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ANLISIS DE ALIMENTOS PRCTICA # 3 ANLISIS BROMATOLGICO BSICO ANLISIS DE PROTENAS DETERMINACIN DE NITRGENO EN PROTENAS POR EL MTODO DE KJELDAHL INTRODUCCIN El problema que representa proporcionar protenas adecuadas a la poblacin del mundo es un tanto secundario en el problema general de alimentacin mundial. Adems de su significado nutritivo las protenas juegan un papel importante en las propiedades organolpticas de los alimentos. Las protenas ejercen una influencia controladora en la textura de los alimentos provenientes de fuentes animales. El contenido protico del trigo y su harina es considerado como uno de los mejores indicadores de la calidad de la panificacin. El anlisis para la determinacin de protenas, a pesar de no estar incluido generalmente como factor de clasificacin en los estndares de granos se acepta como un factor comercial. Las protenas existen en los alimentos en combinacin fsica o qumica con carbohidratos o lpidos. Las glucoprotenas y las lipoprotenas afectan las propiedades reolgicas de las soluciones alimenticias o poseen aplicaciones tcnicas como emulsificantes comestibles. El "envejecimiento" de la carne est relacionado con cambios qumicos en las protenas. Las protenas naturales puras poseen poco sabor. Durante el proceso de calentamiento (ebullicin, panificacin, asado) las cadenas laterales de aminocidos se degradan o interactan con otros componentes de los alimentos (ejemplo, la lisina con los azcares reductores) para conferir sabores tpicos. El calentamiento excesivo puede, por otro lado, reducir el valor nutritivo. El analista de alimentos comnmente desea saber el contenido protico total de los alimentos, aunque dicho contenido est conformado por una mezcla compleja de protenas. Actualmente todos los mtodos para determinar el El contenido protico total de los alimentos son de naturaleza emprica.

aislamiento y pesado directo de la protena proporcionara un mtodo absoluto, sin embargo, dicho mtodo es llevado a cabo slo a veces en investigaciones

bioqumicas pero es completamente imprctico para el anlisis de alimentos. En 1883 el investigador dans Johann Kjeldahl desarroll el proceso bsico del conocido mtodo actual de anlisis de protenas por el mtodo Kjeldahl, ms propiamente, para analizar nitrgeno orgnico. En esta tcnica se digieren las protenas y otros componentes orgnicos de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico en presencia de catalizadores. El nitrgeno orgnico total es convertido en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente en una solucin de cido brico. Los aniones del borato as formado se titulan con HCl estandarizado, lo cual se convierte en el nitrgeno de la muestra. El resultado del anlisis representa el contenido de protena cruda del alimento ya que el nitrgeno tambin proviene de componentes no proticos. Este mtodo ha sufrido varias modificaciones. As, Kjeldahl us originalmente permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidacin, sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descart. En 1885 Wilforth encontr que se poda acelerar la digestin con cido sulfrico aadiendo algunos catalizadores. Gunning en 1889 sugiri la adicin de sulfato de potasio para elevar el punto de ebullicin de la mezcla de la digestin para acortar la reaccin. Por lo tanto, el procedimiento de esta tcnica es ms correctamente conocido como Mtodo Kjeldahl-Wilforth-Gunning. FUENTES DE ERROR Constituyen fuentes de error en este mtodo son: la inclusin de nitrgeno no protico como parte de la protena; la prdida de nitrgeno durante la digestin, la digestin incompleta de la muestra. Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se aaden al cido (para elevar el punto de ebullicin) pueden resultar en una descomposicin por calor y la consecuente prdida de amonaco. Generalmente se recomiendan temperaturas de digestin de 370-410C. Tambin puede ocurrir prdida de nitrgeno si se utiliza demasiado selenio o la temperatura de la digestin no se controla cuidadosamente; las condiciones son an ms crticas que con el cobre o el mercurio cuando se usan como catalizadores.

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ESTRATEGIA En la prctica comercial se tienen que analizar un gran nmero de muestras diariamente, as que se utilizan estrategias que ahorran tiempo de anlisis. En el anlisis del harina de trigo se digiere 1 gramo de muestra usando una cantidad conocida de cido sulfrico 0.1253N, y titulando (mediante una bureta de lectura invertida) con hidrxido de sodio 0.1253N, as se hace posible reportar el porcentaje de protena directamente de la lectura de la bureta. REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MTODO DE KJELDAHL

DIGESTIN

(1) n - C -NH2 + mH2SO4

protena

catalizadores calor

CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN

(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH

2NH3 + Na2SO4+ 2H2O

(3) NH3 + H3BO3 (cido brico) TITULACIN

NH4 + H2BO3- (in borato)

El anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado con HCl estandarizado: (4) H2BO3- + H+ H3BO3

OBJETIVOS El estudiante conocer el fundamento del anlisis de protenas por el mtodo de Kjeldahl. El estudiante se familiarizar con los equipos y el procedimiento del anlisis de protenas por el mtodo de Kjeldahl y la recuperacin de amonaco. El estudiante aprender a realizar los clculos pertinentes para la determinacin de nitrgeno en protenas. MATERIAL 1 matraz de digestin Kjeldahl con capacidad de 125 ml. 1 matraz de Erlenmeyer de 10 ml. 1 matraz volumtrico de 100 ml. 1 mechero de Bunsen. 2 pinzas (nueces). 1 soporte universal 1 pipeta de 5 ml. 1 pipeta de 10 ml. 1 frasco gotero de 25 ml. 1 frasco lmbar con capacidad de 1 litro. 1 piseta grande con agua destilada. 1 microbureta. 3 cuerpos de ebullicin. 1 par de guantes de asbesto. 1 pinzas largas. 1 embudo de cristal chico o mediano. EQUIPO Aparato digestor Kjeldahl (1 para todo el grupo). 1 aparato destilador micro Kjeldahl (1 por equipo). REACTIVOS Verde de bromocresol al 0.1% diluido en alcohol al 95%. Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 95%. cido brico al 2%. cido clorhdrico 0.01N (solucin valorada). Hidrxido de sodio al 30%. cido sulfrico concentrado. Mezcla catalizadora para la digestin: 2.5 g de dixido de selenio + 100 g de sulfato de potasio + 20 g de sulfato de cobre pentahidratado (proporcionada por la coordinacin de laboratorios).

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MTODO ELABORACION DE REACTIVOS 1.- Mezcla Indicadora.- Prepare por separado los indicadores verde de bromocresol al 0.1% y el rojo de metilo al 0.1% diluidos en alcohol al 95%. Mezcle 10 ml. de verde de bromocresol con 2 ml. de la solucin de rojo de metilo en un frasco gotero. 2.- cido Brico al 2%.- Disuelva 10 g de cido brico (en cristales) en 500 ml. de agua destilada hirviendo. Despus de que se enfre transfiera la solucin a un frasco tapado. Se conserva indefinidamente. 3.- cido Clorhdrico 0.01N.- Prepare un litro y valrela con una solucin de NaOH de la misma normalidad. 4.- Hidrxido de Sodio al 30%.- Disuelva 150g de perlas de hidrxido de sodio en 350 ml. de agua destilada. Almacene la solucin en un frasco mbar con tapn de vidrio. 5.- H2SO4 concentrado. 6.- Catalizadores para la Digestin.- Mezcle 2.5g de dixido de selenio (SeO2), 100g de sulfato de potasio (K2SO4) y 20 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 . 5H2O). PROCEDIMIENTO DIGESTIN 1.- Pese exactamente 0.15g de harina de trigo en un matraz de micro-Kjeldahl cuidando que la muestra no se adhiera a las pardes o al cuello del matraz. 2.- Aada 2.5 ml. de H2SO4, dos perlas de ebullicin y aproximadamente 1.0 g de mezcla catalizadora. 3.- Someta a digestin la muestra en el aparato de microKjeldahl bajo una campana de extraccin, con el matraz ligeramente inclinado usando baja temperatura al inicio y aumentando el calor a medida que procede la digestin, rotando los matraces de vez en cuando para asegurarse de que se digiera toda la muestra. La digestin terminar cuando el color de la muestra sea azlverde claro. El proceso tomar aproximadamente 90 minutos. 4.- Enfre el matraz durante unos 4 minutos para que no se endurezca al solidificarse la muestra. 5.- Aada 7 ml. de H2O cuidadosamente, poco a poco, a la muestra digerida. Mezcle y permtale enfriarse.

DESTILACIN 6.- Encienda la unidad destiladora. 7.- Si es posible ajuste la velocidad de destilacin a aproximadamente 5 ml. por minuto 8.- Abra la llave del agua para tener H 2O circulando por el refrigerante todo el tiempo. 9.- Aada la muestra a la cmara de ebullicin por medio de un embudo (para recuperar las perlas de ebullicin) y enjuague el matraz con aproximadamente 5ml. de H2O destilada. 10.- Coloque 1 frasco Erlenmeyer con 10 ml de cido brico y 2 gotas de indicador bajo la salida de destilacin. 11.- Aada aproximadamente 10 ml. de la solucin de NaOH a la cmara de ebullicin LENTAMENTE. La mezcla digerida se tornar oscura (azl-gris o caf oscuro). Si no cambia de color aada ms NaOH. 12.- Deje un poco de NaOH en la copita superior del destilador. 13.- Colecte aproximadamente 20 ml. del destilado (4-5 minutos). El destilado estar listo para ser titulado cuando se torna verde en el matraz receptor. 14.- Retire el matraz de Erlenmeyer y limpie la unidad destiladora enjuagando la cmara de ebullicin varias veces con agua destilada. Cada vez que se aada agua destilada hasta llenar la copita superior de la unidad destiladora para el enjuague deje que sta hierva primero. Luego abra la llave de la parte que permite salir las muestras hacia fuera de la unidad destiladora. Una vez vaca la parte en donde se procesa la muestra asegrese de que est bien vaca. Si queda todava un poco de agua en el fondo permita que hierva para que se vaya toda hacia esa segunda parte de la unidad destiladora. El matraz estar listo para recibir la segunda cantidad de agua destilada para lavar la unidad destiladora. Esta operacin se repite al menos unas 4 veces. NOTA: La llavecita de la segunda parte de la unidad destiladora (que conduce la muestra procesada hacia el vasito permanece cerrada (en posicin horizontal) durante el procesamiento de la muestra. Slo se abre cuando se enjuaga el destilador. TITULACIN 15.- Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta indica el punto final de la titulacin. Comprese este color con el del blanco. Cada equivalente del HCl usado corresponde a un equivalente de NH3 o a un equivalente de N en la muestra original. El peso del N en mg est dado por miliequivalentes del cido X 14 (el peso equivalente del N). RECUPERACIN DEL AMONACO Una posible fuente de variacin en este mtodo es la prdida del gas amonaco o una falla en atrapar el amonaco en el cido brico. Esto puede ocurrir en diferentes pasos del proceso. Una tcnica para buscar la recuperacin del amonaco consiste en destilar cantidades conocidas de amonaco lquido y titularlo con HCl. Se obtendr otra vez el color prpura en

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el cido brico. Mientras se digieren las muestras, se puede destilar una solucin de sulfato de amonio. Aada 5, 10 15 ml (mediante una pipeta) de solucin de sulfato de amonio a la cmara de ebullicin de la unidad destiladora. Enjuguela despus con agua destilada y, si es posible, desionizada. Coloque inmediatamente la punta de la unidad destiladora en 10 ml de cido brico + indicador. Colecte aproximadamente 20 ml. de destilado. Titule la muestra con el HCl estandarizado, registre los ml. de HCl empleados y calcule el peso del nitrgeno en el (NH4)2SO4.

Clculos Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra

% N = NHCl x Volumen de cido corregido x 14 g N x 100

g de muestra mol

en donde: NHCl = Normalidad del HCl en moles/1000ml. Volumen del cido corregido = (ml. del cido estandarizado para la muestra) - (ml. de cido estandarizado para el blanco). 14 = Peso atmico del nitrgeno. Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N a porciento de protena cruda. El porcentaje de N en protena para el harina de trigo es de 18% y su factor de conversin es de 5.70. BIBLIOGRAFA A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists. Methods of Analysis. Washington, D.C. Official

Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed. Jones and Bartlett Publishers. U.S.A. pp 209-212. Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products. Ed. McGraw-Hill Publishing Co. Ltd. New Delhi.

Yeshajahu P. y Meloan C.E. 1987. Food Analysis. Theory and Practice. 2. Ed. AVI U.S.A. pp 753-758.