Superenrollamiento de ADN.

El ADN es una molcula enormemente larga que no es recta ni homognea en toda su longitud. Muy al contrario, ya se ha visto que se puede curvar segn las circunstancias pero, adems, se puede enrollar o desenrollar respecto al modelo cannico definido por Watson y Crick. La variacin en la helicidad se traduce en una tensin, tanto positiva como negativa, que se libera formando espirales de doble hlice en un sentido u otro.

Parmetros de enrollamiento.
Actualmente se puede definir una serie de parmetros para describir el estado de enrollamiento de una molcula o fragmento de ADN. Todos ellos se basan en el concepto de nmero de enlace.

Nmero de enlace.
Se define como el nmero de veces que una hebra se enrosca alrededor de la otra, y se representa por L (de linking, enlace en ingls). El nmero de enlace es, por su propia definicin, constante en una molcula de ADN circular cerrada o en un fragmento que tenga extremos fijados a algn sitio, siempre que no se rompan las cadenas. Por otro lado, en ADN circular cerrado es necesariamente un nmero entero. Este concepto es realmente difcil de imaginar sin conocer todava los otros dos parmetros. Sin embargo, se hace intuitivo que en un ADN circular cerrado, el nmero de veces que una hebra da vueltas sobre la otra debe equivaler al nmero de vueltas totales de la doble hlice. De esto se puede extraer que en el caso de que no haya tensiones en una molcula cerrada, hay un nmero de enlace que llamaremos estable o ideal y denotaremos por L0 y que, adems, es tambin el nmero de vueltas que debera tener el ADN, es decir, el nmero de pares de bases dividido por 10,5 pares de bases por vuelta en el ADN B.

Nmero de torsin.
Se representa por T (de twist, torsin en ingls), y equivale al nmero real de vueltas de la doble hlice. Y cul es la diferencia con L? La diferencia es que T s puede cambiar segn la forma que adquiera el ADN. Va a tender siempre a llegar al valor terico del nmero de enlace estable L 0, es decir, siempre procurar llegar a tener 10,5 pb/vuelta.

Nmero de contorsin.
Se representa por W (de writhe, contorsin en ingls), y es una medida del nmero de veces que se enrollan las dobles hlices una con otra. Da una idea de los superenrollamientos de la doble hlice. Ni este ni el nmero anterior tienen porqu ser enteros.

Los tres nmeros se relacionan mediante la siguiente ecuacin: L=T+W Partiendo del modelo del ADN circular cerrado, y suponiendo que no hay superenrollamientos (W = 0), entonces el nmero de vueltas y el nmero de enlace son iguales: L = T. Si tampoco hay tensiones, entonces los dos nmeros anteriores son iguales al nmero de enlace ideal L0. Supongamos que se corta el ADN y uno de los extremos se gira una vuelta a derechas antes de volver a sellar los extremos, entonces se obtiene una molcula de ADN con una vuelta menos de la que le correspondera por el nmero de pares de bases, es decir, L < L0. En este caso ya no es estable una molcula plana, porque el nmero de vueltas total es menor del que correspondera, con lo que hay que aumentarlo en una unidad; es decir, con la molcula plana T = L, pero como hay una vuelta menos, hay ms pares de bases por vuelta, con lo que hay que aumentar T en una unidad para volver al nmero ideal de pares de bases por vuelta o, lo que es lo mismo, hay que acercar T a L0 para liberar la tensin producida por el desenrollamiento en una vuelta. Esto se consigue haciendo que el ADN se retuerza la vuelta que falta (regla mnemotcnica: si faltan vueltas en la doble hlice, que son a derechas, se meten superhlices a derechas). Como L, T y W estn relacionados, y lo que buscamos es subir el valor de T, las vueltas a derechas de la superhlice se correspondern con un decrecimiento de W; es decir, partimos de que L = L0 1 y, como con la molcula plana L = T, entonces T < L0. Sabemos que L es invariable a menos que se rompan las hebras, con lo que si para acercarse al nmero ideal de vueltas hay que hacer T + 1, entonces W tendr que bajar a W - 1 para que L siga constante. Se puede considerar que W contrarresta T para que L permanezca invariable. En este caso, como T aumenta y W disminuye, se dice que se produce un superenrollamiento negativo. Conclusin: los superenrollamientos a derechas suponen decrecimientos de W, por lo que se llaman negativos, pero hacen que T aumente en tantas unidades como superenrollamientos. El razonamiento anlogo se puede considerar si aumentamos L en una unidad: se producir un superenrollamiento a izquierdas (positivo) que reducir el nmero de vueltas partiendo desde la molcula plana. Todas las molculas con igual nmero de pares de bases se llaman topoismeros o ismeros topolgicos, porque slo se diferencian en la topologa o estructura tridimensional de la doble hlice, es decir, slo se diferencian en los valores de L, T y W. Una manera distinta de relajar un ADN superenrollado negativamente es utilizar la energa provocada por la torsin en desenrollar las vueltas que sean necesarias para que la molcula recupere la estabilidad. Este fenmeno de interconversin entre superhlices negativas y desapareamiento de bases puntual es de extrema importancia en condiciones fisiolgicas, ya que permite abrir la doble hlice en determinados sitios cuando se necesite, por ejemplo, en los procesos de replicacin y transcripcin para permitir la entrada de la polimerasa correspondiente. Adems, y si la regin desenrollada es un palndromo, se podran generar los cruciformes.

Segn la forma que presente el ADN se consideran tres tipos: Tipo I: ADN superenrollado negativamente. Es el tipo normal en la clula. Tipo II: ADN circular. Se obtiene el cortar el ADN tipo I con una endonucleasa que corte slo una de las dos cadenas. Tipo III: ADN lineal. Se obtiene al cortar ADN tipo I con una endonucleasa que corte ambas cadenas. Los tres tipos son los que se pueden obtener de lisados con la mnima manipulacin. El ADN superenrollado positivamente no es natural pero se puede fabricar.

Titulacin de superenrollamientos.
Se puede determinar el nmero de superenrollamientos de una molcula mediante la utilizacin de agentes intercalantes. stos, como el bromuro de etidio, siempre distorsionan a doble hlice desenrollndola, es decir, disminuyendo el T al que una molcula determinada es estable. Con esto, y partiendo de que el ADN en medio fisiolgico est superenrollado negativamente, al disminuir T se tiene que contrarrestar con un aumento equivalente de W, con lo que el efecto es que se eliminan superhlices negativas hasta llegar a no tener ninguna, y todava se pueden provocar superhlices positivas al aumentar la concentracin de agente intercalante. Se ha calculado que hacen falta 12,8 molculas de agente intercalante para desenrollar una vuelta de hlice. Se puede realizar una titulacin del nmero de superenrollamiento mediante tcnicas de sedimentacin y de movilidad electrofortica a distintas concentraciones del agente intercalante (Voet pg. 873). Las diferencias se aprecian en el valor absoluto de superenrollamiento, ya que un ADN con n o n superhlices tiene una forma equivalente. Teniendo en cuenta esto, cuanto mayor sea el nmero de supervueltas, indistintamente de su signo, mayor ser el coeficiente de sedimentacin y la movilidad electrofortica.

Implicaciones biolgicas del superenrollamiento.

En el cromosoma, tanto eucaritico como procaritico, el ADN no es circular cerrado, pero se organiza en dominios topolgicos fijos y anclados a soportes proteicos, con lo que s pueden presentarse fenmenos de superenrollamiento porque L no puede variar dentro de estos dominios. Concretamente, se calcula que en la clula hay una superhlice negativa cada 100 pb, aproximadamente. La densidad de superhlices ( ) es un parmetro topolgico que se determina hallando el nmero de superhlices por cada diez pares de bases. De este modo la densidad normal de superhlices en la clula es de = -0,1. Siempre que se habla de ADN desenrollado se refiere a que su nmero de enlace es menor del que correspondera, y no a que el nmero de vueltas real sea menor. Las implicaciones de que el ADN est normalmente desenrollado son muy grandes porque, adems de permitir la separacin puntual e inmediata de las dos hebras, las superhlices negativas tambin se

pueden relajar girando a izquierdas alrededor de un obstculo (IMPORTANTE: Los superenrollamientos negativos pueden ser tanto superhlices a derechas de la propia doble hlice sobre s misma, como giros a izquierdas de la doble hlice sobre un soporte, llamado superenrollamiento toroidal. Al final es la misma cosa, si lo logris ver). Este fenmeno es el que permite la compactacin del ADN y su organizacin en nucleosomas en el ncleo. En los libros se cuenta que un sobrecruzamiento, es decir, una superhlice negativa arrollada a derechas, se corresponde con dos enrollamientos toroidales a izquierdas. Esto slo es cierto para el caso de un ADN circular cerrado y slo en el caso de que se considere el bucle externo como vuelta alrededor del nucleosoma. Es complicado de ver si no lo hace uno mismo con una cinta larga (puede servir un cinturn), y probando a mantenerla cerrada o abierta despus y antes de darle las vueltas al nucleosoma. Realmente decir que un sobrecruzamiento equivale a dos vueltas toroidales es producto de una apreciacin errnea del giro del ADN alrededor del soporte. Para resolver estas dudas viene muy bien la figura 28-36 del Voet, en la que se aprecia cmo no son dos vueltas alrededor de un soporte, sino una y lo que parece, pero no es, otra. Y todo esto pasa por circularizar el ADN. Otra implicacin importante del superenrollamiento negativo del ADN es durante la replicacin y la transcripcin. Ambos procesos necesitan una apertura inicial de la doble hlice, que se permite por el grado de desenrollamiento del ADN, pero al avanzar la polimerasa correspondiente por la doble hlice, se produce un apilamiento de vueltas delante y una falta de ellas detrs, lo que a razn de 100000 bases por minuto acabara con el proceso en apenas un segundo (en realidad delante y detrs sigue habiendo el mismo nmero de vueltas, pero se distribuyen en menos y ms bases, respectivamente). Esta acumulacin se debe a varias causas, entre ellas a que la polimerasa no puede ir girando a esas velocidades alrededor del ADN, y a que el ADN tampoco puede girar libremente ni delante ni detrs de la enzima porque tiene sus extremos fijos (evidentemente, en un plsmido libre, la compresin por delante y la falta de vueltas detrs se anularan solos). La solucin pasa por eliminar las vueltas de ms que se generan delante mediante un conjunto de enzimas llamadas topoisomerasas, capaces de cambiar el nmero de enlace del ADN.

Topoisomerasas.
Son las enzimas encargadas de mantener el nmero y cantidad de superenrollamiento en una regin, dominio o zona determinada del ADN segn el ndice y proceso metablico que se d en un momento dado. El mecanismo general de accin es cambiar el nmero de enlace de uno en uno o de dos en dos. Las topoisomerasas son, por tanto, de dos tipos:

Topo I: Aumentan de uno en uno el nmero de enlace, por lo que disminuyen o eliminan superhlices negativas. Esto lo consiguen rompiendo una de las dos hebras, fijando uno de los extremos a la enzima y haciendo pasar el otro por el otro lado de la hebra intacta. Como fisiolgicamente el ADN est superenrollado negativamente, el proceso de eliminacin de superhlices negativas es espontneo. La energa necesaria para resellar la hebra viene de que la energa de la hidrlisis se conserva en un enlace fosfodister entre el extremo 5 y un residuo

de Tyr. En las topo I eucariticas se enlaza el extremo 3 de manera similar, y adems pueden relajar ADN en cualquier sentido in vitro. Topo II: Disminuyen de dos en dos el nmero de enlace, por lo que aumentan el superenrollamiento negativo o, tambin, eliminan superenrollamientos positivos. El mecanismo de accin tambin pasa por la rotura pero, en este caso, de las dos hebras. Un mecanismo propuesto es que el ADN superenrollado positivamente gire alrededor de la enzima con una superhlice toroidal a derechas. Este sera el sustrato para que la enzima actuara cortando las dos hebras y pasando cada extremo por un lado distinto de la hlice intacta, volviendo a sellar en el otro lado. El producto es un ADN con un superenrollamiento toroidal a izquierdas, con lo que el nmero de enlace ha bajado en 2 en ese punto (+1 a 1). Cuando se parte de un ADN superenrollado positivamente el proceso es espontneo, pero como en la clula siempre se parte de ADN superenrollado negativamente, introducir otra supervuelta negativa requiere energa. Sin ATP slo puede relajar superhlices de cualquier signo, pero muy lentamente. La topo II eucaritica ni utiliza ATP ni introduce superenrollamientos negativos, sino slo relaja las supervueltas de cualquier signo. Ambas unen transitoriamente el ADN por ambos extremos 5 mediante un residuo de fosfotirosina. Los superenrollamientos se pueden ahora titular partiendo de un ADN superenrollado negativamente y un posterior tratamiento con topo I que, segn el tiempo de reaccin, se obtendran bandas diferenciadas de cada grado individual de superenrollamiento en un gel de electroforesis. A su vez, se puede titular la actividad topo II al partir de un ADN totalmente relajado y en presencia de la enzima y ATP, con lo que se distinguiran bandas producidas por la incorporacin de superhlices negativas hasta el mximo posible que cupiera en la molcula.

Estabilizacin de superhlices.
En el cromosoma bacteriano el ADN se presenta prcticamente libre de protenas asociadas y los dominios son simples bucles de cido nucleico relativamente libre y cuyo superenrollamiento adquiere conformaciones ms o menos al azar, transitorias e inestables. Los cromosomas eucariticos, por su parte, estabilizan cada grado de desenrollamiento mediante la formacin de estructuras supramoleculares cuya estructura se tratar ms adelante pero que, esencialmente, se basan en la estabilizacin de los superenrollamientos negativos en forma de superhlices toroidales a izquierdas alrededor de una estructura proteica que hace de una especie de cilindro. Esta asociacin de ADN alrededor de una estructura proteica se llama nucleosoma. Estas estructuras permiten estabilizar o proteger las superhlices, restringiendo el libre giro de una hebra sobre la otra cuando se produce un corte en una de ellas, de modo que no se pierda la superhelicidad del dominio entero en caso de que haya un pequeo corte de una sola de las cadenas. Se ha determinado mediante ensayos de digestin parcial de ADN que hay unos 200 pares de bases girados en dos vueltas alrededor del ncleo proteico de un nucleosoma. Una vez ms, la apreciacin no es correcta del todo, porque de esas casi dos vueltas toroidales

a izquierdas, realmente es slo una la que est distorsionada, y el resto son ramas de entrada y salida del ADN en forma B. En esos 200 pb hay, aproximadamente, un solo superenrollamiento negativo.

Superenrollamiento y la replicacin y la transcripcin del ADN.

Retomamos el problema planteado anteriormente de cmo se resuelve en el medio celular la compresin del ADN delante de la polimerasa correspondiente. Ahora se puede decir qu topoisomerasa se necesita por delante, donde se acumulan las vueltas pero se queda sin bases suficientes para todas ellas, es decir, se crean superhlices positivas (L > L0). La enzima bacteriana girasa es una topoisomerasa de tipo II, que recorre la doble hlice delante de la horquilla de replicacin y elimina superenrollamientos positivos (baja L) a razn de 10000 por minuto, para que la ADN polimerasa pueda mantener el ritmo de 100000 bases por minuto. Durante la transcripcin ocurre algo parecido pero, adems, se genera demasiado desenrollamiento por detrs, ya que no se sintetiza ADN nuevo. Esto se debe a que, dado que la polimerasa no puede girar sobre s misma porque tiene el ARNm y los ribosomas pegados a ella, adems de que es demasiado grande, provoca realmente la divisin del dominio en otros dos, cada uno con sus caractersticas topolgicas. Esto ha dado lugar a la teora de los dominios gemelos, en la que una topo II actuara por delante, y una topo I por detrs durante el proceso de transcripcin. Teniendo en cuenta la organizacin del cromosoma bacteriano, en el que un gen puede estar transcribindose simultneamente por tantas ARN polimerasas como quepan en su longitud, se hace necesario un estricto control para de la superhelicidad del ADN, aunque ya slo sea para no romperlo. En eucariotas las superhlices, tanto positivas como negativas, se podran relajar con cualquiera de los dos tipos de topoisomerasas. La transcripcin presenta, adems, el fenmeno de la regulacin. En procariotas la ARN polimerasa se ancla selectivamente a las secuencias 10 y 35 de la regin del operador, antes de los genes estructurales del opern. La presencia de la enzima, unido a la de ADN curvo en esa zona, provoca un curvamiento y una unin fuerte y especfica de la polimerasa cuyo efecto sera el de desenrollar el ADN (generar algo de superenrollamiento negativo) para poder provocar la transicin hacia la separacin de las dos hebras en la regin de ms debilidad, es decir, en la caja TATA (-10). El modelo de regulacin mediante la superhelicidad del ADN prev que la funcin de activadores e inhibidores que interaccionen tanto con el ADN como con la propia polimerasa provocaran, respectivamente, un mayor o menor superenrollamiento negativo, de modo que sea ms o menos probable la transicin al desapareamiento de bases. Todo esto sera necesario porque comenzar a transcribir el ADN hace falta que la ARN polimerasa se interponga entre las bases de una o dos vueltas.

Estructura cuaternaria de ADN.

Se considera estructura cuaternaria de ADN a las interacciones entre ste y las protenas accesorias.

Estructura de la cromatina.
Es una cuestin evidente que para almacenar todo el ADN de un organismo, incluido un virus, hay que empaquetarlo hasta niveles que pueden llegar a ser de 5 6 rdenes de magnitud. Este empaquetamiento se consigue slo mediante la interaccin con protenas especficas. El estudio de la estructura cuaternaria de los cidos nucleicos es necesariamente destructivo, con lo que se pierde mucha informacin en el abordaje experimental. Lo primero que hay que hacer es romper la cpsula o clula en la que est incluido el cido nucleico, con lo que se esparcen y pierden multitud de protenas (estructurales, con funciones metablicas, reguladoras) y ARN que pudieran aportar ms informacin que la que realmente se obtiene.

Estructura en virus y bacterias.

Los virus generalmente tienen espacio suficiente en su cpsida para albergar todo su genoma sin ms compresin que la generada al hacer un ovillo. De todos modos, las protenas de la cpsida se unen especficamente a secuencias del ADN, y el tamao es ligeramente ajustable segn la cantidad que entre. Otro tipo de empaquetamiento es que la cpsida se enrolle alrededor de una molcula del cido nucleico que se trate. Las bacterias tienen su cromosoma en una estructura llamada nucleoide, y que suele ocupar 1/3 del volumen total de la bacteria. Dentro de un nucleoide se considera que puede haber entre 50 y 100 dominios de topologa y condiciones metablicas diferentes, separados no se sabe cmo, y cada uno entre 50 y 100 Kpb. Dentro de ellos se observa un superenrollamiento negativo cada 200 pb, pero se considera que es slo la mitad de los que realmente hay in vivo. Se sabe muy poco acerca de la estructura de este nucleoide, excepto las proporciones relativas de ADN (80%) y ARN y protenas (20%). Al comparar estos datos con los del ncleo eucariota (33% de ADN, protenas y ARN) se observa que en las bacterias hay muy pocas protenas, con lo que el ADN est prcticamente desnudo, probablemente para maximizar el proceso de transcripcin. El ADN bacteriano se asocia a protenas bsicas de algn modo todava no determinado, pero bastante dbilmente, porque se pierden irremisiblemente en cualquier proceso de anlisis estructural hasta la fecha. An as, se han detectado protenas llamadas HU (HU1 y HU2) de entre 18 y 20 KDa, que se especula que forman un tetrmero al estilo de las histonas en el nucleosoma (ver ms adelante), pero la interaccin es tan dbil que no se puede medir su tiempo medio de disociacin del ADN. Esta unin tan laxa tambin hace hincapi en la idea de la maximizacin de la eficacia de los recursos y los procesos, tanto de transcripcin como de replicacin. Se ha comprobado que estas protenas bsicas inducen curvatura en el ADN en fragmentos tan pequeos como 80 pb, y que estabilizan superenrollamientos negativos porque

mutaciones en sus genes hupA y hupB (en los dos) cursan con una disminucin del nmero de superenrollamientos. La mutacin ha de ser en ambos genes, ya que si no, no se observa cambio alguno, es decir, parece que ambos productos gnicos son intercambiables o equivalentes, o tambin que hay otras que pueden realizar la funcin de una u otra. Por ahora no se conoce ninguna secuencia de unin especfica para estas protenas, por lo que la unin sera inespecfica. Adems de estas protenas HU existen otras como la HNS (protena parecida a H1; H1-like), que tiene avidez por fragmentos de ADN curvo, y la protena P (positiva), que no se sabe para qu sirve.

Estructura en eucariotas.
El conocimiento de la estructura de la cromatina eucariota es mayor que el de la bacteriana. Se conocen mejor las protenas bsicas asociadas al ADN, llamadas histonas, porque forman estructuras estables llamadas nucleosomas, presentes a lo largo de todo el ADN, formando de una fibra de 11 nm. stas se enrollan sobre s mismas en una estructura de supersolenoide para formar fibras de 30 nm, cada vuelta del solenoide formada por seis nucleosomas consecutivos. Despus se sabe muy poco hasta llegar a la estructura de mxima compactacin que es el cromosoma metafsico, bastante estable. En l cada cromtida es una molcula de ADN comprimida hasta ser un cilindro de 800 nm de dimetro y algunas micras de largo. La composicin de la cromatina eucariota es un tercio de ADN, otro de histonas y otro de otras protenas estructurales y con funcin metablica y ARNhn. Las histonas se asocian al ADN sin especificidad de secuencia pero con una regularidad asombrosa y forman nucleosomas del modo que ya se ha descrito someramente, al estabilizar los superenrollamientos negativos. Una hilera de nucleosomas sobre la misma molcula de ADN forma una fibra visible al microscopio electrnico como una especie de collar de cuentas o rosario, en determinadas condiciones de baja sal, que tiene una anchura de 11 nm. En condiciones de salinidad alta se observa cmo los nucleosomas ya no estn separados, sino que se pegan unos a otros sin poder ver espacios entre ellos. Esta agregacin es posible porque se une al ncleo del nucleosoma otra protena bsica, llamada histona H1, que hace de una especie de grapa para que el ADN no se desenrolle. Cada nucleosoma completo de puede asimilar a un cilindro que, gracias a la mediacin de H1, se puede llegar a asociar con el siguiente de modo que se genere un solenoide de nucleosomas, exactamente con seis por vuelta de solenoide y con las H1 en el centro. Estos solenoides seran las fibras de 30 nm observables en el microscopio electrnico en determinadas condiciones. Despus de esto se sabe muy poco acerca de cmo se organizan estos solenoides, probablemente sobre una matriz o un armazn (scaffold) proteico no histnico. Se especula que pueden formar bucles de diferentes longitudes que para formar el cromosoma metafsico se apilan de determinada manera para formar cada cromtida. En citologa se ha distinguido desde hace mucho tiempo entre heterocromatina densa y eucromatina ms difusa segn el grado diferencial de tincin, que se corresponde con la mayor o menor unin a protenas. Generalmente se pueden asimilar a cromatina inactiva y activa, respectivamente, pero esto no es siempre del todo cierto, porque hay genes transcripcionalmente activos en la heterocromatina, y

otros inactivos en la eucromatina. Adems, hay heterocromatina constitutiva (permanente) y otra facultativa, que segn del tejido y el estado metablico de la clula se presenta o no. No se sabe, hilando con lo anterior, si las zonas de unin de las fibras de 30 nm al armazn son estables o si se pueden cambiar segn las necesidades. Actualmente se investigan las llamadas MAR (matrix attachment regions: regiones de unin a la matriz), para ver si son fijas o no. Las pocas que se han podido aislar no presentan ninguna homologa secuencial asimilable a una misma secuencia consenso (apenas riqueza en C y A) y, adems, se ha detectado que algunas de estas MAR son regiones de regulacin en cis (contiguo al gen) de genes transcripcionalmente activos en uno de los bucles adyacentes. Por todos estos datos, parece que la unin a la matriz o al armazn es dinmica durante la interfase. En la metafase la unin de la cromatina al armazn para formar cromosomas es ms estable pero, a la vista de estos resultados, parece que, adems, es inespecfica.

Nucleosomas.
Los nucleosomas son las partculas estructurales bsicas de la cromatina eucaritica. Ya se ha avanzado que consisten en un ncleo proteico alrededor del cual se arrollan dos superhlices negativas de ADN de manera toroidal y levgira. Al tratar suavemente la cromatina con ADNasa micrococal, que corta ADNds, se pueden obtener oligmeros de nucleosomas que, tras un anlisis electrofortico, se observa que abarcan siempre mltiplos de 200 pb, con lo que se puede concluir que cada nucleosoma contiene unos 200 pb. La separacin en oligmeros tambin indica que hay tramos de ADN desnudo y muy expuesto, pero que el 90% de esos 200 pb est protegido por el ncleo proteico de histonas. Esto permite diferenciar entre el ADN del ncleo del nucleosoma, que ser bsicamente constante, y el ADN de unin, al que se debern las posibles variaciones en la longitud total de cada nucleosoma. Esta ltima apreciacin se demuestra tratando los nucleosomas aislados con nucleasas. En principio se obtienen fragmentos de 166 pb, correspondientes al ADN completo que da dos vueltas enteras alrededor del ncleo proteico y est todava asegurado por la histona H1, que se encuentra por fuera. Esta disposicin obliga a la doble hlice a entrar y salir por el mismo sitio, obligando a los nucleosomas a empaquetarse unos junto a otros cuando estn unidos. Si se aumenta el tiempo de digestin, o si se disminuye la fuerza inica, la histona H1 se libera y entonces se obtiene una fragmento de ADN de 146 pb unido al resto de protenas del ncleo del nucleosoma: las histonas H2A, H2B, H3 y H4. Como regla general, la histona H1 interacciona con unos 22 pb del ADN de unin. El ncleo del nucleosoma est constituido por dos unidades de cada histona, ensambladas como el tetrmero [H4H3H3H4] al que se unen dos dmeros [H2AH2B]. El conjunto se asemeja a un cilindro de 6 nm de alto por 6,4 nm de dimetro y de un peso molecular de 108000 Da (H2A: 14000; H2B: 14000; H3: 15000; H4: 11000). Sobre este ncleo proteico (denominado octmero) se enrollan de promedio unos 200 pb de ADN, cuyo peso es de 130000 Da, y se asegura con la histona H1 que tiene, tambin de promedio, unos 24000 Da. El resultado es un cilindro tan alto como el anterior, pero con 10,4 nm de dimetro, una

estructura formada a partes iguales por ADN y protenas y estabilizada mediante interacciones electrostticas entre los fosfatos del ADN y los aminocidos bsicos (His, Lys, Arg) de las histonas. Las histonas que componen el octmero estn enormemente conservadas en todos los eucariotas. De ellas la ms constante es la H4, que es exactamente igual en todos los animales estudiados hasta la fecha, y slo se han encontrado cambios conservadores en dos o tres aminocidos entre los de animales y algunas plantas superiores. La segunda ms conservada es la H3, y posteriormente las H2A y H2B, con ms variabilidad dentro de grupos filogenticamente emparentados. La extremada conservacin de H3 y H4 se debe a que se ha comprobado que ellas solas son capaces de formar estructuras parecidas a los nucleosomas, unindose al ADN sin la participacin de H2A y H2B. El caso de H1 es distinto, porque su misin principal no es formar nucleosomas, sino unirlos o empaquetarlos de diferente manera, con lo que presenta una variabilidad muy grande incluso dependiente del momento del desarrollo o del tejido que se considere. De hecho, en los eritrocitos de pollo la H1 es tan diferente a las dems que hay quien la llama histona H5. Esta gran diversidad de la histona H1 es, probablemente, la causa de que el ADN de unin no tenga una longitud constante, sino que pueda variar entre 8 y 114 pb (54 pb de media). En cualquier caso, siempre habr 146 pb alrededor del octmero, que se corresponden con 13 vueltas de hlice, segn una digestin con ADNasa I, que provoca cortes en una sola de las cadenas de ADNds. El grado de contorsin de estas 1,7 vueltas de la doble hlice no es constante, sino que se mantiene bastante estable, salvo en sitios donde se produce un giro brusco. Estos curvamientos se deben principalmente al efecto de las protenas (ya se ha dicho que la unin es inespecfica de secuencia), pero tambin a pares AA y GC en el sitio. Estas distorsiones son muy acusadas, y provocan cambios importantes en la anchura de los surcos en el ADN que se reflejan en cambios de la contorsin, que pasa de 10 pb/vuelta en los segmentos de entrada y salida a 10,7 pb/vuelta en los centrales. Es en estos segmentos contorsionados donde se generan entre 0,7 y 0,8 superenrollamientos negativos, porque son stos los que recorren el ncleo proteico oblicuamente para poder salir por abajo y entrar por arriba. Periodicidad de los nucleosomas. Ya se ha avanzado que la unin del ADN a los nucleosomas es independiente de la secuencia pero, sin embargo, los nucleosomas se forman con una regularidad asombrosa. Esto llev a desarrollar experimentos en los que se pondra de manifiesto cul sera en patrn de formacin. Se selecciona una secuencia con sitios de restriccin especficos y se marca radioactivamente. Despus se ensamblan las histonas y se corta el ADN en nucleosomas. Luego se digiere con la enzima de restriccin de uno de los extremos y se somete a electroforesis y a autorradiografa. Si fuera la secuencia la que determinara el lugar del nucleosoma, slo se obtendra una banda ntida (estaran los nucleosomas en fase); si, por el contrario, no hubiera absolutamente ninguna determinacin por parte de la secuencia, se observara una mancha difusa y uniforme (los nucleosomas no estaran en fase). El resultado obtenido es que la situacin parece intermedia. Actualmente se postula que debe haber una secuencia fija sobre la que se forma rpidamente el

primer nucleosoma, mientras que los dems, sencillamente, se forman despus sobre su referencia y a distancias marcadas por la histona H1. Replicacin y transcripcin con nucleosomas. Durante la replicacin los nucleosomas se desorganizan y reorganizan inmediatamente, con lo que no hay grandes espacios sin proteger al menos en la hebra conductora. Cabe la pregunta de si la replicacin de las histonas es tambin semiconservativa o sigue un patrn distinto al del ADN. En principio parece que cada octmero es una mezcla de protenas viejas y nuevas, pero la hebra conductora adquiere rpidamente sus octmeros, mientras que la hebra retardada no, probablemente debido a la presencia de fragmentos de Okazaki y a las protenas SSB (single stranded binding proteins) que se unen a fragmentos de ADNss. In vivo las histonas no se encuentran libres en el nucleoplasma, porque precipitaran debido a las fuertes interacciones que se dan entre ellas. Para evitar esto existen las protenas N1 y la nucleoplasmina, muy cidas, que transportan y protegen (o al revs) tetrmeros H3 2H42 y dmeros H2AH2B. Adems de estas protenas transportadoras, que se pueden considerar chaperonas moleculares, debe haber alguna otra (que a lo mejor no lo es, llmalo X) que indique los sitios que correspondern al ADN de unin, probablemente una protena del grupo HMG (high mobility group: grupo de alta movilidad [electrofortica]) y que algunos se aventuran a sealar como el dmero14/17. Evidentemente, esto es un modelo y debe considerarse como algo transitorio. Durante la transcripcin hace falta eliminar los nucleosomas porque la ARN polimerasa es demasiado grande como para que pudieran permanecer (recordar que lleva consigo, adems, una hebra de ARNhn y un montn de protenas accesorias). Esta necesidad llevada al extremo se observa en sitios con una intensa actividad transcripcional, como la de los genes ARNr, donde el ADN aparece totalmente desprovisto de nucleosomas. Esto se puede comprobar midiendo la longitud del ARN naciente y comparndola con la del ADN que lo codifica. La mayor o menor estructuracin de los nucleosomas se puede relacionar con una menor o mayor tasa de transcripcin, hecho que se observa en los genes activados por calor de Drosophila. En esta aproximacin se aprecia que cuando el gen no est inducido, la digestin con ADNasa micrococal genera el patrn de bandas caracterstico de la presencia de nucleosomas, pero al subir la temperatura ya no se ven bandas, sino una mancha difusa, lo que indica que la nucleasa corta en cualquier sitio y no debe haber nucleosomas. Esta correlacin entre la mayor o menor organizacin en nucleosomas y la tasa de transcripcin puede utilizarse para la determinacin de la actividad de un gen en determinados estados del desarrollo o en determinados tejidos. Para ello se trata el ADN con la nucleasa micrococal a distintas concentraciones, y luego se digiere con una enzima de restriccin que se sabe que proporciona un fragmento que hibrida con una sonda. Si el gen no es transcripcionalmente activo, siempre aparecer una banda en cada pocillo, independientemente de la cantidad de nucleasa que se hubiera puesto, pero si la transcripcin es activa, cuanta ms ADNasa hubiera, menores seran los fragmentos recogidos, con lo que quedaran menos fragmentos capaces de hibridar con la sonda despus del tratamiento con la enzima de restriccin y, por tanto, la intensidad de la banda disminuira hasta desaparecer.

Regulacin del empaquetamiento mediante modificacin covalente. Las histonas, sobre todo la H1, reciben numerosas modificaciones posttraduccionales y sufren regulacin covalente en su unin a ADN. As, se observan acetilaciones de Lys y fosforilaciones de Ser, principalmente, que influyen distintamente sobre la interaccin con ADN. Las histonas H3 y H4 pueden acetilarse para evitar una interaccin demasiado fuerte con el ADN, y funcionalmente se ha relacionado con el hecho de que se favorece la transcripcin cuando esto ocurre. La histona H1 se fosforila para provocar un efecto parecido pero, sin embargo, se ha comprobado que se necesita esta fosforilacin para formar cromosomas metafsicos, que representan el grado mximo de empaquetamiento de la cromatina, lo que parece una paradoja. Otras protenas que se fosforilan son N1 y nucleoplasmina, que unen as histona ms fuertemente y, quizs sirva para formar ms nucleosomas y compactar as el ADN, pero esto tambin parece una contradiccin con o anterior.

Interacciones del ADN con otras protenas.

Las histonas se han descartado como elementos de regulacin fina porque su unin al ADN es inespecfica de la secuencia, con lo que la unin de cualquiera de estas protenas al ADN debe ser mediante el reconocimiento especfico de una secuencia concreta. Aunque hay muchas acciones mediadas por la interaccin entre ADN y protenas (desenrollamiento local, reparacin, recombinacin, regulacin de otros reguladores, metilacin de ADN), aqu slo se hablar de los factores de transcripcin y regulacin, que son protenas de tamao medio o pequeo, generalmente dimricas y simtricas respecto a un eje, capaces as de unirse a una molcula en forma de hlice bicatenaria antiparalela. En general se pueden clasificar estas protenas en cuatro tipos segn su unin al ADN: Mediante una hlice (tipo hlice-bucle-hlice). Mediante dos hlices (tipo cremallera de leucina). Mediante una lmina antiparalela. Mediante dedos de cinc.

Protena tipo hlice-bucle-hlice: el represor del fago 434.

Esta protena es sintetizada en la propia bacteria y se une a los genes lticos del fago cuando est infectada para impedir su transcripcin. Es una protena dimrica con dos subunidades iguales, cada una con cinco hlices , de las que la tercera es la que interacciona con el surco mayor del ADN con bases de cada cadena, debido al giro de la doble hlice. La otra hlice del motivo (2) se encarga de mantener en su lugar la otra y, adems, interacciona con los fosfatos del esqueleto. La estructura doblemente simtrica de la molcula se corresponde en al ADN en un palndromo que abarca casi una vuelta y media (14 pb) de la doble hlice, pero en el que slo estn implicados en la interaccin cuatro nucletidos de cada extremo. En

este caso, la protena contacta con el ADN por un lado y en el mismo sitio de dos vueltas consecutivas de la doble hlice. Las protenas de los factores de transcripcin del tipo homeobox (regulan el patrn de desarrollo durante la embriognesis) tambin se unen a ADN mediante motivos hlice-bucle-hlice. Tanto en este caso como en todos los dems tipos, se hace necesaria una interaccin topolgica, es decir, la curvatura, superhelicidad y torsin local del ADN debe ser la que encaje en la protena y viceversa. Del mismo modo, la interaccin puede modificar la topologa del ADN como las interacciones que se dan entre enzimas y sus sustratos correspondientes. Tambin comn a la mayora de protenas de unin al ADN, las interacciones se pueden clasificar como puentes de hidrgeno entre aminocidos y el esqueleto de azcar-fosfato, con las bases, e interacciones hidrofbicas entre aminocidos apolares y las bases del ADN.

Protena tipo cremallera de leucina.

Estos factores suelen ser activadores de genes, generalmente implicados en el desarrollo del ciclo celular (myc, fos, jun), por lo que se estudian intensamente en el campo de la Oncologa. Destaca el hecho de que la mayora pueden formar heterodmeros, pero en cualquier caso se componen de un tallo que es la cremallera y dos brazos que interaccionan con el surco mayor del ADN en una secuencia de unos 8 pb que, en el caso de ser un homodmero, es un palndromo. Esto quiere decir que interacciona por ambos lados de una sola vuelta. Tambin en este caso y debido al giro del ADN, la interaccin se realiza por cada lado con bases de ambas cadenas.

Protena tipo lmina antiparalela: el represor del opern Met.

Vuelve a ser un dmero en el que una lmina formada por un grupo lineal de cada subunidad encaja en el surco mayor y establece interacciones con unas pocas bases de cada cadena, en un palndromo que abarca slo 6 pb.

Protena del tipo dedo de cinc.

Las protenas con dedos de cinc no son dmeros, sino monmeros y, por tanto, no interaccionan con secuencias palindrmicas, sino lineales, generalmente slo sobre una de las hebras, a la que van recorriendo por el surco mayor. Un dedo de cinc es una estructura bsica que se repite modularmente de dos a 16 veces en este tipo de protenas, constituida por dos grupos lineales en horquilla seguidos de una hlice de tres vueltas y colocada sobre la lmina que forman los anteriores. Esto define un hueco, cerca del extremo ms abierto, en el que cabe un tomo de cinc, que establece cuatro enlaces de coordinacin con sendos aminocidos, dos His en las vueltas 2 y 3 de la hlice y una Cys en cada grupo lineal que, adems, mantiene reducidas. Adems, en la base de la unin entre la lmina y la hlice se establecen interacciones hidrofbicas entre

tres aminocidos, uno por cada elemento lineal: Tyr en el extremo N-terminal del primer grupo lineal , Phe en el extremo C-terminal del segundo grupo lineal, y Leu en la primera vuelta de la hlice . No hay un patrn definido de interaccin de los dedos de cinc con el ADN, pero se observa una abundancia de interacciones entre Arg y G, con tres interacciones por dedo de cinc.

Protenas de unin al surco menor.

Es bastante ms extrao que una protena se una al surco menor, principalmente porque no hay sitio, y tambin porque en ese lado las bases no presentan casi informacin. Sin embargo, cada da se descubren factores nuevos que se unen especficamente a secuencias de regulacin por el lado del surco menor, como el TBP que ya se ha comentado y que, adems, provoca una gran distorsin en la topologa del ADN. La interaccin se establece entre una regin hidrfoba en la protena y la caja TATA.

Conclusiones.
De toda la cantidad de datos puntuales recopilados hasta la fecha, no se puede extraer ninguna idea general, salvo que la interaccin es extremadamente especfica de secuencia y la topologa, y de la interaccin misma. La existencia de una simetra palindrmica o no depende de si la protena es ella misma simtrica y, adems, la interaccin se establece por, pero no depende slo de los aminocidos implicados en una sola de las hlices o de las lminas. Generalmente son aminocidos polares los que se encargan de establecer las interacciones, pero no hay un cdigo de reconocimiento establecido o hallado hasta la fecha, con lo que no es posible todava disear un factor a la carta y, adems, porque no se conoce porqu funcionan estos factores ni cmo regulan la expresin de un gen. Este es un campo muy importante de investigacin hoy da.