Centrifugacin La centrifugacin es un mtodo por el cual se pueden separar slidos de lquidos de diferente densidad mediante una fuerza rotativa

, la cual imprime a la mezcla con una fuerza mayor que la de la gravedad, provocando la sedimentacin de los slidos o de las partculas de mayor densidad. Este es uno de los principios en los que la densidad: Todas lculas, por posa, sectadas por cualquier y una extensa variedad de tcnicas derivadas de esta. Donde la fuerza es mayor a la gravedad. Fundamento terico El objetivo de la centrifugacin es separar slidos insolubles(de particulas muy pequeas dificiles de sedimentar)de un liquido. Para ello, se aplica un fuerte campo centrfugo, con lo cual las partculas tendern a desplazarse a travs del medio en el que se encuentren con la aceleracin G. E=velocidad angular2 x radio de giro. RCF=rw2/g r = radio en mm w = velocidad angular en radianes por segundo g = aceleracin de la gravedad (9807 mm/s2) (1 revolucin =2radianes; w=2rpm/60 w=0,10472xrpm) RCF=1,12r(rpm/1000)2 FUERZACENTRFUGA RELATIVA (RCF)Permite comparar la fuerza a la que est sometida una partcula centrifugada en distintos rotores A qu fuerza centrfuga relativa centrifugamos una muestra en el rotor JA 18.1 si seleccionamos 10000 rpm? Radio 105.3 mm RCF=1,12x105,3x(10000/1000)2=12000g (aprox.) Centrfuga Las centrfugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentacin en poco tiempo de las partculas que tienen una densida mayor que la del medio que las rodea. En general se diferencian en funcin de los mrgenes de aceleracin a que someten a las muestras en : centrfugas (de pocas g a aprox. 3000 g), supercentrfugas (o centrfugas de alta velocidad, rango de 2000 g a 20000 g) y ultracentrfugas (de 15000 g a 600000 g). En las centrfugas se suele controlar la temperatura de la cmara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la friccin. En las ultracentrfugas, la velocidad extrema (ms de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacio en la cmara de la centrfuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra. Tipos de centrfugas

Los aparatos en los que se lleva a cabo la centrifugacin son las centrfugas. Una centrfuga tiene dos componentes esenciales: rotor (donde se coloca la muestra a centrifugar) y motor. Existen dos tipos de rotores:

De ngulo fijo: Los tubos se alojan con un ngulo fijo respecto al eje de giro. Se usa para volmenes grandes. Basculante: Los tubos se hallan dentro de unas carcasas que cuelgan. Estas carcasas estn unidas al rotor con un eje y cuando la centrfuga gira, se mueven. Se usan para volmenes pequeos y para separar partculas con un mismo o casi igual coeficiente de sedimentacin.

Las centrfugas estn metidas en el interior de una cmara acorazada a unos 4C. Si esta cmara no estuviese presente, al comenzar la centrifugacin, y debido al rozamiento con el aire, subira la temperatura de la muestra y podra llegar a desnaturalizarse. Una centrfuga debe tener las masas de las muestras compensadas unas con otras. En caso contrario, la centrfuga podra "saltar por los aires". Aunque hoy en da, para que esto no ocurra, casi todas las centrfugas se detienen si las masas no estn compensadas. Existen dos grandes grupos de centrfugas: Analticas: Con las que se obtienen datos moleculares (masa molecular, coeficiente de sedimentacin, etc.). Son muy caras y escasas. Preparativas: Con las que se aslan y purifican las muestras. Hay 4 tipos de centrfugas preparativas:

De mesa: Alcanzan unas 5.000 rpm (revoluciones por minuto). Se produce una sedimentacin rpida. Hay un subtipo que son las microcentrifugas que llegan a 12.000-15.000 rpm. Se obtiene el precipitado en muy poco tiempo. De alta capacidad: Se utilizan para centrifugar volmenes de 4 a 6 litros. Alcanzan hasta 6.000 rpm. Son del tamao de una lavadora y estn refrigeradas.uso industrial De alta velocidad: Tienen el mismo tamao que las de alta capacidad y llegan a 25.000 rpm. uso industrial Ultracentrfugas: Pueden alcanzar hasta 100.000 rpm. Tambin estn refrigeradas. Son capaces de obtener componentes subcelulares, virus.

Tipos de centrifugacin

Centrifugacin diferencial: diferencia en la densidad de las molculas. Esta diferencia debe ser grande pervada al centrifugar: Las partculas que posean densidades similares sedimentaraficoiza como centrifugacin preparativa para separar ponentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de ncleos y membrana)til para separar molculas. Centrifugacin diferencial La centrifugacin diferencial se basa en la existencia de diferentes partculas en la suspensin que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco

fuerza de aceleracin) sedimentarn las partculas mayores y/o ms densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugacin es centrifugado de nuevo en condiciones de mas tiempo y ms fuerza de aceleracin sedimentan de nuevo las partculas ms densas presentes y as sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugacin y obtener una coleccin de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partculas de diferente tamao y/o densidad.

Centrifugacin isopcnica: Partculas con el mismo coeficiente de sedimentacin se separan al usar medios de diferente densidad. Se usa para la separacin de ADN con mucha frecuencia. Centrifugacin zonal: Se separan partculas con distinto coeficiente de sedimentacin por la accin de determinados tampones.

La centrifugacin en gradiente de densidad El mtodo de gradiente de densidad implica la utilizacin de un soporte fluido, cuya densidad aumenta desde la zona superior a la inferior. El gradiente se consigue con un soluto preferiblemente de baja masa molecular en un solvente en el que la muestra a analizar pueda ser suspendida. La muestra se sita en la parte superior del gradiente como una fina banda. La separacin de los componentes de la muestra se presenta como diferentes bandas o zonas. Existen dos variaciones dentro de la centrifugacin en gradiente de densidad:

Centrifugacin de equilibrio en gradiente o isopcnica Centrifugacin zonal

Estas tcnicas permiten la separacin de partculas y molculas que difieren en masa o densidad. La centrifugacin de equilibrio en gradiente o isopcnica La centrifugacin de equilibrio en gradiente separa las partculas con base en sus densidades diferentes. En esta tcnica la muestra es disuelta en una solucin isocrtica y bajo la fuerza centrfuga el soluto forma el gradiente al distribuirse en el tubo durante la centrifugacin, se denominan autoformados. La condicin fundamental es que la densidad mxima del gradiente final debe siempre exceder a la densidad de las partculas. La centrifugacin de equilibrio en gradiente permite que las especies sedimentantes se muevan por el gradiente hasta que alcanzan un punto donde su densidad y la del gradiente son idnticas, por lo cual tambin se le llama centrifugacin isopcnica. En este punto no se producir una sedimentacin posterior debido a que flotan sobre un "colchn" de material que posee una densidad superior que la suya propia de tal manera que aunque se prolongue el tiempo de centrifugacin, las partculas no van a ir al fondo del tubo. La densidad de la partcula en ese punto se conoce como buoyant density. Esta tcnica se emplea para separar partculas similares en tamao pero distintas en densidad. Esto es cierto para molculas, tales como cidos nuclecos, as como diferentes orgnulos celulares. Se requieren las siguientes caractersticas en los solutos usados para formar el gradiente: bajo PM (de manera que el tiempo requerido para lograr el equilibrio sea corto), bajo grado de ionizacin, baja viscosidad y alta densidad, transparencia a la luz UV, y ser buen solvente para las molculas que se intentan resolver. Frecuentemente se usa CsCl, el Cs+, por ser un in compacto, sedimenta lentamente en los altos campos gravitacionales aplicados durante la centrifugacin y se establece un gradiente con la mayor concentracin en el fondo del tubo (el in Cl- lo sigue de manera de mantener la neutralidad de las cargas). Por otro lado el Cs+ se une a los fosfatos del DNA y RNA y a los grupos OH- de las ribosas de manera que la densidad de las molculas de RNA se incrementa ms que la del DNA. La densidad aproximada en CsCl de protenas es 1.3

g/ml; del DNA 1.6 - 1.7 g/ml y del RNA es 1.75 - 1.85 g/ml. Los gradientes de CsCl permiten separar molculas cuyas densidades difieren en por lo menos 0.02 g/ml. En los medios de separacin suelen incluirse tambin Hg++ o Ag+, con el propsito de aumentar las diferencias entre las densidades de las molculas (a pH neutro el Hg++ se une a T y A, y el in Ag+ se une a G y C). El agregado de compuestos intercalantes como el bromuro de etidio permiten separar molculas de DNA de distinta conformacin aunque tengan la misma composicin de bases. Molculas con una alta proporcin de G y C poseen mayor densidad como consecuencia de los tres puentes H formados. La siguiente ecuacin relaciona el % de G+C con la densidad (?) de la molcula: % (G+C)= [(?- 1.66)/0.098] 100 La centrifugacin zonal La muestra a analizar se deposita en la parte superior de un gradiente de densidad preformado. Bajo fuerza centrfuga las partculas comenzarn a sedimentar a travs del gradiente, movindose cada partcula a diferentes velocidades dependiendo de su masa. La migracin depende de: el tamao y forma de las partculas, la fuerza centrfuga aplicada, y la densidad y viscosidad del medio. La propiedad fsica sobre la que se fundamenta la separacin es la masa de las partculas, y no su densidad. A diferencia de lo que ocurre en la centrifugacin isopcnica, la densidad mxima del gradiente no debe exceder la de las partculas a separar. Los gradientes de densidad impiden que las bandas de cada componente se ensanchen por efecto de corrientes convectivas y se mezclen durante la aceleracin y desaceleracin del rotor. Frecuentemente se usan con este propsito gradientes de sacarosa, ms densos en el fondo que en la parte superior del tubo; otros medios usados con este fin son: glicerol, Ficoll, Percoll. En general se usan rotores de tipo swing-out. Las muestras son centrifugadas lo suficiente como para separar las molculas de inters; si la centrifugacin se prolonga en el tiempo las partculas se recuperan en el pellet, como se muestra en el siguiente grfico:

Diagrama de representacin de la velocidad de la 1: Densidad boyante de partculas 2: Densidad boyante de partculas de ms densidad

centrifugacin zonal de menos

isopicnica densidad

Ultracentrifugacin...: Permite estudiar las caractersticas de sedimentacin de estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y biomolculas. Utiliza rotores (fijos o de columpio) y sistemas de monitoreo. Existen diferentes maneras de monitorear la sede las partculas en la ultracentrifugacin, el ms comn de ellos mediante luz Uerfresones.Categoria:Tcnicas Biologicas