DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS EM UMA AMOSTRA BIOLGICA PELO MTODO DO BIURETO

INTRODUO: Protenas so molculas orgnicas que apresentam diversas funes celulares (transportadores, enzimas, anticorpos, estruturais, etc.). A funo e a estrutura de uma protena esto fortemente correlacionadas, por isso observa-se uma grande variedade de estruturas proticas que acompanham a variedade de funes desempenhadas por estas. Protenas so caracterizadas por sua estrutura bsica, formada por aminocidos unidos por ligaes peptdicas. As ligaes peptdicas so formadas entre o grupo carboxila de um aminocido e o grupo amino do aminocido seguinte com a eliminao de uma molcula de gua. O nmero, a identidade e a disposio destes aminocidos no espao (devido s interaes entre estes) variam entre diferentes protenas e determinam as diferentes estruturas tridimensionais e funes destas.

Figura 12: A, Formao de uma ligao peptdica. B, Estrutura tridimensional de uma protena (citocromo c) (Fonte: Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger (2006) Principles of Biochemistry. 4a ed. Freeman.

A determinao da concentrao de protenas em materiais biolgicos necessria em diversas situaes, como na purificao de uma determinada protena a partir de um extrato de material biolgico para o estudo de suas propriedades e funes, ou na avaliao dos nveis de certas protenas que tm suas quantidades alteradas em determinadas situaes patolgicas. Existem diversos mtodos para a determinao do contedo total de protenas em uma amostra. Suspenses puras de protenas apresentam absoro de luz de

comprimento de onda abaixo de 230 nm com absoro mxima a 220 nm, correspondente principalmente s ligaes peptdicas. Entretanto, j que outros compostos como cidos carboxlicos, ons de tampo, alcois, bicarbonato e substncias aromticas tambm absorvem nesta regio, os resultados obtidos devem ser interpretados com cuidado. As protenas tambm absorvem luz ultravioleta em comprimentos de onda prximos a 280 nm que correspondem a presena de tirosina (275 nm), triptofano (280 nm) e fenilalanina (260 nm) nas molculas. Como o teor destes aminocidos varia entre diferentes protenas, a absoro a 280 nm ser particular de cada grupo de protenas. A quantificao de protenas atravs da absoro a 280 nm uma tcnica rpida e eficiente, entretanto ela est sujeita a interferncias, particularmente de cidos nuclicos que exibem absoro mxima a 260 nm. Outros mtodos bastante comuns baseiam-se no contedo de nitrognio de protenas (todas as protenas possuem um contedo mdio de nitrognio de 16%), como o mtodo de Kjeldahl, ou na reao de sulfato de cobre em meio alcalino com protenas, que fornece um produto de colorao prpura, como no mtodo do Biureto. Tambm bastante utilizado, o mtodo de Folin-Lowry apresenta modificaes ao mtodo do Biureto. Neste mtodo, aps a realizao do mtodo do Biureto adicionado reao o reagente de Ciocalteau (cido fosfotngstico fosfomobildico) que reduzido pela tirosina presente nas molculas de protenas. Nesta reao a colorao desenvolvida mais muito mais intensa, tornando o mtodo 100 vezes mais sensvel do que o mtodo do Biureto, sendo este bastante til para amostras muito diludas. Todos os mtodos possuem vantagens e limitaes, portanto a escolha deve ser cautelosa e levar em considerao os diversos fatores relativos aquela analise, como, por exemplo, as caractersticas da amostra e a disponibilidade de recursos como equipamentos e reagentes. Nesta prtica ser realizado o mtodo do Biureto, que ser descrito em maiores detalhes a seguir.

OBJETIVO GERAL DA PRTICA: Construir uma curva padro de protenas e determinar a concentrao de protenas totais em uma amostra biolgica desconhecida pelo mtodo do Biureto.

I.

CONSTRUO

DE

UMA

CURVA

PADRO

DETERMINAO DA

CONCENTRAO DE PROTENAS EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA:

1. Objetivo: Determinao da concentrao de protenas atravs da formao de produtos com colorao que podero ser quantificados por espectrofotometria.

2. Princpio do mtodo: Este mtodo baseado na reao do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo de Biureto) com protenas e peptdeos (no mnimo tripeptdeos). Maiores detalhes podem ser encontrados no roteiro da aula Anlise Qualitativa de Biomolculas.

3. Reagentes e preparo das solues:

Reagente de Biureto:

Dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sdio e potssio (C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de gua; Adicionar 300 mL de NaOH 10%; Adicionar gua destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de soluo. Conservar a temperatura ambiente protegido da luz.

Soluo padro de casena 1% (10 mg/mL):

Pesar 1g de casena, dissolver com aproximadamente 70mL de gua destilada e depois adicionar hidrxido de sdio 1M at a soluo tornar-se lmpida e completar o volume para 100mL. Aliquotar em fraes de 10 mL e conservar a 20oC.

4. Procedimento: A) Construo da curva padro (ou curva de calibrao)

Identificar 6 tubos de ensaio e colocar em uma estante; Adicionar os reagentes conforme a tabela seguinte:

Tubo (N o ) B 1 2 4 5 6

H2O (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -

Casena 10 mg/mL (mL) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Reativo de Biureto (mL) 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

Abs. 540 nm

Casena mg

Aps a adio do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30 minutos (a colorao prpura formada indicativa da presena de protenas);

Neste momento, inicie a realizao do protocolo seguinte (abaixo) para a determinao da concentrao de protenas na amostra de

concentrao desconhecida que seu grupo recebeu no inicio desta aula;

B) Determinao da concentrao de protenas em uma amostra biolgica de concentrao desconhecida

Adicione mais um tubo estante (tubo A- amostra) Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:

Tubo

gua destilada (mL) 0

Amostra (mL) 1,0

Reativo de Biureto 4,0

Abs. 540 nm

Amostra mg

A (amostra)

Aps a adio do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30 minutos; Selecione o comprimento de onda de 540 nm no espectrofotmetro (o aparelho deve ser ligado no incio da aula); Utilize o tubo 1 como branco de reao calibrando o

espectrofotmetro a 0 de absorvncia e 100% de transmitncia; Determine as absorvncias a 540 nm dos demais tubos e anote nos espaos reservados da tabela. Construir o grfico da curva padro com os dados obtidos nas reaes acima e realizar os clculos para a determinao da concentrao de protena na amostra.

REFERNCIAS:

PETKOWICZ, C.L.O. Bioqumica. 7. ed. Curitiba: Ed. UFPR, 2007. NARDY, M. B.C.; STELLA, M.B.; OLIVEIRA, C. Prticas de laboratrio de bioqumica e biofsica: uma viso integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009. DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5 Edition. W. H. Freeman and Company. New York.