Portadores nasales asintomticos de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en la comunidad que visita la Clnica Asistencial de la USAM en el Valle de Zapotitn1

Lic. Ana Yolanda Ramos Brizuela Lic. Ana Dolores Portillo Hernndez Departamento de Microbiologa Facultad de Medicina Universidad Salvadorea Alberto Masferrer

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE INVESTIGACION

ANTECEDENTES DEL PROBLEMA DE INVESTIGACION Los seres humanos constituyen el principal reservorio de Staphylococcus aureus en la naturaleza. La mucosa de la parte anterior de la nasofaringe supone el principal lugar de colonizacin (4). La colonizacin de regiones mucocutneas supone un factor de riesgo importante para las infecciones estafilocccicas. Se sabe que la infeccin de una herida quirrgica tras una intervencin cardio-torxica resulta hasta 10 veces ms probable entre pacientes que albergan S. aureus en las fosas nasales antes de la operacin que en las dems personas (4). Staphylococcus aureus es un agente frecuente de infecciones en lactantes y nios, la fuente usual de infeccin estafilocccica es la colonizacin de las fosas nasales cuya diseminacin se produce por aerosoles de las fosas nasales anteriores o con mayor frecuencia mediante el contacto interpersonal desde el personal hospitalario a los pacientes(7). La prevalencia e incidencia de los portadores nasales de Staphylococcus aureus varia de acuerdo a la poblacin estudiada; en un estudio realizado en preescolares de Maracaibo en 2000 se obtuvo 73.50% de portadores de los cuales 48.98% presentaban colonizacin nasal; 10.20% colonizacin farngea y 40.82% presentaban estas bacterias, tanto en nariz como en faringe (14). En Holanda se determin el ndice de portadores nasales de Staphylococcus aureus en 91 individuos de diversos departamentos de una universidad; reportando 33 (36%) de portadores nasales persistentes; 15 (17%) de portadores nasales intermitentes y 43 (47%) de no portadores. Despus de ocho aos se

este trabajo fue presentado en el Primer Congreso de AUPRIDES El pas que queremos en Noviembre del 2007

evaluaron a los mismos voluntarios y se observ una persistencia de portadores nasales de Staphylococcus aureus en 12 (13%) (7). Un estudio en personal hospitalario en Cuba arroj cifras de 31% de prevalencia de portadores nasales, cifras comparables con las Gaspar y Col. en 1991 en Espaa donde la prevalencia fue de 22.17%(7). En El Salvador, existen pocos estudios en los que se detectan portadores nasales, pero no aparecen datos epidemiolgicos importantes sobre portadores de S. aureus en la comunidad.

FORMULACION DEL PROBLEMA DE INVESTIGACION En el ao 2006 se investig la presencia de portadores nasales asintomticos de S. aureus en las personas que acudieron a la Clnica Asistencial de la USAM en Zapotitn. 41 de los 152 estudiados resultaron positivos a esta bacteria. En este trabajo se pretenda conocer si esta relacin se haba incrementado, disminuido o si se mantena en cifras similares en igual perodo del ao 2007.

JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION Diferentes estudios microbiolgicos y epidemiolgicos demuestran que los seres humanos son los principales reservorios de Staphylococcus aureus en la naturaleza, de hecho, la mucosa de la parte anterior de la nasofaringe supone el principal lugar de colonizacin y aproximadamente el 30% de los adultos sanos resultan afectados en un momento de su vida (11). La mayor parte de infecciones por S. aureus adquiridas en la comunidad son auto-infecciones por cepas que el individuo ha portado en la porcin anterior de las fosas nasales, sobre la piel o en ambos sitios (11). Numerosos factores de riesgo se han asociado con el incremento y la severidad de las infecciones del tracto respiratorio inferior, tales como: edad, sexo, nivel socioeconmico, eficiencia de los mecanismos de defensa del hospedero entre otros (11). Si el nmero de portadores se reduce, disminuir tambin la transmisin de estos microorganismos y, por ende, la morbi-mortalidad debida a infecciones agudas del tracto respiratorio inferior (11). En el pas, la informacin relacionada a la presencia de portadores nasales es muy escasa, lo que motiv a realizar la presente investigacin para: Determinar la incidencia de portadores nasales en un lugar especfico que pudiera ser reflejo para el resto del pas. Comparar en dos aos consecutivos la presencia de portadores nasales, de acuerdo a edad, sexo, ocupacin y procedencia de la poblacin estudiada para conocer si el promedio de estos portadores nasales asintomticos permanece en

una proporcin similar o si se ha modificado y, por medio de la prueba estadstica de comparacin de medias t de Student, conocer si esta modificacin es estadsticamente significativa o si se debe al azar.

OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION OBJETIVO GENERAL Comprobar la presencia de portadores nasales asintomticos de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en personas de 1 a 70 aos que asisten a la Clnica Asistencial de Zapotitn en el perodo de marzo a abril del 2006 y marzo a abril del 2007 y comparar ambos perodos. OBJETIVOS ESPECIFICOS En los portadores nasales de Staphylococcus aureus coagulasa positiva: Identificar el rea de procedencia Identificar el sexo ms afectado Identificar las edades ms afectadas Identificar la ocupacin Determinar la presencia de Staphylococcus aureus por pruebas de Catalasa, Coagulasa y Manitol. Aplicar el estadgrafo de la t de Student entre los valores promedios obtenidos en las dos muestras estudiadas para conocer la relacin entre ellas

MARCO TEORICO El nombre Staphylococcus procede del trmino griego racimo de cocos, dada la disposicin celular de estos cocos principalmente cuando se cultivan en medio de slidos como agar. En las muestras directas, los microorganismos aparecen como clulas nicas, en parejas o cadenas cortas. Los Staphylococcus son cocos Gram positivos de 0,5 a 1,5 micras de dimetro, no mviles, aerobios facultativos, catalasa positivos y capaces de crecer en un medio con el 10% de cloruro sdico y a temperaturas entre el 18 40 C (8). Las especies ms frecuentemente asociadas con infecciones humanas son S. aureus (el miembro ms virulento y mejor conocido del gnero), S. epidermidis, S. haemolithycus, S. lugdunensis, S. saprofyticus, S. schleiferi. El Staphylococcus aureus es la nica especie hallada en humanos que produce la enzima coagulasa; as pues, todas las dems son conocidas comnmente como estafilococos coagulasa negativa (8). En los cultivos en crecimiento, las clulas de S. aureus son uniformemente Grampositivas y de tamao regular, y se agrupan entre si en racimos con la precisin de bolas de billar. En cultivos viejos, lesiones en proceso de mejora y en presencia

de algunos antibiticos, a menudo las clulas se vuelven de tamao ms variables y muchas pierden su positividad a la coloracin de Gram. La pared celular de S. aureus esta constituida por un pptido-glucano grampositivo tpico intercalado con molculas de un cido ribitol-teitoico, que es antignico y relativamente especfico para S. aureus. En la mayor parte de las cepas, el pptido-glucano est cubierto por protenas de superficie; una de ellas, la protena A, es nica porque fija a la porcin Fc de las molculas de IgG, y deja dirigida hacia el exterior la porcin Fab reactiva con el antgeno. Este fenmeno probablemente contribuya a la virulencia de S. aureus ya que interfiere con la deteccin del Sistema Inmune y con la opsonizacin (11). CARACTERISTICAS DE IDENTIFICACION Despus de la incubacin en agar durante la noche, S. aureus produce colonias blancas que tienden a adoptar un color amarillo dorado con el paso del tiempo, caracterstica en la que se basa el epteto aureus (dorado) de esta especie. Todos los estafilococos producen catalasa, una enzima protectora que cataliza la conversin del perxido de hidrogeno txico. Esta sustancia se acumula durante el metabolismo bacteriano o es liberada despus de la fagocitosis, para convertirse en agua y oxgeno (9). La produccin de catalasa que convierte el perxido de hidrgeno en agua y en oxgeno permite diferenciar al Staphylococcus (catalasa positiva) de Staphylococcus y Streptococcus (catalasa negativa) (9). La catalasa utiliza el perxido de hidrgeno como donador y como aceptor de electrones. La catalasa es una hemo-protena que contiene cuatro grupos hem. Adems de poseer actividad peroxidsica, es capaz de usar una molcula de H2O2 como sustrato donador de electrones (reductor) y otra molcula de H2O2 como oxidante o aceptor de electrones. En la mayor parte de las condiciones in Vivo, la actividad peroxidsica de la catalasa parece favorecida (9). CATALASA 2 H2 O2

2 H2 O + O2

Por otra parte, las cepas de S. aureus poseen dos formas de coagulasa: de unin (llamada tambin factor de agrupamiento) y libre. La coagulasa unida a la pared celular estafilocccica puede convertir directamente el fibringeno en fibrina insoluble, y hacer que los estafilococos formen grumos. La libre obtiene los mismos resultados mediante reaccin con un factor plasmtico globulnico (factor de reaccin con la coagulasa [FRC]) para formar un factor similar a la trombina, la estafilo-trombina. Ese factor cataliza la conversin del fibringeno en fibrina insoluble. La coagulasa se usa como marcador de virulencia para S. aureus. El papel de la coagulasa en la patogenia de la enfermedad es especulativo, pero la enzima puede provocar formacin de una capa de fibrina alrededor del absceso 4

estafilocccico, lo que localiza la infeccin y protege al microorganismo de la fagocitosis (8). El estudio ms usado para distinguir a S. aureus de otros estafilococos es la produccin de coagulasa, que se fija de manera no enzimtica a la protrombina y forma con ella un complejo que inicia la polimerizacin de la fibrina. Este proceso se evidencia al incubar dos estafilococos en plasma: en cuestin de horas se produce un cogulo de fibrina (9) o (3). La coagulacin fisiolgica normal de la sangre se produce a travs de complejas series de reacciones, cuyas ltimas dos son: PROTROMBINA + PROTROMBINASA + Ca Cl2 = TROMBINA TROMBINA + FIBRINOGENO = FIBRINA (COAGULO) El papel de la coagulasa estafilocccica parece desplazar tanto la protrombinasa como la protrombina. Primero, la coagulasa se combina con el FRC: COAGULASA + FRC = COAGULASA Este complejo reemplaza a la trombina en la formacin de fibrina FRC + COAGULASA + FIBRINOGENO = FIBRINA (COGULO) El Staphylococcus aureus produce coagulasa, protena de tipo enzimtica que coagula el plasma oxalatado y citratado en presencia de un factor contenido en muchos sueros. Esto proviene de la destruccin metablica del citrato que entonces libera el Ca2+ (esencial para la coagulacin) del citrato quelatado CaCl2 (3). Staphylococcus aureus tambin libera diversas enzimas al medio: La hialuronidasa hidroliza los cidos hialurnicos o mucopolisacridos cidos presentes en la matriz extracelular del tejido conectivo. La hialuronidasa facilita la diseminacin de S. aureus en los tejidos. Ms del 90% de las cepas de S. aureus producen esta enzima. La fibrinolisina o estafilocinasa por su parte puede disolver cogulos de fibrina y es producida prcticamente por todas las cepas de estafilococos. Cuando se introdujo la penicilina, ms del 90% de los estafilococos aislados eran susceptibles a ella. Sin embargo, el microorganismo desarroll resistencia con rapidez, mediada sobretodo por produccin de penicilinasa (-lactamasa). La amplia diseminacin de la enzima es asegurada por su presencia en plsmidos transmisibles (9).

TOXINAS La leucocidina producida por S. aureus puede matar a los leucocitos expuestos de muchos animales. Su funcin en la patogenia es incierta, puesto que los estafilococos patgenos no pueden matar eritrocitos y a veces son fagocitados de manera tan eficiente como las variedades no patgenas. Sin embargo, son capaces de multiplicacin muy activa, en tanto que los microorganismos no patgenos tienden a morir dentro de la clula. La toxina, por su parte, incluye al menos dos protenas que producen descamacin generalizada en el sndrome de la piel escaldada causado por estafilococo. Casi todas las cepas del S. aureus aisladas de los pacientes con sndrome de choque txico producen una toxina llamada toxina-1 del choque txico (TSST-1) la cual es igual a la enterotoxina F y a la exotoxina C pirgenas. En los humanos la toxina se vincula con fiebre, choque y afeccin de mltiples sistemas incluyendo erupcin descamativa de la piel. Aproximadamente el 50% de las cepas de S. aureus producen al menos seis toxinas solubles (A-F). Son toxinas termoestables (resisten la ebullicin durante 30 minutos) y resistentes a la accin de las enzimas del intestino. Son causa importante de intoxicacin alimentaria y se producen cuando S. aureus crece en productos alimenticios a base de carbohidratos y protenas. La ingestin de 25 micras de toxina por humanos o monos provoca vmitos y diarrea. El efecto emtico de la enterotoxina tal vez se debe a la estimulacin del sistema nervioso central (centro del vmito) luego que la toxina acta sobre los receptores nerviosos en el intestino (7). ENFERMEDAD ESTAFILOCCCICA Las infecciones producidas por S. aureus se tipifican como lesiones purulentas, agudas, agresivas y localmente destructoras. Las infecciones que produce en otros rganos, como pulmn, rin, hueso, tambin son focales y destructivas, pero tienen mayor potencial de extenderse en el interior del rgano afectado y ms all, hacia la sangre y oros rganos. Estas infecciones producen fiebre elevada y toxicidad general y pueden causar la muerte en pocos das (11). Las etapas tempranas de la colonizacin por S. aureus son mediadas por diversas protenas de superficie que se fijan a elementos del hospedero, telas, lquidos corporales o cuerpos extraos como sondas y catteres. No se han podido aclarar del todo los mecanismos de diseminacin de las bacterias ms all de la superficie corporal. A ninguno de los muchos factores potenciales de virulencia producidos por Staphylococcus aureus se le puede asignar la funcin nica, incluso primaria, de contribuir a que la bacteria se multiplique y produzca lesiones progresivas en los tejidos. De hecho S. aureus tiene poca capacidad de infeccin, a menos que existan factores como traumatismos, materiales extraos y otras condiciones locales. (11)

Una vez por debajo de la barrera mucosa o cutnea, cualquier mecanismo que proteja a las bacterias de la fagocitosis puede permitirles seguir multiplicndose el tiempo suficiente para que sus productos, como la toxina alfa, inicien la lesin local. Un factor conocido por interferir con la fagocitosis es la protena A de superficie. Su fijacin sobre la porcin Fc de la IgG puede competir con las clulas fagocticas por los sitios de esta clase disponibles, y de este modo disminuir con eficacia la opsonizacin. La produccin de coagulasa puede retrasar la migracin de los fagocitos hacia el sitio de la infeccin, e incluso S. aureus fagocitado puede resistir la accin lisosmica. As la reaccin inflamatoria aguda prosigue y la lesin en desarrollo manifiesta tendencia notable a la localizacin, quiz como consecuencia de la reaccin fibrtica a la lesin de las clulas del hospedero mediada por la toxina alfa. (11) La evolucin de la lesin depende de la capacidad del hospedero para localizar el proceso, lo que difiere segn el tejido afectado. En la piel la regla es la resolucin espontnea del fornculo por granulacin y fibrosis. En pulmn, rin, hueso y otros rganos, el proceso puede seguir diseminndose con produccin de focos satlites y afeccin a regiones amplias. En los peores casos, los estafilococos no son frenados y se difunden hacia la sangre y los rganos distantes. (11) Las manifestaciones clnicas de algunas enfermedades estafilocccicas se deben casi exclusivamente a las toxinas, mientras que en otras se produce proliferacin del microorganismo con formacin de abscesos y destruccin tisular. (9) Sndrome de la Piel Escaldada (SPEE) Este sndrome comprende una gama de trastornos cutneos de gravedad variable causados por cepas de S. aureus productoras de toxinas descamativas y la forma mas grave se denomina Enfermedad de Ritter si afecta afectan a recin nacidos y Necrlisis Epidrmica Txica en las personas mayores. Otras formas mas leves son el pnfigo neonatal y el imptigo ampolloso. La Enfermedad de Ritter comienza frecuentemente con un prdromo inespecfico. La fase aguda se instaura con la erupcin de un exantema eritematoso, el eritema aparece en las zonas periorbitarias y peribucal y se extiende por el tronco y de forma centrfuga a las extremidades; entre los lactantes y los nios son frecuentes la fiebre y la irritabilidad, o el letargo, pero no as la toxicidad general (6). Imptigo ampollar Es una forma localizada de SPEE. Ciertas cepas especficas de S. aureus productoras de toxinas, se asocian con vesculas cutneas superficiales localizadas. El eritema no se extiende ms all de los bordes de la lesin. La enfermedad se limita sobre todo a lactantes y nios pequeos y es muy contagiosa (9). Otras infecciones cutneas

La foliculitis es una infeccin pigena localizada en el folculo piloso. La base del folculo aparece elevada y enrojecida, con una pequea coleccin de pus debajo de la superficie epidrmica. Si esta lesin aparece en la base del prpado se conoce como orzuelo. El fornculo es una extensin de la foliculitis. Se caracteriza por un ndulo elevado, doloroso y grande, con una coleccin subyacente de tejido necrtico. Esas lesiones pueden drenar de modo espontneo o tras incisin quirrgica. El ntrax se debe a la confluencia de varios fornculos y se extiende hasta el tejido subcutneo mas profundo. Esta infeccin cursa con escalofros y fiebre, lo que indica diseminacin sistmica de los estafilococos. La bacteriemia con extensin a otros tejidos es comn en el ntrax (9). Se pueden producir infecciones estafilocccicas de las heridas tras intervenciones quirrgicas o lesiones traumticas, debidas a introduccin en la herida de los microorganismos que colonizan la piel. Estas infecciones se caracterizan por edema, eritema, dolor y cmulo de material purulento. En los casos con fiebre y afectacin del estado general, o si la infeccin no cede con tratamiento local, est indicada la terapia antibitica contra S. aureus (9). Sndrome del choque txico La enfermedad comienza de modo brusco con fiebre, hipotensin y un exantema eritematoso macular difuso, junto con afectacin de mltiples rganos. Este sndrome se debe a cepas de S. aureus productoras de la toxina1 del sndrome de choque txico u otra toxina relacionada. Se ha descrito la presencia de cepas productoras de esta toxina en la vagina de prcticamente todas las mujeres con el sndrome, y en el 10% de las mujeres sanas. En presencia de tampones muy absorbentes, esas bacterias se pueden multiplicar con rapidez y liberar la toxina hacia la circulacin sistmica. Tambin se ha descrito produccin de toxinas en cepas estafilocccicas aisladas de heridas de pacientes con sndrome de choque toxico (9). Intoxicacin alimentaria estafilocccica Entre dos y seis horas despus de la ingestin de algn alimento contaminado empieza de forma brusca la intoxicacin alimentaria estafilocccica con nuseas, vmito, dolor abdominal, clico y diarrea y su volumen es inferior a la observada con el clera y la infeccin por E. coli toxignica, no existe fiebre ni erupcin cutnea y la exploracin neurolgica resulta normal. La mayora de los casos revierte de forma espontnea entre las ocho y veinticuatro horas despus del comienzo. El factor de riesgo ms importante en los brotes de esta enfermedad consiste en la ingestin de alimentos que han permanecido sin refrigeracin durante perodos prolongados con lo que se pueden formar la toxina antes del consumo (6). Infecciones de las vas respiratorias

Staphylococcus aureus puede penetrar al parnquima pulmonar de dos formas distintas: una, por aspiracin de la flora de las vas respiratorias altas y la otra por diseminacin hematgena. La neumona estafilocccica representa una infeccin poco frecuente, aunque grave, que se caracteriza clnicamente por dolor torxico, toxicidad general y disnea y desde una perspectiva anatomopatolgica por infiltracin intensa de neutrfilos, necrosis y formacin de abscesos. El empiema pleural constituye una complicacin frecuente e incrementa la mortalidad (6). Infecciones msculo-esquelticas La osteomielitis aguda de los adultos tiene como causa ms comn a S. aureus y una de las principales causas en los nios. La osteomielitis aguda aparece debido a la siembra hematgena del hueso (especialmente un hueso daado) o a la extensin directa de un foco infeccioso contiguo. La osteomielitis aguda de los adultos comienza de ordinario con sntomas generales y dolor de la regin afectada que duran varias semanas o meses. El S. aureus tambin es causa de osteomielitis crnica, que aparece en lugares sometidos a ciruga o que han sufrido un traumatismo o falta de riego sanguneo (6). Infecciones intravasculares Staphylococcus aureus constituye la causa mas comn de endocarditis bacteriana aguda tanto de vlvulas nativas como prtesis. Este microorganismo puede infectar vlvulas que anteriormente eran normales. La endocarditis estafilocccica adopta la forma de una enfermedad febril aguda que no suele durar mas de algunas semanas; antes de que el paciente solicite atencin mdica, aparecen a menudo complicaciones como: Meningitis, absceso cerebral o visceral, embolia vascular perifrica, insuficiencia valvular con insuficiencia cardiaca y pericarditis purulenta. Las vlvulas ms afectadas son la mitral y la artica, salvo en los adictos a drogas por va intravenosa, quienes sufren sobre todo infeccin de vlvula tricspide. La endocarditis estafilocccica de las vlvulas originales se asocia a una tasa de mortalidad elevada (alrededor de 40%) y exige la instauracin inmediata de tratamiento antimicrobiano (6). Bacteriemia Los casos clnicos de bacteriemia por Staphylococcus aureus carecen de foco de infeccin primario demostrable. En esta situacin debe valorarse la posible presencia de endocarditis, a pesar de que no existan soplos cambiantes. Las complicaciones de la bacteriemia por Staphylococcus aureus comprenden: abscesos de las vsceras abdominales, absceso cerebral, meningitis, artritis sptica, osteomielitis y absceso epidural (4).

HIPTESIS HIPTESIS DE TRABAJO La incidencia de portadores nasales de Staphylococcus aureus en las personas entre 1 y 70 aos que asistieron a la Clnica Asistencial de Zapotitn en el perodo de marzo a abril 2007 es mayor que en el perodo de marzo a abril del 2006. HIPTESIS NULA o de NEGACIN La incidencia de portadores nasales de Staphylococcus aureus en las personas entre 1 y 70 aos que asistieron a la Clnica Asistencial de Zapotitn en el perodo de marzo a abril 2006 no difieren significativamente de la encontrada en igual perodo del ao 2007.

DEFINICIN DE LAS VARIABLES DEFINICIN CONCEPTUAL PROCEDENCIA: Origen geogrfico de los pacientes; donde naci o donde vive. EDAD: Tiempo transcurrido desde el nacimiento; duracin de la vida. SEXO: Condicin orgnica que distingue al macho de la hembra. PORTADOR: Persona o cosa que lleva con ello agentes de infeccin. PORTADOR ASINTOMTICO: Persona que no presenta signos ni sntomas, fuente importante de diseminacin del microorganismo. OCUPACIN: Trabajo, empleo, oficio, cargo. PRESENCIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS: Colonizacin del agente en una zona anatmica determinada. DEFINICIN OPERATIVA PROCEDENCIA: De seis cantones del rea geogrfica de la Clnica Asistencial de Zapotitn en el perodo de 2006. Cerro Plata El Mosquito Escalante El Tigre Flor Amarilla EL Predio En el perodo marzo a abril del 2007 se estudiaron diez cantones, agregndose a los anteriores: Entre Ros Veracruz Conacaste Otros

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OCUPACIN: Para el perodo de marzo a abril del 2006 Estudiante Jornalero Agricultor Ama de casa Para el perodo de marzo a abril del 2007, se agregaron a los anteriores: Tcnico Menor EDAD: 1-4 aos 5-9 aos 10-19 aos 20-29 aos 30-39 aos 40-70 aos SEXO: Femenino Masculino

PRESENCIA DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVA Prueba de la Catalasa: Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo

Prueba de la Coagulasa:

Prueba del Manitol:

DISEO METODOLGICO TIPO DE ESTUDIO Observacional, transversal, descriptivo. POBLACIN OBJETIVO Personas entre 1 y 70 aos de edad que asistieron a la Clnica Asistencial de Zapotitn entre marzo a abril de 2006 y marzo a abril del 2007 sin sntomas respiratorios. 11

UBICACIN GEOGRFICA La Clnica Asistencial est ubicada en Zapotitn, Cantn Flor Amarilla, Departamento de la Libertad (ver anexo 3). CRITERIOS DE INCLUSIN Y EXCLUSIN CRITERIOS DE INCLUSIN: Personas de ambos sexos que asistieron a la Clnica Asistencial de Zapotitn entre las edades de 1 a 70 aos que aceptaran voluntariamente participar en el estudio. CRITERIOS DE EXCLUSIN Personas fuera de ese rango de edad Personas con sintomatologa en vas respiratorias superiores Personas con antecedentes de antibitico-terapia reciente

UNIVERSO Y MUESTRA TAMAO DEL UNIVERSO El universo est representado por las personas que asistieron a la Clnica Asistencial de Zapotitn en el perodo comprendido entre marzo y abril de 2006 y entre marzo y abril del 2007 en los das que sin previo aviso se fueron a tomar las muestras. TAMAO DE LA MUESTRA La muestra correspondi a 152 personas que asistieron a la Clnica Asistencial de Zapotitn y que cumplan con los criterios de inclusin, con un promedio de 10 personas diarias, en el perodo de marzo a abril de 2006. Para el perodo de marzo a abril del 2007, se estudi, bajo el mismo esquema, a las personas que acudieron a la Clnica Asistencial de Zapotitn. En esta ocasin asistieron un promedio de 12 personas diarias. El nmero de personas estudiadas fue de 175.

PLAN DE OPERATIVIZACIN DE LAS VARIABLES VARIABLE Procedencia DIMENSIONES Cantones: El Astillero Cerro Plata Entre Ros Flor Amarilla El Predio INDICADORES Nmero de personas

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El Tigre Veracruz Escalante El Mosquito Ocupacin Estudiante Jornalero Tcnico Agricultor Ama de casa Tcnico Menor 1 - 4 aos 5 - 9 aos 10 -19 aos 20 - 29 aos 30 - 39 aos 40 - 70 aos Femenino Masculino Nmero de personas

Edad

Nmero de personas

Sexo

Nmero de personas

Presencia de Staphylococcus aureus Prueba de Catalasa Prueba de la Coagulasa Prueba del Manitol (+) (+) (+) (-) (-) (-)

TCNICAS E INSTRUMENTOS DE INVESTIGACIN TOMA DE MUESTRAS Se tomaron hisopados nasales en ambas alas de la nariz tomando en cuenta los requisitos de toma, conservacin y transporte de muestra para estudios microbiolgicos (13). Se obtiene una muestra adecuada siguiendo los pasos siguientes: 1. Seleccionar la zona anatmica ms adecuada para la toma de muestra. 2. Evitar la contaminacin con la flora normal (medio de cultivo selectivo). 3. No usar antispticos, desinfectantes o antibiticos antes de la toma de muestra. 4. Utilizar siempre materiales estriles. 13

5. 6. 7. 8.

Utilizar medio de transporte (Stuart) para las muestras. Identificar cada muestra con nmero correlativo. Administrar el formulario con da y hora de la toma de muestra Conservar el medio de transporte (Stuart) a temperatura ambiente.

CULTIVOS: El Estafilococo es un anaerobio facultativo, pero se obtiene un crecimiento ms abundante en condiciones aerobias. Algunas cepas tambin requieren un aumento de la tensin de CO2. El crecimiento ocurre con un amplio espectro de temperatura 6.5 a 45 C, con un ptimo para Staphylococcus aureus de 30 a 37oC. El pH ptimo es de 7.0 a 7.5 pero el espectro varia de 4.2 a 9.3. Los estafilococos crecen bien en muchos medios de rutina de laboratorio como agar tripticasa soya. Se aconseja agar sangre de carnero para el aislamiento primario (10). Para detectar portadores nasales es recomendable el uso de agar sal y manitol. PRUEBA DE LA CATALASA Se coloca una gota de solucin de Perxido de hidrgeno al 3% sobre un portaobjetos, a continuacin se agrega una pequea cantidad de bacterias del cultivo de Staphylococcus aureus. La formacin de burbujas que liberan oxgeno, indica una prueba positiva para Staphylococcus (7). PRUEBA DE COAGULASA El plasma citratado de conejo se us en una dilucin 1:5. A continuacin se mezcl con un volumen igual de suspensin de Staphylococcus obtenido a partir de cultivos en Agar Sal-manitol. Se colocaron los tubos en incubadora a 37 C durante 4 horas. Se incluy controles en tubo con plasma, nicamente mezclados con caldo estril (7) y (13). La formacin de un cogulo nos indic una prueba positiva a Staphylococcus aureus. En otras especies de Staphylococcus no hay formacin de coagulo (7). Todo estafilococo coagulasa positiva se considera patgeno para los humanos. RECOLECCIN DE DATOS RECOLECCIN DE MUESTRAS NASALES. Las muestras se colectaron por hisopado nasal, se utilizaron guantes estriles para tomar la muestra y se hizo un frote de ambas fosas nasales a todas las personas que acudieron a la Clnica Asistencial de Zapotitn y que fueron incluidas en la muestra de estudio; Las muestras fueron transportadas en medio de Stuart al Laboratorio de Microbiologa de la Facultad de Medicina de la USAM Una vez en el Laboratorio de Microbiologa de la Facultad de Medicina de la USAM fueron inoculadas en el medio de cultivo de Agar sangre de carnero 5%, Sal y Manitol, que es un medio de alta salinidad (7.5% de NaCl). La sal inhibe la 14

mayor parte de la flora normal del rea nasal pero no al Staphylococcus aureus. Contiene manitol como fuente de Carbono y energa. El Staphylococcus aureus fermenta el manitol y hace que se forme un halo amarillo en 48 horas alrededor de las colonias (13). El Agar Sal y manitol es especfico para detectar portadores nasales de Staphylococcus aureus (12). Una vez observado el crecimiento se realizaron las pruebas de la catalasa y de la coagulasa Las muestras fueron recolectadas los das lunes, mircoles y viernes durante cinco semanas de los meses de marzo y abril. A todas las personas que llegaron a la Clnica en ese da, que cumplan con los criterios de inclusin y que aceptaron voluntariamente participar se les realiz la toma de muestra.

DISEO ESTADSTICO PARA EL ANLISIS DE DATOS. PRUEBA t STUDENT Esta prueba es utilizada para evaluar si dos grupos difieren entre s de manera significativa (1). Para saber si el valor t es significativo, se aplica la frmula de la t de Student y se calculan los grados de libertad. La prueba se basa en una distribucin poblacional o muestral de diferencia de medias y los grados de libertad constituyen el nmero de maneras en que los datos pueden variar libremente, dependiendo del tamao de los grupos que se comparan. Cuanto mayor es el nmero de grados de libertad, la distribucin t de Student se acercar ms a ser una distribucin normal, sobre todo si stos sobrepasan de 120. Una vez calculados el valor t y los grados de libertad, se elige el nivel de significacin estadstica y se compara el valor obtenido con el que aparece en la tabla de distribucin de la t de Student. Si el valor calculado es igual o mayor al que aparece en la tabla, se acepta la Hiptesis de trabajo y se rechaza la Hiptesis nula (5).

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PROCESAMIENTO Y ANLISIS DE RESULTADOS PERSONAS QUE ASISTIERON A LA CLNICA ASISTENCIAL DE ZAPOTITAN Y QUE PRESENTARON PRUEBAS DE CATALASA, COAGULASA Y MANITOL POSITIVAS DISTRIBUIDAS SEGN SU LUGAR DE PROCEDENCIA.

Tabla N 1 / 2006

Tabla N 1 / 2007

LUGAR DE PROCEDENCIA CANTON: CERRO PLATA MOSQUITO ESCALANTE EL TIGRE FLOR AMARILLA EL PREDIO TOTAL

PERSONAS PRUEBAS POSITIVAS 3 10 4 13 8 3 41

X2 9 100 16 167 64 9 367

LUGAR DE PROCEDENCIA CANTON Cerro Plata Mosquito Escalante El Tigre Flor Amarilla El Predio Entre Ros Veracruz Conacaste Otros TOTAL

PERSONAS PRUEBA POSITIVA 4 3 10 13 41 5 12 27 1 2 118

X2 16 9 100 169 1681 25 144 729 1 4 2878

t (calculada) = 0.908

gdl = 14

t (tabla) = 0.868

Nivel de significacin = 0.2 0.908 > 0.868 t (calculada) > t (tabla)

Se acepta la Hiptesis de trabajo y se rechaza Ho

Al comparar las pruebas realizadas en dos aos consecutivos se observa un incremento del 20% en el segundo ao estudiado en relacin al 2006

16

Grfico N 1 / 2006
14 12 10 8 6 4 2 0
Fuente: Muestra tomada a 152 personas en la Clnica Asistencial de Zapotitn en 5 semanas de los meses Marzo y Abril de 2006

Cerro de plata Mosquito Escalante El Tigre Flor Amarilla El Predio

Grfico N 1 / 2007
40 30 20 10 0 Cerro de plata Mosquito Escalante El Tigre Flor Amarilla El Predio Entre Ros Veracruz Conacaste otros

Fuente: Muestra tomada a 175 personas en la Clnica Asistencial de Zapotitn en 5 semanas de los meses Marzo y Abril de 2007

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PERSONAS QUE ASISTIERON A LA CLNICA ASISTENCIAL DE ZAPOTITN Y QUE PRESENTARON PRUEBAS DE CATALASA, COAGULASA Y MANITOL POSITIVAS DISTRIBUIDAS SEGN OCUPACIN Tabla N 2 / 2006 PRUEBAS POSITIVAS AGRICULTOR 4 ESTUDIANTE 7 JORNALERO 26 AMA DE CASA 4 TOTAL 41 OCUPACIN X2 16 49 676 16 757 Tabla N 2 / 2007

LUGAR DE PROCEDENCIA CANTON Agricultor Estudiante Jornalero Ama de Casa Tcnico Menor TOTAL

PERSONAS PRUEBA POSITIVA 10 29 19 41 4 15 118

X2 100 841 361 1681 16 225 3224

t (calculada) = 1.172

gdl = 8

t (tabla) = 1.4

Nivel de significacin = 0.1 1.172 < 1.4 t (calculada) < t (tabla)

Se acepta la Hiptesis nula (Ho) y se rechaza Hiptesis de trabajo (Ht)

En este caso la ocupacin no parece ser un factor determinante en la presencia o no de Staphylococcus aureus en la poblacin asintomtica estudiada

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Grfico N 2 / 2006
30 25 20 15 10 5 0 PRUEBAS POSITIVAS
Fuente: Muestra tomada a 152 personas en la Clnica Asistencial de Zapotitn en 5 semanas de los meses Marzo y Abril de 2006

AGRICULTOR ESTUDIANTE JORNALERO AMA DE CASA

Grfico N 2 / 2007
41 36 31 26 21 16 11 6 1 -4 PRUEBAS POSITIVAS

AGRICULTOR ESTUDIANTE JORNALERO AMA DE CASA TECNICO MENOR

Fuente: Muestra tomada a 175 personas en la Clnica Asistencial de Zapotitn en 5 semanas de los meses Marzo y Abril de 2007

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PERSONAS QUE ASISTIERON A LA CLNICA ASISTENCIAL DE ZAPOTITN Y QUE PRESENTARON PRUEBAS DE LA CATALASA, COAGULASA Y MANITOL POSITIVA, DISTRIBUIDAS SEGN GRUPO DE EDAD

Tabla N 3 / 2006 GRUPO ETREO (AOS) 1 A 4 5 A 9 10 A 19 20 A 29 30 A 39 40 A 70 TOTAL NMERO DE PRUEBAS PERSONAS POSITIVAS 15 17 19 35 46 20 152 0 3 4 10 16 8 41 X2 0 9 16 100 256 64 445

Tabla N 3 / 2007 GRUPO ETREO (AOS) 1a4 5a9 10 a 19 20 a 39 30 a 39 40 a 70 TOTAL NMERO DE PRUEBAS PERSONAS POSITIVA 22 27 24 32 24 47 176 18 16 18 22 13 31 118 X2 324 256 324 484 169 961 2518

t (calculada) = 3.690

gdl = 48

t (tabla) = 2.66

Nivel de significacin = 0.005 3.690 > 0.879 t (calculada) > t (tabla)

Se acepta la Hiptesis de trabajo y se rechaza Hiptesis nula (Ho)

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Grfico N 3 / 2006
16 14 12 10 8 6 4 2 0 PRUEBAS POSITIVAS 1 A 4 AOS 5 A 9 AOS 10 A 19 AOS 20 A 29 AOS 30 A 39 AOS 40 A 70 AOS

Fuente: Muestra tomada a 152 personas en la Clnica Asistencial de Zapotitn en 5 semanas de los meses Marzo y Abril de 2006

Grfico N 3 / 2007
30 25 20 15 10 5 0 PRUEBAS POSITIVAS 1 A 4 AOS 5 A 9 AOS 10 A 19 AOS 20 A 29 AOS 30 A 39 AOS 40 A 70 AOS

Fuente: Muestra tomada a 175 personas en la Clnica Asistencial de Zapotitn en 5 semanas de los meses Marzo y Abril de 2007

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PERSONAS QUE ASISTIERON A LA CLNICA ASISTENCIAL DE ZAPOTITN Y QUE PRESENTARON PRUEBAS DE CATALASA, COAGULASA Y MANITOL POSITIVAS, DISTRIBUIDAS SEGN SEXO Tabla N 4 / 2006 GRUPO ETREO (AOS) 1 A 4 5 A 9 10 A 19 20 A 29 30 A 39 40 A 70 TOTAL PRUEBAS POSITIVAS 0 3 4 10 16 8 41 MASCULINO 0 2 2 7 10 5 26 X2 0 4 4 49 100 25 182 FEMENINO 0 1 2 3 6 3 15 X2 0 1 4 9 36 9 59

Tabla N 4 / 2007 GRUPO ETREO (AOS) 1a4 5a9 10 a 19 20 a 39 30 a 39 40 a 70 TOTAL PRUEBAS POSITIVA 18 16 18 22 13 31 118 MASCULINO 5 9 12 6 2 15 49 X2 25 81 144 36 4 225 115 FEMENINO 13 7 6 16 11 16 69 X2 169 49 36 256 121 256 887

MASCULINO 1.549 > 1.3 (gdl=73) p < 0.1 t(c) > t(t)

FEMENINO 4.596 > 2.66 (gdl=82) p < 0.005 t(c) > t(t)

En ambos casos se rechaza la Hiptesis nula (Ho) En este caso el sexo femenino parece estar mucho ms relacionado con la presencia de Staphylococcus aureus en la poblacin asintomtica estudiada

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Grfico N 4
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 MASCULINO FEMENINO
1 A 4 Aos 5 A 9 Aos 10 A 19 Aos 20 A 29 Aos 30 A 39 Aos 40 A 70 Aos

Fuente: Muestra tomada a 152 personas en la Clnica Asistencial de Zapotitn en 5 semanas de los meses Marzo y Abril de 2006

Grfico N 4 / 2007
16 14 12 10 8 6 4 2 0 MASCULINO FEMENINO 1 A 4 Aos 5 A 9 Aos 10 A 19 Aos 20 A 29 Aos 30 A 39 Aos 40 A 70 Aos

Fuente: Muestra tomada a 175 personas en la Clnica Asistencial de Zapotitn en 5 semanas de los meses Marzo y Abril de 2007

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DISCUSION S. aureus es un componente de la microbiota humana normal, colonizando en situaciones normales piel y mucosas, entre otras las fosas nasales, hbitat epidemiolgicamente importante ya que de ah puede diseminarse a otros sitios, provocando infecciones cutneas leves hasta infecciones potencialmente mortales (10), (11). Estudios a nivel mundial muestran un 40 a 50% de los humanos que albergan Staphylococcus aureus en la nariz (7). Es importante recordar que S. aureus posee la enzima coagulasa que al unirse, no de manera enzimtica, con el fibringeno provoca la agregacin de bacterias (9), (10). Todo esto sucede a nivel de mucosa nasal, favoreciendo la instalacin de acmulos de bacterias en las fosas nasales recubiertas de fibrina (9), lo que indudablemente hace ms potencialmente patgenos a estos acmulos bacterianos. Los estafilococos se encuentran regularmente en la ropa de cama, vestimentas y fomites del entorno (7). Esto podra contribuir a mantener estos microorganismos en los jornaleros y en las amas de casa que mantienen la ropa hmeda por la transpiracin, calor y temperatura de una zona geogrfica como Zapotitn, lo que puede ser un reflejo epidemiolgico para otras reas similares (14). Uno de los hallazgos que ms llama la atencin en este estudio es el marcado incremento encontrado, en la incidencia de portadores nasales asintomticos de S. aureus coagulasa positiva, en la segunda fase de este estudio, es decir en la comparacin de lo encontrado en el 2007 con respecto al 2006 en igual poca del ao. Si bien es cierto que no se intent conocer si los portadores encontrados en el 2006 mantenan su condicin de portadores de esta bacteria potencialmente peligrosa, el incremento de la incidencia de portadores en el grupo del 2007 es realmente alarmante desde el punto de vista epidemiolgico. A diferencia de la literatura mundial, donde sealan a la edad escolar como uno de los grupos de portadores nasales de Staphylococcus aureus ms frecuentes, en esta investigacin los adultos entre 30 y 39 aos fueron los que presentaron la incidencia mayor de portadores nasales durante el perodo 2006. Algo similar ocurri en la investigacin del 2007, ya que siempre fueron los adultos (40 70 aos) los que presentaron el mayor porcentaje de incidencia. El sexo masculino result ms afectado segn el estudio del perodo de marzo a abril del 2006, lo que coincide con la literatura consultada (2). Sin embargo, el 2007 present lo contrario, ya que fue el sexo femenino (amas de casa fundamentalmente) quien nos mostr el mayor nmero de casos. En la investigacin del 2006, el grupo de los jornaleros, present la mayor incidencia y, en relacin a la procedencia, las personas que habitaban en el Cantn El Tigre. La investigacin del 2007, nos mostr al Cantn Flor Amarilla 24

como el lugar de procedencia con mayor nmero de casos y con respecto a la ocupacin los datos mostraron a las amas de casa como las de mayor porcentaje de incidencia en ese segundo estudio. En realidad los hallazgos del 2007 no contradicen lo encontrado en el 2006 ya que las amas de casa tambin estn expuestas a las mismas condiciones climticas de la zona en mencin. Adems, en este caso puede contribuir la constante exposicin al fuego de las cocinas de lea en sus funciones de ama de casa o negocios de la economa informal de la zona que como la venta de comida, son llevadas a cabo fundamentalmente por amas de casa. Otros factores que pueden contribuir a estos datos seran las largas distancias que tienen que recorrer hacia las escuelas, centros de atencin de salud, lugares de abastecimiento de agua, que podran estar contribuyendo tanto en los jornaleros como en las amas de casa, a la transpiracin y al mantenimiento hmedo de la ropa. Se debe considerar tambin la posibilidad de que estas mujeres sean pareja ntima de jornaleros y otros grupos ocupacionales, manteniendo la presencia del Staphylococcus aureus por transmisin directa o indirecta. Considerando aspectos epidemiolgicos, las personas que resultaron portadoras nasales de S. aureus son diseminadores potenciales de estos microorganismos a ropa, utensilios, fomites, etc. Si adems, consideramos otros factores acompaantes, observados en la zona, como son la falta de higiene personal, escasez de agua en el hogar, presencia de letrinas en malas condiciones, falta de una cultura de higiene en el hogar, hacinamiento, etc. la situacin se torna an ms alarmante (11), (6). Lo encontrado en este trabajo debe considerarse como una voz de alerta epidemiolgica porque podra estar ocurriendo en la convivencia familiar y comunitaria a nivel de todo el pas. La variacin encontrada en cuanto a la procedencia de los portadores puede considerarse tambin como una seal de que esta situacin sea mucho ms generalizada a otras zonas. Sin embargo como este estudio fue solamente Observacional, y no pretende extender a toda la poblacin sus resultados, se hace necesario realizar un estudio ms acucioso, en sta o en otra zona del pas para conocer la posible implicacin epidemiolgica nacional en el objetivo de evitar epidemias generadas por esta bacteria.

CONCLUSIONES Los resultados obtenidos en el estudio nos permiten hacer las conclusiones siguientes: El nmero de casos positivos a la Prueba de Catalasa, Coagulasa y Manitol, en la Clnica Asistencial de Zapotitn en 2007, aument significativamente en comparacin con igual perodo del 2006. Si consideramos por lugar de procedencia, ocupacin de la persona y edad, el nmero de portadores aument con un nivel de significacin superior al 20% con respecto a los casos investigados en la misma clnica en el ao 2006. 25

El nmero de casos positivos a la pruebas de Catalasa, Coagulasa y Manitol segn el sexo de las personas, fue mucho mayor en las mujeres en el 2007 a diferencia de lo encontrado en igual perodo del 2006 donde los hombres presentaban el mayor nmero de incidencia.

RECOMENDACIONES Realizar nuevos estudios de incidencia de portadores asintomticos de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en diferentes zonas del pas para obtener datos epidemiolgicos que permitan programar, con conocimiento de causa, planes de control comunitario que eviten la posibilidad de epidemias de enfermedades diarreicas o respiratorias agudas o cualquiera de las manifestaciones del Sndrome de piel escaldada al que estn expuestos fundamentalmente nuestros nios. Crear un programa en la clnica asistencia de Zapotitn que evale peridicamente la incidencia de portadores asintomtico por Staphylococcus aureus para que proporcione datos epidemiolgicos sistemticos y permita el estudio de la prevalencia de esta bacteria en los portadores encontrados. Crear programas que estimulen a la poblacin de esta comunidad a mejorar las medidas higinicas tanto de su hogar como las personales para crear una cultura de salud y tratar de disminuir los portadores asintomticos.

BIBLIOGRAFIA 1. Bonilla, Gildaberto. (2000). Como hacer una tesis de graduacin con tcnicas estadsticas. 4ta. Edicin. El Salvador. UCA Editores. 2. Departamento de Microbiologa del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud UNA. (2001). Portacin nasal de Staphylococcus aureus en el personal hospitalario, frecuencia y patrn de sensibilidad antimicrobiana. Disponible: http:// www.Microbiologa Staphylococcus aureus. 3. Frobisher, Martin. Fuerst, Robert. (1976). Microbiolgica. 13a. Edicin. Mxico. Nueva Editorial Interamericana. 4. Harrison, Tensley Randolph. Baunwald, Eugene. Hauser, Stephen L. (2004). Principios de Medicina Interna. 15a Edicin. Espaa. Mc Graw Hill Internacional. 5. Hernndez Sampieri, Roberto. Fernndez Collado, Carlos. Baptista Lucio, Pilar. (2006). Metodologa de la Investigacin. 4 Edicin. Best Seller. Mxico. Mc Graw Hill Internacional. 6. Hernndez Vadell, Ibis Trinidad. Peraza Torano, Gilda T. Gonzlez Bonet, Iliana. Staphylococcus aureus resistente a la metacilina: deteccin de portadores entre nios hospitalizados y nios sanos de la comunidad. Disponible: http://Microbiologia.Staphylococcus aureus. Portadores nasales.

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7. Jawetz, Ernest. Melnick, Joseph. Edward, Adalberg. (1998). Microbiologa Medica. 16a Edicin. Mxico. Mc Graw Hill Internacional. 8. Murray, Robert. Granner, Daryl. (1994). Bioqumica de Harper. 13. Edicin. Mxico. Manual Moderno. 9. Murray, Patrick R. Kobayashi, George S. Pfaller, Michael A. Rosenthal, Ken S. (1997). 2a. Edicin. Harcourt Brace. Espaa. 10. Rosa Fraile, Manuel de La. Prieto, Jos. (1997). Microbiologa en Ciencias de la Salud: Conceptos y Aplicaciones. 2 Edicin. Buenos Aires. Elsevier. 11. Serris John, C. Ryan, Kenneth J. (2005). Microbiologa Mdica: Una introduccin a las enfermedades infecciosas. 4. Edicin. Espaa. Mc Graw Hill Internacional. 12. Stuart, Walter T. (2000). Microbiologa 1. Edicin. Espaa. Mc Graw Hill Internacional. 13. Torres, Miguel Francisco. Manual Prctico de Bacteriologa Mdica. (1999). 2. Edicin. Editorial Serviprensa C.A . Guatemala. Guatemala. 14. Kutchynskaya, Josefina. Valero, Leal. Portadores nasofarngeos de bacterias potencialmente patgenas en pre-escolares de Maracaibo. (2000-2001). Disponible: http: // www.Microbiologa. Staphylococcus aureus.

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ANEXO 1 INSTRUMENTO DE RECOLECCION DE DATOS CLNICA ASISTENCIAL DE ZAPOTITN (USAM).

Ficha Nmero: Edad: _________ Sexo: M___ F___ Procedencia: Cantn: ___________________________ Ocupacin: ___________________________________ Resultados:

Microscpico: Cocos Gram positivos: Crecimiento en Agar Sal Manitol: Prueba catalasa: Prueba coagulasa: Si___ No___ Si___ No___ Positivo___ Negativo___ Positivo___ Negativo___

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ANEXO 2

MUNICIPIO DE ZAPOTITN

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ANEXO 3 UBICACIN GEOGRFICA DE LA CLNICA ASISTENCIAL ALBERTO MASFERRER

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