasi: enzimi che operano su reazioni di riduzione e deidrogenazione. Non usano quasi mai O2 ma NADH. I substrati sono composti carbonilici che vengono ridotti a alcoli e viceversa. La riduzione operabile solo dalle deidrogenasi con NADH. In assenza di O2 non si pu scaricare lNADH se non su un substrato organico. Operano su C=C oppure possono ossidare unaldeide allacido carbossilico corrispondente con una reazione irreversibile. Ossidasi: enzimi specializzati nellossidazione. Riducono O2 in H2O2. Ossigenasi: enzimi che usano O2 come reagente introducono O2 in molecole organiche. Metabolizzano molecole xeno biotiche (estranee) ossigenandole. Pi importante ossigenasi citocromo. NAD: una biomolecola che ha il compito di trasferire gli elettroni, permette una redox spostando gli atomi di H. E un coenzima ossido riduttivo facente parte delle deidrogenasi insieme a FAD e TPP. FAD: fattore ossidante del ciclo di krebs trasporta elettroni nel processo biochimico della catena di trasporto di elettroni. 10. DESCRIVERE: IL SIGNIFICATO DELLE CURVE DI GADEN, COSA SI INTENDE PER FERMENTAZIONE BATCH,

FED-BATCH E CONTINUA, EVIDENZIARE I VANTAGGI E GLI SVANTAGGI ASSOCIATI A TALI SISTEMI FERMENTATIVI
I processi microbici sono stati suddivisi da Gaden in funzione di quanto il substrato viene consumato, di quanto la biomassa cresce e il prodotto viene sintetizzato in 3 tipi diversi di fermentazioni. Nelle fementazioni di 1 tipo il prodotto principale costituisce il diretto risultato del metabolismo energetico primario, con correlazione ponderale tra substrato consumato e prodotto formato.In particolare si ha una degradazione del substrato, fonte di C e energia, come ad esempio nella produzione di biomassa (Processo aerobico) o di Ac. Lattico (Fermentazione batterica anaerobica). Le velocit specifiche di crescita, di consumo de substrato e di formazione del prodotto, raggiungono il loro max pressoch contemporaneamente. I prodotti di questa classe sono generalmente associati allo sviluppo. Nelle fermentazioni di 2 tipo il prodotto principale proviene dal metabolismo energetico, ma ci avviene meno direttamente e in modo pi complesso rispetto ai prodotti ottenibili dai processi appartenenti alla classe di primo tipo. Le relazioni tra le curve relative alla velocit specifica di crescita,di consumo di substrato e di formazione di prodotto, sono pi complesse, con Max diversi e non sovrapponibili. In particolare in coltura Batch i Max valori di velocit specifica si ottengono a 2 diversi tempi. Nella prima parte si ha uno sviluppo microbico buono con alto contenuto di Substrato e piccola o assente sintesi di Prodotto; nella seconda lo sviluppo rallenta e inizia la sintesi del prodotto accompagnata da un'alta velocit di consumo del substrato.

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Sono distinguibili in pratica due fasi di fermentazione: nella prima il substrato utilizzato per lo sviluppo microbico (trofofase) nella seconda per la formazione di prodotto (idiofase). Nelle fermentazioni di 3 tipo il prodotto deriva dal metabolismo biosintetico e non da quello primario, senza correlazione di resa di conversione rispetto alla degradazione della fonte primaria di C dell'energia. In genere si ha una 1fase con sviluppo del microrganismo (trofofase) e consumo substrato associato a scarsa o nessuna formazione del prodotto; in una 2 fase, mentre lo sviluppo diminuisce rapidamente, insieme al consumo del substrato, si ha il max della velocit di formazione del prodotto(idiofase). In questa classe possono essere raggruppate quasi tutte le produzioni di antibiotico , vitamine, enzimi esocell, e anche alcuni polisaccaridi. Per i processi che appartengono a questa classe il metabolismo 1 e la formazione del prodotto avvengono in tempi separati. Dal punto di vista cinetico si hanno max in 2 tempi diversi. Durante una crescita in Batch (fermentazione discontinua ) la velocit specifica di formazione della biomassa cambia continuamente da 0 al valore Max durante la fase esponenziale ed il suo valore cambia molto da microrganismo a microrganismo. Richiede pochi sistemi di controllo e la fermentazione si ferma al raggiungimento della max quantit del metabolita. Nelle colture alimentate in discontinuo (Fed-batch= somministrano poca quantit di substrato in modo da non avere inibizione. Sistema aperto, microfiltrazioni) si ha alimentazione senza fuoriuscita di brodocoltura. indicata quando ci sono fenomeni di inibizione da substrato e non da prodotto. Il sistema biosintetico viene mantenuto ad alte prestazioni fornendo substrati a [ ] inferiori a quelle alle quali si manifestano fenomeni di inibizione. L'alimentazione pu essere costituita da singoli componenti o da terreno fresco. Ci possono essere processi con alimentazioni ripetute dove il fermentatore scaricato parzialmente prima dell'aggiunta di terreno fresco (repeaded fed-batch). Qualora i fenomeni che inibiscono alte produttivit sano legati soprattutto o esclusivamente a substrato si possono allestire processi fed-batch senza scarico del terreno, aggiungendo solo il substrato che causa inibizione. Nelle colture in continuo si ha alimentazione continua di terreno colturale fresco o di substrato e rimozione continua del mezzo colturale o di trasformazione in modo da avere sempre la max produzione del metabolita. Le colture in continuo danno la possibilit di prolungare lo stato stazionario di produzione migliore e questo costituisce il maggior vantaggio rispetto a sistemi discontinui.Questi processi sono caratterizzati dal fatto di avere una composizione costante, che pu essere raggiunta aggiungendo nel tempo una quantit di terreno fresco con la stessa velocit con la quale terreno esausto viene allontanato. Quando l'apporto di substrati mantenuto costante e sotto la soglia di inibizione e quando i prodotti tossici sono continuamente rimossi teoricamente possibile prolungare il processo all'infinito. Le colture continue possono essere:a stadio unico, multi-stadio o chiuse

11. PRODUZIONE DI LISINA: A) MICRORGANISMI PRODUTTORI, B) VIA METABOLICA SEGUITA E REGOLAZIONE DELLA STESSA, C) STRATEGIE TECNOLOGICHE E MOLECOLARI PER ACCUMULARE TALE METABOLICA ED IMPIEGO DI MUTANTI (DEFINIRE COSA SI INTENDE PER MUTANTE AUTOTROFO E REGOLATORE), D) TECNICA DI FERMENTAZIONE (TERRENO COLTURALE, TIPO DI FERMENTAZIONE ECC. ) MOTIVARE LA SCELTA DEI DIVERSI COMPONENTI DEL TERRENO la Lisina viene sintetizzata in una via ramificata. Si usa corinebacterium. Acido ossalacetato il substrato di partenza che viene trasformato in aspartato per transamminazione e ridotto in aspartato semialdeide (si ramifica) dove una DH forma omoserina. Una sintasi condensa piruvato a dare aspartato semialdeide a dare acido diaminopimerleo che disidratando ciclizza e si forma a. amminoadipidico ridotto nel doppio legame e decarbossilando si forma Lys. Occorre un mutante regolatore; esiste trasportatore, cos viene secreta lisina e vengono meno i fenomeni di inibizione. Sistema aerato con biotina e melassi-fermentazione gaden II- si aggiunge (NH4)2SO4 che evita precipitare lys- per basso grado di purezza, si liofilizza-per grado di purezza piu alto si usano resine a scambio ionico.

Esame di fermentazioni
Si pu usare un altro sistema: E.coli(forma a. amminoadipidico) + Aeromomas aerogenes (decarbossila)

12. a.) amminoacido: la decarbossilazione avviene attraverso l'intervento il cofattore piridossalfosfato che in questo caso anzich permettere la forma di un carboanione determina la richiusura dell'ossigeno portando il distacco di anidride carbonica con la formazione di un ammina b.) -chetoacido: la devarbossilazione avviene per mezzo della tiaminapirofosfato e pu essere di due tipi:ossidativa a carico di una deidrogenasi non ossidativa a carico di una decarbossilasi. La decarbossilazione non ossidativa consente di passare da un -chetoacido all'aldeide corrispondente. Invece la decarbossilazione ossidativa porta alla formazione di un tioestere. C)hetoacido: la decarbossilazione avviene spontaneamente perch i prodotti di reazione sono stabiliti da tautomeria. D)rossiacido: decarbossilazione a carico di questo composto avviene in seguito a ossidazione a carico dell'OH in posizione beta, quindi si forma un gruppo chetoacido quindi la decarbossilazione spontanea.

13. FONTI DI CARBONIO COMPLESSE: DEFINIRE COSA SI INTENDE PER FONTI DI CARBONIO COMPLESSE EVIDENZIANDO I VANTAGGI E GLI SVANTAGGI ASSOCIATI ALLIMPIEGO DI TALI FONTI, DESCRIVERE LE CARATTERISTICHE DEI MELASSI E DELLAMIDO EVIDENZIANDO QUANDO POSSIBILE IMPIEGARE TALI FONTI CON LE DIFFERENTI STRATEGIE DA ATTUARE IN CASO DI IMPOSSIBILIT DA PARTE DEL MICRORGANISMO DI UTILIZZARE LE STESSE IMPIEGO DI AMIDO COME FONTE DI CARBONIO: DESCRIVERE COME POSSIBILE LIMPIEGO DI TALE POLISACCARIDE IN CASO DI FERMENTAZIONI CONDOTTE CON MICRORGANISMI PRIVI DI AMILASI E GLUCOAMILASI Le fonti di carbonio complesse fanno parti delle esigenze nutrizionali per i microrganismi che utilizzandole influenzano la velocit di riproduzione della cellula. Le fonti di carbonio complesse cono zuccheri complessi come melassi, amido, cellulosa.I melassi derivano dalla lavorazione del saccarosio.Sono una fonte di carbonio per allestire un terreno per la crescita dei microrganismi. Con la sterilizzazione del terreno melassi, si pu portare alla formazione di glicosil amine.L'amido un materiale di scarto formato da amilosio e amilopectina. Per usarlo devo avere un microrganismo con pi enzimi -amilasi che formano oligomeri diversi a seconsa del microrganismo glucoamilasi, che stanano le singole unita amlasi. Se l'amido non lo si pu usare la pretratto con miscele di enzimi a seconda del grado di depolarizzazione. La cellulosa vantaggiosa per poco usata perch ci sono pochi enzimi che la idrolizzano avendo una particolare struttura. Le cellulasi sono prodotte da muffe, per cui si inocula la cellulosa con le muffe che la idrolizzano.

16. REGOLAZIONE DEL METABOLISMO MICROBICO: REGOLAZIONE DELLATTIVIT ENZIMATICA IN VIE LINEARI E RAMIFICATE (ENZIMI ISOSTERICI, ALLOSTERICI FORMAZIONE DI LEGAMI COVALENTI), REPRESSIONE DA CATABOLITA, IMPIEGO DI MUTANTI AUTOTROFI E REGOLATORI (SPECIFICARE ANCHE COME SI DEFINISCONO E COME SI OTTENGONO) REGOLAZIONE DEL METABOLISMO MICROBICO: REGOLAZIONE DELLATTIVIT ENZIMATICA IN VIE LINEARI E RAMIFICATE, REPRESSIONE DA CATABOLITA, IMPIEGO DI MUTANTI AUTOTROFI E REGOLATORI (SPECIFICARE ANCHE COME SI DEFINISCONO E COME SI OTTENGONO) La regolazione del metabolismo microbico permette di adattarsi alle diverse condizioni, non accumulando metaboliti.Vi sono due tipi di regolazione, uno dell ATTIVIT enzimatica (pi veloce), laltro della SINTESI enzimatica (pi vantaggioso perch lenzima viene sintetizzato solo quando serve).Lattivit enzimatica pu essere regolata dalla concentrazione dei metaboliti della via. Questa uninibizione a feedback. Il prodotto si lega ad un sito allosterico determinando una modifica conformazionale e conseguente inattivazione. Le

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molecole che reagiscono con le proteine in siti diversi da quello catalitico sono dette effettori allosterici. Possono essere induttori o repressori.La cinetica in questo caso di tipo sigmoidale. La proteina senza induttore poco affine al substrato.Le vie metaboliche lineari sono inibite dallaumento della concentrazione del prodotto che inibisce il primo enzima (inibizione feedback dal prodotto finale).Le vie ramificate sono pi complicate da regolare perch i prodotti non si formano nella stessa quantit. La regolazione deve permettere di ottenere ci che serve nelle giuste quantit. Si pu regolare a livello delle ramificazioni, oppure regolare il primo enzima a valle (isoenzima)questo per regola la velocit di sintesi dei prodotti.Un altro sistema quello di agire sul primo enzima che ha siti allosterici diversi. Si pu avere anche una regolazione a feedback sequenziale, dove i prodotti inibiscono a livello della ramificazione e lintermedio che si accumula inibisce il primo enzima.Esiste linibizione isosferica, ossia uninibizione a livello del sito attivo con un analogo strutturale.La formazione di legami covalenti un tipo di regolazione oppure anche regolare la dissociazione o associazione di enzimi multimerici.La regolazione della sintesi enzimatica di solito una repressione da catabolita. La [glu] spesso da fenomeni di repressione catabolica. Esistono sia attivatori che repressori nella trascrizione. Repr:controllo negativo, blocco operatore, blocco trascr. Att: controllo positivo,prot cap+ aumento [cAMP e lat] e dimin [glu] porta trascriz.

15. METABOLISMO DI TIPO ANAEROBIO: DESTINO DELLACIDO PIRUVICO NEI CLOSTRIDI. (DESCRIVERE LE CARATTERISTICHE GENERALI DI TALE GRUPPO MICROBICO, VIA GLICOLITICA IMPIEGATA, FORMAZIONE DI ACETIL-COA, FERMENTAZIONE ACETON-BUTILICA). I clostridi sono eubatteri, gram positivi e sporigeni.Sono anaerobi obbligati, alcuni aerotolleranti. I clostridi quindi fermentano. Servono trattamenti forti per poter eliminare le spore. Sono fortemente proteolitici e saccarolitici. Utilizzano amido e cellulosa. Producono: acetonbutirrico (solvente organico ) e CO2.Glucosio Piruvato a. organici, alcoli (propanolo, etanolo, butanolo), acetone Qesti prodotti derivano da substrati su cui vengono scaricati elettroni. Pur non avendo la piruvato deidrogenasi (PDH) possono trasformare CH3C=OCOOH in CH3OSCoA tramite un sistema enzima piruvato feredossina ossido reduttasi. 2 mol di acetilcoA possono condensare a dare acetoacetilcoA il quale pu essere idrolizzato (prima sostituito con P) a dare ATP+aceto acetato. AcetoacetilcoA pu essere ridotto a a.butirrico o a a.butanolo

14- Batteri lattici: descrivere le differenze metaboliche tra i batteri lattici omofermentanti, eterofermentanti ed eterofermentanti facoltativi, ruolo della piruvato ossidasi nel metabolismo dei batteri lattici e dei clostridi (RISP SUI CLOSTRIDI SOPRA!) Batteri lattici omo ed eterofermentanti obbligati e facoltativi. Descrivere le vie glicolitiche seguite e il tipo di fermentazione Batteri lattici: definire le differenze esistenti tra omofermentanti, eterofermentanti ed eterofermentanti facoltativi in termini di catabolismo degli zuccheri e di fermentazione. Descrivere inoltre il rapporto di tali microrganismi nei confronti dell'ossigeno e definire il ruolo della piruvato ossidasi presente in alcune specie.

I batteri lattici producono acido lattico per abbassare pH nella GI. Sono procarioti, gram positivi, anaerobi o microaerotolleranti. Si distinguono in omofermentanti o eterofermentanti. OMOFERMENTANTI= glucosio acido lattico 1 fanno glicolisi classica 1,5 piruvato lattato

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NADH NAD+ ETEROFERMENTANTI= glucosio acido lattico Altri metaboliti (EtOH, CH3COOH) Fosfochetolasi Xilulosio gliceraldeide acetilfosfato: con EtOH crescita lenta, con CH3COOH crescita esponenziale

OMOFERMENTANTI STRETTI: ETEROFERMENTANTI STRETTI:

glicolisia. lattico fosfochetolasia. lattico, etanolo, CH3COOH

ETEROFERMENTANTO FACOLTATIVI: con pentosifosfochetolasi con esosiglicolisi Alcuni batteri lattici crescono meglio in presenza di O2 perch hanno la piruvato ossidasi che permette loro di formare acetilcoA con il quale si pu ottenere acetilfosfato e quindi acetato + ATP.

a pH>5 inizia la produzione solventi a Ph<5 prodotto butanolo e acetone

17. Per usare lamido devo avere un microrganismo con pi enzimi,alfa amilasi, che formano oligomeri diversi a seconda del microrganismo: glucoamilasi, che staccano le singole unit - beta amilasi, che staccano unit di due monomeri (maltosio).Se non si pu usare lamido devo pretrattarlo (si usano amilasi e glucoamilasi di origine microbica, pi diffuso Bacillus).Esistono glucomilasi di origine funginea.. Con il pretrattamento uso miscele di enzimi a seconda del grado di depolarizzazione e pu essere fatto sia post sia in contemporanea allinoculo. Sono stati anche creati OGM in grado di usare amido.

18. ciclo degli acidi tricarbossilici nei microrganismi aerobi ed anaerobi: descrivere ruolo metabolico e le differenze esistenti nelle reazioni di decarbossilazione Differenze e il meccanismo diverse decarbossilazioni ciclo degli acidi tricarbossilici ossalsucinato alfa chetoglutarato dalla parte alfa. decarbossilazione spontanea. Vi un riarrangiamento della molecola

Alfa cheto glutarato succinil coA decarbossilazione ossidativa con formazione tioestere Ciclo degli acidi tricarbossilici in senso riduttivo Il ciclo di krebs importante per molti organismi fermentativi che hanno bisogno degli intermedi di tale ciclo, ma non necessitano della produzione di NADH e FADH2 dato che non utilizzano la catena respiratoria. Per queste ragioni il ciclo di krebs trasformato da ciclo ossidativo a ciclo riduttivo. Questi batteri hanno in genere una carenza di alpha.chetoglutarato DH e qui non si forma succinil-CoA secondo il normale ciclo ma mediante fumarato riduttasi FADdipendente. 19. Ruolo della biotina nella produzione di amminoacidi: spiegare i fenomeni di competizione che si verificano a livello di carbossilazione dellacido piruvico e dellacetil-CoA, meccanismo di reazione, strategie tecnologiche per ovviare alle problematiche legate alla concentrazione di tale cofattore

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Inizialmente si pensava che la biotina servisse per formare gli amminoacidi (tanto glutammato =tanta biotina). Invece non cos in quanto il glutammato si accumula. La biotina lavora con lacetilcoA carb che provoca aumento fosfolipidi e diminuisce glutammato secreto. Per evitare laumento acidi grassi si pu usare la penicillina che rimuove la parete e rende pi permeabile. Oppure si aggiunge acido grasso al sistema cos non ne viene prodotto o aggiungendo tensioattivo che facilitano crescita del glutammato. Si pu creare un auxotrofo per il glicerolo che non fa creare bene le membrane.

20. Piridossalfosfato. il cofattore per le reazioni con gli amminoacidi. CHO pu reagire con il gruppo NH2 a dareimmine ( basi di shift). un legame che si forma spontaneamente. Le reazioni sono: racemizzazione intermedio fondamentale il carbanione perch planare. Lenzima che opera il PLP che trasforma lamminoacido da tetraedrico a planare decarbossilazione il prodotto della reazione unammina. In questo caso non si forma il carbanione ma la carica negativa dellossigeno determina il distacco della CO2 transaminazione il carbanione in equilibrio con la forma enamminica e grazie allacqua si ha idrolisi del legame imminico con formazione di alfa chetoacido corrispondente + piridossalinina formazione legami covalenti il carbanione viene usato come nucleofilo e va a formare un legame C-C per passare da un amminoacido allaltro beta eliminazione viene eliminata una molecola dacqua a carico di un amminoacido con OH in beta per passare da un amminoacido a un altro

21. a) definire cosa si intende per repressione da catabolita b) quando si verifica nei processi fermentativi c) ruolo nelle colture batch, fed-batch e continue rispetto a tale fenomeno

La coltura in batch un sistema chiuso, in quanto all'inizio della coltura vengono forniti tutti i nutrienti necessari alla crescita cellulare (detti nel loro complesso terreno di coltura) senza aggiunte successive. La cinetica di crescita caratterizzata da quattro fasi: fase di latenza, durante la quale le cellule si adattano al terreno, perci non si ha un incremento della biomassa (massa complessiva delle cellule); fase di crescita esponenziale, nella quale le cellule si dividono molto rapidamente, secondo appunto un andamento esponenziale del tipo y= 2x, dove y il numero di cellule e x il numero di generazioni; fase stazionaria, durante la quale la crescita rallenta man mano che i nutrienti scarseggiano, fino ad arrestarsi; fase di letalit, nella quale la scarsit di nutrienti tale da causare la diminuzione della biomassa, poich muoiono pi cellule di quelle che si generano, determinando la fine della coltura.

Complessivamente, la coltura in batch un sistema vantaggioso per ottenere rapidamente un'alta quantit di biomassa, tanto che spesso usata come pre-coltura per altri processi fermentativi; d'altro canto, non pu essere applicata per tempi medio-lunghi.

La coltura in continuo invece un sistema aperto, in cui nuovo terreno di coltura immesso costantemente, mentre quello che si esaurito eliminato, generalmente attraverso due pompe. Prevede tre fasi: la

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prima una fase in batch, con entrambe le pompe non funzionanti, necessaria per raggiungere un'adeguata biomassa. Al termine della crescita esponenziale, comincia la fase di start-up, in cui le cellule vengono alimentate e si assiste ad un ulteriore aumento della biomassa. L'ultima invece la fase stazionaria, nella quale la biomassa resta costante e i flussi in entrata e in uscita non cambiano. I vantaggi delle colture in continuo sono lo stato fisiologico della biomassa uniforme, la produzione di biomassa costante nel tempo, l'assenza di tempi morti, la possibilit di controllare il processo fermentativo regolando i flussi (se si vuole terminare la coltura, sufficiente aumentare il flusso in uscita pi di quello in entrata; il contrario se si vuole accumulare il terreno di coltura). Lo svantaggio principale la delicatezza del sistema, visto che la media-lunga durata del processo pu portare a contaminazione, cos come le numerose e ripetute divisioni cellulari possono portare all'accumulo di mutazioni nelle cellule, fattore non irrilevante trattandosi di organismi selezionati.

Infine, esiste la coltura in fed-batch. Si tratta di un sistema semi-aperto, in quanto aperto solo in entrata, ma non in uscita, perci anche detto a volume variabile. Anch'esso diviso in pi fasi: inizialmente si ha una fase in batch, poi, una volta raggiunta adeguata biomassa, inizia il processo fedbatch. La biomassa aumenta in proporzione ai nutrienti forniti, fino a che non sono altri fattori a causare un rallentamento della crescita, come ad esempio la scarsit di ossigeno; a questo punto conveniente rallentare il flusso di nutriente fino ad arrestare il sistema. La coltura in fed-batch, sebbene di breve durata (alcune decine di ore), previene problemi di inibizione da prodotti del metabolismo cellulare tossici e l'accumulo di mutazioni, oltre a diminuire la possibilit di contaminazione; inoltre, consente di recuperare la biomassa per iniziare un nuovo processo.

La scelta del tipo di coltura dipende da vari fattori. Uno su tutti la fase del metabolismo in cui prodotto il composto d'interesse. Se la sua produzione segue le fasi di crescita cellulare, cio rientra in quello che definito metabolismo primario, la maggior parte sar ottenuta nella fase di crescita esponenziale, detta trofofase. Diversamente, la biosintesi del prodotto pu iniziare quando terminata la crescita esponenziale, cio questa sostanza fa parte del metabolismo secondario, pertanto la produzione maggiore si ha nella fase stazionaria o idiofase. 22. Piridossalfosfato: descrivere il ruolo di tale cofattore a livello di metabolismo microbico e descrivere come avvengono le reazioni catalizzate da tale cofattore Il piridossalfosfato un cofattore di enzimi transferasi come le transaminasi. Funziona con catalisi covalente elettrofila per formazione di una base di Shiff. Il gruppo carbonilico del piridossalfosfato si lega ad un gruppo ammino-terminale formando un'immina (base di Shiff). Unendo ad una soluzione di un amminoacido una piccola quantit di una soluzione di questa vitamina e analizzando successivamente la composizione, si possono ritrovare il cofattore intatto, il cofattore modificato e una variet di molecole derivate dall'amminoacido di partenza; si conclude che questo cofattore possiede intrinsecamente attivit catalitica per varie reazioni (decarbossilazione, deaminazione, racemizzazione etc.) e che la sua capacit ed aspecificit devono essere modulate per svolgere una funzione utile e non recare danni alla cellula. Si pu trovare nelle transaminasi, enzimi che trasportano un gruppo NH2 da un amminoacido su un -chetoacido. Oppure si pu trovare nelle amminoacididecarbossilasi, enzimi che tolgono

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il gruppo -COOH degli amminoacidi, o ancora nelle deidratasi, enzimi che tolgono acqua da certi amminoacidi. 23. Ruolo fisiologico dei cofattori ossidoriduttivi (NAD e FAD) e di deidrogenasi, ossidasi e ossigenasi NAD una biomolecola il cui ruolo biologico consiste nel trasferire gli elettroni, quindi nel permettere le ossido-riduzioni; come sempre avviene in biologia, essa svolge il suo importante ruolo tramite lo spostamento di atomi di idrogeno. un coenzima ossidoriduttivo. Il NAD svolge il suo ruolo essenziale di trasferitore in numerosissime reazioni chimiche, quali alcune tappe della glicolisi o del ciclo di Krebs; i seguenti sono alcuni esempi: gliceraldeide 3-fosfato + NAD+ 1,3-bisfosfoglicerato + NADH + H+ (glicolisi) malato + NAD+ ossalacetato + NADH + H+ (ciclo di Krebs) FAD Il flavina adenina dinucleotide (FAD o FADH2), un importante fattore ossidante del ciclo di Krebs ed interviene nel trasporto degli elettroni nel processo biochimico chiamato catena di trasporto degli elettroni. un coenzima ossidoriduttivo e partecipa a innumerevoli reazioni che comportano il trasferimento di 1 o 2 elettroni. Durante il ciclo di Krebs, il FAD acquisisce due atomi di idrogeno, che si legano agli atomi di azoto con doppi legami negli anelli aromatici della riboflavina diventando FADH2