INSTITUTO SUPERIOR DE CINCIAS DA SADE EGAS MONIZ CURSO DE CINCIAS FORENSES E CRIMINAIS ENTOMOTOXICOLOGIA 6 Semestre 2010/2011

Marta A. Marques Lopes

INSTITUTO SUPERIOR DE CINCIAS DA SADE EGAS MONIZ CURSO DE CINCIAS FORENSES E CRIMINAIS

MONOGRAFIA

ENTOMOTOXICOLOGIA Um novo paradigma nas Cincias Forenses

Little Fly, Thy summer's play My thoughtless hand Has brushed away. Am not I A fly like thee? Or art not thou A man like me? For I dance And drink, and sing, Till some blind hand Shall brush my wing. If thought is life And strength and breath And the want Of thought is death; Then am I A happy fly, If I live, Or if I die.

William Blake

Marta A. Marques Lopes

MONTE DA CAPARICA 2010/2011

MARTA A. MARQUES LOPES

Entomotoxicologia Um novo paradigma nas Cincias Forenses

Trabalho monogrfico da Licenciatura de Cincias Forenses e Criminais do Instituto Superior de Cincias da Sade Egas Moniz, como requisito concluso da licenciatura. Avaliador:

AUTOR:

Marta A. Marques Lopes Aluno n107806

Monte da Caparica, 26 Abril 2011

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RESUMO

Entomotoxicologia Um novo paradigma nas Cincias Forenses

O presente estudo prope-se a constitui uma sistematizao dos princpios bsicos da Entomotoxicologia, como uma disciplina hbrida da Entomologia e Toxicologia, onde a sinergia de conhecimentos de duas rea diferentes pode, em casos de soluo difcil no contexto forense, oferecer um til instrumento de constituio ou corroborao de prova.

Palvras-Chave: Entomologia, Toxicologia, Artrpodes, Substncias, Medicamentos

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Captulo 5 do livro chins de Sung Tzu sobre medicina forense, relatando a soluo do caso de apunhalamento atravs du uso das moscas: as moscas adultas haviam denunciado a presena de sangue na foice do assassino (Fonte: M. Benecke, 1998 in M. Benecke, 2001) Figura 2 Calliphora vicina (Fonte: http://diptera.info/forum/viewthread.php?thread_id=36645) Figura 3 Calliphora vomitoria (Fonte: http://diptera.info/photogallery.php?photo_id=6393) Figura 4 Lucilia sericata (Fonte: http://diptera.info/photogallery.php?photo_id=3408)

LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Lista de susbtncias txicas detectadas nas diferentes fases de desenvolvimento dos insectos (Fonte: M. Gosselin, et al., 2011) Tabela 2 - Comparao da preparao da amostra e procedimentos analticos para cada substncia txica (Fonte: M. Gosselin, et al., 2011)

LISTA DE ABREVIATURAS
ADN cido desoxirribonucleico CL Chemiluminescence (Quemiluminescncia) DAD Diode Array Detector (Detector de Diodo) ECD Electron Capture Detection (Deteco de Captura de Electres) EIA Enzyme Immunoassay (Imunoensaio enzimtico) FID Flame Ionization Detector (Detector de Ionizao de Chama) FPIA Fluorescence Polarisation Imunoassay (Fluorimunoensaio de Polarizao) GC Gas Chromatography (Cromatografia Gasosa) HPLC High Performance Liquid Cromatography (Cromatografia lquida de alta performance) HS Headspace ICP Inductively Coupled Plasma (Plasma de Acoplamento Indutivo) LC Liquid Chromatography (Cromatografia Lquida) LLE Liquid-Liquid Extraction (Extraco Lquido-Lquido) MS Mass Spectrometry (Espectrometria de Massa) MS/MS Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry (Espectrometria de Massa/ Espectrometria de Massa) NPH Nitrogen-Phosphorous Detection (Detector de Nitrognio Fsforo) PMI Post-mortem Interval (Intervalo morte) RIA Radioimuunoassay (Radioimunoensaio) SLE Suported Liquid Extraction (Extrao Slido-Lquido) SPE Solid Phase Extraction (extraco em fase slida) UV Ultraviolet (Ultravioleta)

NDICE 1 NOTA INTRODUTRIA.......................................................................................... 8 2 HISTRIA DA ENTOMOLOGIA E DA ENTOMOTOXICOLOGIA....................... 9 3 FUTURO E POTENCIALIDADES DA ENTOMOLOGIA E ENTOMOTOXICOLOGIA ............................................................................... 14 4 COMPONENTE ENTOMOLGICA ...................................................................... 16 4.1 Espcies entomolgicas com interesse forense ............................................. 16 4.2 Abordagem cena de crime ......................................................................... 19 4.3 Recolha de amostras e espcimes ................................................................. 21 4.4 Processamento das amostras......................................................................... 26 4.5 Preparao e Identificao dos insectos ........................................................ 28 4.6 Clculo do PMI (Post-mortem interval)........................................................ 29 4.7 Influncia das condies externas................................................................. 30 5 COMPONENTE TOXICOLGICA ........................................................................ 31 5.1 Potencialidades da Entomotoxicologia ......................................................... 31 5.2 Espcies e estdios de interesse entomotoxicolgico .................................... 32 5.3 Substncias-alvo de pesquisa entomotoxicolgica ........................................ 33 5.4 Sampling/amostragem .................................................................................. 33 5.5 Processamento analtico ............................................................................... 36 5.6 Limitaes e factores de erro........................................................................ 38 5.7 A influncia das substncias no ciclo de vida dos Dpteros........................... 39 6 CONSIDERAES FINAIS ................................................................................... 40 BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................ 41 ANEXOS

1 NOTA INTRODUTRIA Uma investigao legal exige esforos combinados e cooperao de peritos de diferentes reas: peritos de cena de crime, patologistas, antropologistas, entomlogos e profissionais de apoio. Cada um destes profissionais desempenha um papel crucial em cada processo de investigao. Todavia, quase sempre nem todas as especialidades esto representadas. Algumas so envolvidas a posteriori, no decurso da investigao e na medida das necessidades dos procedimentos mdico-legais e natureza dos casos. Na maioria das jurisdies mdico-legais o patologista forense a autoridade legal na tutela do cadver. As suas funes principais so o exame ao hbito interno e externo, deteco/anlise de potenciais leses ante-mortem, alteraes post-mortem bem como recolha de evidncias no que ao cadver diz respeito. Ele determinar, assim, a forma, o momento e a causa de cada caso de morte decorrente de violncia, decorrente de circunstncias suspeitas ou desconhecidas, ou morte repentina ou no assistida, explicando e defendendo as razes do seu diagnstico em sede de tribunal. Quando h insectos associados ao cadver descoberto, amostras de espcimes devem ser recolhidas semelhana de evidncias biolgicas. A importncia dos insectos da decomposio est bem estabelecida mas o treino e experincia dos patologistas mdicos no os prepara inteiramente para a recolha de toda a informao necessria que os artrpodes oferecem. A literatura revela que nas ltimas 3 dcadas que a contribuio da Entomologia nas investigaes mdico-criminais se encontra perfeitamente documentada e que os casos so fascinantes pelas aplicaes desta disciplina investigao. As tcnicas utilizadas actualmente na Entomologia Forense permitem aos peritos a recolha de fortes evidncias e informao extremamente til na investigao da morte, do tempo morte, estao do ano em que ocorreu a morte, localizao geogrfica da consumao do crime, movimento ou deslocao dos restos, altura de leses, intervalo de submerso, locais especficos de trauma corporal, artefactos post-mortem no corpo e na cena de crime, negligncia, abuso sexual, identificao de suspeitos e uso de drogas. no mbito do uso dos conhecimentos entomolgicos determinao do uso de drogas ou de morte por abuso de drogas que surge uma disciplina hbrida A Entomotoxicologia.

Esta define-se, assim, como a aplicao da anlise toxicolgica de insectos que se alimentam de matria orgnica de forma a identificar a presena de drogas e toxinas nos tecidos contaminados. Esta disciplina estuda igualmente os efeitos que estas substncias causam no desenvolvimento dos artrpodes de forma a auxiliar o clculo do PMI (Postmortem interval). O aumento de mortes relacionadas com o abuso de drogas (como sejam a cocana e herona) ou mortes de alguma forma relacionadas com o consumo acidental ou deliberado de substncias txicas e venenosas justifica o interesse crescente da Entomotoxicologia como especialidade forense emergente. Em corpos esqueletizados ou em avanado estado de decomposio, onde as fontes convencionais de amostras biolgicas, como sangue, urina, rgos internos, no se encontram disponveis, os insectos colonizadores podem ser uma boa alternativa de fontes de amostras para anlise toxicolgica. Todavia, como se ver adiante, a par com as enormes potencialidades da Entomotoxicologia, existem diversas limitaes que tm merecido a cautela dos investigadores da rea. Estas dizem particularmente respeito interpretao da correspondncia das concentraes de droga nos insectos e nos restos humanos. Adicionalmente, a falta de conhecimento da farmacocintica das drogas nos insectos, a enorme variabilidade entre modelos experimentais e tcnicas analticas parece comprometer a utilidade desta especialidade. A maioria dos autores , no obstante, consensual na mais-valia que a Entomotoxicologia representar no futuro, ultrapassadas as dificuldades de estudo da farmacocintica das substncias nos artrpodes, no efeito daquelas no desenvolvimento das espcies de interesse forense e aps a definio de protocolos rigorosos de actuao nas vrias fases da investigao (colheita, descontaminao, processamento e preparao das amostras e procedimento analtico), bem como na sua validao. 2 HISTRIA DA ENTOMOLOGIA E DA ENTOMOTOXICOLOGIA Centenas de espcies de artrpodes so atradas pelos cadveres, primeiro as moscas (dpteros), besouros (colepteros), e as suas larvas, bem como caros e nemtodos. Estes animais alimentam-se, vivem e procriam em e sobre o cadver, dependendo das sua preferncias biolgicas e do estado de decomposio.

Uma vez que os artrpodes so, de longe, o grupo biolgicos mais importante na Terra (cujo diversidade ultrapassa as plantas), eles podem ser encontrados numa imensa variedade de locais, incluindo as cenas de crime. Este facto abre um imenso leque de aplicaes para a entomologia forense, a investigao dos insectos e outros artrpodes recolhidos dos cadveres e das cenas de crime (M. Benecke, 2001). O primeiro caso de entomologia forense documentado informado pelo advogado chins e investigador Sung Tzu no sculo XXII no livro de texto mdico-legal "Hsi yan chi lu" (uma traduo possvel ser "Limpando os erros"). Este autor descreve o caso de um cadver apunhalado, perto de um campo de arroz. Um dia depois do assassinato, o investigador disse para todos os trabalhadores que colocassem as suas ferramentas (foices) no cho. Traos invisveis de sangue trouxeram varejeiras a uma nica foice. Ento inquirido, o dono da ferramenta confessou o seu crime e "bateu a cabea dele no cho".

Figura 1 Captulo 5 do livro chins de Sung Tzu sobre medicina forense, relatando a soluo do caso de apunhalamento atravs du uso das moscas: as moscas adultas haviam denunciado a presena de sangue na foice do assassino (Fonte: M. Benecke, 1998 in M. Benecke, 2001)

Leclercq e Lambert (1976) confirmaram a preferncia de certas varejeiras por sangue: encontraram Calliphora vomitoria num cadver, 6 horas depois da morte, fazendo a oviposio no sangue, mas no nas feridas, do cadver. Dois sculos antes, em 1767, o bilogo Carl Von Linn afirmou que trs moscas destruiriam um cavalo to rpido quanto um leo o faria (no sentido de estas produzirem uma grande massa de larvas). Durante exumaes, em Frana e na Alemanha, nos sculos 18 e 19, peritos mdicos observaram que os corpos enterrados estavam habitados por artrpodes de muitos tipos, mas foi em 1831, que o mdico francs Orfila, observando inmeras exumaes
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compreendeu que as larvas representam um papel importante na decomposio dos corpos. O primeiro relatrio moderno de um caso de entomologia forense avaliando um intervalo post-mortem (PMI) foi feito pelo mdico francs Bergeret em 1855. O caso tratava de uma pupa de mosca varejeira e larvas de traas. No seu trabalho Bergeret faz uma breve avaliao geral no ciclo de vida dos insectos. Entretanto ele assume, equivocadamente, que aquela metamorfose geralmente requereria um ano (une anne entire). Alm disso, assume igualmente que as fmeas geralmente fariam a deposio dos ovos no Vero e que as larvas se transformariam em pupas (a que ele chama ninfas), na primavera seguinte e emergiriam no vero. Alguns estudos seus revelaram falta de conhecimentos relativo sucesso de insectos em cadveres, sua poca. Todavia, compreenda-se que a rea de estudo de Bergeret no seria a Entomologia Forense, apenas recorrendo a esta como uma das suas vrias ferramentas de investigao forense (M. Benecke, 2001). Em 1879, o presidente da Sociedade Francesa de Medicina Forense, Paul Camille Hippolyte Brouardel descreve o caso de um recm-nascido, autopsiado por ele em 15 de Janeiro de 1878. O corpo mumificado estava habitado por vrios artrpodes, inclusiv larvas de borboleta e pequenos caros que levaram a um pedido de ajuda de Monsieur Perier, Professor do Museu de Histria Natural de Paris, e ao Veterinrio do Exrcito Pierre Mgnin. Perier informou que o corpo provavelmente estaria seco antes de ser abandonado e que, pelo estado de preservao e das larvas encontradas, declarou que a criana poderia ter nascido e morrido no Vero anterior ("de l'te dernier probablement), cerca de 6 a 7 meses antes do cadver ser autopsiado. Mgnin informou que o corpo teria sido coberto por uma camada castanha, composta por caros e fezes de caros, mas no de caros vivos. Na cavidade craniana, ele encontrou um grande nmero de uma nica espcie de caros. Considerando o nmero provvel de indivduos que calculou estarem presentes no cadver, fez uma estimativa conservadora e informou que o cadver estaria abandonado h pelo menos 5 meses (3 meses para o desenvolvimento dos caros, precedido por 2 meses para a dessecao) mas mais provavelmente 7 a 8 meses. Este caso que aquele apresenta como sendo o Caso n 12 de Mgnin no trabalho "La faune de cadavres" onde afirmou que era seu prmiere tude mdico-lgale" (primeiro estudo mdico-legal). Em 6 de abril de 1881, o mdico alemo Reinhard apresentou o primeiro estudo sistemtico em entomologia forense. Lidando com exumaes na Saxnia, recolheu,
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principalmente, moscas Forides, taxonomicamente identificadas pelo entomlogo Brauer em Viena. Descreveu igualmente a presena de besouros em sepulturas com mais de 15 anos. Em algumas situaes, chegou a observar insectos a procriarem dentro de fendas da adipocera. No entanto, acabou por concluir que presena deles podia estar mais relacionada com a alimentao de razes de plantas que penetram nas sepulturas do que por qualquer associao directa com os corpos. O seu trabalho foi reconhecido por muito tempo e em 1928 uma extensa citao deste apareceu no trabalho do perito em moscas Forides, Schmitz bem como noutros. No mesmo perodo, Jean Pierre Mgnin, comeou a desenvolver a sua teoria de ondas ecolgicas previsveis de vida de insectos em corpos. Em 1855, ele tornou-se veterinrio do exrcito. Pela sua formao militar, Mgnin denominou as diferentes colonizaes sucessivas de legies ou esquadras, comparando assim cada grupo de espcies que chegavam ao cadver, a uma tropa do exrcito. Entretanto, h quem as chame de ondas, fazendo aluso ao constante ir e vir, fluxo e refluxo, das ondas do mar (das diferentes espcies). Jean Pierre Mgnin, trabalhou com caros (publicaes neste assunto datam entre 1876 e 1879) e publicou alguns dos seus resultados no livro "Faune de Tombeaux" (Fauna das Tumbas, 1887). Deixou 15 anos de experincia mdico-legal em corpos, em 14 publicaes e vrios resumos de documentos, entre 1883 e 1896. Finalmente, em 1894, Mgnin publicou o seu livro mais importante La Faune des Cadavres onde expandiu sua teoria anterior de quatro ondas de insectos para corpos expostos, para oito ondas de sucesses. Para corpos enterrados, ele relatou apenas duas ondas. O livro focava-se em informao sobre larvas e formas adultas de vrias famlias de insectos e os seus desenhos mostravam as nervuras das asas, os espirculos posteriores e a anatomia global dos insectos de forma a possibilitar a sua identificao. Alm dos avanos que ofereceu cincia da entomologia forense, o trabalho de Mgnin popularizou grandemente o tema. As suas contribuies para o conhecimento actual sobre fauna de artrpodes em sepulturas, sobre fauna em geral e sobre a flora dos corpos mumificados ou decompostos, foi posteriormente homenageada tendo recebido um deles o nome de Endoconidium megninii. Um outro relato experimental foi fornecido por Eduard Von de Ritter Niezabitowski, tambm mdico do Instituto Mdico-Legal da Universidade de Cracvia. As suas pesquisas foram efectuadas entre Maio de 1899 e Setembro de 1900, e usaram fetos resultado de abortos de alguns animais. As suas observaes tratavam principalmente de
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moscas: Calliphoridae, Lucilia caesar, Sarcophaga carnaria e Pyophila nigriceps; bem como besouros, principalmente Silpha, Necrophorus e Dermestidae. A sua importante contribuio para este campo foi a fornecer a prova experimental de que os corpos humanos, partilham a mesma fauna que os corpos dos animais, tanto vertebrados como invertebrados. Entretanto, no virar do sculo, em Frana e Alemanha verifica-se um aumento generalizado do interesse pelos estudos zoolgicos, inclusive pela vida dos invertebrados. Como evidncia deste facto, pode ver-se o grande sucesso de duas sries de livros da poca, o de Alfred Brehm (1877), Thierleben (Vida dos Animais), e mesmo o de Jean Henri Fabre (1879-1907), Souvenirs entomologiques (Recordaes da Vida dos Insectos), entre outros tpicos que lidavam especificamente com os besouros e com as varejeiras. Estes livros, ainda populares na Europa, motivaram o interesse pela entomologia num grande nmero de pessoas. Entre os benefcios perpetuados por esta popularidade esto numerosos trabalhos que continuam a ser usados nos actuais estudos de casos forenses. No incio dos anos vinte, foram publicadas listas de espcie e monografias sobre insectos com importncia forense, com um enfoque na ecologia, metabolismo ou anatomia. Controle de pestes e "terapia com larvas" foram temas de crescente interesse durante este perodo e muitas contribuies saram deste campo criando uma importante fonte cientfica de interpretao de evidncias de insectos de interesse forense. O interesse de larvas em corpos manteve-se elevado em 1922, quando Karl Meixner, do Instituto Mdico-Legal de Viena e Innsbruck relatou casos de corpos que se desintegravam rapidamente quando armazenados na cave do Instituto. Alguns anos depois, Hermann Merkel, do Instituto Mdico-Legal de Munique, reiterou as observaes de Meixner com o relato de casos que demonstravam que as circunstncias da morte podiam influenciar o curso da sucesso dos insectos. O nico relato de caso durante os anos trinta parece ter vindo de mdico Josef Holzer, do Instituto Mdico-Legal de Innsbruck, ustria. Holzer investigou o tipo de destruio causada pelas larvas de Trichoptera, alimentando-se de corpos submersos em de gua doce. Durante os anos quarenta, apenas uma nota de Bequaert parece indicar o uso de insectos para determinar o intervalo post-mortem. Nos anos cinquenta, Hubert Caspers (1952) do Instituto de Zoologia e do Museu do Estado de Hamburgo introduziu o uso de pupas de Trichoptera como uma ferramenta de investigao forense.
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Entre a dcada de 60 e meados dos anos 80, a entomologia forense foi mantida principalmente pelo mdico belga Marcel Leclecq e pelo professor de biologia Pekka Nuorteva (primeiro no Museu de Zoologia de Helsinki e depois, professor do Departamento de Proteco Ambiental e Conservao, da Universidade de Helsinki, Finlndia), com um enfoque apenas em estudos de caso (M. Benecke, 2001). A dcada de 70 assistiu emergncia da entomotoxicologia como um novo ramo da entomologia forense. Aqui, detectou-se a presena de toxinas nos decompositores invertebrados, a qual foi usada como mtodo de determinao da causa de morte. Assim, o uso da entomotologia forense escalou da determinao do PMI apenas, para a identificao da causa de morte. Da deteco de metais, nos finais da dcada de 70 evoluiu-se para a deteco de inmeras drogas e respectivos metabolitos. Em 1980 Beyer et al. (1980), in Gupta A. et al. (2004), relataram um caso em que uma mulher foi encontrada num caso de esqueletizao inicial, a cerca de 14 dias aps a sua morte. Os autores analisaram as larvas de Cochliomyia macellaria (Fabricius) (Calliphoridae) usando GC e TLC, tendo os resultados revelado a presena de fenobarbital. Depois deste caso vrios cientistas detectaram a presena de um razovel nmero de drogas como benzodiazepinas, barbitricos, antidepressivos tricclicos e variados narcticos, etc. (a lista interminvel). O mtodo de extraco foi igualmente optimizado da GC e TLC para tcnicas como RIA, MS, HPLC, etc. Toda esta evoluo indicia que, hoje em dia, virtualmente qualquer droga pode ser detectada, mesmo em quantidades residuais tanto em larvas como em insectos adultos (Gupta A. et al., 2004) 3 FUTURO E POTENCIALIDADES DA ENTOMOLOGIA E ENTOMOTOXICOLOGIA Para se falar no futuro, torna-se imperativo analisar as potencialidades dos mtodos actuais. Antes de mais, a identificao das espcies actuais, das quais no se tem o completo conhecimento. O mtodo de identificao das espcies pode mudar de, por exemplo, identificao morfolgica para anlise de ADN. Com a identificao das espcies dever ser efectuada a identificao das espcies associadas aos vrios ecossistemas. Esta pesquisa dever ser levada a cabo nessa rea particular onde se encontram as espcies. Em considerao dever ser tida, para alm da rea geogrfica, a altura do dia
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e a estao do ano, etc. Dever ponderar-se todos estes factores na conduo de qualquer pesquisa nesta rea de estudo. (Gupta A. et al., 2004) Duas situaes paradigmticas da influncia destes factores so, por exemplo, as circunstncias em que se encontra um cadver num carro, onde o carro pode ser tomado, em si, como um ecossistema particular, j que o nmero de pontos de entrada no carro limitado, sendo, por vezes, mesmo inexistentes. Como resultado no sabemos que espcies conseguem entrar neste ecossistema consideravelmente fechado, nem ao fim de quanto tempo o fazem. Um outro caso so as espcies presentes em casos de cadveres encontrados em gua, de lagos, rios, mar, etc. Nestes casos extremamente difcil calcular o tempo morte j que o corpo se encontra em decomposio para l do possvel reconhecimento. O entomlogo pode, ento, aqui dar uma valiosa ajuda. (Gupta A. et al., 2004) Relativamente Entomotoxicologia, a rea objecto deste trabalho, apesar de nesta terem sido feitos recentemente progressos considerveis, h ainda um longo caminho a percorrer. Esta cincia, no obstante a sua utilidade, ainda no se desenvolveu ao ponto de poder ser utilizada na prtica de rotina. (Gupta A. et al., 2004) A Entomologia pode igualmente ser usada para identificao. Tal pode ser feito por extraco do DNA do cadver dos artrpodes colonizadores. Quando os insectos se alimentam dos restos humanos, eles esto a ingerir clulas humanas. Estas, por sua vez, podero fornecer quantidade necessria para uma amostra. E se aqui podemos dizer que havendo DNA humano presente no insecto ele estar presente nos restos humanos, j em cadveres carbonizados parece acreditar-se ser possvel conseguir DNA humano de larvas colonizadoras mesmo o teste directo sobre os tecidos dos restos poder dar um resultado negativo. (Gupta A. et al., 2004) Outros autores, (JA DiZinno et al., 2002), tm trabalho desenvolvido na utilizao de DNA mitocondrial para determinar a coincidncia com o DNA encontrado no sangue presente no tracto digestivo do insecto com o encontrado no osso do cadver. Este tipo de tcnicas pode ser til em casos de cadveres em avanado estado de composio. 4 COMPONENTE ENTOMOLGICA A mais importante aplicao da evidncia entomolgica nas Cincias Forenses a estimativa do tempo morte, isto , do intervalo de decomposio.

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Aplicaes adicionais como a determinao do local de morte ou a deteco de trauma ante-mortem. 4.1 Espcies entomolgicas com interesse forense As moscas como as das famlias Calliphoridae, Sarcophagidae e Muscidae so as espcies mais comuns. Estes so altamente mveis, voadores robustos e so, portanto, as primeiras a chegar ao cadver, to cedo quanto alguns minutos logo aps a morte. Os indivduos adultos iniciam imediatamente a oviposio (deposio de ovos), a larviposio (deposio larvares de 1 nstar) ou alimentao de vrios fluidos ricos em protenas que se libertam do cadver continuando depois a oviposio (ML Goff et al, 1994). Apesar da importncia forense de cada espcie estar, em grande medida dependente da localizao, abordar-se-o as espcies mais comuns na Europa. 4.1.1. Calliphoridae As espcies Calliphora vicina (Robineau-Desvoidy, 1830), Calliphora vomitora (Linnaeus, 1758) e Lucilia sericata (Meigen, 1826) so alguns dos colonizadores iniciais mais comuns (Gennard, 2007). O mesmo referido por Prado e Castro, C. (2009), as espcies acima so frequentes colonizadores sarcosaprfagos em Portugal, continental e ilhas. 4.1.1.1. Calliphora vicina (Robineau-Desvoidy, 1830) Reino Animalia Filo Arthropoda Classe Insecta Ordem Diptera Famlia Calliphoridae Gnero Calliphora Trata-se de um espcimen grande, com cerca de 9-11 mm de comprimento. O espirculo torcico frontal laranja, Smith (1986) em Gennard (2007). O topo superior da cabea preto e a metade frontal da boca de um laranja avermelhado. A face inferior da face preta. Possui plos pretos na mandbula, independentemente da cor que esta possa ter. O trax preto e o topo do trax (dorso) est coberto por um
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brilho acinzentado (pubescncia). Possui um par de fortes cerdas enfiladas no centro do trax. Estas so chamadas de cerdas acrsticas. Como acontece com outras espcies de moscas, esta espcie possui tambm uma espcie de ventoinha de cerdas, as cerdas hipopleurais, na parte acima da coxa da cada perna posterior, prximo do espirculo posterior. O abdmen azulado com um efeito prateado e axadrezado. A basicosta na asa de um tom amarelado, apesar de poder assumir tonalidades tendentes para amarelo-acastanhado (Gennard, 2007).

Figura 2 Calliphora vicina (Fonte: http://diptera.info/forum/viewthread.php?thread_id=36645)

4.1.1.2 Calliphora vomitoria (Linnaeus, 1758) Reino Animalia Filo Arthropoda Classe Insecta Ordem Diptera Famlia Calliphoridae Gnero Calliphora Estas so igualmente moscas grandes e azuladas. Esta espcie possui um ciclo de vida mais longo que a anteriormente descrita e encontrada mais frequentemente em zonas rurais. Os plos na mandbula e a cor da basicosta ajudam a identificar a Calliphora vomitoria. A basicosta negra (por oposio ao laranja observado na Calliphora vicina) e os plos na base da mandbula e em redor da margem da boca so alaranjados. O espirculo frontal (anterior) do trax acastanhado. Quando ambas, Calliphora vicina e Calliphora vomitoria, so observadas juntas no 3 instar larvar, elas podem ser separadas, segundo Smith (1986) em Gennard (2007) pela
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largura dos seus espirculos posteriores. O autor indica que na Calliphora vicina os espirculos medem 0.23-.028 mm de largura. Os espirculos desta espcie so menores que os da Calliphora vomitoria e esto separados pela mesma, ou maior, distncia de largura de um nico espirculo. Na Calliphora vomitoria os espirculos so de maiores dimenses, com cerca de 0.33-0.38 mm. Os seus espirculos so separados por uma distncia menor que o dimetro de um espirculo individual.

Figura 3 Calliphora vomitoria (Fonte: http://diptera.info/photogallery.php?photo_id=6393)

4.1.1.3 Lucilia sericata (Meigen, 1826) Reino Animalia Filo Arthropoda Classe Insecta Ordem Diptera Famlia Calliphoridae Gnero Lucilia Esta mosca comummente chamada de varejeira verde-garrafa porque todas as moscas deste gnero possuem uma colorao verde metlica. Estas distinguem-se das restantes por possurem uma elevao na escama, a aba da asa traseira, a qual possui tufos de plo. A Lucilia sericata tem uma basicosta amarelada. Uma das diferenas entre a larva de Calliphora e da de Lucilia sericata que o esclirito oral no esqueleto da cabea (esqueleto cefalofarngeo) transparente e assim, aparente estar ausente na larva de Lucilia sericata. A identidade da larva de Lucilia sericata pode ser igualmente confirmada pela observao da margem do segmento posterior da larva. As protruses encontradas ao longo da margem externa do segmento so chamadas tubrculos. So designados por, do topo, o interno, mediano e externo. Se a distncia entre os dois tubrculos mais internos for a mesma que a distncia que o interior e o mediano, ento
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esta espcie pode ser identificada como Lucilia sericata. Esta particularidade caracterstica do 3 instar larvar. O investigador Erzinlioglu (1987), em Gennard (2007) observou que em redor dos espirculos posteriores, nos primeiro e segundo instares larvares, da Calliphora e da Lucilia, existe um crculo de plos. Na espcies de Calliphora estes plos so visveis debaixo de luz fraca, sendo bem desenvolvidos na Calliphora vomitoria, mas no so facilmente visveis nas espcie de Lucilia.

Figura 3 Lucilia sericata (Fonte: http://diptera.info/photogallery.php?photo_id=3408)

4.2 Abordagem cena de crime A entomologia forense comea na cena do crime, ou local de recolha. Muitos dos artrpodes associados fauna geral de decompositores no se encontram nos restos mas esto distribudos em redor destes, ou mesmo habitando o solo debaixo dos restos. Se as colheitas entomolgicas forem efectuadas uma vez removidos os restos do local existe uma forte possibilidade que parte da fauna artrpode no ser documentada e recolhida. Este facto pode, ou no, ter um impacto negativo na subsequente anlise. De qualquer forma, resulta num deficit de evidncias recolhidas e, portanto, os procedimentos standard devero ser a documentao e recolha das evidncias entomotoxicolgicas in situ. Os elementos determinantes para a utilizao dos artrpodes como indicadores forenses so a adequada identificao, documentao, colheita e transporte de evidncias oriundas de restos humanos ou animais. Para uma maximizao da recolha de evidncias, esta tarefa deve ser levada a cabo ainda na cena do crime ou no local de presena do cadver. Todavia, devido ao facto de, em alguns casos, as maiores reas de
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alimentao dos artrpodes serem internas, algumas colheitas devero ser efectuadas na morgue, antes ou durante a autpsia. Existem uma infinidade de circunstncias e contextos de recuperao de restos humanos. Genericamente estes ambientes podem ser classificados em terrestres (incluindo subterrneos), aquticos e marinhos. Os insectos e outros artrpodes podem ser recolhidos de restos humanos ou animais encontrados em qualquer um destes ambientes. Quando consideramos o aspecto concreto de ambientes artificiais criados pelo homem em reas como residenciais (moradias, apartamentos), edifcios abandonados, carros, contentores selados e aterros, a cincia entomolgica ganha outra complexidade. A interpretao de actividade de artrpodes em ambientes mais naturais como florestas, regies montanhosas, desertos, regies pantanosas, riachos, lagos, valas ou campos agrcolas poder ser mais directa, mas cada ambiente apresenta o seu prprio conjunto de caractersticas nicas que devem ser tidas em considerao (Byrd & Castoser, 2009). pouco provvel que um entomlogo forense qualificado esteja sempre presente no local para a colheita e identificao das actividades. Por este motivo, absolutamente essencial que o investigador de cena de crime ou mdico legista esto bem formados e familiarizados com os vrios aspectos da documentao e colheita entomolgicas. Se um entomlogo forense estiver presente na cena, ele dever ser o primeiro perito a aproximar-se dos restos para uma avaliao inicial e documentao fotogrfica. fundamental que os restos no sejam perturbados antes da colheita de evidncias entomolgicas, que o acesso esteja limitado a alguns indivduos pois a actividade humana pode impactar tanto a presena de artrpodes voadores ou rastejantes nos restos e reas circundantes. De importncia crtica para a utilizao de evidncias entomolgicas em investigao criminal a criao de uma descrio ou esquema detalhado da rea fsica envolvente. Esta descrio deve incluir notas escritas, fotografias de detalhe da cena e das reas circundantes. Esta documentao parte da avaliao inicial que dever ser efectuado para cada investigao em que sejam recolhidas evidncias entomolgicas. Se presente na cena, o entomlogo forense dever trabalhar como um elemento da equipa de investigao. Como tal, este deve ser informado dos corredores de acesso ao corpo, e informado acerca das evidncias fsicas ainda in situ, o que foi recolhido e o que no deve ser perturbado.

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O processo de colheita entomolgica pode ser, de certa forma, intrusivo, dependendo da localizao dos insectos e da extenso de colheita. Em algumas circunstncias, a colheita pode resultar numa ligeira e inevitvel perturbao dos restos. Por este motivo, manda a boa prtica obter permisso do gestor da cena de crime ou do mdico legista, quem possuir jurisdio sobre a cena, para entrar e recolher evidncias dos restos (Byrd & Castoser, 2009). 4.3 Recolha de amostras e espcimes A forma mais eficiente de responder a uma chamada para assistir numa cena de crime possuir de antemo um kit preparado contendo todo o material e requisitos para a colheita de espcimes entomolgicos (Gennard, 2007). A recolha de evidncias entomolgicas na cena de crime, especialmente do corpo, requer a utilizao de equipamento protector, maioritariamente para evitar a contaminao da cena com fibras ou outro material introduzido pelo investigador. Em particular, fortemente recomendado que os entomlogos forenses usem luvas e overshoes (Amendt et al., 2006). O equipamento necessrio inclui recipientes de amostragem de plstico ou policarbonato com tampa de rosca, para espcimes vivos e fixados, pinas, plataformas de pisar para evitar a contaminao da cena, um frasco para abate contento etilacetato, etiquetas, marcadores indelveis de pontas finas, pinas finas, pincis, uma rede entomolgica e agentes de abate de larvas, como gua a ferver, e um conservante. Existe uma srie de conservantes disponveis, incluindo lcool 70-80% e soluo de Kahle, cada um com as suas vantagens. A soluo de Kahle contm tanto conservante como anti-fngico e pode igualmente ser usada para abater as larvas se tudo o resto falhar, apesar de tal no ser uma abordagem recomendada pois trata-se de um conservante para os adultos mortos. As larvas devem ser abatidas usando gua a ferver ou quase a ferver durante 30 segundos, de forma a fix-las no seu mximo comprimento. A gua pode ser levada para o local de crime no termus ou aquecida num pequeno fogo de campismo. Uma vez que ser necessrio recolher espcimes vivos do local, torna-se necessrio levar algum alimento. Carne moda ou fgado de porco so boas alternativas. Estas devem encontrar-se temperatura ambiente, e no devem estar refrigeradas nem congeladas, quando as larvas so colocadas sobre estas. Para a viagem at ao laboratrio
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a temperatura deve estar a mais baixa possvel e idealmente abaixo da temperatura basal dos espcimes. Um frigorfico de carro ou uma mala trmica com termoacumuladores frios ser o ideal. Dever igualmente ser colocado um termmetro para verificar a temperatura durante o transporte. Estes termmetros devem estar calibrados de forma a conseguirem-se leituras correctas. Por uma questo de segurana no deve ser usado um termmetro digital, sendo prefervel um termmetro de lcool em vez de um de mercrio. Caixas para transporte dos espcimes devem ser includas. Os recipientes de amostras vivas e fixadas devem ser embalados/transportados juntos em pares. O habitat geral da cena deve ser registado. Este registo deve incluir eventuais referncias a cobertura ou embrulho do corpo; ambiente interior, se as janelas estavam abertas ou fechadas; o tipo de solo onde o corpo foi encontrado; a natureza de qualquer vegetao e uma descrio geral do local, com registos fotogrficos. Deve ser igualmente registada a temperatura, bem como o grau de luz/sombra da cena. Se possvel, deve ser levado para o local, uma estao meteorolgica porttil, de forma a conseguir leituras contnuas de temperatura, intensidade de luz, humidade e direco e velocidade do vento. A informao mnima dever ser a temperatura e humidade (Gennard, 2007). Amendt et al (2006) recomendam que para espcies encontradas mortas, independentemente de se tratarem de adultos ou imaturos, estas sejam conservadas em etanol 7095%. A escolha justificada por motivos de conservao, j que os tecidos geralmente encontram-se por si s mal preservados, mas tambm e por questes de sade e segurana. Os autores no recomendam o uso de formalina ou formaldedo (Amendt et al., 2006). A recolha de espcies vivas, exigem, por sua vez, procedimentos diferentes em funo da fase de desenvolvimento do artrpode. 4.3.1 Recolha de ovos O corpo de cadver dever ser investigado seguindo uma ordem. Assim, a regio da cabea dever ser examinada primeiro, depois o tronco, em direco aos membros que so separados e revistados. Quaisquer leses devem ser detectadas. Assim que um dos lados for verificado, o corpo dever ser virado para se inspeccionar o lado oposto. A roupa dever ser escrupulosamente revista no local. Em particular os bolsos, mangas e
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dobras. Uma inspeco mais pormenorizada ser possvel na morgue quando as roupas forem retiradas. Os ovos das moscas so depositados em lotes e podem ser facilmente confundidos com lama amarelada ou p; j os ovos dos besouros so frequentemente depositados individualmente, podendo, por isso, facilmente perdidos ou no identificados. Os ovos das moscas so frequentemente depositados no escuro ou quase escuro, orifcios hmidos como ouvidos, nariz, pestanas, boca ou genitais. Eles podem igualmente ser depositados nas pregas de pele por detrs das orelhas ou na roupa que absorveu exsudado. assim importante, que todas as partes do cadver sejam inspeccionadas, sendo eventualmente importante estar presente na autpsia para recolhas adicionais, se o corpo estava vestido ou embrulhado (Gennard, 2007). Os ovos devem, ento, ser colocados em tecido ou papel humedecido e dentro de frascos. Estes devem permitir a entrada de ar mas evitar a fuga das larvas recolhidas. As amostras devero ser, nas 24 horas seguintes, entregues a um perito para a sua cultura. Se tal no for possvel, devem ser abatidas e preservadas em etanol 7095% (Amendt et al., 2006). 4.3.2 Recolha de larvas As larvas sero encontradas no corpo quando se procurarem os ovos. Ambos tendem a localizar-se em orifcios como os olhos, ouvidos, nariz, etc., incluindo leses. As larvas devero ser colhidas de cada local em lotes de 20-30 por frasco, para que no se gere calor ou amnia durante o transporte. Poder ser necessrio mais que um frasco por local infestado. O primeiro nstar o menor e mais vulnervel das trs fases larvares e a larvas, se recolhidas nesta fase, podero morrer com relativa facilidade. necessrio, portanto, proteg-las da secura durante a colheita de um cadver. Sabe-se que as larvas, quando atingem o fim do 2 e o 3 instar, agregam-se. Estas massas de larvas so capazes de elevar a temperatura acima da temperatura ambiente e o calor extra produzido pode, por isso, influenciar o seu ndice de desenvolvimento. Se for observada a formao da massa larvar, esta dever ser fotografada e a temperatura da massa medida, antes da colheita do local de infestao. A temperatura de massas larvares dever ser registada para cada parte do corpo onde for observada, de forma a ser tida em considerao no clculo da histria trmica da cena de crime (Gennard, 2007).
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Se possvel, deve armazenar-se a maioria dos indivduos de cada amostra em frascos sujeitos a condies controladas (i.e. temperatura e humidade conhecidas); as temperaturas de frio positivo so as mais adequadas (2-6C). Os frascos devem permitir a entrada de ar mas evitar a sada das larvas. Eles devem ser leno de papel para absorver os fluidos produzidos pelas larvas. As amostras vivas devem ser transferidas para um perito para desenvolvimento num perodo de 24 horas. Os restantes espcimes devem ser abatidos com gua muito quente (>80C), sendo que uma imerso durante 30 segundos o ideal para conseguir uma boa preservao. Posteriormente, a gua deve ser descartada e as larvas lavadas com uma passagem de etanol antes de serem armazenadas num frasco com etanol a 70-95%. Todos os procedimentos devem ser realizados o mais rapidamente possvel aps a colheita e com todos os tempos registados. Se no houver gua quente disponvel no local, as larvas devem ser mortas o mais rapidamente possvel no laboratrio, ou o uso de gua quente pode ser substitudo pela criopreservao das larvas (preferencialmente a -20 C) por 1 h. No se devem inserir directamente larvas vivas em etanol porque elas iro escurecer em alguns dias, devido ao fenmeno de putrefao, e iro igualmente encolher. O encolhimento vai dificultar a estimativa do comprimento real podendo igualmente ocultar alguns caracteres morfolgicos. Assim, Amendt et al. (2006) recomendam que todas as amostras sejam abatidas quando a utilizao dos insectos para o inqurito ambgua no momento da recolha e/ou o seu desenvolvimento impossvel (Amendt et al., 2006). 4.3.3 Recolha das pupas As pupas de mosca so usualmente encontradas a alguma distncia do corpo. O 3 nstar post-feeding migra e pode, assim, ser encontrado no solo 3-5 cm abaixo da superfcie, em bolsos, debaixo de tapetes, em camas de folhagem e em qualquer recanto de edifcios. Se as pupas estiverem ainda no corpo significa que poder ter havido alguma restrio sua migrao ou poder tratar-se de uma espcie particular de insecto. As pupas mudam, ao longo do tempo, de uma colorao branca para acastanhada, por isso todas as pupas, independentemente da cor devero ser recolhidas. Para tal deve proceder-se a uma busca organizada. O ideal procurar numa moldura de 1 m de para l de uma rea 36 m2 em redor do corpo, se este no se encontrar numa casa. Esta tarefa lenta e morosa, na qual devero ser recolhidas amostras de solo nas arestas da moldura,
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usando uma esptula a uma profundidade de 10 cm. Poder ser necessrio crivar ou peneirar o solo, ou inspeccion-lo manualmente. Como indicado, as pupas recuperadas devem ser colocadas em contentores com papel humedecido e devidamente rotulados. As pupas no requerem alimento mas devero ser encaminhadas para o laboratrio para identificao. Devero ser cultivadas at emergncia para que a sua identificao seja, ento, confirmada. O puprio deve ser guardado como evidncia adicional (Gennard, 2007). Sempre que possvel, as pupas devem ser transferidas, para desenvolvimento, em 24 horas; de outra forma, cada amostra dever ser armazenada em frascos sob condies controladas (2-6C). As tampas dos frascos devem ser perfuradas com pequenos orifcios para permitir a entrada de ar (Amendt et al., 2006). 4.3.4 Recolha dos adultos Os insectos voadores presentes na cena de crime devero ser recolhidos com o auxlio de uma rede, antes da colheita manual de qualquer espcie no corpo. Isto porque eles so mais facilmente capturveis com uma rede e podem desaparecer se perturbados. Estes insectos podem ser mantidos em recipientes de abate individuais, ou podem ser colocados at morte, num nico recipiente. Uma vez que os insectos so mveis, estes so representativos da cena de crime como um todo. Em qualquer dos casos, rotulagem inequvoca e registo so imperativos. Se a cena de crime for um carro, podem obter-se evidncias relevantes recolhendo insectos que possam ter ficado aprisionados na grelha do radiador, capot ou pra-brisas. Tal pode fornecer informao sobre eventual movimento do corpo. As temperaturas no interior do carro podem ser importantes, j que possvel que no interior da viatura estas estejam elevadas, afectando assim a velocidade de desenvolvimento de insectos que tenham, eventualmente entrado para a viatura e depositado ovos. Os adultos vivos devem ser abatidos, colocando-os num frasco, sendo este ento colocado num congelador (idealmente a -20C) por 1 h, seguindo-se o armazenamento dos espcimes mortos em etanol a 70-95%. No que respeita recolha de adultos rastejantes, insectos como besouros, que so visveis na superfcie do corpo, podem ser recolhidos manualmente e colocados em recipientes individuais devidamente rotulados. Tal feito por precauo uma vez que os besouros so predadores de outros insectos, podendo assim destruir outras espcies25

evidncia. Em cenas de crime de interior, os cantos e recantos das salas devem ser inspeccionados. As folhagens que servem de cama ou cobertura ao cadver, bem como terra usada para cobrir o corpo, numa cena de exterior, podem ser recolhidas a intervalos regulares, crivados ou inspeccionados manualmente. Podem tambm ser usadas armadilhas para recolha de rastejantes junto ao corpo (Gennard, 2007). Se existirem condies de instalaes para fixao por pins de espcimes adultos, ento tal dever ser efectuado adicionalmente, j que muitas vezes facilita a identificao. Os adultos que emergiram recentemente do puprio devero apenas ser abatidos aps o completo endurecimento das asas e o desenvolvimento da colorao (aps cerca de 6 horas) (Amendt et al., 2006). 4.3.5 Recolha de remanescentes Remanescentes, como a epiderme das pupas, puprios vazios ou fezes de besouros , que documentam a actividade prvia do insecto e a sua presena, deve ser armazenado, quando completamente desidratados, em condies secas em frascos ou em etanol a 7095% (Amendt et al., 2006). 4.4 Processamento das amostras fortemente recomendado o envio dos insectos-evidncia para um perito em entomologia forense que esteja familiarizado com as espcies locais e com o processamento de espcies em laboratrio. Em regra, este laboratrio dever ter procedimentos de operao que assegurem que todas as amostras e informao sejam documentadas de forma a poderem ser, mais tarde, rastreadas numa eventual auditoria (Amendt et al., 2006). 4.4.1 Chegada das amostras ao laboratrio Se as amostras no forem recolhidas por um entomlogo forense, elas devem ser devidamente documentadas, chegada, pelo menos com os seguintes elementos: 1. Quem a Autoridade instrutora/requisitante e qual foi a hora e tipo de aproximao? 2. Quando foram recebidas as amostras? 3. Como foram as amostras transportadas (e.g. correio, estafeta)?
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4. Em que condies foram recebidas as amostras (e.g. morreram algumas larvas no acondicionamento/transporte)? Haviam selos? Se sim, estavam intactos ou violados? 5. Especifique claramente toda a amostra com um nico cdigo (nmero e/ou nome); este cdigo ser a referncia do caso para o futuro e dever ser colocado em todas as amostras. 6. Todos estes parmetros e informaes devem ser mencionados no relatrio: - Etiquetar toda a caixa e frasco de armazenamento com o cdigo especfico antes de remover o selo ou abrir os contentores. - Decidir se os espcimes devero ser desenvolvidos at fase adulta. Se sim, que quantidades de espcimes sero desenvolvidos? (Amendt et al., 2006). 4.4.2. Cultura dos estdios imaturos Qualquer espcimen vivo, imaturo, que no for para abate dever ser imediatamente colocado no ambiente de cultura. Estes devem ser desenvolvidos em condies de temperatura e humidade controlada e registadas. J. Amendt et al. (2006) afirmam que o desenvolvimento deve ser idealmente efectuado com recurso a uma incubadora calibrada e certificada, em temperatura constante ou, pelo menos, mantendo uma cuidadosa documentao dos padres de temperatura usando um data logger certificado dentro da incubadora. Se uma incubadora com estas condies no estiver disponvel, recomendvel como medida mnima, desenvolver a larva temperatura ambiente, de forma a poder documentar-se a restante parte do ciclo de vida das amostras e a permitir a identificao, j que os indivduos adultos so mais facilmente identificveis que os imaturos. Deve igualmente ser assegurada uma cuidadosa documentao dos padres de temperatura recorrendo, por exemplo, ao uso de um termmetro certificado. A monitorizao do crescimento larvar dever ser efectuada de forma a assegurar o sucesso da emergncia dos adultos e a documentar as respectivas datas de mudas, pupao e incubao (Amendt et al., 2006).
4.4.3 Tratamento dos solos e camas de folhagem

Uma vez que diferentes fases do desenvolvimento evidenciam diferentes nveis de mobilidade, Amendt et al. (2006) publicam as seguintes recomendaes:
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1. Exame visual das amostras, dispondo-as numa rea especialmente preparada, como um painel na bancada. Neste procedimento procuram-se detectar pupas imveis e larvas vivas para posterior desenvolvimento. Uma peneira ou flutuao na gua podem, por vezes, ser teis na pesquisa em amostras de solo, dependendo do tipo de solo e do tipo de partculas, incluindo at as folhas da cama do cadver. 2. Se a visualizao imediata das amostras no for de todo possvel, estas devem ser armazenadas no frio (4C) para evitar a continuao do desenvolvimento dos estdios imaturos e o crescimento de fungos (Amendt et al., 2006). 4.5 Preparao e Identificao dos insectos Amendt et al. (2006) recomendam os seguintes cuidados na preparao e identificao das amostras: 1. Marcar qualquer espcimen identificado ou examinado, slide do microscpio, ou qualquer outra amostra com o cdigo do laboratrio para o caso particular e com o cdigo da ampola especfica. Esta marcao deve claramente, sem qualquer ambiguidade, identificar os indivduos que foram alvo de anlise. Este cuidado garantir que um eventual futuro perito possa identificar a amostra especfica que foi submetida a anlise em causa. 2. Se no for possvel examinar e identificar os insectos, imaturos ou adultos, de forma adequada, eles devero ser mantidos devidamente etiquetados num frasco com etanol 70-95%. 3. O armazenamento em etanol assegura que seja possvel uma posterior anlise de ADN para identificao. Tal pode ser necessrio se a identificao morfolgica no for possvel (ex: larvas de Sarcophagidae) ou quando as determinaes morfolgicas tm de ser confirmadas em situaes complexas (ex: como o caso das chamadas espcies irms, que so morfologicamente idnticas, especialmente em fases larvares precoces). Assim, procede-se identificao de espcimes imaturos (especialmente larvas) usando chaves de identificao fiveis e identificando o indivduo mais diferenciado da amostra. Para alarvas, por exemplo, registar o estdio de desenvolvimento (primeiro, segundo, terceiro, post-feeding, pr-pupa) (Amendt et al, 2006). 4.6 Clculo do PMI (Post-mortem interval)

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A investigao de qualquer morte assenta numa estimativa precisa da hora da morte ou no tempo morte, designado de intervalo post-mortem (PMI post-mortem interval). O clculo do PMI essencial na investigao de toda a morte suspeita de forma a reconstituir os eventos e circunstncias da morte, para ligar um suspeito vtima, e para estabelecer a credibilidade das declaraes da vtima. No apenas til em casos criminais mas tambm nos civis. De facto, mesmo em casos de morte natural, acidental ou suicdio, esta estimativa pode ter implicaes judicirias em situaes de seguros e heranas. Existem diferentes mtodos para estimativa do PMI. Um patologista geralmente determina-o, no perodo post-mortem precoce e com base nas alteraes dos tecidos moles como sejam o endurecimento muscular (rigor), deposio do sangue (livor), arrefecimento corporal (algor), e estados de decomposio. Todavia, frequentemente a sequncia destas alteraes podem apenas representar uma grosseira aproximao hora de morte, j que estes mtodos so, em certo grau, pouco confiveis e imprecisos. Muitos so os factores que influenciam a decomposio humana, alguns directamente associados ao cadver (ex.: idade, constituio, integridade do corpo, causa da morte) e outros associados ao ambiente (ex.: temperatura, ventilao, humidade, roupa, acesso do corpo a animais). Existem modelos matemticos e ferramentas estatsticas que conseguem integrar todas estas variveis no clculo do PMI. Utilizando apenas os mtodos de temperatura ou qumica dos fluidos corporais, alguns autores proclamam uma mxima preciso com um intervalo de confiana de 95%, mas a avaliao precisa da cronologia da morte no possvel para um perodo superior a 48-80 h depois da morte, dependendo da disponibilidade de equipamento, da natureza das circunstncias da morte e das condies ambientais. Em qualquer caso, quanto mais longo for o PMI, menos precisa ser a estimativa do intervalo. Mesmo que os mtodos tanatolgicos possam oferecer resultados precisos nos dias 1-3 do post-mortem (i.e. no post-mortem precoce), para l desse perodo, a evidncia entomolgica associada a, e em redor do corpo passa a ser muito mais importante e indicativa do tempo decorrido desde a morte at vrias semanas ou at meses (Amendt et al., 2006). 4.7 Influncia das condies externas

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A oviposio e o desenvolvimento de insectos podem ser afectados por factores bioclimticos como o fotoperodo e a temperatura. Estes factores so de extrema importncia na estimativa do PMI pelos entomlogos forenses. Primeiramente, estes factores ambientais aparentam ser de menor importncia para a deteco de drogas em insectos. Todavia, os entomotoxiclogos usam dados experimentais, frequentemente gerados em laboratrio sob condies de luminosidade e temperatura constantes, para a interpretao de casos forenses reais. Por este motivo, os entomotoxiclogos tm de ter presente a influncia dos factores ambientais no desenvolvimento do insecto. A luminosidade constante aumenta a variao de tempo para que um insecto se torne adulto e retarda significativamente o desenvolvimento quando comparados com insectos criados em fotoperodos cclicos (Gosselin et al., 2011). O desenvolvimento pode ser igualmente acelerado ou retardado variando a temperatura ambiente. Adicionalmente, a chuva e humidade influencia a oviposio e o desenvolvimento do insecto. Se os testes entomolgicos so efectuados em laboratrio, importante usar um fotoperodo realista 12:12 H (luz/sombra), e uma humidade e temperatura escolhida em funo da espcie em investigao e condies climticas da regio onde se encontra o caso forense. Os factores climticos no influenciam apenas o desenvolvimento do insecto mas tambm a sua motilidade intestinal, e portanto, a absoro e excreo de drogas encontra-se igualmente dependente da temperatura ambiente. Mais, a estabilidade das drogas nos tecidos pode ser igualmente influenciada pela temperatura, humidade e radiao UV. Como resultado, os factores ambientais exercem influncia na concentrao final de droga presente nos tecidos do insecto analisado. Devido importncia das condies climticas, estas devem ser monitorizadas e registadas durante o desenvolvimento, amostragem e armazenamento dos insectos desenvolvidos experimentalmente. Em casos reais, as condies climticas devem ser investigadas atravs de estaes meteorolgicas para se reunir a maior quantidade de informao possvel acerca do desenvolvimento do insecto. No que respeita influncia dos factores ambientais na motilidade intestinal e absoro final das drogas nos tecidos dos insectos bem como a estabilidade tecidular daquelas, ser necessria investigao futura para se calcular o impacto dos factores ambientais na deteco final da droga (Gosselin et al., 2011). 5 COMPONENTE TOXICOLGICA
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Para alm das aplicaes do estudo dos artrpodes no contexto exclusivo da Entomologia Forenses, ele igualmente importante uma vez que os insectos so importantes amostras alternativas para anlises toxicolgicas quando no possvel ou no esto disponveis as amostras humanas. Vrias publicaes descrevem a deteco de txicos e substncias controladas atravs da anlise de artrpodes. (Goff et al., 1994 e Tracqui et al., 2004) Alguns estudos procuraram correlacionar as concentraes de droga nos tecidos humanos com as encontradas em larvas de Dpteros que se alimentavam daqueles tecidos. As anlises toxicolgicas efectuadas em amostras insectos so, em geral, as mesmas usadas para tecidos e fluidos de origem humana. 5.1 Potencialidades da Entomotoxicologia O maior interesse da Entomotoxicologia a determinao do abuso de drogas imediatamente antes da morte, especialmente em restos esqueletizados, quando j no existem tecidos ou fluidos para anlise. Igualmente, em restos em avanado esto de decomposio, as anlises toxicolgicas podem ser facilitadas utilizando os insectos uma vez que se observam assim menos interferncias no percurso analtico devidas decomposio da matriz em anlise. Adicionalmente, num estudo comparativo de Kintz et al. (em Gosselin et al., 2011) conseguiu-se uma maior sensibilidade usando formas larvares em vez do material ptrido. Por outro lado, as concentraes de drogas parecem ser mais estveis em insectos, enquanto que o mesmo nem sempre acontece na maioria dos tecidos no post-mortem. De um ponto de vista puramente prtico, os insectos tm interesse uma vez que esto presentes, ou os seus restos, em elevado nmero (pupas ou exvias) por um longo perodo de tempo, mesmo quando j no esto disponveis amostras toxicolgicas (Gosselin et al., 2011). 5.2 Espcies e estdios de interesse entomotoxicolgico A utilizao de espcies necrfagas como matriz para a deteco qualitativa est perfeitamente documentada e geralmente aceite pelos toxiclogos forenses.
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Alguns estudos animais [muito embora o mesmo no se possa concluir para estudos em humanos] demonstraram uma possvel correlao entre as concentraes de droga no substrato e as concentraes encontradas nos diferentes estdios de desenvolvimento dos insectos cultivados nesse substrato. Para investigaes entomotoxicolgicas, recomendada a utilizao de espcies necrfagas dpteras ou colepteras, uma vez que so as primeiras a colonizar o cadver. As espcies necrfagas so geralmente muito comuns e presentes de forma abundante na cena de crime. Alm disso, o seu perfil biolgico e desenvolvimento so j conhecidos uma vez que so j usados em Entomologia Forense no clculo do PMI. No apenas a espcie que importante, mas igualmente o seu desenvolvimento e actividade (Gosselin et al., 2011). ecloso dos ovos, seguem-se 3 estdios larvares. No terceiro estdios larvar, so observadas 3 actividades principais: alimentao, digesto e busca por alimento. Uma vez atingido o tamanho mximo larvar, a alimentao cessa, e a larvar afasta-se da fonte de alimento, procurando um local para a metamorfose para pupa. Diferenas na concentrao de substncias (drogas) so observadas em larvas com diferentes actividades alimentares. Adicionalmente, a concentrao de drogas na pupa so mais baixos que na larva, mas parecem ser mais reprodutveis. Em cadveres em avanado estado de decomposio, os insectos colonizadores na pupa de primeira gerao podem ser considerados um ndice de concentrao de droga melhor que as larvas de segunda gerao (Gosselin et al., 2011). Todavia, para os entomlogos forenses, a quantificao adicional de drogas em larvas pode ser importante na explicao da alterao do desenvolvimento do insecto e, por isso, na estimativa do PMI. Se por um lado existe uma diferena nas quantidades de droga observadas nos diferentes estados de larva e pupa, por outro existe uma grande discusso e muitas questes por responder no que respeita ao metabolismo da droga, absoro e eliminao e, portanto, na acumulao da droga e na sua localizao nos insectos (Gosselin et al., 2011). Nas larvas em perodo de alimentao, as drogas podem ser absorvidas atravs do intestino mdio e depois distribudas por toda o organismo. porm, pouco claro, se as drogas ficam armazenadas na hemolinfa, corpos gordos ou tegumento. A droga pode ser excretada directamente pelo tubo digestivo ou via tbulos de Malpighi aps metabolizao. De acordo com Parry et al. (em Gosselin et al, 2011), o metabolismo das substncias nos insectos ocorre nos tbulos de Malpighi via citocromo P450 e
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glutationa-transferase. Todavia, o metabolismo da droga nos insectos no se encontra ainda elucidado. A presena de metabolitos poder resultar da aco enzimtica e/ou metabolismo larvar. Os tbulos de Malpighi no s so responsveis pela excreo da droga durante a fase larvar como tambm ainda segregam a droga na fase de postfeeding (ps-alimentao) conduzindo a concentraes de droga mais baixas quando comparadas com as presentes em larvas em alimentao activa (Gosselin et al, 2011). Assim que os insectos se encontram na fase de pupa, os tbulos de Malpighi so degradados e o restante contedo intestinal ser apenas excretado como mecnio na emergncia do insecto adulto. Como as concentraes das drogas parecem ser baixas nos adultos, a maioria das drogas deve ser excretada durante os dois primeiros dias da vida adulta (Gosselin et al., 2011). 5.3 Substncias-alvo de pesquisa entomotoxicolgica Numerosos compostos (drogas, metais e pesticidas) foram j detectados, num contexto forense, em tecidos de insectos (Gosselin et al., 2011), alguns dos quais podem ser encontradas nas tabelas 1 e 2 anexas ao presente trabalho. 5.4 Sampling/amostragem Para alguns toxiclogos, a amostragem dos insectos poder parecer simples; tirar apenas algumas larvas do cadver. No entanto, esta uma fase que pode introduzir grande variabilidade na deteco da droga. Em primeiro lugar, a amostragem de insectos (larvas ou pupas) pode ser efectuada em redor, debaixo ou no prprio cadver. Quando o corpo se encontra em avanada decomposio, os investigadores devem ter em mente que os insectos recolhidos podem ser oriundos de uma fonte que no o cadver. Alm disso, vrios autores demonstram a importncia de colheitas em vrios locais do corpo, uma vez que se observou grande variabilidade de amostras inter-locais no que respeita concentrao de drogas. Esta observao faz sentido j que as substncias de distribuem pelo organismo de acordo com as suas propriedades fsicoqumicas, conduzindo a diferentes concentraes de droga em diferentes rgos ou tecidos, como tambm em insectos desenvolvidos nestes diferentes substratos (Gosselin et al., 2011).

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Enquanto a maioria dos investigadores fazem uma amostragem aleatria, os melhores locais de amostragem para deteco de drogas so os rgos internos (ex.: fgado), a rea da cabea ou msculos, caso no hajam j rgos internos. Todavia, na literatura, esto descritos outros locais de amostragem como a superfcie drmica (Gosselin et al., 2011). Em case reports ou pesquisas mais antigas, pupas e larvas so frequentemente recolhidas de diferentes zonas do corpo e juntas (em pool) numa amostra nica, possivelmente devido a problemas com a sensibilidade dos mtodos analticos usados. Porm, informao respeitante a deteco da droga em diferentes reas do corpo, bem como a variabilidade inter-insectos devido a diferenas no desenvolvimento dos estdios ou na actividade, ser perdida (Gosselin et al., 2011). Esta informao poder no ser de interesse para a interpretao do relatrio do caso, no momento mas da maior importncia para o incremento do futuro conhecimento entomotoxicolgico. Neste momento, os padres e orientaes para a recolha de amostras em entomotoxicologia forense foram publicados por Amendt et al. (2006) e Carvalho et al. (2010). Infelizmente, o nmero mnimo de espcimes que devem ser recolhidas no mencionado e a diferenciao entre a actividade e maturidade dos insectos no especificada. Todavia Tracqui et al. (2004) descreve uma recolha de um mnimo de 30 espcimes do mesmo estdio e actividade de cada localizao. Talvez este factor no seja de interesse em casos reais, mas , certamente, de interesse para pesquisa entomotoxicolgica, de forma a assegurar uma boa anlise estatstica.

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(*) L(liver)-fgado; B(brain)-crebro; M (muscle)-msculo; O(others)-Outros. (**) L(larvae)-larva; P(pupae)-pupa; EP (empty pupae)-pupa vazia; A(adults)-adultos. Figura - Folha de protocolo de registo de amostras para anlise entomotoxicolgica (Fonte: Gosselin et al., 2011)

Na figura acima, pode encontrar-se um protocolo de amostragem modificado baseado nos apresentados por Amendt et al. (2006) e Carvalho et al. (2010). As adaptaes foram efectuadas ao nvel da quantidade de espcimes recolhidos, da frequncia da amostragem e da informao relativa actividade dos insectos. A amostragem em contexto experimental pode ser efectuada em diferentes fases de desenvolvimento ou a intervalos de tempo regulares. No mesmo intervalo de tempo, podem ser observadas diferentes fases de desenvolvimento ou actividades, resultando em resultados quantitativos irreprodutveis. Por este motivo, Gosselin et al. (2011) recomenda uma amostragem frequente no incio de cada fase de desenvolvimento. O mesmo autor sugere que se mantenham vivas as larvas na fase de alimentao, durante vrias horas e antes de se matarem. Tal procedimento garante assim que as drogas presentes no seu tracto digestivo sejam completamente excretadas. Estes parmetros

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adicionais so de extremo interesse para efeito de pesquisa, mas nem tanto para a imediata interpretao de casos (Gosselin et al., 2011). 5.5 Processamento analtico A descrio de dados analticos fiveis deve ser o estandarte da investigao forense. Os investigadores entomotoxiclogos necessitam de resultados vlidos, reproductveis e comparveis de forma a poderem retirar delas concluses correctas. Estes so da maior importncia j que sero usados por outros para interpretao de casos. Por este motivo, so necessrios consensos internacionais no que respeita aos mtodos de sacrifcio adequados, armazenamento, manuseamento e anlise das amostras. Alm disto, o entomotoxiclogo dever prestar ateno aos requisitos de validao. Na reviso da literatura levada a cabo por Gosselin et al. (2011), o autor observou que no existem protocolos recomendados para o sacrifcio, armazenamento e para descontaminao das amostras. Estes passos podem, no entanto, influenciar os resultados j que a estabilidade ou contaminao das drogas pela fonte de alimento iro alterar o resultado analtico e, portanto, a concluso final. (Gosselin et al., 2011). Espcimes como larvas ou insectos adultos so mortos por congelamento ou fervura, aps o que so conservados em lcool 70% ou a -20C. As pupas, por outro lado so conservadas em frio seco de 2-6C. Gosselin et al. (2011) recomenda, no entanto, o frio seco a -20C para todas as amostras de forma a assegurar a estabilidade das drogas e diminuir a possvel extraco da droga da matriz quando a conservao feita em lcool. Outro passo importante prvio anlise a descontaminao dos insectos. Foram observadas concentraes de drogas mais elevadas em espcimes no lavados do que nos submetidos a lavagem devido contaminao de superfcie. Os insectos devero ser lavados com gua desionizada, uma soluo de soro fisiolgico (NaCl 0.9%) ou com metanol. Todavia, no existem estudos que avaliem a eficcia destes mtodos de lavagem (Gosselin et al., 2011). Uma vez mortos e descontaminados, as amostras sero preparadas para anlise. A preparao da amostra depende da natureza do tecido do insecto e da droga a estudar. Uma vez que os insectos so espcimes slidos, eles sero, numa primeira fase, macerados e homogeneizados, ou sujeitos a digesto com bases ou cidos fortes, enzimas ou ainda pulverizados por moagem. Na sua experincia, Gosselin et al. (2011)
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observa que a utilizao de um homogeneizador Precellys 48 (Bertin Technologies, Montigny-Le-Bretonneux, France) permite a pulverizao de um espcimen numa ampola, evitando assim contaminao cruzada entre diferentes amostras. Uma vez pulverizadas as amostras, as drogas so extradas da matriz. Tcnicas de extraco adequadas permitem um mtodo com sensibilidade optimizada e removem, igualmente, compostos da matriz que possam ser potenciais interferentes conduzindo a uma maior selectividade e um mtodo mais reprodutvel, independentemente de variaes na matriz da amostra. No anexo 2 podem consultar-se, em formato tabelar, as substncias detectadas e a preparao/anlise da amostra apresentada na literatura (Gosselin et al., 2011). claro que os entomotoxiclogos ainda usam tcnicas clssicas de extraco como precipitao de protenas, extraco lquido-lquido (LLE- liquid-liquid extraction), ou extraco de fase slida (SPE- solid phase extraction). O objectivo da tcnica de extraco final isolar os compostos de interesse de uma forma simples, com a sensibilidade pretendida, sem interferentes da matriz e com um extracto compatvel com o procedimento analtico final. Vrios procedimentos analticos de deteco/quantificao foram usados na anlise de tecidos de insectos (ver anexo 2). A escolha da tcnica depende das propriedades fsico-qumicas da droga de interesse e, claro, da selectividade e sensibilidade pretendidas (Gosselin et al., 2011). luz dos recentes desenvolvimentos no campo da Entomotoxicologia, importante possuir mtodos extremamente sensveis de forma a garantir a anlise de um s espcimen de vrios locais do corpo, para fins de interpretao de casos. Porm, as tcnicas observadas usadas em pesquisa entomotoxicolgica e estudos de casos nem sempre so sensveis o suficiente e, na maioria dos casos, exigem pools de espcimes para detectar a presena de droga. Enquanto no passado tcnicas como a MS/MS no estavam disponveis na maioria dos laboratrios, actualmente estas conseguem uma sensibilidade que permite a anlise de um nico espcimen e, espera-se, possibilitaro novos conhecimentos nesta rea, bem como nos procedimentos de deteco de drogas em investigaes forenses. Outro facto o de que as antigas tcnicas, que no eram especficas (ex.: imunoensaios), eram muitas vezes usadas na formulao das concluses. Uma vez mais os mtodos de MS ou MS/MS, adequadamente validados, conseguem uma maior selectividade e especificidade de deteco conduzindo a resultados mais fiveis.

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No apenas importante o desenvolvimento e escolha da tcnica aplicada, para garantir uma deteco e quantificao fivel, mas tambm a validao de acordo com os padres internacionais dever ser obtida para assegurar a validade dos resultados e consequentemente a interpretao e concluso. Parece razovel que um mtodo seja adequado ao propsito; porm, na reviso de publicaes entomotoxicolgicas, Gosselin et al. (2011) observou que h uma tendncia para a ausncia de validao dos mtodos usados. A maioria das orientaes de validao inclui selectividade, sensibilidade, calibrao, acurcia, preciso e estabilidade como parmetros fundamentais de validao. Afirma o mesmo autor que, no obstante algumas publicaes discutirem a preciso e vis do mtodo, apenas alguns estudos mediram a recuperao da extraco, a interferncia da matriz ou a estabilidade das amostras. Para mtodos usando LC-MS, a avaliao da interferncia da matriz mandatria, uma vez que a co-eluio dos compostos pode influenciar a ionizao do(s) composto(s) de interesse, influenciando a sensibilidade e a quantificao do analito-alvo. Durante o desenvolvimento do mtodo, a tcnica de extraco dever ser avaliada para garantir a reprodutibilidade dos resultados e uma sensibilidade adequada. Por outro lado, um problema para a determinao da recuperao da extraco nos tecidos dos insectos o facto de frequentemente os broncos enriquecidos com drogas no reflectirem os casos reais j que a droga no incorporada no tecido mas apenas repicada na matriz. A estabilidade outro parmetro importante que deve ser avaliado com mais detalhe durante todo o estudo entomolgico, que vai desde o processo de abate at ao armazenamento e processamento da amostra, para garantir resultados adequados (Gosselin et al., 2011). 5.6 Limitaes e factores de erro O maior problema para os Entomotoxiclogos a interpretao de resultados. Actualmente no possvel estimar a causa e circunstncias da morte com base nas concentraes da droga observadas nos insectos extrados do cadver. Esta relao em casos forenses humanos no se encontra ainda perfeitamente estabelecida e continua controversa. De acordo com alguns autores, dificilmente se espera que tal relao possa vir a ser estabelecida devido a um vasto leque de factores

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influenciadores, largamente inexplorados e, ao momento, impraticveis (Gosselin et al., 2011). Enquanto os entomotoxiclogos tentam encontrar uma relao entre as concentraes de droga no substrato e nos insectos de cultura com alimento artificialmente inoculado ou modelos animais, a colheita de espcimes de insectos em casos humanos post-mortem bem mais interessante. Estes insectos so cultivados em circunstncias realsticas. Todavia, existem vrios inconvenientes. Primeiro que tudo, difcil e morosa a obteno de uma base de dados com casos humanos para pesquisa. Alguns investigadores usam tecidos humanos, como o muscular ou o heptico para cultivo experimental de larvas, no entanto, este procedimento eticamente questionvel. Adicionalmente, a determinao da concentrao de droga em tecidos em decomposio no bvia e at impossvel em restos esqueletizados. Mesmo que as concentraes de droga sejam determinadas, a redistribuio da droga post-mortem e a estabilidade da droga nem sempre so bem conhecidas, o que complica a interpretao (Gosselin et al., 2011). 5.7 A influncia das substncias no ciclo de vida dos Dpteros Estudos feitos tm-se focado no potencial uso de insectos como amostras alternativas para anlises toxicolgicas; os resultados demonstraram a utilidade dos testes a insectos complementares aos testes aos restos. Uma droga ou toxina pode ser detectada na larva quando a sua taxa de absoro excede a de eliminao. Todavia, o mecanismo de como exactamente a larva bioacumula ou elimina a droga no se encontra perfeitamente descrito, bem como a forma como estas drogas afectam o desenvolvimento larvar. Os efeitos das drogas e toxinas no ndice de desenvolvimento dos dpteros uma questo primordial a resolver antes de se poder usar as larvas para a determinao do PMI (Introna et al., 2001). A ttulo de exemplo seguem-se alguns estudos com drogas de abuso. Introna et al. (2011) a respeito dos resultados dos estudos de Bourel et al. (1999) escreve que se a presena de morfina nos tecidos no for tida em conta, ento possvel uma subestimao do PMI de cerca de 24 horas para a larva de L. sericata medindo de 8 a 14 mm de comprimento total. Afirma igualmente que estes autores observaram que a L. sericata se desenvolve a uma menor taxa que aquela observada na cultura em carcaa de coelho com menos de 50.0 mg/h de morfina.
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A respeito dos efeitos da metanfetamina nos padres de desenvolvimento de P. ruficornis, Goff et al. (1992) (em Introna et al., 2011), ilustrou analogias substanciais com os estudos levados a cabo com herona e cocana, bem como diferenas significativas. Foi observado uma taxa de desenvolvimento acelerado das 24 s 60 horas apenas em larvas cultivadas em tecidos de coelho contendo doses letais; aps as 60 horas, a taxa de crescimento para a colnia da dose letal mdia abrandou. Ao contrrio da situao com herona e cocana, as larvas de todas as colnias alimentadas com coelho que recebeu metanfetamina apresentavam um menor comprimento mximo (obtido precocemente) em relao s da colnia de controlo. Como observado para a herona, mas no para a cocana, detectou-se uma relao entre a concentrao tecidular de metanfetamina (e anfetamina) e a durao da fase pupria. Finalmente, os mesmos autores demonstraram que as diferenas observadas nas taxas de desenvolvimento foram suficientes para alterar o PMI estimado com base no desenvolvimento larvar em at 18 horas e estimativas baseadas no desenvolvimento puprio em at 48 horas. Os mesmos autores, em estudos publicados em 1994 (em Introna, 2011), investigaram igualmente os efeitos de outra droga de abuso comummente usada (Fenciclidina) no desenvolvimento de P. ruficornis. A fenciclidina foi introduzida na dcada de 70, uma droga psicadlica e pode ser consumida em forma de droga fumada, inalada ou per os. um tranquilizante e facilmente encontrada no mercado como medicamento de uso veterinrio. Ao contrrio dos estudos j mencionados usando cocana, herona e metanfetamina, no foi observada uma relao directa entre a dose de fenciclidina administrada e a concentrao de droga detectada nos tecidos. Aqui no foram observadas, entre as colnias, diferenas significativas no ndice de crescimento larvar, apesar da durao do perodo de ps-alimentao (post-feeding) ter sido menor para larvas alimentadas de tecidos contendo a droga. As diferenas mdias na durao na fase larvar em colnias tratadas variaram de 3 a 17 horas menos do que nas larvas das colnias de controlo. Similarmente herona, a durao da fase pupria foi superior para colnias alimentadas de tecidos contendo a droga. 6 CONSIDERAES FINAIS As investigaes de que so exemplo as sumariamente referenciadas no presente trabalho, demonstraram a possibilidade de correlaes qualitativas e quantitativas entre as concentraes de droga encontrada nos tecidos, larvas de dpteros em
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desenvolvimento, em pupas e em material fecal de insectos uma vez que o processo de bioacumulao comum a um vasto leque de insectos. Todavia, apesar do uso de artrpodes como amostras alternativas para anlises toxicolgicas se encontrar bem documentado em literatura, existem tambm referncias s suas limitaes. Alguns autores, como Punder (1991) (em Introna et al., 2011), no encontraram correlao entre a concentrao de droga em larvas e em tecidos dos quais as larvas se alimentaram. O mesmo autor afirmou que as larvas so espcimes teis como amostras toxicolgicas com propsitos qualitativos mas que aparentam ser de valor quantitativo limitado j que no actual estado da pesquisa entomotoxicolgica no se conseguem avaliaes quantitativas precisas. Torna-se assim, claro que o metabolismo e excreo da droga nos diferentes estdios de desenvolvimento dos insectos necessitam de estudo mais detalhado de forma a perceber-se qual a verdadeira extenso da incorporao das drogas nos tecidos dos insectos. Desta forma, os entomotoxiclogos poderiam determinar qual a fase de desenvolvimento do insecto mais relevante para a deteco de drogas, que tecidos fornecem concentraes maiores e mais reproductveis e, portanto, chegar a resultado mais fiveis. As pesquisas futuras devero igualmente explorar a estabilidade das drogas usando de diferentes mtodos de armazenamento, praticveis em condies forenses reais. A deteco de drogas em insectos no s pode ser uma til ferramenta para o perito toxicolgico na busca da causa de morte como, para o entomlogo, igualmente um parmetro importante no clculo do PMI, j que o desenvolvimento do insecto impactado pela presena de drogas no seu organismo.

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BIBLIOGRAFIA Amendt J., Campobasso C., Gaudry E., Reiter C., Leblanc H., Hall M.J.R., Best practice in forensic entomology: standards and guidelines, Int. J. Legal Med. 121 (2) (2006) 90 104 Benecke M., A brief history of forensic entomology, Forensic Sci. Int. 120 (2001) 2-14. Byrd J.H. & Castoser J.L. (Ed.) (2009) Forensic Entomology The utility of Arthropods in Legal Investigations. Boca Raton, EUA: CRC Press Bourel B. et al, 2001, Morphine extraction in necrophagous insects remains for determining ante-mortem opiate intoxication, Forensic Science International 120 (2001) 127-131 Carvalho L.M.L., Toxicology and forensic entomology, em: Amendt J., Campo- basso C.P., Goff M.L., Grassberger M. (Eds.), (2010) Current Concepts in Forensic Entomology, Springer Science, pp. 163178. Definis-Gojanovic M. et al, 2007, Drug Analysis in Necrophagous Flies and Human Tissues, Arh Hig Rada Toksokl 2007; 58:313-316 DiZinno J.A., Lord W.D., Collins-Morton M.B., Wilson M.R., Goff M.L., Mitochondrial DNA sequencing of beetle larvae (Nitidulidae: Omosita) recovered from human bone, J Forensic Sci. 47 (2002) 1337-1339. Gennard D.E.(Ed.) (2007) Forensic Entomology an introduction. West Sussex, England: John Wiley and Sons, Ltd Goff M. L., Brown W.A., Omori A.I., LaPointe D.A. Preliminary observations of the effect of phencyclidine in decomposing tissues on the development of Parasarcophaga ruficornis (Diptera: Sarcophagidae), J. Forensic Sci. 39 (1994) 123-128 Gosselin M., et al., Entomotoxicology, experimental set-up and interpretation for forensic toxicologists, Forensic Sci. Int. (2011); doi:10.1016/j.forsciint.2010.12.015 Gupta A., Setia P., 2004, Forensic Entomology Past, Present and Future, Aggrawals Internet Journal of Forensic Medicine and Toxicology 5(1) (2004) 50-53 Introna F, Campobasso CP, Goff ML., Entomotoxicology. Forensic Sci Int. 2001 Aug 15; 120(1-2): 42-7 Prado e Castro C., Arnaldos M.I., Garca M.D., Additions to the Calliphoridae (Diptera) fauna from Portugal, with description of new records, Boln. Asoc. esp. Ent. 33(34):425-437, 2010(2009) Tracqui A., Keyser-Tracqui C., Kintz P., Ludes B., Entomotoxicology for the forensic toxicologist: much ado about nothing? Int. J. Legal Med. 118 (2004) 194196.

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Imagem de Calliphora vicina. Recuperado em 2011, Abril 4, de

http://diptera.info/forum/viewthread.php?thread_id=36645)

Imagem de Calliphora vomitoria. Recuperado em 2011, Abril 4, de

http://diptera.info/photogallery.php?photo_id=6393)

Imagem de Lucilia sericata. Recuperado em 2011, Abril 4, de

http://diptera.info/photogallery.php?photo_id=3408)

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Anexo 1
Tabela 1- Lista de susbtncias txicas detectadas nas diferentes fases de desenvolvimento dos insectos (Fonte: Gosselin M., et al., 2011)

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Tabela 1( continuao) - Lista de susbtncias txicas detectadas nas diferentes fases de desenvolvimento dos insectos (Fonte: Gosselin M., et al., 2011)

L, larva; P, pupa; PP, pr-pupa; Pu, puparia; A, adulto; C, cultura; F, excremento (em Ingls, frass); E, exvia

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Anexo 2
Tabela 2- Comparao da preparao da amostra e procedimentos analticos para cada substncia txica (Fonte: Gosselin M., et al., 2011)

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