Master BBSG P Rihet

Prdisposition Gntique au Paludisme: Contrle gntique de linfection,des formes simples et des formes graves De lapproche gne candidat au clonage positionnel

Prdisposition Gntique au Paludisme

Objectif: Identier, chez lhomme, des Gnes et leurs Variants Impliqus dans le Contrle de la Rsistance au Paludisme
tudes dans une population humaine vivant dans une zone endmique tudes dans un modle animal de la maladie humaine

Prdisposition Gntique au Paludisme: Diffrences de Squence dADN expliquant des Diffrences de Rsistance Individu Rsistant
Met A T G Val G T C Ser T C A Leu C T G Gln C A A Pro C G G Cys T G T

Individu Sensible
A Met T G G Val T C T Ser C A C Leu T G

Gne X

T*
A A C G G T G T

Polymorphisme Associ la Susceptibilit

Change qualitativement/quantitativement Lexpression du gne =>Modifie la squence protique =>Modifie la quantit de la protine

Prdisposition Gntique au Paludisme: Des Souris et des Hommes

1.Donnes du problme Phnotypes pertinents Composante gntique 2. Approche gne candidat
Etude dassociation chez lhomme Ciblage gnique chez la souris

3. Clonage positionnel
Outils molculaires et concepts Analyses de liaison gntique/gnome humain Analyses de liaison gntique/gnome de la souris Identication des gnes et gnomique fonctionnelle

Rsistance/Susceptibilit de lHte au Paludisme.Une Notion Complexe

Prdisposition Gntique au Paludisme: Quels sont les Phnotypes Pertinents?

Formes Simples
(symptomes cliniques dont la vre)

Stades Sanguins Asexus Formes svres -anmie svre -neuropaludisme

(convulsions generalises, coma)

-Dtresse respiratoire svre

Prdisposition Gntique au Paludisme: Quels sont les Phnotypes Pertinents?

Phenotypes 2 Accs Palustre -prsence/absence -risque Phenotypes 1

Parasitmie
Phenotypes 3 Anmie svre Neuropaludisme Dtresse respiratoire -prsence/absence -risque

Prdisposition Gntique au Paludisme: Quels sont les Phnotypes Pertinents ?

Phenotypes 1

Parasitmie
Moyenne ou Maximale
Parasitmie Accs

Seuil clinique dpendant de lge

temps

Phenotypes 2 Accs Palustre

Phenotypes 3 Formes svres AS, NP et DRS

Prdisposition Gntique au Paludisme:

De linfection la maladie

Piqres infestantes de moustiques

400 enfants

Infections asymptomatiques

200

Accs palustre

100

Paludisme svre 1

Prdisposition Gntique au Paludisme?

Parasite
- Taux de multiplication - Cytoadhrence - Variations antigniques - Rsistance aux thrapeutiques

Hte
- Age

Phnotypes lis linfection par P.falciparum

Devenir de linfection

- Immunit - Immunopathologie - Facteurs gntiques

Vecteur
Exposition - Dose inoculum - Rsistance aux insecticides
-

Facteurs socioconomiques
- Stabilit

politique - Facteurs culturels - Lutte anti-vectorielle - Accs au traitement

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Y-a-t-il un contrle gntique des Phnotypes Pertinents?

Quelles approches pour valuer lexistence dune composante gntique?

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Y-a-t-il un contrle gntique des Phnotypes Pertinents?

Aggrgation familiale des formes svres (Ranque 2005), des formes simples (Traor 1999), des hauts niveaux dinfection (Abel 1992), des taux danticorps (Aucan 2001) Etude de jumeaux monozygotes vs dizygotes: formes simples (Jepson 1995), des taux danticorps (Sjoberg 1992) Etude de populations sympatriques: formes simples (Modiano 1996), des hauts niveaux dinfection (Modiano 1996), des taux danticorps (Modiano 1998)

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Si oui, le modle gntique des Phnotypes Pertinents est simple?

Analyses de sgrgation=>modle gntique plutt complexe

Parasitmie (Abel 1992, Garcia 1998, Rihet 1998) Taux danticorps (Stirnadel 1999) =>plusieurs gnes contrlent les phnotypes

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Le paludisme, une maladie multifactorielle

Maladie monognique/1 gne

Maladie/un gne majeur Maladie oligognique/qq gnes Maladie multifactorielle Maladie polygnique/ De nombreux gnes Environnement/ 0 gne

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Le paludisme, une maladie multifactorielle

De nombreuses inconnues:
Nombre de gnes et dallles impliqus Impact de chacun des gnes et allles (hritabilit) Mode hrditaire Frquences des allles morbides Localisation sur le gnome Identit des gnes et allles

Prdisposition Gntique au Paludisme: Etude de populations humaines Objectif: Identier, chez lhomme, des Gnes et leurs Variants Impliqus dans le Contrle de la Rsistance au Paludisme
Contrle de la Parasitmie
phnotypes 1: parasitmie

Prdisposition aux formes Simples

phnotypes 2: vre

Prdisposition aux formes Svres

phnotypes 3: AS, NP, DRS

Prdisposition Gntique au Paludisme:

De linfection la maladie

Piqres infestantes de moustiques Gnes contrlant la parasitmie Infections asymptomatiques

400 enfants

200

Gnes contrlant la survenue daccs palustres simples Accs palustre 100

Gnes contrlant la survenue daccs palustres svres Paludisme svre 1

Prdisposition Gntique au Paludisme: Des Souris et des Hommes

1.Donnes du problme Phnotypes pertinents Composante gntique 2. Approche gne candidat
Etude dassociation chez lhomme Ciblage gnique chez la souris

3. Clonage positionnel
Outils molculaires et concepts Analyses de liaison gntique/gnome humain Analyses de liaison gntique/gnome de la souris Identication des gnes et gnomique fonctionnelle

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche Gne Candidat

Hypothse: le Gne/Variant est Impliqu dans le Contrle du Phnotype/Maladie 2 mthodes danalyse chez lhomme:
Cas-contrle (comparaison des frquences allliques) Etude familiale (Transmission/Disequilibrium Tests)

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche Gne Candidat

Comment choisir le gne/variant candidat?

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche Gne Candidat

Lhypothse (le Gne/Variant est Impliqu dans le Paludisme) est base sur:
La fonction du gne:
Gne impliqu dans le systme immunitaire et potentiellement impliqu dans la dfense de lhte ou dans la physiopathologie Gne impliqu dans la cytoadhrence potentiellement impliqu dans la physiopathologie Gne impliqu dans la physiologie du globule rouge, habitat des stades sanguins

La prsence de dciences frquentes au niveau de gnes du globule rouge (ie hmoglobinopathies) dans des zones dendmie palustre
Hmoglobines S et C=>gne de la -globine Thalassmies=> gnes des -globine et -globine

Approche Gne Candidat: Un cas dcole, lhmoglobine

Gne codant pour la -globine (chromosome 11p15.5) les mutations S et C concernent deux bases voisines dans le 6me codon:
HbS: GAG->GTG (glu->val) HbC: GAG->AAG (glu->lys)

Approche Gne Candidat: un cas dcole Leffet Protecteur de lHmoglobine S contre le Paludisme Svre en Gambie

AA AA

AS

AS

Approche Gne Candidat: un cas dcole Leffet Protecteur de lHmoglobine S contre le Paludisme Svre en Gambie

AS

AS

Odds ratio OR=0,11

OR<1: allle associ la protection OR>1: allle associ la susceptibilit

Prdisposition Gntique au Paludisme Comment expliquer leffet protecteur des Hb S et C?

Limitation de la croissance du parasite dans certaines conditions Elimination favorise des globules rouges infects Exposition modie des antignes la surface des parasites Stimulation de la rponse immunitaire Diminution de la cytoadhrence des globules rouges infects la surface des cellules endothliales

Prdisposition Gntique au Paludisme Leffet protecteur des Hb S et C, en rsum Leffet est conrm par de nombreuses tudes Leffet est important (Odds ratio jusqu 0,07) LHb S et lHBC protgent contre le paludisme simple et svre MAIS leffet ne concerne quune petite fraction de la population qui prsente une rsistance au paludisme Globalement, leffet de lHb ne reprsenterait que 2% de lincidence des accs palustres simples

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche Gne Candidat

Lhypothse (le Gne/Variant est Impliqu dans le Paludisme) est base sur: Diapositive 0
La fonction du gne:
Gne impliqu dans le systme immunitaire et potentiellement impliqu dans la dfense de lhte ou dans la physiopathologie =>QUELS MCANISMES IMMUNITAIRES?

Prdisposition Gntique au Paludisme

Principaux mcanismes immunitaires anti-Plasmodium

Anticorps bloquant linvasion

Immunit cellulaire
Anticorps bloquant linvasion

Anticorps anti-toxines Anticorps bloquant la squestration Dans les organes profonds

Phagocytose et ADCC Immunit cellulaire

Prdisposition Gntique au Paludisme Immunit cellulaire au niveau du foie

Daprs Doolan and Hoffman

Prdisposition Gntique au Paludisme Phagocytose et ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity), Mcanismes effecteurs anti-stades sanguins

Infected Red Cells TNF

FcRIIA

Mrozote

Effector Cells Ac non cytophile vs cytophile

Prdisposition Gntique au Paludisme

Systme immunitaire, cytoadhrence et neuropaludisme

Neuropaludisme

IL6 IL1

T CD8

ICAM-1 CD36

pRBC: globule rouge infect

Prdisposition Gntique au Paludisme: Approche Gne Candidat/Etudes Cas-Contrle Gnes associs au Paludisme Svre
type de molcules gnes localisation

Gnes associs au Paludisme Simple

type de molcules gnes chromosomes

HBA1 et HBA2 (!-globine) "-globine

molcules rythrocytaires

16pter-p13.3 11p15.5 9q34 16q22.1 Xq28 17q21-q22 19p13.3-p13.2 7q11.2 17cen-q11.2 6p21.3 6p21.3 6p21.3 5q31.1-q33.1 5q31 2q14 21q22.1 6q23-q24 Xq26 1q21-q23
molcules rythrocytaires

!-globine HBA1 et HBA2 ("-globine) G6PD

molcules immunologiques

11p 16p 7q 17cen-q 2q14

groupes sanguins ABO haptoglobine G6PD Band3 (SLC4A1)

NOS2 IL1A

molcules d'adhsion

ICAM-1 CD36 NOS2 HLAB HLADRB1-DQB1 TNF IL12B

Odds ratio 0,07<OR<9 Except Hb: 0,3<OR<5

Rappel: OR<1: allle associ la protection OR>1: allle associ la susceptibilit

molcules immunologiques

IL13 IL1B IFNRA1 IFNRG CD40L FcgRIIA et FcgRIIB

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche Gne Candidat

Gnes codant pour Molecules Erythrocytaires Gnes du Systme Immunitaire et Molcules dAdhsion
Case-control ASSOCIATION

thalassemias G6PD HbS HbC

Case-control ASSOCIATION

Anmie svre Neuropaludisme

*CD40L,IFNR ICAM1, IL12B TNF, HLAB, HLADRB1-DQB1 iNOS

Accs Palustre

Parasitmie

Prdisposition Gntique au Paludisme: Approche Gne Candidat/Etudes Cas-Contrle

Biais possible dans les tudes cas-contrle d des fonds gntiques diffrent dans les populations cas et contrle
Diffrence de frquence alllique entre les deux populations au niveau de nombreux loci rpartis sur le gnome (rien voir avec la maladie tudi)

Solution: contrle lintrieur des familles

Association de la transmission dun allle donn des parents aux enfants

Prdisposition Gntique au Paludisme

Etude de gnes candidats: Etude familiale ie TDT (Transmission Disequilibrium Test)
1 Parent Htrozygote
M1M2

2 Allles

1 Enfant Atteint

-Comparaison des allles transmis par les parents htrozygotes lenfant atteint avec les allles non transmis (Spielman 1993) -Dveloppement de nouveaux tests TDT . Parents manquants . Marqueurs multiallliques . Plusieurs enfants par famille . Phnotypes quantitatifs . Analyse multipoint

Prdisposition Gntique au Paludisme Etude familiale ie TDT

Un tude en Gambie montre leffet protecteur de lhmoglobine S contre le paludisme svre (Ackermann et al 2005) Une tude au Burkina Faso montre leffet protecteur de lhmoglobine C contre le paludisme simple (Rihet et al 2004) Une tude en Gambie et une autre au Mali montre linuence de polymorphismes du gne IFN et de son rcepteur IFNRI sur le paludisme svre (Cabantous et al 2005; Koch et al 2003)

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche gne candidat et contribution des modles murins

Dmonstration directe du rle dun gne par ciblage gnique (KO) ou transgnse:
Ex: le gne X est-il impliqu dans la rsistance une maladie?
KO dun gne chez une souris R Transgnse du gne (provenant dune souris R) chez une souris S

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche Gne Candidat

Hypothse: le Gne/Variant est Impliqu dans le Contrle du Phnotype/Maladie Plusieurs gnes et variants prdisposant au paludisme ainsi identis Limite: faible nombre de gnes tests et gnes tests ncessairement connus

Prdisposition Gntique au Paludisme: Des Souris et des Hommes

1.Donnes du problme Phnotypes pertinents Composante gntique 2. Approche gne candidat
Etude dassociation chez lhomme Ciblage gnique chez la souris

3. Clonage positionnel
Outils molculaires et concepts Analyses de liaison gntique/gnome humain Analyses de liaison gntique/gnome de la souris Identication des gnes et gnomique fonctionnelle

Gntique classique vs Clonage positionnel

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche Clonage Positionnel

Etapes:
Localiser les Gnes de Prdisposition sur le Gnome Humain ou Murin (Liaison Gntique) Identier les Gnes Associs la Rsistance/Susceptibilit au Paludisme Identier les Variants Impliqus dans la Rsistance/Susceptibilit au Paludisme

Positional Cloning
Family studies Chromosome interval Genomic Candidate sequences genes
The Human Genome Project

Disease mutation
Met A T G Val G T C Ser T C A Leu C T G Gln C A A Pro C G G Cys T G T

A Met T G G Val T C T Ser C A C Leu T G

T*
A A C G G T G T

Segregation and Linkage Analyses

Fine Genetic Mapping

Identification of Genes Causing the Disease

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche Clonage Positionnel

Etape de localisation des gnes de prdisposition base sur une analyse de liaison gntique =>comment dnir une liaison gntique? =>quels outils molculaires utiliser? =>des scores de liaison gntique?

Prdisposition Gntique au Paludisme: Clonage positionnel Analyse de liaison gntique

Liaison gntique (Linkage): cosgrgation de deux ou plusieurs allles au cours des gnrations en raison de la proximit de leur locus sur le gnome/sur le mme chromosome.

Prdisposition Gntique au Paludisme: Clonage positionnel Analyse de liaison gntique

Liaison gntique dun marqueur gntique avec un phnotype (trait qualitatif ou quantitatif): cosgrgation dallles du marqueur gntique avec (lallle de prdisposition ) la maladie au cours des gnrations (en raison de la proximit de leur locus sur le gnome/sur le mme chromosome).

Clonage positionnel Analyse de liaison gntique: Le Lodscore bas sur un Rapport de vraisemblance (Hypot liaison gntique vs Hypot non liaison gntique)

Clonage positionnel Analyse de liaison gntique: les outils molculaires Les marqueurs microsatellites: allles identis par leur taille rpartis sur lensemble du gnome

Les SNPs: -substitution/dltion-insertion dune seule bp -de nombreuses techniques pour les typer/identier -rpartis sur lensemble du gnome

Clonage positionnel Analyse de liaison gntique: les outils molculaires Les marqueurs microsatellites: allles identis par leur taille/ nb de rptitions de tetra, tri ou dinuclotides: ex= (CA)n rpartis sur lensemble du gnome: carte 1996 du gnthon 5264 microsatellites

Clonage positionnel Analyse de liaison gntique: les microsatellites

Clonage positionnel Analyse de liaison gntique: les SNPs Les SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms): -substitution/dltion-insertion dune seule bp TTGTCCC allle -590C/ promoteurIL4 TTGTTCC allle -590T/ promoteurIL4 -de nombreuses techniques pour les typer/identier (RFLP, SSCP, DHPLC, squenage) -rpartis sur lensemble du gnome: 1re carte publie en 2001: 1.42 millions SNPs sur le gnome humain

Clonage positionnel Analyse de liaison gntique: les SNPs Typage par PCR-RFLP

Prdisposition Gntique au Paludisme:Analyse de liaison gntique Deux rgions chromosomiques contenant des gnes de prdisposition
OMIM Online Mendelian Inhritance in Man MIM248310 PLASMODIUM FALCIPARUM BLOOD INFECTION LEVELS, PFBI

Gene map locus 5q31-q33 Rihet et al. (1998) provided evidence for linkage of the level of blood infection with Plasmodium falciparum and the chromosome region 5q31-q33, which contains numerous candidate genes encoding immunologic molecules. They performed a sib-pair linkage analysis on 153 sibs from 34 families. The results, obtained by means of a 2-point Haseman-Elston method and a nonparametric approach, showed linkage of parasitemia to D5S393 (P = 0.002) and D5S658 (P = 0.0004). Multipoint analyses confirmed linkage, with a peak close to D5S658. The heritability of the locus was 0.48, according to the 2-point results, and 0.43, according to the multipoint results; this indicated that its variation accounted for approximately 45% of the variance of blood infection levels and that the locus plays a central role in the control of parasitemia. Garcia et al. (1998) and Flori et al. (2003) also found association between P. falciparum blood infection levels and 5q31-q33. Hernandez-Valladares et al. (2004) used an F(11) advance intercross line in a population of mice infected with Plasmodium chabaudi to identify mouse quantitative trait loci (QTLs) for control of parasitemia on mouse chromosomes 11 and 18, which carry regions homologous to human 5q31q33. They identified a novel QTL for parasitemia control on mouse chromosome 11, linked to marker D11Mit242, and involved in the clearance stages of the parasites from the bloodstream.

Prdisposition Gntique au Paludisme:Analyse de liaison gntique Deux rgions chromosomiques contenant des gnes de prdisposition
OMIM Online Mendelian Inhritance in Man MIM609148 MALARIA, MILD, SUSCEPTIBILITY, MALS

Gene map locus 6p21.3 Tumor necrosis factor-alpha (TNF; 191160) is thought to be a critical mediator of malaria fever, and mild malaria was previously reported to be linked to the MHC region containing the TNF gene (Jepson et al., 1997). Flori et al. (2003) analyzed 34 families from Burkina Faso to test for linkage between polymorphisms within the MHC region and mild malaria. Twopoint analysis indicated linkage of mild malaria to TNFd (lod = 3.27), a highly polymorphic marker in the MHC region. Multipoint analysis also indicated evidence for linkage of mild malaria to the MHC region, with a peak close to TNF (lod = 3.86). The authors proposed that genetic variation within TNF may influence susceptibility to mild malaria, but TNF alleles associated with resistance to severe malaria, including the TNF-308 (191160.0004) polymorphism, are unlikely to explain linkage of mild malaria to the MHC region.

Prdisposition Gntique au Paludisme:Analyse de liaison gntique Chromosome 5q31-q33

Candidate Genes IL13 IL4 IL5 IRF1 IL3 CSF2 IL9 CD14 ADRB2 C SF1R

5q

cM
3

Markers
D5S642 D5S2117 D5S393, D5S399 D5S658 D5S436 D5S2090 D5S636 D5S2012 D5S487

q31.1 q31.2 q31.3 q32 q33.1 q33.2 q33.3 q34 q35.1 q35.2 q35.3

3.5 1.8 4.6 2.7 2.9 3.2 1.6

IL12B

Score de liaison gntique

Multipoint Z-score
0.5 1.5 2.5 3.5 0 1 2 3

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

D5S642

D5S2117

D5S393

D5S399 D5S658

p=0.0008

Prdisposition Gntique au Paludisme:Analyse de liaison gntique Chromosome 5q31-q33

Chromosome 5q31-33
D5S436 D5S2090 D5S636 D5S2012
23 24

D5S487

cM

Analyse de Liaison Gntique entre le Chromosome 5q31-q33 et la Parasitmie

Zone urbaine Zone rurale Zone rurale (Burkina faso) (Burkina faso) (Cameroun)
Rihet et al 1998 Flori et al 2003 Garcia et al 1998

Familles (Pedigres) Germains

Paires de (demi)germains

34 153 285 0.0008 0.00001 0.48

44(84) 195 337 0.007 0.00006 0.46

9 25 26 <0.05 (ND) -

P (Liaison Gntique) P (Liaison-Association) Hritabilit

Rihet et al., Am J Hum Genet, 1998, 63(2):498 Garcia et al, Am J Trop Med Hyg, 1998, 58(6):705 Flori et al Genes Immunity, 4, 265

Prdisposition Gntique au Paludisme:Analyse de liaison gntique Le chromosome 5q31-q33 est li dautres maladies
IGES (IMMUNOGLOBULIN E CONCENTRATION)
Marsh et al. (1994), Meyers et al. (1994)

BHR1 (BRONCHIAL HYPERRESPONSIVENESS, ASTHMA)

Postma et al. (1995), The Collaborative Study on Genetics of Asthma (1997),

EOS (EOSINOPHILIA, FAMILIAL)

Lin et al. (1997), Rioux et al. (1998)

SM1 (S MANSONI INFECTION,SUSCEPTIBILITY/RESISTANCE)

Marquet et al. (1996), Muller-Myhsok et al. (1997).

PFBI (P FALCIPARUM BLOOD INFECTION LEVELS)

Rihet et al (1998), Garcia et al (1998), Flori et al (2003)

Prdisposition Gntique au Paludisme:Analyse de liaison gntique

Le chromosome 5q31-q33 contient de nombreux gnes du systme immunitaire
Monocytes
IL-2
CPA

IFN-

IRF1

Th1

IL-12
CPA

Th0

IFN-

IL-4
IL-10

IL-3 GM-CSF Eosinophils Neutrophils

Elimination of Parasites - Phagocytosis - ADCC - ADCI

IL-4
Th2
CPA

IL-5

cytophilic IgG

IL-2

IL-4

IL-4 IL-5 IL-9 IL-13

IL-6 IL-10

LB

IgG4 B Lymphocytes

Prdisposition Gntique au Paludisme et chromosome 5q31-q33 :Hypothse Gnes contrlant la rponse immunitaire protectrice et la parasitmie

Gnes (chromosome 5q31-q33)

Balance Th1/Th2

Prolifration, diffrenciation et activation des cellules effectrices

Production des anticorps cytophiles et non cytophiles

Rponse immunitaire protectrice Parasitmie

Une Rgion chromosomique dintrt: la rgion 6p21-p23

Chr 6

Classe II

6p21.3

CMH

Classe III

TNF
Classe I

Gnes codant pour des molcules immunologiques

Une tude Familiale Longitudinale au Bukina faso: Chromosome 6p21-p23 et Accs Palustre Simple

Phnotypes: -Accs: oui/non -Risque daccs (effet de lge inclus) -Parasitmie maximale (effet de lge inclus)

Parasitmie

Accs Parasitmie maximale

Temps (2 ans)

Analyse de Liaison Gntique entre le Chromosome 6p21-p23 et le Risque dAccs Palustre Flori et al (2003), Hum Mol Genet,12(4): 375
4,5 4 3,5 3 2,5

TNF

LOD score = 3,86 P= 1,22.10-5

Lod score

2 1,5 1 0,5 0

MHC class I
A CB

MHC Class II
DR DQ DP

1cM
1 cM

TNFb TNF-308, -244, -238 TNFd

D6S276

D6S291

Analyse de Liaison Gntique entre le Chromosome 6p21-p23 et la Parasitmie Maximale

3 2,5

TNF

LOD score = 3,55 P= 0,0002

Lod score

2 1,5 1
cMH classe I CMH classe II
DRDQ DP

1 cM

0,5
A CB

0
D6S276 TNFb TNF-308, -244, -238 TNFd D6S291

Carte gntique

Recherche systmatique des mutations prsentes dans le gne TNF dans la population dtude

Analyse de 16 fragments du gne TNF (3,6Kb). Recherche des mutations dans le promoteur, les exons et les introns par DHPLC (Denaturing High Performance Chromatography) et Squenage. Test dassociation entre les mutations dont la frquence est suprieure 0,01 et la parasitmie maximale et le risque daccs palustre.

Mutations dtectes dans le gne TNF

Promoteur

420 472, 489

267

610ins

732ins

1304

2053

-863, -857

-308 -244, -238 -163

-1031

-376*

100pb

exon intron * Mutation non dtecte Frquence suprieure 0,01

2395

851

SNPs du TNF associs avec les accs palustres simples

Promoteur

420 472, 489

-1031

238 -163

851

-308

1304

267

610ins

732ins

2053

-863, -857

-376*

-244, -

100pb

exon intron * Mutation non dtecte

2395

SNPs du TNF associs avec les accs palustres simples et/ou svres SNPs du TNF associs au paludisme svre
Promoteur

420 472, 489

-1031

238 -163

851

-308

1304

267

610ins

732ins

2053

-863, -857

-376*

-244, -

100pb

exon intron * Mutation non dtecte

2395

Rle de TNF dans la survenue daccs simples

Pic de liaison gntique au niveau du gne TNF Plusieurs SNPs associs aux accs simples
Les polymorphismes du TNF expliquent pour partie les diffrences de risque daccs palustre entre les individus

Injection dAc anti-TNF inhibe la vre chez des sujets infects par P.falciparum
le TNF est impliqu

Rle de TNF dans la survenue daccs svres

Taux levs de TNF associs au paludisme svre et une mortalit plus leve (Grau 1989; Kwiatkowski 1990) Modle souris(P. berghei ANKA):
Injection dAc anti-TNF protge des souris Souris TNFR2 KO protges (Grau et al 1987 ; Lucas et al 1997)

Plusieurs SNPs associs au paludisme svre (pas dtude systmatique)

Des Gnes de Prdisposition sont LocalissEt Aprs???

Chromosome 5

6p21-p23 TNF 700 genes Autre?

5q31-q33 400 genes

Chromosome 6

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche clonage positionnel et contribution des modles murins

Localiser les Gnes de Prdisposition sur le Gnome Humain (Liaison Gntique)

Localisation 1: Liaison Gntique Localisation plus ne: dsquilibre de liaison (ie augmenter la densit des marqueurs/analyses TDT) Localisation plus ne: comparaison des gnomes homme-souris condition que les rgions lies la rsistance au paludisme chez lhomme et chez la souris contiennent des gnes orthologues

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche clonage positionnel et contribution des modles murins

De nombreuses similitudes sur les plans gnomiques, physiologiques et physiopathologiques entre lhomme et la souris Squence complte des deux gnomes Conservation de la syntnie De nombreuses lignes consanguines disponibles avec des phnotypes contrasts Des croisements entre 2 lignes consanguines ayant des phnotypes diffrents Dmonstration directe du rle dun gne par KO ou transgense

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche clonage positionnel et contribution des modles murins

Des croisements entre 2 lignes

rsistante au neuropaludisme (R) Sensible au neuropaludisme (S) =>obtention des souris F2 =>association entre le gnotype des souris F2 et un trait QUALITATIF, le neuropaludisme: => LE TEST DE LIAISON GENETIQUE EST UN SIMPLE X2

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche clonage positionnel et contribution des modles murins

Des croisements entre 2 lignes

Lune contrlant bien linfection par P.chabaudi (rsistante R) Lune contrlant mal linfection par P.chabaudi (sensible S) =>obtention des souris F2 =>association entre le gnotype des souris F2 et un trait QUANTITATIF, la parasitmie => LE TEST DE LIAISON GENETIQUE EST UN SIMPLE t-test ou test de Mann-whitney

Rgions chromosomiques Homme et Souris lies au Paludisme

Ou comment exploiter la conservation de la syntnie homme-souris

Chromosomes 6p21-p23 region

linked to mild malaria Linked to P.chabaudi+ P berghei Resistance/ susceptibility
Burt et al, 1999 Hernandez et al, 2004 Ohno et al, 2004

1 4 8 9 10 13 17 Mouse syntenic chromosomal region

Human chromosome 6

Rgions chromosomiques Homme et Souris lies au Paludisme

Ou comment exploiter la conservation de la syntnie homme-souris
6p21-p23 region linked to mild malaria Linked to P.chabaudi resistance

Chromosomes 1 4 8 9 10 13 17

TNF: SNPs associs Aux formes simples

TNF: rle dmontr par KO et transgnse

Human chromosome 6

Mouse syntenic chromosomal region

Rgions chromosomiques Homme et Souris lies au Paludisme: ET LA REGION MURINE CORRESPONDANT AU CHROMOSOME 5q31-q33?

Hernandez-Valladares M, Rihet P, ole-MoiYoi OK, Iraqi FA. Mapping of a new quantitative trait locus for resistance to malaria in mice by a comparative mapping approach with human Chromosome 5q31-q33. Immunogenetics. 2004 May;56(2):115-7.

Rgions chromosomiques Homme et Souris lies au Paludisme

Human chromosome 5

10 cM

Mouse syntenic chromosomal region

1 11 13 5q31-q33 region
linked to parasitemia Linked to P. chabaudi resistance
Hernandez et al, 2004

15 17 18

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche clonage positionnel et contribution des modles murins

Les rgions lies la rsistance au paludisme chez lhomme et chez la souris contiennent des gnes orthologues.
Homme 6p21-p23 5q31-q33 Souris chr17 chr 11

=>Le modle souris peut faciliter la cartographie puis lidentication du gne de prdisposition. Le rle du gne est dmontr in vivo chez la souris.A SUIVRE pour les chromosomes 5q31-q33 et 6p21-p23

Prdisposition Gntique au Paludisme:

Approche clonage positionnel et gnomique fonctionnelle Identication de gnes et variants impliqus

Existence de diffrences gntiques entre les individus expliquant les diffrences de rsistance au paludisme (corrlation phnotype-gnotype chez lhomme et la souris) =>HYPOTHSE: certains polymorphismes affectent lexpression des gnes =>Gnes sur (ou sous) exprims chez les individus sensibles. Do lintrt dtudes de transcriptome

Etude du contrle gntique des phnotypes de rsistance au paludisme chez lhomme Cartographie gntique chez la souris

Mise en vidence dune composante gntique

Analyse de liaison

Localisation des rgions chromosomiques impliques (10-20cM)

5q31-q33 6p21-p23

Tests familiaux dassociation

Localisation fine des rgions chromosomiques impliques (1-5cM) Analyse du transcriptome chez la souris et lhomme
Etude de polymorphismes de gnes candidats

Identification des gnes et des variants associs

TNF

Etudes fonctionnelles

Souris KO

Identification des gnes et des variants impliqus

Prdisposition Gntique au Paludisme Approche Clonage Positionnel

De nombreuses tudes chez la souris, modle du contrle de la parasitmie et modle du neuropaludisme=>de nombreux loci, et quelques gnes identis (Pklr, Vnn1 ou Vnn3, Tnf) Chez lhomme, 2 loci conrms ce jour (chromosomes 5q31-q33 et 6p21.3) contrlant la parasitmie ou les accs palustres simples et correspondant des loci identis chez la souris

Prdisposition Gntique au Paludisme Approche Clonage Positionnel

Dautres loci/gnes identier par criblage de lensemble du gnome humain: plusieurs nouveaux locus sur les chromosomes 5p15, 10p15, 12q21, 13q13

A Sakuntabhai, R Ndiaye, I Casademont et al Plos one 2008

A Sakuntabhai, R Ndiaye, I Casademont et al Plos one 2008

12

Prdisposition Gntique au Paludisme Conclusion

Approches gne candidat et clonage positionnel complmentaires Plusieurs gnes dont les polymorphismes sont associs au paludisme sont des gnes codant pour des molcules de cytoadhrence et/ou du systme immunitaire=>gnes impliqus directement dans un mcanisme effecteur ou dans sa rgulation Les polymorphismes au niveau de ces gnes expliquent en partie les diffrences de rsistance/susceptibilit au paludisme

Gnes associs au paludisme en action: Elimination des stades hpatiques

HLA-B

Daprs Doolan and Hoffman

Gnes associs au paludisme en action: Elimination des stades sanguins

+ NCR3 NK
NCR3
NK Th1

IFN

IL-18

TNF Monocytes

Elimination des stades sanguins:

Phagocytose Cytotoxicit

IRF1

IL-12
+
CPA

Neutrophiles Eosinophiles

Th0

IFN

IL-4
IL-10

HLA-DR

IL-3 GM-CSF

_ _
Th2

IL-4
rythrocyte parasit

IL-5
IL-4 IL-6 IL-5 IL-10 IL-13 IL-9
+

LB FcgRIIA

IgG1 (IgG2) IgG cytophiles IgG3

IL-4

IgG non cytophiles (IgG2) IgG4

Gnes situs dans la rgion 5q31-q33/6p21.3

Gnes associs au paludisme en action: Rle dans le neuropaludisme

Neuropaludisme

IL6 IL1

T CD8

ICAM-1 CD36

Daprs Grau et al

pRBC: globule rouge infect