Memòria

Volumen I
Memoria
PROYECTO FINAL DE CARRERA
Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

PFC presentado para optar al ttulo de Ingeniera Tcnica Industrial especialidad Qumica por Silvia Calle Aznar
Barcelona, 12 de Junio de 2011
Tutor proyecto: Eva Mara Carral Maha

Departamento de Qumica Industrial Universitat Politcnica de Catalunya (UPC)
NDICE DE MEMORIA
ndice de memoria..................................................................................... 1 OBJETIVO ............................................................................................. 5 RESUM .................................................................................................. 7 RESUMEN.............................................................................................. 9 AGRADECIMIENTOS ............................................................................ 11 Captulo 1: INTRODUCCIN ................................................................ 13 Captulo 2: EL CAF ............................................................................ 15 2.1. EL CAF ................................................................................... 15 2.1.1. Composicin ......................................................................... 16 2.1.2. Tipos de caf ........................................................................ 17 2.1.3. Caractersticas del caf ........................................................... 17 2.1.4. Pases consumidores de caf ................................................... 18 2.1.5. Pases productores de caf arbica y robusta ............................. 19 2.1.6. Tipos de caf segn su Origen ................................................. 20 2.1.7. Pases exportadores e importadores de caf .............................. 21 2.2. ELABORACIN DEL CAF ............................................................ 22 2.2.1. Cosecha y preparacin de los granos ........................................ 22 2.2.2. Tipos de caf segn su procesado ............................................ 28 Captulo 3: LA CAFENA EN EL CAF ................................................... 29 3.1. EL PAPEL DE LA CAFENA EN EL CAF ........................................... 29 3.1.1. Propiedades qumicas de la cafena .......................................... 29 3.1.2. Vida media y eliminacin de la cafena ...................................... 31 3.1.3. Propiedades fisiolgicas de la cafena en el caf ......................... 31 Captulo 4: MTODOS ANALTICOS PARA LA DETERMINACIN Y CARACTERIZACIN DE LA CAFENA.................................................... 33 4.1. MTODO CROMATOGRFICO ....................................................... 35 4.1.1. Introduccin a la cromatografa ............................................... 35 4.1.2. Tipos de cromatografa ........................................................... 36 4.1.3. Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) ................... 38 4.1.4. Cromatografa de particin o reparto ........................................ 40 4.1.5. Cromatografa de fase normal y fase inversa ............................. 42
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4.1.6. Instrumentacin para cromatografa de lquidos de alta resolucin 43 4.1.7. Parmetros cromatogrficos .................................................... 52 4.2. MTODO ESPECTROSCPICO ...................................................... 55 4.2.1. Mtodos espectroscpicos ....................................................... 55 4.2.2. Radiacin electromagntica ..................................................... 55 4.2.3. Interaccin de la radiacin electromagntica con la materia ......... 57 4.2.4. Espectroscopa UV ................................................................. 59 4.2.5. Instrumentacin para espectroscopa UV................................... 63 Captulo 5: PARTE EXPERIMENTAL ..................................................... 65 5.1. MATERIAL DE LABORATORIO UTILIZADO ...................................... 65 5.1.1. Preparacin del material de vidrio ............................................ 67 5.2. PREPARACIN DE MUESTRAS PATRN PARA ELABORAR LA RECTA DE CALIBRADO........................................................................................ 67 5.2.1. Instrumentacin .................................................................... 67 5.2.2. Preparacin de las muestras patrn ......................................... 67 5.3. MUESTRAS DE CAFENA DE CAF ................................................. 68 5.3.1. Instrumentacin .................................................................... 69 5.3.2. Preparacin de las muestras de caf......................................... 69 5.4. PROCEDIMIENTOS DE SEPARACIN DE LA CAFENA DEL CAF ........ 70 5.4.1. Mtodo de extraccin de cafena utilizado (I) ............................. 70 5.4.2. Mtodo de extraccin de cafena utilizado (II) ............................ 71 5.4.3. Mtodo de extraccin de cafena utilizado (III)........................... 72 5.5. PUESTA A PUNTO DEL MTODO CROMATOGRFICO (HPLC) ............. 80 5.5.1. Instrumentacin .................................................................... 80 5.5.2. Puesta a punto del Sistema Cromatogrfico ............................... 80 5.6. PUESTA A PUNTO DEL MTODO ESPECTROFOTOMTRICO UV .......... 91 5.6.1. Instrumentacin .................................................................... 91 5.6.2. Puesta a punto del Sistema Espectrofotomtrico ........................ 91 Captulo 6: RESULTADOS Y DISCUSIN .............................................. 95 6.1. RESULTADOS OBTENIDOS POR (HPLC) ......................................... 96 6.1.1. Determinacin de la cafena por cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) ............................................................................. 98 6.2. RESULTADOS OBTENIDOS POR ESPECTROFOTMETRO UV-VIS ...... 118 6.2.1. Determinacin de la cafena por Espectrofotometra UV ............. 118 Captulo 7: CONCLUSIONES .............................................................. 139 Captulo 8: EVALUACIN ECONMICA .............................................. 141
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8.1. 8.2. 8.3. 8.4. 8.5.
Costes energticos ................................................................... 142 Costes de material y reactivos ................................................... 143 Amortizaciones ........................................................................ 146 Costes de personal................................................................... 147 Coste Total ............................................................................. 148
Captulo 9: SEGURIDAD Y MEDIO AMBIENTE .................................... 149 Captulo 10: BIBLIOGRAFA ............................................................. 153 10.1. Bibliografa de Consulta ............................................................ 153 10.2. Pginas web de consulta ........................................................... 155
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OBJETIVO
En este proyecto se realiza el estudio de la cafena analtico, tanto cualitativo como cuantitativo de la cafena en diferentes tipos de caf comerciales. Los objetivos del estudio son:
Ensayar mtodos de extraccin y purificacin de la cafena en los diferentes cafs. Desarrollar una metodologa analtica que permita la determinacin y cuantificacin de la cafena en el caf utilizando la cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) y la espectroscopa UV-VIS. Realizar una puesta a punto de los mtodos analticos elegidos y encontrados en bibliografa hasta lograr las condiciones ptimas que permitan la identificacin y la cuantificacin de la cafena en los diferentes cafs. Preparar diferentes soluciones patrn con cafena pura para realizar la curva de calibrado para cada mtodo ensayado que nos permita determinar la cantidad de cafena en cada caf. Efectuar los clculos pertinentes para determinar la cantidad de cafena contenida en cada caf utilizando la curva de calibrado. Estudiar e intentar establecer una comparacin entre la cantidad de cafena y las diferentes caractersticas del caf; tales como la variedad del caf, el pas de origen, procesado
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RESUM
Aquest projecte consta duna part terica on sexplica tant els diferents tipus de caf, composici I caracterstiques, aix com el paper que desenvolupa la cafena del caf i com influeix sobre el cos hum. Tamb es fa una recopilaci dun resum teric sobre els dos mtodes analtics utilitzats en els experiments per la determinaci quantitativa de la cafena del caf. La cromatografia de lquids dalta resoluci (HPLC) i lespectroscopia UVVIS. A la part experimental, es van realitzar diferents assajos fins a obtenir les condicions ptimes en cadascuna de les tcniques per a la determinaci tant qualitativa con quantitativa de la cafena, ajudant-nos de la interpolaci en una recta de calibratge confeccionada amb les solucions patr de cafena de concentraci coneguda. Tamb es van assajar diferents mtodes dextracci de la cafena dels diferents cafs. Desprs de posar a punt tant el mtode de separaci de la cafena del caf com els mtodes analtics utilitzats: HPLC i espectrofotomtric, es va procedir a la determinaci quantitativa de la cafena en diferents cafs comercials de divers origen i caracterstiques. Un cop efectuades totes les determinacions de cafena en els diferents cafs, treballant sempre amb varies repeticions per poder realitzar un petit estudi estadstic dels valors obtinguts i assegurar la fiabilitat dells, es va intentar treure conclusions analitzant els valors de cafena obtinguts i una delles s la demostraci, tal i com previem, de que la quantitat de cafena depn tant del tipus de caf, com del seu pas dorigen i del seu processat. En aquest projecte shan tingut en compte les normes de bones prctiques al laboratori (GLP) i criteris de sostenibilitat i el respecte pel medi ambient realitzant una bona gesti del residus generats.
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RESUMEN
Este proyecto consta de una parte terica en donde se explica tanto los diferentes tipos de caf, composicin y caractersticas, as como el papel que tiene la cafena del caf y cmo influye sobre el organismo humano. Tambin se recopila un resumen terico sobre los dos mtodos analticos utilizados en los experimentos para la determinacin cuantitativa de la cafena del caf. La cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) y la espectroscopa UV-VIS. En la parte experimental, se realizaron diferentes ensayos hasta obtener las condiciones ptimas en cada una de las tcnicas para la determinacin tanto cualitativa como cuantitativa de la cafena, ayudndonos de la interpolacin en una recta de calibrado confeccionada con soluciones patrn de cafena de concentracin conocida. Tambin se ensayaron distintos mtodos de extraccin de la cafena de los diferentes cafs. Despus de poner a punto tanto el mtodo de separacin de la cafena del caf como los dos mtodos analticos utilizados: HPLC y espectrofotomtrico, se procedi a la determinacin cuantitativa de la cafena en distintos cafs comerciales de distinto origen y caractersticas. Una vez efectuadas todas las determinaciones de cafena en los distintos cafs, trabajando siempre con varias repeticiones para poder realizar un pequeo estudio estadstico de los valores obtenidos y asegurar la fiabilidad de ellos, se intenta sacar conclusiones analizando los valores de cafena obtenidos y una de ellas es la demostracin, tal y como preveamos, de que la cantidad de cafena depende tanto del tipo de caf, como del pas de origen y de su procesado. En este proyecto se han tenido en cuenta las normas de buenas prcticas en el laboratorio (GLP) y criterios de sostenibilidad y respeto por el medio ambiente realizando una correcta gestin de los residuos generados.
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero dar las gracias a Eva Carral, por su ayuda y consejos que han hecho posible el desarrollo de este proyecto. Gracias por tu amabilidad y paciencia con nosotras incluso en los momentos difciles. En segundo lugar quiero agradecer a Nuria Borrs por su ayuda en el laboratorio y al Dr. Ramn Oliver por sus nimos diarios. A Margarita Sanchez y Enric Boada por prestarnos su colaboracin en el laboratorio. Agradecer a mi compaera de proyecto Anabel por todo el trabajo realizado. Gracias por su apoyo, comprensin y ayuda. Las horas en las que hemos podido compartir experiencias y trabajar en equipo nos han hecho aprender de nuestros errores. Por ltimo, quiero dar las gracias a Andrea y Marga por su colaboracin y compaerismo y por hacer que las muchas horas en el laboratorio se hicieran ms cortas. Por ltimo, dar las gracias a mis padres, mi familia y mis amigos por estar siempre a mi lado y en especial a Ana, Eva y Marcos por su apoyo durante todo este tiempo.
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CAPTULO 1: INTRODUCCIN
La cafena es un polvo inodoro, incoloro y amargo. Friedrich Ferdinand Runge la aisl del caf en 1819 y del t en 1827, pero su estructura qumica no se describi hasta 1875 por E. Fischer. La cafena (1, 3, 7-trimetilxantina) y otros alcaloides metilxantnicos, son derivados del grupo de las xantinas, que a su vez se derivan de las purinas. Tambin es conocida por el nombre tena, guaranna o matena. La cafena ha sido consumida durante siglos a pesar de los intentos repetidos de prohibir su uso por motivos morales, econmicos, mdicos o polticos. El descubrimiento del caf tuvo lugar en el siglo IX en Arabia y se cultiv por primera vez en Etiopa. En el siglo XV se desarroll la tcnica de tostar y moler los granos de caf y el consumo de los productos con cafena se expandi rpidamente por todo el mundo. La cafena es una sustancia que se encuentra en ciertas plantas naturales y puede producirse sintticamente en laboratorio. Se localiza en cantidades variables en las semillas, las hojas y los frutos de algunas plantas, donde acta como un pesticida natural que paraliza y mata ciertos insectos que se alimentan de las plantas. Se encuentra en el caf, t, chocolate, yoco, cacao y, en bebidas de cola y energticas. Tambin se encuentran en bebidas que contienen guaran y a menudo como ingrediente en los suplementos de prdida de peso y energizantes, las bebidas deportivas, preparaciones herbales y analgsicos. El caf es una de las fuentes de cafena consumidas con mayor frecuencia aunque los expertos recomiendan generalmente limitar la ingesta en torno a 300 mg al da.
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CAPTULO 2: EL CAF
2.1. EL CAF
El caf es una bebida que se obtiene de las semillas tostadas de las plantas del caf o cafetos (Coffea spp). Los cafetos son arbustos de hoja perenne de la familia de las Rubiceas.
Figura 1. Planta de caf o cafetos (coffea spp).
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Estos producen flores de color blanco que producen frutos de color rojizo. La parte interior del fruto contienen dos semillas o granos de caf. Hay algunas especies de cafetos que solo producen una nica semilla por fruto, se conocen como caf perlado. Los granos de caf o semillas son la parte del fruto que contiene ms cafena.
2.1.1. Composicin
Los granos de caf poseen ms de 2.000 sustancias diferentes (cafena, minerales, lpidos, trigonelinas, aminocidos protenas, cidos alifticos, glicsidos y carbohidratos) de tal manera que el caf no es solo cafena (1, 3, 7-trimetilxantina), sin embargo es el ingrediente farmacolgicamente ms activo. Las dimetilxantinas derivadas (teofilina y teobramina) tambin se encuentran en una variedad de especies de plantas. El caf tiene mltiples componentes. Los granos de caf crudos tienen una composicin diferente entre la variedad Arbica y la Robusta.
Figura 2. Granos de caf verde
En la variedad Arbica, la cafena comprende el 1,2% de la materia seca, 4,2% minerales, de los cuales 1,7% es potasio; 16% lpidos, 1,0% trigonelinas, 11,5% protenas y aminocidos, 1,4% cidos alifticos, 6,5% despidos (cidos clorognicos), 0,2% glucsidos y 58% carbohidratos. En la variedad Robusta, la cafena comprende el 2,2% de la materia seca, 4,4% minerales, de los cuales 1,8% corresponden al potasio; 10% lpidos, 0,7% trigonelinas, 11,8% protenas y aminocidos, 1,4% cidos alifticos, 10% cidos clorognicos y 59,5% glucsidos trazas y carbohidratos. El contenido de agua de los granos de caf crudo comercial vara entre 8% y 12%. La composicin de los granos de caf se altera de forma dramtica por el proceso de tostado, y pierde gran cantidad de agua (posee apenas 1% a 5%), protenas, cidos clorognicos y carbohidratos (Tabla 1).
Figura 3. Granos de caf tostados
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Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales Tabla 1. Composicin de los granos de caf tostado medio (porcentaje en base seca) Componente Cafena Variedad Arbica 1,3 Variedad Robusta 2,4
2.1.2.
Tipos de caf
Existen aproximadamente unas 40 especies de cafetos, pero la bebida del caf se obtiene fundamentalmente de tres plantas: El cafeto de Arabia, el cafeto robusta y el cafeto liberica.
El cafeto de arabia (Coffea arabica) Es un arbusto que crece unos 12 metros de altura en estado natural. Procede de las montaas de Etiopia. Constituye la especie ms importante en la actualidad y la que produce un caf de mayor calidad. El cafeto robusta (Coffea canephora) Es un rbol o arbusto de unos 10 metros de altura. Procede de frica occidental, aunque se cultiva en muchas zonas tropicales. Es una especie ms fcil de cultivar que la arabica ya que resiste mejor las enfermedades. El cafeto liberica (Coffea liberica) Es un rbol que puede alcanzarlos 18 m de altura. Procede de Liberia, en el oeste de frica, aunque se cultiva principalmente en Indonesia. Produce semillas ms grandes que proporcionan poco sabor.
2.1.3.
Caractersticas del caf
En este apartado, se intenta describir cuales son las caractersticas del caf y lo que se percibe con los sentidos. Los granos de caf, segn su procedencia, tienen generalmente caractersticas distintivas como:
Sabor: los criterios sobre el sabor incluyen trminos como ctrico o terroso, caramelizado, afrutado, acidez, amargor, sabor aterciopelado Aroma: los criterios sobre los olores incluyen trminos como suave, delicado, nico, exclusivo, intenso Intensidad: ligero, suave, medio, intenso, equilibrado Cuerpo: Hace referencia al tacto en el paladar segn sea su espesor, densidad, viscosidad o cremosidad. Persistencia: Hace referencia al tiempo que dura en el paladar y se detectan las notas de aroma.
stos dependen del ambiente local donde crecen las plantas de caf, su mtodo de proceso, y la subespecie gentica o varietal. As, los cafs presentan un gran abanico de sabores, y las variedades ms valoradas y ms raras alcanzan precios muy elevados.
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En el caf tostado se identifican ms de 700 sustancias voltiles, las cuales corresponden a cerca del 0,1% del total de la materia. Las caractersticas qumicas y el aroma de los constituyentes voltiles del caf han sido motivo de importantes estudios; hoy en da se conocen cientos de aromas, que segn los expertos superan las del vino.
2.1.4.
Pases consumidores de caf
Los pases que consumen una mayor cantidad de caf en kilogramos por persona y ao son: Finlandia (12 Kilogramos/persona/ao), Noruega (9,9), Islandia (9), Dinamarca (8,7), Pases bajos (8,4), Suecia (8,2), Suiza (7,9), Alemania (6,9), Aruba (6,8), Luxemburgo (6,8), Canad (6,5), Austria (6,1), Bosnia-Herzegovina (6,1), Italia (5,9), Eslovenia (5,8), Brasil (5,6), Grecia (5,5) y Croacia (5,1).
Figura 4. Pases consumidores de caf en kilogramos por persona y ao
Para el consumo hay dos variedades importantes:
Arbica: da el caf de mejor calidad, posee un sabor mucho ms suave y rico que el Robusta, un aroma complejos, poca acidez y poca cafena (entre 0,7 y 1,5%). Por todo esto suele ser ms caro. Robusta: da un caf de peor calidad, posee un sabor menos sabroso y ms cido, es menos aromtico y contiene el doble de cafena que el Arbica (entre un 2 y un 3,5%). Por esto suele ser muy utilizado en la elaboracin de caf instantneo y otros cafs ms baratos.
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2.1.5.
Pases productores de caf arbica y robusta
Aunque la imagen de las plantaciones de caf se asocie a menudo con la de inmensos terrenos que se pueden encontrar en diversos pases, la produccin mundial de caf proviene, alrededor de un 70%, de explotaciones principalmente familiares de superficie inferior a 10 hectreas, incluso generalmente por debajo de cinco hectreas.[] Al tratarse de pequeos agricultores, el cultivo del caf da trabajo a un enorme nmero de personas, ya que la recoleccin, muy raramente mecanizada, requiere un tiempo de mano de obra importante que constituye la parte fundamental del coste de produccin. As pues, slo en Brasil, se estima entre 230.000 y 300.000 el nmero de agricultores que viven del caf y 3 millones el nmero de personas empleadas. De todas las especies de caf, slo se cultivan diez, y de dos de ellas se obtiene el 90% de la produccin mundial de caf: Coffea arbica y Coffea canephora (Robusta). Existen dos variedades principales de cultivo en estas plantaciones:
Arbica: Sus plantas, sin embargo, son delicadas de cultivar pero, a pesar de ello, su cultivo asciende a ms de un 60% en el comercio mundial. Aunque es originario de Etiopa y se cultiva principalmente en Brasil, Colombia y Centroamrica, tambin se produce en pases como Brasil, Camern, Colombia, Costa Rica, Cuba, Ecuador, Guatemala, Nicaragua, Hait, Jamaica, Java, Kenia, Mxico, Per, Bolivia, Puerto Rico, Repblica Dominicana, El Salvador, Tanzania, Honduras y Venezuela. Robusta: Es ms resistente que el arbico (de ah su nombre de robusta). Aparece en Uganda y pronto se descubre su alta resistencia contra el calor, las enfermedades y los parsitos. Su cultivo llega casi al 40% y suele utilizarse para la fabricacin de caf soluble o instantneo y mezclas que es donde se aprecia su carcter fuerte. Se cultiva principalmente en frica Central y Oriental, Sudeste de Asia y Brasil.
Figura 5. Distribucin geogrfica de produccin de los diferentes cultivos (r: robusta, a: arabica, m: robusta y arabica).
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Las plantaciones pueden hacerse completamente al descubierto, lo que facilita la organizacin de las operaciones de cultivo y aumenta la produccin frutal al aprovechar al mximo la radiacin solar, siempre y cuando no hayan otros factores limitantes como la fertilidad del suelo, la disponibilidad de agua, entre otros; pero disminuye la longevidad y la resistencia a las enfermedades de los cafetos ya que obliga a la planta a incrementar sus actividades fisiolgicas, como fotosntesis y transpiracin. Por otra parte, las plantaciones pueden hacerse a semisombra (se habla de caf de sombra), lo que mejor se corresponde con la autoecologa de la especie, pero reduce la productividad y complica la gestin. Hay numerosos mtodos de cultivo de sombra, desde la plantacin directa en bosque hasta sabias combinaciones de rboles de refugio cortados en funcin de la fase de fructificacin de los cafetos o hasta sistemas de policultivo. Las plantaciones de sombra inducen generalmente una mejor biodiversidad, aunque muy variable en calidad segn los sistemas empleados y en relacin al estado inicial natural.
2.1.6.
Tipos de caf segn su Origen
Segn el lugar donde se producen tenemos los siguientes tipos de caf:
Cafs americanos: Caf Caf Caf Caf Caf Caf Caf Caf de Colombia del Brasil de Costa Rica de Guatemala de Jamaica de Nicaragua del Per de Mxico
Cafs rabes: Caf moka
Cafs africanos: Caf de Tanzania Caf de Kenia Caf de Etiopia
Cafs de Asia: Caf Caf Caf Caf de de de de la India Java Sumatra Clebes
Caf de Hawai.
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2.1.7.
Pases exportadores e importadores de caf
El caf es la segunda mercanca comercializada en el mundo, tras el petrleo. Se estima en 125 millones el nmero de personas que vive del cultivo del caf, incluyendo 25 millones de pequeos productores. Cada ao se beben 400.000 millones de tazas de caf. Por tanto, en juego hay muchos intereses econmicos y sociales extremadamente importantes. Los mayores exportadores del caf son los sudamericanos. Colombia y Brasil han exportado desde hace dcadas millones de toneladas de ste producto a todo el mundo. Los principales exportadores de caf son Colombia, Brasil, Vietnam, Indonesia, Etiopa, Mxico, India, Per, Guatemala y Honduras.
Figura 6. Pases productores de caf
Los pases importadores que forman parte de la Organizacin Internacional del Caf son: Colombia, Alemania, Austria, Blgica, Chipre, Dinamarca, Espaa, Estonia, Eslovaquia, Eslovenia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungra, Irlanda, Italia, Japn, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Pases Bajos, Polonia, Portugal, Repblica Checa, Reino Unido, Suecia, Suiza, Estados Unidos de Amrica y la Comunidad Europea.[] Seis empresas adquieren casi la mitad de la produccin mundial: Kraft, Nestl, Procter & Gamble, Sara Lee, y la Federacin Nacional De Cafeteros, cuyas ventas anuales generan beneficios del orden de mil millones de dlares.
Figura 7. Pases importadores de caf
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2.2. ELABORACIN DEL CAF

2.2.1.
Cosecha Cuando los frutos llegan a la madurez, de 6 a 8 meses despus de la floracin para el arbiga y de 9 a 11 meses para el robusta, puede comenzar la cosecha del caf. Se emplean dos mtodos: la recoleccin o el despalillado.
Cosecha y preparacin de los granos
La recoleccin consiste en recoger manualmente slo los granos de caf maduros en su punto. Es la tcnica ms costosa, que obliga a pasar durante das varias veces sin interrupcin por el mismo arbusto pero que obtiene las mejores calidades de caf. El despalillado consiste en raspar la rama de las cerezas. Este mtodo puede ser mecanizado. Se recoge por esta tcnica expeditiva una mezcla heterognea de cerezas ms o menos maduras, y es el origen de cafs ms cidos (debido a los frutos an verdes).
En el Departamento de Caldas (Colombia), la cosecha de caf se realiza en los meses de septiembre, octubre y noviembre. El caf maduro, de color rojo se recolecta prontamente para evitar su caida; los pequeos productores, dan inicio al proceso de transformacin del caf mediante el despulpado de los frutos, labor que se ejecuta generalmente con la utilizacin de mquinas conocidas comunmente como "despulpadoras", las cuales retiran la pulpa de los granos para posteriormente realizar el lavado y preseleccionamiento de los mismos. Posteriormente los granos se secan ya sea con ayuda del sol o por medio de secadoras industriales. Para obtener caf calidad "federacin" se deben seleccionar los granos de acuerdo con los estndares sealados por la Federacin Nacional de Cafeteros de Colombia.
Procesamiento Inicialmente los granos de caf recin cogidos se procesan, ya sea mediante el mtodo seco, o el hmedo.
Mtodo mojado
Se emplea el proceso seco para el caf Robusta y gran parte del caf Arbigo de Per, Brasil y Etiopa. Se secan los granos al sol y luego se muelen para eliminar la capa exterior, el muclago seco, la vitela y la cscara plateada. El proceso de molienda se realiza en las instalaciones grandes. Los desperdicios pueden servir como combustible, o tambin, como alimento para los animales. El secado se practica sobre superficies de secado, donde se rastrillan las cerezas de caf y se extienden regularmente. Despus de algunos das, la parte carnosa ya deshidratada se separa.
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Mtodo hmedo Por otra parte, el proceso hmedo, que se emplea para obtener el caf Arbigo de ms alta calidad, puede provocar seria contaminacin. Los granos maduros se lavan primero para eliminar los ms livianos y la basura, luego se reducen a pulpa para quitar la capa exterior y parte del muclago que se encuentra debajo de sta. En seguida, es necesario fermentar los granos, recin reducidos a pulpa, en los tanques respectivos. Este proceso enzimtico descompone las otras capas de muclago, formando un afluente que puede causar serios problemas de contaminacin, al descargarlo directamente a los arroyos o ros. Luego de un lavado final, el caf ahora llamado vitela, se seca al sol o artificialmente. Luego, el caf se descascara para quitar la capa plateada y la de vitela, produciendo el caf en grano limpio o verde que se comercializa internacionalmente. La mayor parte del caf verde del mundo pasa por algn tipo de proceso de lavado, entre ellos la mayora del caf de calidad superior. El lavado se aplica a frutos bien maduros. Despus de ser recogido, el caf verde es clasificado por inmersin en agua. Los frutos malos o inmaduros flotarn y los frutos buenos y maduros se hundirn. La piel de la cereza y parte de la pulpa es eliminada presionando el grano mediante una mquina sumergida a travs de una rejilla. El grano todava tendr una cantidad significativa de pulpa adherida que necesita ser quitada. As se obtienen cafs lavados, descritos como propios y brillantes, generalmente menos cidos y de mejor sabor. La tcnica, a menudo mecanizada, necesita disponer de cubas y de un suministro de agua suficiente. El proceso hmedo requiere una gran cantidad de agua y puede provocar serios problemas de contaminacin. Se puede reciclar la mayora de caudal para economizar agua, y, al hacer esto, se concentra el contenido de enzimas en el agua, para el proceso de produccin de pulpa, y esto facilita la fermentacin. El agua utilizada para el lavado final puede verterse directamente a los ros, pero el otro afluente debe pasar por los pozos de filtracin. Despus del secado o el lavado, el grano de caf se encuentra an encerrado en el ncleo del fruto (el endocarpio): es el caf coque (despus de secado) o el caf parche o vitela (despus de lavado). Es necesario clasificarlo, con el fin de eliminar cualquier haba descompuesta, descolorada o daada. La seleccin puede mecanizarse, en las instalaciones industriales, con ayuda de cmaras con CCD, pero esta operacin se hace a menudo manualmente, en los pases en desarrollo. El caf puede conservarse protegido por su propia cscara durante un cierto tiempo. Algunas cosechas incluso se envejecen para mejorar el sabor del caf. La ltima operacin de preparacin, que permite obtener el caf verde, consiste en descascarillar mecnicamente los granos. Luego, el caf se descascara para quitar la fina capa plateada (el tegumento) y la de vitela,
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produciendo el caf en grano limpio o verde que se comercializa internacionalmente. Las cscaras se recuperan y se utilizan como combustible. Son los granos secos o lavados, luego descascarillados, los que se comercializan en los mercados internacionales.
Semi-hmedo
El semi-hmedo es un proceso hbrido con un uso muy limitado en Brasil y Sumatara/Clebes. Se pasa la cereza a travs de un rastrillo para eliminar la piel y parte de la pulpa como en el proceso hmedo pero el producto resultante es secado al Sol y no fermentado ni cepillado. Pasos adicionales
Clasificacin
Una vez que el caf se ha secado y pasa a ser caf verde, se clasifica a mano o mquina para quitar las impurezas y los granos malos o deformes. Adems, el caf tambin es clasificado por tamao.
Pulido
Algunos granos de caf se pulen para quitar la piel de plata. Esto se hace para mejorar el aspecto de los granos de caf verde y para eliminar los desperdicios que se hayan producido en el tueste.
Almacenamiento
El caf verde es bastante estable si se almacena de forma correcta. Debe guardarse en contenedores que transpiren a menudo algn tipo de saco de fibra y lo mantengan seco y limpio.
Envejecimiento
Todo el caf, cuando fue introducido en Europa, vena del puerto de Moca, en lo que se conoce actualmente como Yemen. Para importar los granos a Europa, el caf iba en barcos en un trayecto muy largo rodeando el continente africano. Estos largos viajes y la exposicin al aire del mar cambiaba el sabor del caf. Una vez que el Canal de Suez fue abierto, el tiempo del trayecto hacia Europa se redujo enormemente y comenz a llegar caf cuyo sabor no haba sido alterado. En cierta medida, este caf ms fresco fue rechazado porque los europeos se haban acostumbrado al sabor anterior. Para intentar lograr un sabor parecido al anterior, parte del caf se envejeca en grandes almacenes al aire libre en los puertos durante seis o ms meses en un intento de simular los efectos de los largos viajes en mar. Aunque todava se debate ampliamente, se cree que ciertos tipos de caf verde mejoran con los aos; especialmente aquellos valorados por su baja acidez, como los cafs de Indonesia o India. Varios de los productores de estos cafs venden granos de caf que han sido envejecidos unos 3 aos, y algunos llegan incluso a 8 aos. Sin embargo, la mayor parte de los expertos
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en caf estn de acuerdo en que el punto ms alto de sabor y frescura del caf se logra un ao despus de la cosecha, ya que los granos de caf envejecidos en exceso pierden gran parte de su contenido en aceites esenciales.
Descafeinamiento
La semilla de cafeto contiene un 2% de cafena. Ya en 1943 se comprob que un gramo diario de cafena (equivalente a 10 tazas de caf express o a 5 de caf filtrado por goteo), absorbido durante una semana basta para inducir un cuadro carencial o sndrome de abstinencia. El descafeinamiento es un procedimiento cuyo objetivo consiste en proporcionar el sabor del caf, pero sin los efectos excitantes de la cafena. El primero en llevar a cabo el procedimiento fue el qumico alemn Friedrich Ferdinand Runge en 1820 despus de que su amigo, el poeta Goethe, le sugiriera que analizara los componentes del caf para descubrir la causa de su insomnio. Runge tambin fue el descubridor de la cafena. Sin embargo, el verdadero progreso tcnico trascendental no se produjo hasta la vuelta del siglo, en 1903, cuando Ludwig Roselius, un importador alemn, decidi pretratar los granos de caf con vapor antes de ponerlos en contacto con el solvente extractor de la cafena. De esta forma, al aumentar la superficie de los granos hmedos e hinchados se facilitaba la eliminacin de la cafena, haciendo posible producir caf descafeinado a escala comercial por primera vez. El caf descafeinado se introduce en Estados Unidos bajo la reconocida marca Sanca (derivado de sans caffeine, o sea, sin cafena en francs). Posteriormente la marca fue adquirida por la compaa de alimentos General Foods. La disminucin del contenido en cafena se hace a costa de las cualidades gustativas. Se utilizan varios mtodos. El principio general, basado en el de Roselius, consiste en empapar los granos en agua, extraer la cafena del lquido as obtenido por adicin de solvente orgnico o por adsorcin sobre carbn activo, y finalmente volver a empapar los granos en el lquido empobrecido en cafena para que reabsorban los otros compuestos siempre presentes. El solvente, principalmente el acetato de etilo que se encuentra en los frutos, nunca est en contacto con los granos, slo con el agua con la cual se empapa el grano. Existe tambin un mtodo de descafeinamiento que utiliza un chorro de dixido de carbono bajo presin.
Tueste y torrefaccin
Tueste del caf
Llegados a su destino, los granos son tostados, lo que desarrolla su aroma y les da su color oscuro. En algunos pases, el tueste se hace aadiendo hasta un 15% de azcar a los granos de caf, en cuyo caso el proceso se denomina torrefaccin y el caf resultante, con un sabor algo ms vigoroso y granos de brillo aceitoso a consecuencia del caramelo depositado, caf torrefacto. A continuacin los granos se muelen.
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Con el tueste, los granos duplican su tamao. Al principio de la aplicacin del calor, el color de los granos verdes pasa a amarillo, luego a marrn canela. Es en ese momento cuando el grano pierde su humedad. Cuando la temperatura en el interior alcanza alrededor de 200 C, salen los aceites de los granos. En general, cuanto ms aceite hay, ms sabor tiene el caf. Durante el tueste, los granos se agrietan de una forma similar a la de las palomitas de maz que explotan bajo calor. Hay dos momentos de explosin que se utilizan como indicadores del nivel de tueste alcanzado.
Figura 8. Niveles de tueste: rubio, canela, medio, ropa de monje, marrn, marrn oscuro, italiano (o seminegro), francs (negro).
Los granos se vuelven ms oscuros y liberan an ms aceite hasta que finaliza el tueste, y son retirados de la fuente de calor. Hasta el siglo XIX se compraban los granos verdes y su tostado se haca con estufa. En 1900 la empresa Hill Brothers inventa el envasado en vaco de caf tostado, que conservaba el sabor y aroma por ms tiempo. Esto cambiara la forma de consumir caf y sentenci la vida de las tostadoras locales. Preparacin de la bebida
La molienda
El grado de espesor de la molienda tiene un impacto importante en el proceso de elaboracin de la bebida, y es crtico saber combinar la consistencia del grado de fineza del caf con el mtodo de elaboracin para poder extraer un sabor ptimo de los granos tostados. Los mtodos de la elaboracin del caf que exponen la molienda de caf a agua calentada durante mucho tiempo necesita que las partculas tengan un mayor grosor que si, en cambio, se utilizan mtodos ms rpidos. Los granos que se muelen demasiado para un determinado mtodo de elaboracin expondrn demasiada rea superficial al agua caliente y producirn un gusto amargo y spero. En el otro extremo, si se muele poco y se dejan partculas excesivamente gruesas, se producir un caf dbil, acuoso y falto de sabor. El ndice de deterioro aumenta cuando el caf est molido, como resultado de la mayor rea superficial expuesta al oxgeno. Con el aumento del caf como bebida de gourmet se ha hecho muy popular moler los granos en casa justo antes de elaborar la bebida, y hay disponibles muchos aparatos electrodomsticos que permiten realizar este proceso.
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Hay varios mtodos para producir la molienda de caf para elaborar la bebida:
Molienda: basada en dos elementos giratorios que machacan o que rasgan el grano con menos riesgo de quemarse. Las cuchillas pueden tener forma redonda o cnica; los ltimos son ms silenciosos y se atascan menos. Las cuchillas muelen el caf a un tamao razonablemente constante, lo que produce una extraccin ms uniforme cuando se elabora la bebida. Los expertos en caf consideran que el molinillo es el nico mtodo aceptable de moler el caf. Picado: La mayora de molinillos modernos realmente pican el grano en pedazos (y algunos bebedores de caf utilizan simplemente una licuadora casera para realizar el proceso). Aunque gozan de una vida mucho ms larga antes de que se desgasten las cuchillas, los resultados son peores, produciendo una molienda poco homognea y, en consecuencia, darn lugar a una extraccin inconsistente y a un producto degradado en la taza. Machacado: El caf turco es producido por infusin con una molienda de una fineza casi impalpable. En ausencia de un molinillo con una calidad suficiente, la nica forma fiable de alcanzarlo es golpear los granos en un mortero.
Caf instantneo. El caf instantneo y soluble es caf seco en polvo o granulado, que se puede disolver rpidamente en agua caliente para ser consumido. En 1881, un qumico estadounidense llamado Satori Kato present el primer caf instantneo durante la Feria del Mundo Panamericano. Sin embargo se debe a Federico Lehnhoff (inventor) y George Washington el primer esfuerzo que llev a la fabricacin comercial. Hay sugerencias de que se inspir viendo polvo seco en el borde de una taza de caf de plata.[11] Federico Lehnhoff Wyld, un guatemalteco-alemn, tambin cre un proceso de caf instantneo en aquella poca,[12] el cual vendi ms tarde en Europa; ya que Lehnhoff era el mdico de cabecera de Washington, se ha sugerido que el descubrimiento no fue independiente. Para obtener el caf soluble se utilizan dos procesos distintos: el secado por aspersin y la liofilizacin. En los dos casos, el tueste del caf se hace a menor temperatura (entre 190 y 210 C) y a continuacin es molido y solubilizado en agua caliente. El lquido obtenido se centrifuga y luego se seca. El secado por aspersin se realiza por aire caliente, mientras que en la liofilizacin se realiza por congelacin brusca a bajas temperaturas. El caf obtenido equivale aproximadamente a una tercera parte del peso del caf verde. Gracias a Nestl, que desarroll su caf soluble Nescaf en 1938, los soldados estadounidenses pudieron tomar caf en sus puestos de combate durante la II Guerra Mundial.
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2.2.2.
Tipos de caf segn su procesado
Caf natural (100% tueste natural) Caf torrefacto (100% tueste con azcar) Caf mezcla (50% tueste natural y 50% tueste torrefacto) Caf mezcla (70% tueste natural y 30% tueste torrefacto) Caf mezcla (30% tueste natural y 70% tueste torrefacto) Caf tueste natural descafeinado (100% tueste natural) Caf tueste mezcla descafeinado (50% tueste natural y 50% tueste torrefacto) Caf tueste mezcla descafeinado (70% tueste natural y 30% tueste torrefacto) Caf tueste mezcla descafeinado (80% tueste natural y 20% tueste torrefacto) Caf expresso natural Caf expresso mezcla Caf expresso descafeinado Caf soluble natural Caf soluble mezcla Caf soluble descafeinado
Dependiendo del procesado al que es sometido el caf, se obtiene una mayor o menor cantidad de cafena. Por lo general los cafs con tostado natural o mezcla son los que tienen una mayor cantidad de cafena, seguidos de los cafs instantneos. Los que menos cantidad tienen son los cafs naturales o mezclas descafeinados, seguidos de los cafs instantneos descafeinados que son los que menos tienen de todos.
Tabla 2. Contenido de cafena en diferentes productos Rango de cafena (mg) 41-83 27-72 0,4-7 5-1 Promedio de cafena (mg) 60 50 2,4 3
Volumen/peso Caf Tostado Instantneo Tostado descafeinado Instantneo descafeinado 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml
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CAPTULO 3: LA CAFENA EN EL CAF
3.1. EL PAPEL DE LA CAFENA EN EL CAF

3.1.1. Propiedades qumicas de la cafena
La cafena es un alcaloide del grupo de las xantinas, concretamente pertenece a la familia de las metilxantinas. Las bases xnticas o pricas son alcaloides derivados de la purina. Concretamente, provienen del anillo de la purina que se forma a travs de la condensacin de una pirimidina con un imidazol. Poseen una estructura cristalina y su frmula molecular es C3H4N2. Las ms importantes son las metilxantinas: cafena, teofilina y teobromina, conocidas respectivamente como 1,3,7-trimetilxantina, 1,3-dimetilxantina y 3,7dimetilxantina.
Figura 9. Estructura molecular de la cafena
La frmula qumica de la cafena es C8H10N4O2, con una masa molecular de 194,19 g/mol. Es una molcula qumica aquiral, y por lo tanto, no tiene enantimeros ni tiene estereoismeros. Presenta la siguiente frmula molecular:
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Figura 10. Estructura molecular de la cafena
Su nombre sistemtico es 1,3,7-trimetilxantina, 1,3,7-trimetil-2,6-dioxopurina o 3,7-dihidro-1,3,7-trimetil-1H-purina-2,6-diona. Tambin es conocida como trimetilxantina, tena, matena, guaranna, metilteobromina o metilteofilina, ya que se obtiene por extraccin de materiales vegetales como el caf, t, guaran, chocolate, yerba mate o la nuez de cola. En estado puro es un slido cristalino blanco inodoro en forma de agujas blancas o polvo, con un gusto muy amargo, que tiene una densidad de 1,23 g/ml, un punto de fusin de 237 C y es eflorescente en contacto con aire. A presin atmosfrica sublima a 176 C, sin descomposicin. Tambin, puede cristalizar en forma de prismas hexagonales. Esta sustancia es soluble en agua y es funcin directa de la temperatura. A 25 C se disuelven 22 mg de cafena en 1 ml de agua, mientras que a 80 C se diluyen 180 mg/ml y a 100 C lo hacen 670 mg/ml. Es muy soluble en agua hirviendo en la que cristaliza como monohidrato, ya que va perdiendo progresivamente la molcula de agua, hasta que lo hace totalmente a los 100 C. Sin embargo tiene ms afinidad por algunos disolventes orgnicos, como el cloroformo (CHCl3) y el diclorometano (CH2Cl2), que a su vez son casi inmiscibles en agua. La cafena puede formar combinaciones estables con sales alcalinas de cidos dbiles, como el benzoato y silicato de sodio, pero su reaccin con cidos da lugar a compuestos muy inestables. Se descompone fcilmente por la accin de lcalis calientes y por cloro.
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3.1.2.
Vida media y eliminacin de la cafena
Casi el 100% de la cafena ingerida, es rpidamente absorbida a partir del tracto gastrointestinal, aumentando su concentracin en el plasma sanguneo a un nivel mximo (Mx.) en unos 30-45 minutos. Una vez integrada en el torrente circulatorio, la cafena se introduce rpidamente en todos los tejidos corporales. Para su excrecin, dada su gran capacidad de permear las membranas, la cafena debe transformarse en sus metabolitos. El periodo de semieliminacin de la cafena (el tiempo requerido para que el cuerpo elimine la mitad de la presente en el plasma sanguneo, es decir, la vida media) oscila entre horas y das, dependiendo de la edad, el sexo, la mediacin y las condiciones de salud. Los recin nacidos carecen de los enzimas precisos para metabolizar la cafena; en ellos, el tiempo de semieliminacin es de 3-4 das. En los fumadores es ms breve (3 horas) que en los no fumadores (3-7 horas). En las mujeres gestantes es de 18 horas y en los pacientes con insuficiencia heptica (deterioro severo de la funcin heptica; del hgado) es tambin ms prolongado que en los que no tienen trastornos de esta naturaleza.
3.1.3.
Propiedades fisiolgicas de la cafena en el caf
La cafena es el estimulante leve psicoactivo ms consumido en el mundo y se encuentra en bebidas no alcohlicas como el caf. El caf es un estimulante del sistema nervioso central por su elevado contenido en cafena. Las preparaciones con las semillas de caf se utilizan como remedio habitual para estimular el organismo. De esta manera, se usa para mantenerse despierto evitando la somnolencia, para estimular la mente y aumentar la energa del organismo. Aunque ms dbil que otros estimulantes, la cafena puede producir sntomas de intoxicacin, tolerancia y abstinencia causados por esta sustancia en algunos individuos. Tiene efecto diurtico y estimulante del miocardio. Relaja los msculos lisos, favorece la vasodilatacin, contrae las arterias cerebrales, aumenta la secrecin cida del estomago y potencia la contraccin del msculo esqueltico. Pero en grandes dosis pueden elevar el humor, causar insomnio, aumentar la irritabilidad, inducir ansiedad y disminuir el cansancio. La ingesta crnica o intensa, causa intoxicacin que se manifiesta con nerviosismo, insomnio, hiperacidez gstrica, contracciones musculares, confusin, taquicardia o arritmia cardaca y agitacin psicomotriz.
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CAPTULO 4: MTODOS ANALTICOS PARA LA DETERMINACIN Y CARACTERIZACIN DE LA CAFENA
La cafena es un alcaloide del grupo de las xantinas, que acta como droga estimulante y psicoactiva. Se encuentra en muchas especies de plantas. La fuente habitual de cafena es el caf, pero tambin se encuentra en el t (tena), guaran (guaranina), mate (matena), cacao y refrescos de cola, entre otros. El contenido de cafena vara enormemente de unas plantas a otras. Dentro de una misma especie tambin existe gran variabilidad. As, el contenido en cafena del caf vara dependiendo de la variedad, del tipo de grano y del mtodo de preparacin. Las plantas producen cafena como pesticida natural, a modo de proteccin mecnica a travs de la cual logran paralizar y matar ciertos insectos que se alimentan de la planta. La determinacin de cafena ha adquirido mucha importancia, debido a su uso en la industria farmacutica y en la industria de alimentos; ya sea como ingrediente en la elaboracin de refrescos y bebidas energticas o por su presencia en productos como el t, el mate, el cacao y el caf. En todos estos casos, el control de calidad del parmetro cafena es necesario en los productos que la contienen. Por esta razn, se han desarrollado nuevos mtodos instrumentales para su determinacin en diversas matrices, especialmente en alimentos.
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Para elegir una tcnica de separacin de la cafena, adems de tener en cuenta los criterios econmicos y de accesibilidad, hay que atender a dos tipos de consideraciones: unas tienen que ver con las propiedades fsicas y estructurales de las molculas que se pretende separar, o de las caractersticas de la matriz en que se encuentran; otras se derivan de los objetivos del anlisis (sensibilidad, resolucin, tiempo de anlisis, necesidad de una deteccin especfica). El mtodo de seleccin incluye los pasos necesarios para la obtencin, preparacin y posible fraccionamiento de la muestra, la aplicacin de la tcnica analtica adecuada y el tratamiento de los datos obtenidos. Las tcnicas analticas ms empleadas en la actualidad pueden englobarse en dos grandes grupos: tcnicas de separacin y tcnicas espectroscpicas. Las tcnicas espectroscpicas proporcionan, para cada compuesto analizado, una informacin compleja, relacionada con sus caractersticas estructurales especficas, por otro lado las tcnicas de separacin se utilizan para resolver los componentes de una mezcla y la seal obtenida puede utilizarse con fines analticos cuantitativos o cualitativos. En la actualidad, las separaciones analticas se efectan fundamentalmente por cromatografa y electroforesis. La cromatografa no solo permite la separacin de los componentes de una mezcla, sino tambin su identificacin y cuantificacin. El anlisis cualitativo est basado en la medida de parmetros cromatogrficos (tiempos y volmenes de retencin) mientras que el anlisis cuantitativo est basado en la medida de alturas o reas de picos cromatogrficos que se relacionan con la concentracin. La columna cromatogrfica y la forma con la que se disea, constituye el corazn de la separacin. El detector, situado al final de la columna es el que garantiza la respuesta de los componentes que se separan. La determinacin de la cafena se suele llevar a cabo mediante tcnicas de separacin como HPLC (Cromatografa lquida de alta eficiencia), CE (Electroforesis capilar), TLC (Cromatografa de capa fina) o GC (Cromatografa de gases). Estos mtodos realizan la deteccin mediante tcnicas electroqumicas (potenciomtricas, conductimtricas, amperomtricas, etc.), pticas (espectrofotomtricas, fluorimtricas, etc.) y otras (termoqumicas). La eleccin de una u otra tcnica depende del problema a resolver, del volumen de muestra y de su concentracin.
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4.1. MTODO CROMATOGRFICO

4.1.1. Introduccin a la cromatografa
En 1906, el botnico Ruso M. Tswett realiz un experimento que condujo al descubrimiento de lo que hoy conocemos como cromatografa. Coloc un extracto de pigmentos vegetales en la parte superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar ter, observ que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendan a travs de la columna a diferentes velocidades. Un rasgo caracterstico de la cromatografa es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de l (fase mvil). La clave de la separacin en cromatografa es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribucin). En el experimento de Tswett, la separacin de los pigmentos vegetales se logr gracias a que cada uno de ellos tena una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes ms afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (ms retenidos) mientras que los ms afines a la fase mvil (menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatogrfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando as su separacin y mediante el uso de un detector, su caracterizacin qumica. Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los mtodos cromatogrficos segn el estado fsico de la fase mvil. En una primera etapa la cromatografa de lquidos se realizaba en columnas de vidrio con dimetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas realiz Tswett sus trabajos originales. Para asegurar unos caudales razonables, el dimetro de las partculas de la fase estacionaria slida por lo general era de 150 a 200 m. Incluso as, los caudales eran bajos, llegando a unas pocas dcimas de mililitro por minuto. En consecuencia, los tiempos de separacin eran largos (varias horas). Los intentos para acelerar el procedimiento clsico mediante la aplicacin de vaco, o por bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumento de caudal originaba un aumento de la altura de plato por encima del mnimo caracterstico que se observa en las grficas de la altura de plato frente al caudal y el resultado era una menor eficacia. En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografa de lquidos, los cientficos se dieron cuenta de que se podan conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna disminuyendo el tamao de las partculas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta finales de los aos sesenta cuando se desarroll la tecnologa adecuada para producir y utilizar rellenos de tamao de partcula del orden de los 3 o 10 m. Esta tecnologa requiere una instrumentacin sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la cromatografa de lquidos clsica. Para distinguir estos procedimientos ms nuevos de los mtodos bsicos, que todava se utilizan con fines preparativos, se emplea la denominacin de cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC).
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4.1.2.
Tipos de cromatografa
La cromatografa es un mtodo de separacin y anlisis basado en el uso de una fase estacionaria y una mvil. Los componentes de una muestra se hacen pasar por una fase estacionaria mediante el flujo de una fase mvil de manera que las sustancias se distribuyen entre las dos fases; aquellos solutos cuya relacin de distribucin sea favorable a la fase estacionaria quedan retenidos por sta, mientras que los solutos que se encuentran preferentemente en la fase mvil sern los primeros en arrastrar. De esta forma los solutos sern separados en orden creciente a sus coeficientes de distribucin con respecto a la fase estacionaria. El conjunto de tcnicas que se valen de una fase mvil que se desplaza a lo largo del sistema y una fase estacionaria que permanece fija reciben el nombre de cromatografa. Los mtodos cromatogrficos pueden ser clasificados:
1. Segn el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase
estacionaria y fase mvil:
Cromatografa en columna: consiste en columnas huecas de longitud y dimetro variable en cuyo interior hallamos la fase estacionaria. La fase mvil se hace pasar por ellas ya sea por gravedad o aplicacin de presin. Cromatografa plana: la fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en papel (cromatografa en capa fina y en papel, respectivamente) y la fase mvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada por la gravedad.
2. Segn los estados de las fases implicadas, en especial de la fase mvil:
Cromatografa de gases: En este caso la fase mvil es un gas inerte (helio o nitrgeno) y la fase estacionaria es un slido (cromatografa gas-slido) o un lquido sostenido por un slido inerte (cromatografa gas-lquido). Este tipo de cromatografa siempre es en columna, ya que es la nica manera de que la fase mvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografa lquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de dimetro) y largo (hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor capacidad de separacin. Cromatografa de lquidos: La fase mvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un slido que interacta con las sustancias que se desea separar (cromatografa lquido-slido), o bien un lquido inmiscible con la fase mvil, depositado en la superficie de un slido (cromatografa lquido-lquido). La cromatografa de lquidos (siempre la fase mvil es un lquido) puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna en papel en capa fina
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En la cromatografa en columna, la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo; en la cromatografa en papel, la fase estacionaria es la solucin acuosa contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografa lquidolquido; en la cromatografa en capa finaa, se dispersa sobre una lmina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor uniforme.
Cromatografa de fluidos supercrticos (cualquier sustancia que se halle en condiciones de presin y temperatura superiores a su punto crtico).
3. Si nos centramos en la cromatografa lquida podemos clasificarla, tambin,
segn el mecanismo de interaccin del soluto con la fase estacionaria:
Cromatografa de reparto o particin: se vale de una fase estacionaria lquida que forma una pelcula sobre un soporte slido. La distribucin del soluto vienen dada por el equilibrio entre la fase estacionaria y mvil. Se utiliza para especies poco polares pero no inicas de masa molecular menor de 104 g/mol. Cromatografa de adsorcin o cromatografa lquido-slido: el soluto presente en una fase mvil lquida o gaseosa se adsorbe a las partculas slidas de la fase estacionaria. La separacin de los diferentes solutos se debe al equilibrio entre las fases estacionaria y mvil. Se utiliza para especies no polares, ismeros estructurales y grupos de compuestos de masa molecular menor de 104 g/mol. Cromatografa de intercambio inico: consiste en hacer pasar una fase mvil lquida sobre una fase estacionaria que presenta grupos inicos en su superficie de modo que los iones de signo opuesto quedarn retenidos por fuerzas electrostticas. Se utiliza para especies inicas de masa molecular menor de 104 g/mol. Cromatografa de exclusin por tamao o cromatografa en gel: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamao y forma de las molculas. Se utiliza para solutos con masa molecular mayor de 104 g/mol. Cromatografa de afinidad: emplea interacciones especficas entre una clase de molculas de soluto y una segunda molcula unida covalentemente a la fase estacionaria.
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Silvia Calle Aznar Tabla 3. Clasificacin de las separaciones cromatogrficas Tipo Reparto o particin Absorcin Papel Capa fina Gel o de exclusin por tamao Cambio inico Fase mvil Lquido Lquido Lquido Lquido Fase estacionaria Lquido Slido Lquido Lquido o slido Lquido Resina Mtodo de fijacin de la fase estacionaria Adsorbida en un slido poroso sostenido en una columna tubular Sostenida en una columna tubular Sostenida en poros de un papel grueso Slido finamente dividido sostenido sobre una placa de vidrio: el lquido puede absorberse sobre las partculas Sostenido en los intersticios de un polmero slido Resina de intercambio inico finamente dividida en una columna tubular
Lquido Lquido
Las nicas sustancias que no pueden ser tratadas por cromatografa son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria. Dentro de las tcnicas cromatogrficas no se incluyen los mtodos que utilizan campos elctricos para separar molculas cargadas, mtodos que se denominan electroseparaciones, electromigraciones o electroforesis.
4.1.3. Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC)

La instrumentacin desarrollada debido al gran avance tecnolgico posibilit la tcnica de separacin y sta a su vez obliga a un perfeccionamiento de la instrumentacin existente y como consecuencia de este empuje se crea una tecnologa de alta calidad, que puede aplicarse ya a la cromatografa en fase lquida. La mejor forma de comprender lo que es actualmente la cromatografa lquida de alta resolucin, denominada por las siglas de su nombre en castellano "CLAR" o bien en ingls "HPLC" (High performance liquid chromatography), ser compararla con la cromatografa de columna clsica (CC) que es su predecesora y enumerar las ventajas que tiene sobre ella, como son:
Posibilidad de volver a utilizar la columna multitud de veces. Columnas ms eficaces con menos longitud. Continuidad de flujo. Resultado continuo (detector en continuo). El tiempo necesario para efectuar una separacin se reduce a una centsima parte.
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La cromatografa de lquidos de alta resolucin, es la tcnica de separacin ms ampliamente utilizada actualmente. Las razones de su popularidad las encontramos en su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de gran inters en la industria. Algunos ejemplos son: aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y gran variedad de sustancias inorgnicas. En cromatografa lquido-lquido, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de la columna que contiene la fase estacionaria. La fase estacionaria es un lquido que recubre el interior de un tubo capilar o la superficie de partculas slidas empaquetadas dentro de la columna. La cromatografa lquida se lleva a cabo en la columna. Se coloca la muestra y se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. El fluido que entra por la columna se llama eluyente. El fluido que sale por el extremo de la columna se llama eluato:
Figura 11. Dibujo de la entrada y salida de la columna
El proceso de paso de un lquido o un gas a travs de una columna cromatogrfica se llama elucin. Las separaciones estn basadas en las diferencias de la velocidad de migracin entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su interaccin con las fases. Como se muestra en la figura 12 el reparto de solutos entre las fases mvil y estacionaria dan lugar a la separacin.
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Figura 12. Representacin esquemtica de una separacin cromatogrfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidad que el soluto B por la fase estacionaria, permanece en la columna ms tiempo.
Para aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las partculas de la fase fija se disminuye hasta micras, usando altas presiones para lograr que la fase mvil pueda fluir.
4.1.4.
Cromatografa de particin o reparto
La cromatografa de reparto ha llegado a ser el tipo de cromatografa de lquidos ms ampliamente utilizado. En el pasado, la mayora de las aplicaciones se han referido a compuestos polares no inicos de baja a moderada masa molecular < 3000. Sin embargo, recientemente se han desarrollado algunos mtodos que han extendido las separaciones de reparto a los compuestos inicos. La cromatografa de reparto se puede subdividir en cromatografa lquidolquido y cromatografa con fases ligadas qumicamente (enlazadas). La diferencia entre estas tcnicas radica en la forma como se retiene la fase estacionarla sobre las partculas soporte del relleno. En lquido-lquido, la fase estacionaria lquida se retiene sobre la superficie del soporte por adsorcin fsica. En fase unida qumicamente, la fase estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte. La cromatografa de reparto, al principio era del tipo lquido-lquido; sin embargo, en la actualidad los mtodos de fase enlazada son los que predominan debido a las desventajas de los sistemas lquido-lquido. Una de esas desventajas es la prdida de fase estacionaria por disolucin en la fase mvil, lo que hace necesario un peridico recubrimiento de las partculas del soporte. Por otra parte,
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el problema de la solubilidad de la fase estacionaria impide el uso de los rellenos de fase lquida en la elucin con gradiente. La discusin se centrar exclusivamente en la cromatografa de reparto con fases unidas qumicamente. sta es una tcnica de anlisis cromatogrfico, en la que la retencin del analito en la columna depende de la naturaleza de su interaccin con la fase estacionaria. En la figura 13, se observa la forma en que interacciona el soluto, el analito, con la fase estacionaria. En la de particin de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria.
Figura 13. Interaccin del analito con la fase estacionaria
La tcnica de cromatografa de particin de columna se basa en la retencin del analito en una columna slida como granos de fibra o cualquier otro material inerte qumicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolvente afn al analito; y una fase mvil liquida o gaseosa; cuando la fase mvil pasa a travs de la columna, el equilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda al final disuelto en la fase estacionaria. En la figura 14, las flechas, que son el flujo de la fase mvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los crculos, alrededor de los cuales hay una capa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito, donde este se disuelve.
Figura 14. Flujo de fase mvil llevando el analito a trevs de la fase estacionaria
Las molculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la mvil, a esto se le llama particin puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoqumica del sistema, entre las dos fases. La retencin depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a la matriz slida, y de que tanto la fase mvil pueda arrastrarlo al fluir.
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En la figura 15 el analito que son los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capa de solvente adherida a la matriz slida. El analito tambin se distribuye entre la capa de solvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como est sobre una columna se le llaman particin de columna.
Figura 15. Distribucin del analito entre la capa solvente de la fase estacionaria
Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tiene diferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separacin del analito de la mezcla se logra por migracin diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito por el disolvente de la columna, el reparto en esta ser mayor que en la fase mvil. Esta tcnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o lquidos inmiscibles. En HPLC se puede llevar a cabo una cromatografa lquida en fase normal cuando la fase estacionaria es relativamente polar y la fase mvil es relativamente apolar. Pero, se efecta una cromatografa en fase inversa (o reversa) cuando la fase estacionaria es relativamente apolar y la fase mvil es relativamente polar.
4.1.5.
Cromatografa de fase normal y fase inversa
Inicialmente, la cromatografa de lquidos utilizaba fases estacionarias de elevada polaridad tales como el agua o el trietilenglicol colocadas sobre partculas de slice o almina. Por razones histricas, a este tipo de cromatografa se le conoce ahora como cromatografa en fase normal. La cromatografa de fase normal utiliza una fase estacionaria polar (frecuentemente hidroflica) y una fase mvil menos polar. Para seleccionar una fase ptima, es mejor empezar con una fase mvil de un hidrocarburo puro como el heptano. Si la muestra se retiene fuertemente, la polaridad de la fase mvil debe aumentarse, quiz aadiendo pequeas cantidades de metanol o de dioxano. En cromatografa en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que relativamente es el ms soluble en la fase mvil y un aumento de la polaridad de la fase mvil provoca una disminucin del tiempo de elucin. Por contraste, en los mtodos en fase inversa, los componentes ms polares aparecen primero, y un aumento de la polaridad de la fase mvil aumenta el tiempo de elucin.
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La tcnica de fase inversa es el modo ms ampliamente utilizado en HPLC e incluye cerca de la mitad de los mtodos de cromatografa lquida. Esta tcnica es la que probablemente proporcionar retencin y selectividad ptimas cuando los compuestos no tienen grupos para enlaces de hidrgeno o no tienen un carcter predominantemente aliftico o aromtico. En la cromatografa en fase inversa (o reversa), la fase estacionaria es no polar, con frecuencia se trata de un hidrocarburo, y la fase mvil es relativamente polar (como el agua, el metanol o el acetonitrilo). La cromatografa de fase inversa utiliza un empaque enlazado hidrofbico, usualmente con un grupo funcional octadecilo (C-18) u octilo(C-8) y una fase mvil polar, frecuentemente una fase mvil parcial o totalmente acuosa. Conforme aumenta el carcter hidrofbico de los solutos, la retencin aumenta. El agua es el eluyente ms dbil. El metanol y el acetonitrilo son disolventes populares porque tienen baja viscosidad y son fciles de conseguir con excelente pureza. En cromatografa de fase inversa la fuerza de la retencin no es la interaccin favorable del soluto con la fase estacionaria, sino el efecto del disolvente de la fase mvil para forzar al soluto hacia dentro de la capa hidrocarbonada enlazada. Los rellenos de fase enlazada se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento unido qumicamente tiene un carcter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares.
4.1.6. Instrumentacin resolucin
para
cromatografa
de
lquidos
de
alta
Este es un esquema del conjunto de componentes fundamentales necesarios para la cromatografa lquida:
Figura 16. Esquema de un HPLC
Figura 17.
Componentes del HPLC utilizado
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Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de partcula entre 3 y 10 m, que son comunes en cromatografa de lquidos, se requieren presiones altas. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa. La figura 18 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin tpico.
Figura 18.
Esquema de los componentes fundamentales de un cromatgrafo de HPLC.
Cada uno de los componentes se trata en los prrafos que siguen a continuacin: RECIPIENTES PARA LA FASE MVIL Y SISTEMAS PARA EL TRATAMIENTO DE LOS DISOLVENTES Un aparato de HPLC se equipa con uno o ms recipientes de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos (en general oxgeno y nitrgeno) que interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o sistemas de difusin que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Estos sistemas tambin contienen un dispositivo para la filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin de los disolventes. Si el equipo no consta de desgasificadores y los filtros, una forma de tratar los disolventes antes de
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introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vaco a travs de un filtro de poro muy pequeo (ver equipo de filtrado para HPLC en Anexo 5). Este tratamiento elimina los gases adems de la materia en suspensin. La fase mvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes; algo importantes es que deben ser grado HPLC, esto implica un 99% o mas de pureza para evitar contaminantes que puedan interferir en la elucin de la muestra o bien que contengan algunas pequeas partculas que puedan tapar la columna; por eso es necesario filtrarlos antes de que entren a la columna. Los disolventes ms usados en HPLC son agua, disoluciones tampn acuosas y disolventes orgnicos como el metanol o el acetonitrilo. Deben ser espectroscpicamente puros, exentos de partculas slidas y degasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte muy poco soluble como el helio. En el caso de no poder utilizar helio se pueden desgasificar mediante la utilizacin del equipo de ultrasonidos (ver Anexo 2). Dependiendo del equipo, cuando se trata de una mezcla de disolventes; se puede o no programar la bomba para que tome las cantidades adecuadas de cada disolvente o bien, algunas otras bombas (las ms antiguas) no tienen la capacidad de realizar esta mezcla y por lo tanto esta se tiene que preparar por nosotros. SISTEMAS DE BOMBEO Debido a las elevadas presiones de trabajo y al pequeo tamao de las partculas de la fase estacionaria, se utiliza una bomba que es la encargada de introducir la fase mvil o disolvente a travs de la columna. Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen:

La generacin de presiones superiores a 6000 psi Un flujo libre de pulsaciones Capacidad de cubrir un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min, El control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo Componentes resistentes a la corrosin (juntas de acero inoxidable o tefln). Construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados
Las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosin, debido a que los lquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema slo supone una prdida de disolvente. Es evidente que esta prdida puede suponer un riesgo de incendio. Entre los sistemas de bombeo se utilizan tres tipos de bombas:

bombas recprocas o de vaivn bombas neumticas o de presin constante bombas de jeringa o de desplazamiento
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Las Bombas recprocas o de vaivn, son las ms utilizadas. Estn formadas por una pequea cmara cilndrica que se llena y luego se vaca por oscilacin de un pistn de zafiro. El bombeo produce un flujo pulsado que despus debe amortiguarse. Sus principales ventajas son que se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal constante, pudindose adaptar a la tcnica de elucin con gradiente, debido a su pequeo volumen interno. Las Bombas neumticas o de presin constante, hacen uso de la presin de un gas aplicado al recipiente conteniendo la fase mvil. Son sencillas, no provocan pulsaciones pero estn limitadas a presiones relativamente bajas. Las Bombas de desplazamiento o tipo jeringa, consisten en una cmara equipada con un mecanismo de tornillo. Suministran un flujo libre de pulsaciones pero con una capacidad limitada a unos 250 ml. Amortiguadores de pulsos Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones de flujo. Un mtodo sencillo de amortiguacin contiene un fuelle flexible o un gas compresible en la porcin superior cerrada de un tubo en T para absorber parte de la energa de pulsacin. Cuando la bomba se rellena esta energa se libera para ayudar a suavizar la pulsacin de presin. Los amortiguadores electrnicos de pulsos proporcionan una carrera hacia delante corta y rpida del pistn, y enseguida la carrera rpida de recarga de la bomba. El pequeo impulso hacia delante amortigua el pulso de flujo llevando disolvente a la presin del sistema. Control del caudal y sistemas de programacin Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos comerciales se equipan con dispositivos controlados por ordenador que permiten medir el caudal mediante la determinacin de la cada de presin a travs de un restrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la seal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba. La bomba enva el disolvente hacia la vlvula inyectora que es una vlvula de varias vas que permite introducir al disolvente, la muestra contenida en el loop de volumen calibrado. SISTEMAS DE INYECCIN DE MUESTRA A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser muy pequeos, de unas pocas dcimas de microlitro a tal vez 500 L. Adems, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. El mtodo ms simple es la utilizacin de una jeringa de alta presin con un diafragma (septum) a la entrada de la columna. Est limitado a una presin mxima de operacin de 1500 psi. Las vlvulas de inyeccin con bucles de volumen conocido, es el mtodo ms utilizado, como el que se muestra en la figura 19. Estos dispositivos estn
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normalmente integrados en el equipo cromatogrfico y hay bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos de muestra desde 5 a 500 L. Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisin relativa de unas dcimas por ciento. Tambin existen vlvulas de inyeccin de micromuestras, con bucles con volmenes de 0,5 a 5 L.
Figura 19. Bucle de muestra para cromatografa de lquidos.
COLUMNAS En las columnas cromatogrficas es donde se produce la velocidad diferencial de los solutos que permite su separacin. Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con partculas que contienen la fase estacionaria y los materiales ms usados para los tubos de las columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulacin ms fcil. Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. Cientos de columnas empaquetadas que difieren en tamao y relleno se comercializan por distintos fabricantes. Columnas analticas La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen una longitud entre 5 y 30 cm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10 m. La eficacia de las columnas aumenta al disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria. Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se protege la entrada de la columna con otra ms corta, la precolumna, para eliminar contaminantes y partculas de polvo. Como cierre de las columnas se utilizan placas filtrantes de acero que no dejan escapar las micropartculas de la columna.
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Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm de dimetro interno, y empaquetada con partculas de 5 m. Estas columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro. Tambin, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con partculas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta 100 000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente. La ltima propiedad es de considerable importancia, puesto que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros. Termostatos En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las dcimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 C. Para poder controlar con precisin la temperatura, las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua que provenga de un bao a temperatura constante.
Tipos de rellenos de la columna En cromatografa de reparto lquido-lquido los empaques de columna ms utilizados, son aquellos con fases estacionarias orgnicas enlazadas. Reemplazan a los empaques clsicos en los que el lquido estacionario recubre un material de soporte. El reparto ocurre entre la fase enlazada y una fase mvil lquida. Los soportes con fase enlazada se preparan uniendo covalentemente a la superficie de la slice una especie orgnica de hidrocarburo. Los soportes incluyen geles de slice de poro grandes, cuentas con lechos porosos y micropartculas. El siloxano se ha convertido en el estndar de las fases enlazadas comerciales. Es poco probable que la porcin hidrocarbonada de octilo u octadecilo se extienda totalmente dentro de la fase mvil. Las fases monomricas responden rpidamente a los cambios en la composicin de la fase mvil, cuando son mojadas por ellas. La falta de mojado causa una eficiencia pobre, presentndose adsorcin en la interfase o entrecara adsorbentedisolvente en adicin al equilibrio de reparto lquido lquido esperado. Una fase enlazada popular es un hidrocarburo de cadena lineal. El grupo alquilo puede ser de diversas longitudes, normalmente es un grupo etilo (C-2), octilo (C-8) u octadecilo (C-18). Este ltimo puede utilizarse para las aplicaciones donde se requiere un mximo de retencin.
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Figura 20. Columna cromatogrfica C18 utilizada
Introduccin de la muestra Una vez que la columna se encuentra correctamente empaquetada, se procede a la aplicacin de la disolucin de la muestra. Cuando se introduce en la columna cierta cantidad de muestra, sta se queda en una zona de cierta altura en la columna. Si entonces se introduce el disolvente, comienza el desplazamiento de la zona a lo largo de la columna. La parte superior de la zona se disuelve poco a poco y, empujado por la disolucin que se forma, el frente de la zona avanza hacia la base de la columna. Procedimientos de elucin La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto es prcticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elucin como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. La cromatografa de fase normal se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente ms polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografa de fase inversa, que es la ms utilizada, se caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o dbilmente polar y el disolvente es ms polar. Un disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografa de fase inversa elimina las colas de los picos porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningn soluto originando colas. La cromatografa de fase inversa tambin es menos sensible a impurezas polares (como el agua), que pueda haber en el eluyente. Elucin isocrtica y gradiente Cuando se usa el mismo disolvente durante toda la separacin, se denomina elucin isocrtica. La elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si un disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar una elucin gradiente. En este caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo un gradiente contino.
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Figura 21.
Las molculas del disolvente y las molculas del soluto compiten entre s en su reaccin con los puntos activos de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, ms fcilmente se desplaza el soluto.
DETECTORES El papel del detector es indicar los momentos de aparicin de los componentes, y proporcionar indicacin cuantitativa y cualitativa de los mismos. El detector utilizado depende de la naturaleza de la muestra y deber reunir una serie de caractersticas como son, tener una sensibilidad elevada, buena estabilidad y reproducibilidad. Amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la presin y la temperatura. Los tipos de detectores en cromatografa de lquidos se clasifican en:
Los detectores basados en una propiedad del soluto que no la suele presentar la fase mvil. Suelen ser muy selectivos y sensibles: Detectores de absorbancia ultravioleta, son los ms utilizados. Su fundamento es la espectrofotometra de absorcin de luz visible y ultravioleta de un componente a una determinada longitud de onda. Los ms potentes son los que utilizan un montaje de fotodiodos para registrar el espectro completo de cada soluto que pasa por el detector. Los datos de absorbancia se representan en funcin de la longitud de onda y del tiempo. Detectores de fluorescencia, son muy sensibles y selectivos, el principio de operacin se basa en la irradiacin con la luz UV al componente de inters y la posterior medida de la luz fluorescente emitida por ste. Detectores electroqumicos, ofrece ventajas debido a su especificidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad, especialmente para compuestos orgnicos. Responde a analitos que puedan oxidarse o reducirse. Es el ejemplo de fenoles, aminas, perxidos (pueden detectarse por oxidacin) y cetonas, aldehdos (detectados por reduccin). Las tcnicas electroqumicas ms utilizadas con esta finalidad son la amperometra, voltamperometra y culombimetra.
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Los detectores basados en una propiedad de la disolucin, responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles: Detectores de ndice de refraccin, est formado por una celda con dos compartimentos, en uno se introduce el disolvente puro y en el otro la muestra, se hace pasar luz visible paralela. Cuando entra en la celda soluto de distinto ndice de refraccin al disolvente el has se desva y vara la seal dada por la fotoclula. El principal inconveniente es que son muy sensibles a los cambios de temperatura y no resultan apropiados para trabajar con la modalidad de elusin con gradiente. Detectores de conductividad, son los ms utilizados cuando los solutos eluidos son inicos, como cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos despus de su separacin por cromatografa de cambio inico. Tienen elevada sensibilidad, baratos y de larga duracin.
Los detectores ms utilizados en cromatografa de lquidos son:
Detector UV. Hay bsicamente tres tipos: Detector de Longitud de Onda Fija Detector de Longitud de Onda Variable Detector de Arreglo de Diodos
El detector ms comn en HPLC es el detector de ultravioleta, que utiliza una celda de flujo como la que se muestra en la figura 22, porque muchos solutos absorben luz ultravioleta. Los sistemas ms simples utilizan la intensa raya de emisin a 254 nm de una lmpara de mercurio. Los instrumentos ms verstiles tienen lmparas de deuterio, xenn o volframio, y un monocromador, con el que se puede elegir la longitud de onda ptima, de ultravioleta o visible, para detectar los analitos estudiados.
Figura 22.
Celda de detector ultravioleta en HPLC. Una celda ordinaria contiene un camino ptico de 0,5 cm y contiene slo 8l de lquido.
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REGISTRADOR INTEGRADOR Despus de que se haya producido la separacin en la columna y los componentes de la mezcla hayan pasado al detector, ste da una seal elctrica proporcional a la cantidad de materia; esta seal es enviada al registrador que a su vez da un cromatograma de intensidad en funcin del tiempo (figura 23); en el cual, lo ideal es obtener picos gaussianos los cuales corresponden cada uno a un componente diferente de la muestra. El integrador calcula el rea de cada pico, la cual se puede relacionar con la concentracin del componente si se tiene una curva patrn; si no se cuenta con ella, slo sera cualitativa.
Figura 23. Cromatograma tpico obtenido por un HPLC
Debido a que los detectores que se usan en estos equipos no son destructivos, es posible recuperar los productos que salen de l, y de esta manera realizar otro tipo de separaciones (por ejemplo) analticas (tambin depende del tamao del loop, de la columna y del tipo de bomba).
4.1.7.
Parmetros cromatogrficos
Volumen y tiempo de retencin El volumen de fase mvil (o tiempo para Tr) necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de inyeccin a travs de la columna, hasta el detector, en el punto mximo del pico del soluto se define como volumen de retencin (Vr). El volumen muerto (V0) representa lo que se conoce como espacio muerto o volumen de retraso de la columna, incluye las contribuciones efectivas del volumen del inyector, tubera, conexin, columna y detector.
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Factor de capacidad (K) Actualmente, se conoce como factor de retencin (k). El factor de retencin es un parmetro experimental importante que se utiliza para describir las velocidades de migracin de los solutos en columnas. Para el soluto A, el factor de retencin, kA se define como:
KA =
K A VS VM
(1)
donde KA es la constante de distribucin del soluto A, Vs es el volumen del soluto en la fase estacionaria y Vm el volumen del soluto en la fase mvil. Selectividad El factor de selectividad de una columna para dos solutos, A y B, se define como la relacin de la constante de distribucin del soluto retenido con ms fuerza, B, y la constante de distribucin del soluto retenido con menos fuerza, A:
KB KA
(2)
donde KB es la constante de distribucin de la especie retenida con ms fuerza, especie B, y KA es la constante de la especie retenida con menos fuerza, es decir, la especie A, que eluye ms rpido. De acuerdo con esta definicin, siempre es mayor que la unidad. Eficiencia La eficiencia de una columna cromatogrfica depende del ensanchamiento de banda que ocurre cuando un compuesto pasa a travs de la columna. Para las mediciones cuantitativas de la eficiencia de las columnas cromatogrficas se emplean dos trminos: (1) altura del plato H y (2) cantidad de platos o nmero de platos tericos N. Los dos estn relacionados por la ecuacin:
N=
L H
(3)
donde L es la longitud del empaque de la columna (en cm). La eficiencia de las columnas cromatogrficas aumenta a medida que es mayor el nmero de platos N y la altura H es menor. Se observan grandes diferencias en la eficiencia de las columnas como resultado de las diferencias en el tipo de columna y de las fases mvil y estacionaria. En trminos de nmero de platos tericos, la eficiencia puede variar desde unos centmetros hasta varios cientos de miles; la altura de los platos vara desde unas dcimas hasta milsimas de centmetro y son comunes incluso mas pequeas.
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Resolucin cromatogrfica Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos A y B. la resolucin de cada columna queda definida como:
RS =
2Z 2((trA ) (trB )) = WA + WB WA + WB
(4)
Se puede mejorar la resolucin para una fase estacionaria determinada alargando la columna, lo que incrementa el nmero de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa de aadir platos es un incremento en el tiempo necesario para la separacin de los componentes. Nmero de platos tericos Expresada como una cantidad adimensional, refleja el nmero de veces que el soluto se reparte entre las dos fases durante su paso a travs de la columna.
Figura 24. Platos tericos de una columna
Asimetra (AF) El factor de asimetra del pico (AF, de asymetry factor) se define como la razn de las mitades del ancho del pico a una altura dada. Conforme se mida ms abajo la asimetra del pico AF es mayor, debido al ruido del detector, un compromiso aceptable es medir AF en 10% de la altura del pico.
Figura 25. Representacin esquemtica del factor de asimetra.
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4.2. MTODO ESPECTROSCPICO

4.2.1. Mtodos espectroscpicos
Los mtodos espectroscpicos de anlisis estn basados en medidas de radiacin electromagntica absorbida o emitida por las sustancias. En funcin de ello se clasifican fundamentalmente en:
Mtodos de absorcin: Se basan en la disminucin de la potencia de un haz de radiacin electromagntica al interaccionar sobre una sustancia. Mtodos de emisin: Se basan en la radiacin que emite una sustancia cuando es excitada previamente por medio de otro tipo de energa. Mtodos de fluorescencia: Se basan en la radiacin que emite la sustancia cuando es excitada previamente por un haz de radiacin electromagntica.
Otras clasificaciones de los mtodos espectroscpicos se establecen en funcin de la regin del espectro electromagntico que interviene en la tcnica. As, pueden usarse regiones como rayos X, UV, visible, infrarrojo, microondas, etc. Aunque existen muchos tipos de espectroscopa, las ms utilizadas en qumica orgnica se agrupan en cuatro categoras:

espectroscopa de resonancia magntica nuclear (RMN) espectroscopa de infrarrojo espectroscopa de ultravioleta espectrometra de masas
4.2.2.
Radiacin electromagntica
La radiacin electromagntica normalmente descrita por el modelo de onda se representa por los campos elctrico y magntico que oscilan en dos planos perpendiculares entre s y a la direccin de propagacin. En el vaco se propaga a la velocidad de la luz (300.000 Km/s).
Figura 26. Representacin de la onda electromagntica que se desplaza en el espacio siguiendo la trayectoria del eje X.
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Los vectores campo elctrico (E) y magntico (H) son perpendiculares y su mdulo, direccin y sentido varan segn un movimiento oscilatorio. Ambos vectores cambian en funcin del tiempo debido a la propagacin de onda. Se considerar slo el vector elctrico para explicar sus propiedades y simplificar el tratamiento de datos. Los parmetros que caracterizan una onda son:
Longitud de onda () que representa la distancia entre dos puntos con idntico valor de campo elctrico en mdulo y direccin. La frecuencia () que designa el nmero de oscilaciones por unidad de tiempo. Esta unidad depende de la longitud de onda.
=c/ (c=velocidad de la luz) (5)
La radiacin electromagntica est cuantizada, es decir, est formada por unidades discretas de energa llamadas fotones. La energa, E, de un fotn viene dada por la expresin:
E = h = hc
(Constante de Planck, h= 6,6252x10-34 Js) (6)
Intensidad (I) que se define como el nmero de fotones que por unidad de tiempo atraviesa la unidad de rea, perpendicular a su direccin de propagacin. Esta magnitud est relacionada con el mdulo del vector campo elctrico.
El espectro de la radiacin electromagntica en funcin de la longitud de onda o de la energa est convenientemente dividido en secciones y cada una, abarca unos valores de energa que utilizan las distintas tcnicas electromagnticas. La radiacin electromagntica ultravioleta-visible, en el intervalo de 200-750 nm, constituye la zona del espectro en la que operan las espectroscopas UV-Visible y de fluorescencia.
Tabla 4. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos. Radiacin Radio Microondas Infrarrojo UV-Visible Rayos X Longitud de onda (nm) 1012 108 106 2x102-7,5x102 10-103 Transicin molecular Espn nuclear Espn elctrico Vibracional Electrnica Electrnica (capas internas) Tcnica espectroscpica RMN EPR IR UV-Visible Espectroscopa de rayos X (no difraccin)
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Figura 27. Espectro de ondas electromagnticas
4.2.3.
Interaccin de la radiacin electromagntica con la materia
Cuando la radiacin electromagntica atraviesa una capa de materia, se produce absorcin y se eliminan selectivamente ciertas frecuencias de la radiacin incidente. El estudio de las frecuencias de radiacin absorbidas por una muestra constituye el espectro de absorcin de la misma y ofrece un medio para caracterizarla. Toda molcula posee una serie de cantidades discretas o cuantos de energa, denominados niveles de energa. Su energa total corresponde a la suma de toda una serie de componentes energticos que estn cuantizados: E total= E traslacin + E rotacin + E vibracin + E electrnica + + E espn electrnico + E espn nuclear En una molcula, los niveles de energa determinados por las distribuciones espaciales posibles de los electrones se denominan niveles de energa electrnicos.
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Figura 28. Diagrama de energa de una molcula diatmica con el nivel electrnico fundamental y excitado y sus niveles vibracionales.
En esta figura, se representan dos transiciones electrnicas desde el estado fundamental hasta el excitado, inducidas con valores de energa E1 y E2. Cuando la radiacin de energa h interacciona con una molcula, que tiene dos estados electrnicos con energas E1 y E0, si se verifica que:
E = E1 E0 = h (7)
La molecula absorber esta energa (E = h) y realizar una transicin electrnica, pasando del estado fundamental (S0) a un estado excitado (S1). La transicin electrnica tiene lugar en un espacio de tiempo del orden de 10-15 segundos, sin variacin de la distancia entre los ncleos (Principio de FranckCondon). En los picosegundos siguientes, el ncleo de la molcula se adapta a las nuevas condiciones de equilibrio correspondientes a este estado excitado. Finalmente, la molcula regresa a su estado fundamental por uno de los caminos siguientes:
La partcula excitada emite un fotn de la misma energa que ha absorbido y vuelve inmediatamente al estado fundamental. La molcula en el estado excitado sufre un proceso de relajacin sin emisin de fotones. En dicho proceso, la molcula pierde energa dentro del estado excitado. Cuando regresa al estado fundamental emite radiacin electromagntica de mayor longitud de onda y menos energa. Este tipo de sucesos tiene lugar en escala de tiempo de los nanosegundos donde se sitan las espectroscopas de absorcin y de fluorescencia. La radiacin electromagntica puede dar lugar a una reaccin fotoqumica, como por ejemplo las reacciones qumicas del proceso de la fotosntesis en clulas vegetales especializadas.
Estos conceptos constituyen el fundamento de la espectroscopa molecular y cada tcnica espectroscpica est restringida a una zona del espectro de energas.
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4.2.4.
Espectroscopa UV
Cuando la radiacin electromagntica incide sobre la solucin de molculas puede dar lugar a tres tipos de sucesos: absorcin, dispersin y emisin de la radiacin. La teora de orbitales moleculares (OM) considera que en la formacin de un enlace entre dos tomos, dos orbitales atmicos se fusionan para dar los orbitales moleculares enlazante y antienlazante. Cada orbital molecular puede acomodar un par de electrones con espines apareados (de signo opuesto) que se denomina estado singlete. En una transicin electrnica, uno de los electrones pasar a un orbital molecular distinto conservando su nmero de espn y en este caso, la molcula en el estado excitado sigue en el estado singlete. Pero, dado que ahora los electrones se encuentran en orbitales moleculares distintos pueden tener los espines paralelos (mismo signo) y si esto ocurre, a dicho estado se le denomina triplete: En general, los orbitales moleculares se clasifican en:
Orbitales enlazante y * antienlazante que se forman por la combinacin de los orbitales atmicos tipo (s) y/o (p) y constituyen los enlaces simples de las molculas. Orbitales enlazante y * antienlazante originados por la combinacin de los orbitales atmicos (p) que participan en los enlaces mltiples. Orbitales n que representan las molculas con un heteroatmo tipo N y O con pares de electrones desapareados que no participan directamente en el enlace molecular.
En condiciones normales, los electrones de una molcula ocupan preferentemente los orbitales moleculares enlazantes de menor energa con sus espines apareados.
Figura 29. Diagrama de los niveles de energa y posibles transiciones moleculares.
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Silvia Calle Aznar
Una molcula absorber radiacin electromagntica de energa hv y realizar una transicin electrnica, si la longitud de onda cumple con la condicin E=h, siendo E la diferencia de energa entre el nivel electrnico fundamental y uno ms enrgico. Este concepto constituye el fundamento de la espectroscopa de absorcin. La espectroscopa de absorcin UV-Vis analiza las transiciones electrnicas * y n* inducidas por la radiacin luminosa ultravioletavisible. Las transiciones * requieren energa UV lejano.
Figura 30. Molcula X-Y que absorbe radiacin electromagntica (E) y pasa del estado electrnico fundamental (E0) al excitado (E1).
En la figura 30 se puede observar que la longitud de onda de la radiacin incidente y emergente es la misma, pero no su intensidad. Los grupos funcionales de una molcula que son excitados por la absorcin de radiacin luminosa UV-Visible se denominan cromforos. Ecuacin de Lambert-Beer: coeficiente de extincin molar Si se hace incidir radiacin monocromtica sobre una muestra con una concentracin c de una sustancia que absorbe a esa longitud de onda , la intensidad de la radiacin que la atraviesa, I, est relacionada con la intensidad incidente I0 y con el espesor de la muestra, l, por la expresin:
I = I0ecl
(8)
aplicando logaritmos:
log I = log I0 - cl (9)
reordenando trminos:
log I0 - log I = cl (10)
pudindose escribir:
log (I/I0) = cl (11)
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Habitualmente, el cociente I/I0 se denomina transmitancia de la muestra y se suele expresar como porcentaje de luz transmitida: (I/I0)100. Por otra parte, se define la absorbancia de la muestra como: A = log(1/T). Tanto la absorbancia como la transmitancia son magnitudes que se obtienen directamente en el espectrofotmetro. Segn estas definiciones, queda finalmente la siguiente expresin que se conoce con el nombre de la ley de Lambert-Beer:
A = lc (12)
donde es la absortividad molar (una medida de la radiacin absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda l y en unas condiciones experimentales determinadas; tambin se denomina coeficiente de extincin molar si, como es frecuente, la concentracin se expresa en moles por litro. Si se opera, por tanto, a una longitud de onda dada y con una cubeta de un determinado espesor, l, la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a la concentracin molar de la muestra, c, lo que constituye el fundamento del anlisis espectrofotomtrico cuantitativo. Existen, sin embargo, distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al anlisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de calibrado que relaciona las absorbancias con las concentraciones. Curva de Calibracin Denominamos espectro de una sustancia a la representacin de absorbancia (A) en funcin de longitud de onda (), este grfico presenta ondulaciones con mximos y mnimos. Para hacer las determinaciones cuantitativas se elige, en general, la longitud de onda correspondiente a un mximo, pues el error de medicin es mnimo y la sensibilidad mxima. Para verificar el cumplimiento de la ley de Beer, se debe realizar la curva de calibracin; absorbancia (A) en funcin de concentracin (c), para lo cual se preparan soluciones de la sustancia de concentraciones conocidas y se mide la absorbancia a la longitud de onda elegida. Si es vlida la ley de Beer, para esa sustancia a esas concentraciones, la relacin debe ser una recta, que pase por el origen de los ejes cartesianos; a menudo se observan desviaciones debidas a diversos factores.
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Silvia Calle Aznar
Figura 31. Curva de calibracin
Espectro de absorcin UV-Vis El espectro de absorcin de una molcula en solucin es la representacin grfica de la probabilidad de absorcin de radiacin luminosa por sus cromforos con respeto a la longitud de onda. Constituye una caracterstica propia de la molcula que depende de sus propiedades estructurales y del disolvente.
Figura 32. Espectro de absorcin de diferentes sustancias
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Cuando un cromforo absorbe radiacin luminosa realiza transiciones electrnicas discretas y su espectro debera estar formado por lneas de absorcin cuya magnitud estara relacionada con la probabilidad de la transicin y la concentracin molecular. Sin embargo, el espectro de absorcin en disolucin es continuo debido a la interaccin soluto-disolvente y est formado por las bandas de absorbancia que corresponden a las diversas transiciones permitidas entre el estado fundamental y cualquiera de los niveles vibracionales de los estados electrnicos excitados. Cada banda se caracteriza por una longitud de onda de mxima absorcin, mx, que corresponde a la transicin ms probable.
4.2.5.
Instrumentacin para espectroscopa UV
Espectrofotmetros Un espectrofotmetro consta de las siguientes unidades bsicas: a) La lmpara que emite la radiacin electromagntica. Los espectrofotmetros de absorcin UV-Visible suelen estar equipados con dos tipos de lmparas: las halgenas que emiten luz visible en la zona del espectro visible (700-350 nm) y las de deuterio que emiten radiacin ultravioleta y cubren el espectro UV-prximo (350-250 nm). b) Las lentes pticas que concentran el haz de luz luminoso y lo enfocan sobre el monocromador. c) El monocromador, unidad que permite obtener luz monocromtica o radiacin formada por una sola longitud de onda. d) El sistema de cubetas o clulas, donde situamos la solucin de muestra a analizar y se caracteriza por su longitud de paso. e) El detector: la luz no absorbida (trasmitida) por la muestra contina su camino hacia el fotomultiplicador y por mediacin del sistema de fotodiodos esta seal ptica es transformada en elctrica, para finalmente, ser ampliada y registrada o digitalizada.
Para determinar la absorbancia, A, de una muestra en un espectrofotmetro de mono-haz, es necesario hacer dos lecturas independientes: primero la del disolvente (Ad) y a continuacin la solucin de muestra (Am). Dado que las absorbancias son aditivas, la medida de absorbancia del soluto ser: A = Ad-Am. Los espectrofotmetros de doble haz tiene las misma unidades comentadas, pero adems, disponen de un dispositivo que divide el haz ptico inicial en dos haces idnticos que recorrern caminos paralelos e incidirn sobre dos cubetas de forma casi simultnea, una de referencia donde se sita el disolvente y otra para la muestra. As pues, en una sola operacin se obtiene la medida de absorbancia del soluto.
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Figura 33. Sistema ptico de un espectrofotmetro mono-haz
Figura 34.
Espectrofotmetro UV-VIS utilizado
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CAPTULO 5: PARTE EXPERIMENTAL
La metodologa analtica empleada para cuantificar la cafena, consista en separar por sistemas tradicionales de extraccin lquido-lquido el principio activo y valorarla despus por tcnicas cromatogrficas y espectrofotomtricas, teniendo en cuenta la exactitud y precisin de los mtodos empleados.
5.1.
MATERIAL DE LABORATORIO UTILIZADO
A continuacin se muestra un listado con el material utilizado para los experimentos realizados en el laboratorio.

Aro de corchos para matraces Cubetas (o celda) de cuarzo para espectrofotmetro UV Cuentagotas Desecador Embudo alemn (vidrio) y Embudo Bchner Embudo decantacin Embudo para pesar slidos
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Equipo de filtracin de HPLC (Crisol con placa porosa de vidrio Pyrex, Cuerpo con placa porosa, Embudo de filtracin, Matraz erlenmeyer, pinzas para rtulas) Equipo de reflujo (Soporte, Aro de acero con espiga, Nuez doble o Pinza triples, Pinzas para buretas y refrigerantes (sin nuez), Refrigerante de bolas, gomas, bridas) Esptulas Filtros de jeringa HPLC Frasco lavador de agua Mili-Q Jeringa (plstico y vidrio) Jeringa Hamilton Matraz aforado Matraz erlenmeyer (sin esmerilar) Matraz Kitasato (sin esmerilar) Matraz redondo, fondo plano sin esmerilar y esmerilado Matraz redondo, fondo redondo esmerilado Mortero de porcelana Papel absorbente Papel de filtro para anlisis cualitativo y vidrio) Papel indicador de pH Parafilm Pera de goma Pesafiltros Pipetas aforadas, Pipetas graduadas Pipeta Pasteur polietileno Probeta graduada Tubos de ensayo con tapn rosca Tubos Eppendorf Varillas de vidrio Vasos de precipitados (vidrio y polipropileno) Papel de filtro (microfibra de
El resto de material, equipos, productos y reactivos utilizados pueden ser consultados en los Anexos 5 y 6.
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5.1.1.
Preparacin del material de vidrio
Todo el material de vidrio ha sido lavado con agua y jabn, aclarado abundantemente con agua destilada (Mili-Q) y despus rociado con acetona y secado con aire para asegurar su limpieza sin que quedara ningn residuo o impureza. Las conexiones entre piezas de vidrio se han impregnado con vaselina para conseguir as un mejor encaje entre ellas y permitiendo al mismo tiempo que posteriormente se puedan volver a separar.
5.2. PREPARACIN DE MUESTRAS PATRN PARA ELABORAR LA RECTA DE CALIBRADO

5.2.1.
Equipos:
Instrumentacin
Unidad de purificacin de agua para laboratorios ELGA, Classic. Balanza analtica Mettler, AB-104-S Estufa Selecta, Digitheat. Purelab
Reactivos:
Cafena (Sigma-Aldrich, reactivo analtico) Agua Milli-Q (Millipore). cido clorhdrico 0,01 M
5.2.2.
Preparacin de las muestras patrn
Primero se ha preparado la disolucin patrn de cafena, a partir de 40 mg de cafena (previamente secada que se disuelven, en matraz aforado de 100 ml, en agua Milli-Q (400ppm). Seguidamente, se traspasan, con ayuda de pipeta aforada, 10 ml de esta disolucin a otro matraz aforado de 100 ml y se lleva a enrase con la misma agua Milli-Q (40 ppm). A partir de esta ltima solucin patrn de cafena de 40 ppm, se preparan 5 soluciones ms diluidas de concentraciones de 4, 8, 16, 24 y 32 microgramos de cafena por mililitro:
(5 ml de solucin patrn de cafena de 40 ppm + 2 ml HCl 0,01 M)/50 ml de agua (4 ppm) (5 ml de solucin patrn de cafena de 40 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (8 ppm) (10 ml de solucin patrn de cafena de 40 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (16 ppm) (15 ml de solucin patrn de cafena de 40 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (24 ppm) (20 ml de solucin patrn de cafena de 40 ppm + 1 ml HCl 0,01 M)/25 ml de agua (32 ppm)
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5.3.
MUESTRAS DE CAFENA DE CAF

Tabla 5. 32 muestras de cafs analizados
Se han analizado un total de 32 muestras de caf.
Muestra Tipo de caf 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Caf Kenya natural. Tostadero Bon Mercat Caf Costa Rica natural. Tostadero Bon Mercat Caf Caracolillo natural. Tostadero Bon Mercat Caf Guatemala natural. Tostadero Bon Mercat Caf Brasil natural. Tostadero Bon Mercat Caf Colombia natural. Tostadero Bon Mercat Caf Sumatra natural. Tostadero Bon Mercat Caf molido de tueste 100% natural. Carrefour Caf molido de Colombia tueste 100% natural. Carrefour Seleccin Caf molido de Etiopa tueste 100% natural. Carrefour Seleccin Caf molido de tueste natural 100% Arbiga. Carrefour Seleccin Caf molido de tueste natural 100% Arbiga. Saimaza Colombia. Desarrollo Sosten. Caf molido de tueste natural 100% Arbiga. Saimaza Brasil. Desarrollo Sostenible Caf molido de tueste natural 100% Arbiga. Marcilla SENSEO Kenya Caf molido de tueste natural 100% Arbiga. Marcilla SENSEO Brasil Caf molido de tueste 100% natural. Hacendado Caf molido de tueste natural 100% Arbiga. Bonka Puro Colombia Caf molido de tueste natural 100% Arbiga. Cafe Mexique Chiapas Destination Caf molido mezcla ( % natural y % torrefacto). Soley Caf molido mezcla (30 % natural y 70 % torrefacto). Bonka Especial Caf molido mezcla (70 % natural y 30 % torrefacto). Bonka Caf molido mezcla (50 % natural y 50 % torrefacto). Bonka Intenso Caf Express mezcla (70 % natural y 30 % torrefacto). Dia Caf molido mezcla (50 % natural y 50 % torrefacto). Dia Caf molido descafeinado de tueste 100% natural. Gran Aroma Marcilla Caf molido descafeinado de tueste 100% natural. Carrefour Caf molido mezcla descafeinado (50 % natural y 50 % torrefacto). Dia Caf Express mezcla descafeinado (80 % natural y 20 % torrefacto). Dia Caf soluble de tueste 100% natural. NESCAF Classic Natural Caf soluble de tueste 100% natural. Auchan Caf soluble descafeinado de tueste 100% natural. Carrefour Caf soluble descafeinado de tueste 100% natural. NESCAF Classic Descafeinado
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Estas muestras estn divididas en 8 cafs naturales de tostadero (Tostadero Bon Mercat) de diferentes pases de origen y 24 muestras de cafs de marcas comerciales. Los cafs de marcas comerciales se han dividido en 6 grupos, ya que son los tipos de caf ms comercializados en nuestro pas:

Tueste natural
Mezcla Descafeinado natural Descafeinado mezcla Soluble natural Soluble natural descafeinado
Cada uno de estos tipos tiene unas caractersticas distintas independientemente de la calidad de la mezcla. Se ha intentado recoger la mxima informacin sobre los diferentes tipos.
5.3.1.
Equipos:
Instrumentacin
Unidad de purificacin de agua para laboratorios ELGA, Classic. Balanza analtica Mettler, AB-104-S Purelab
Reactivos:
Cafs de Tostadero Bon Mercat Cafs comerciales
5.3.2.
Preparacin de las muestras de caf
Para explicar la preparacin de las muestras de caf, en el siguiente apartado se detalla la extraccin de la cafena del caf mediante diferentes procedimientos.
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5.4. PROCEDIMIENTOS DE SEPARACIN DE LA CAFENA DEL CAF

En este captulo se explica el procedimiento de extraccin de cafena de caf para posteriormente determinarla por las dos tcnicas analticas utilizadas: cromatografa de lquidos de alta resolucin y espectrofotometra UV-Vis. Para la separacin de la cafena de productos naturales se deben realizar una serie de pasos iniciales que permitan la extraccin de la cafena, aislada del resto de las sustancias que la acompaan y que es necesario eliminar, puesto que pueden constituir interferencias para su posterior determinacin.
5.4.1.
Mtodo de extraccin de cafena utilizado (I)
Instrumentacin Equipos: Unidad de purificacin de agua para laboratorios ELGA, Classic. Balanza analtica Mettler, AB-104-S Manta calefactora Selecta, Fibroman-C Material de laboratorio Purelab
Reactivos:
Cafena (Sigma-Aldrich, reactivo analtico) Sulfato de sodio anhidro (Panreac, reactivo analtico) Carbonato de sodio anhidro (Panreac, reactivo analtico) Cloroformo (Panreac, reactivo analtico) Acetona (Panreac, reactivo analtico) ter de petrleo (Panreac, reactivo analtico) Agua Milli-Q (Millipore). Muestra de caf
Preparacin de las muestras de caf Este mtodo se ha realizado siguiendo el procedimiento que se describi en el PFC1, pero sustituyendo el rotavapor por una sencilla evaporacin en una manta calefactora. Cada uno de los ensayos utilizados se especifica paso a paso en el procedimiento normalizado de trabajo PNT-P-OBCACAER-00 (incluido en los anexos del PFC1). Se pesan aproximadamente 100 g de caf y se ponen a reflujo con 200 ml de Agua Milli-Q durante 15 minutos.
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Seguidamente, se filtra la solucin al vaco en caliente y se aaden 5 g de Na2CO3 hasta la total disolucin. Se deja enfriar y se agregan 15 ml cloroformo que se extraen agitando suavemente durante unos minutos, se repite ste procedimiento una vez ms. Posteriormente, en un matraz de fondo redondo se introducen las dos fases orgnicas recolectadas de las dos extracciones anteriores. Se aaden pequeas cantidades de Na2SO4 para absorber el agua y se deja evaporar hasta sequedad. Una vez eliminado el cloroformo, se disuelve la cafena en acetona, calentando y aadiendo gota a gota ter de petrleo con lo que se observa una ligera turbidez. Se deja secar a temperatura ambiente, hasta que se vean los cristales de cafena purificada y se filtran al vaco. Finalmente, se introducen los cristales en una cpsula de porcelana, previamente tarada, y se dejan secar a temperatura ambiente. Posteriormente, se pesa la cpsula de porcelana con los cristales de cafena para poder obtener el rendimiento. Este mtodo es muy laborioso y se produjeron prdidas durante la recristalizacin. Por otra parte, la cantidad de caf utilizado es excesivamente grande, por lo que se decidi modificar el mtodo de extraccin.
5.4.2.
Mtodo de extraccin de cafena utilizado (II)
Instrumentacin Equipos: Unidad de purificacin de agua para laboratorios ELGA, Classic. Balanza analtica Mettler, AB-104-S Material de laboratorio Reactivos: Cafena (Sigma-Aldrich, reactivo analtico) Acetato de plomo (Panreac, reactivo analtico) cido sulfrico (Panreac, reactivo analtico) cido clorhdrico 0,01 M Agua Milli-Q (Millipore). Muestra de caf Preparacin de las muestras de caf Se supone aproximadamente un porcentaje medio de1,2% de cafena en el caf, basndonos en la bibliografa. Por lo tanto, se transfiere a un matraz aforado de 250 ml, 200 mg de caf finamente triturado (equivalente aproximadamente a 2,4 mg de cafena) y se aade Agua Milli-Q hasta aproximadamente 150 ml. Purelab
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A continuacin, se agita vigorosamente el matraz bien tapado durante 5 min, se aaden 10 ml de HCl 0,01 M y se vuelve a agitar durante 5 minutos. Se contina aadiendo 5 mL de una solucin de acetato de plomo al 10% y se repite la agitacin. Despus, se enrasa con Agua Milli-Q, se homogeniza y se filtra. Finalmente, se pipetean 25 ml de filtrado, se transfieren a un matraz aforado de 50 ml, se aaden 0,1 ml de H2SO4 4,5 M y se agita la solucin. Inmediatamente, se enrasa con Agua Milli-Q, se homogeniza y se filtra. Al realizar este procedimiento se observa que la solucin obtenida es ligeramente turbia y tiene una coloracin amarillenta. Por este motivo, se opt por modificar el mtodo de extraccin.
5.4.3.
Mtodo de extraccin de cafena utilizado (III)
Instrumentacin Equipos: Unidad de purificacin de agua para laboratorios ELGA, Classic. Balanza analtica Mettler, AB-104-S Manta calefactora Selecta, Fibroman-C Estufa Selecta, Digitheat. Reactivos: Cafena (Sigma-Aldrich, reactivo analtico) Sulfato de sodio anhidro (Panreac, reactivo analtico) Carbonato de sodio anhidro (Panreac, reactivo analtico) Cloroformo (Panreac, reactivo analtico) Preparacin de las muestras de caf Suponiendo que en cada caf la proporcin de cafena sea del 1,2%, se pesan aproximadamente 300 mg y se ponen a reflujo con 200 ml de Agua Milli-Q durante 15 minutos. Seguidamente, se filtra la solucin en caliente y se aaden 5 g de Na2CO3 hasta la total disolucin. Se deja enfriar y se agregan 15 ml cloroformo que se extraen agitando suavemente durante unos minutos y se repite esta operacin una vez ms. Despus de la separacin de las dos fases, se aaden pequeas cantidades de Na2SO4 para absorber el agua, se filtra la fase clorofrmica hacindola pasar por papel filtro hacia un matraz erlenmeyer o baln, y se deja evaporar hasta sequedad. Una vez eliminado el cloroformo, se aade al mismo matraz o baln, 50 ml de Agua Milli-Q y se agita bien hasta perfecta disolucin. Posteriormente, mediante un embudo se enrasa a 100 ml en un matraz aforado.
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Finalmente, se toman 10 ml de esta ltima solucin, se aade 1 ml de la solucin de cido clorhdrico 0,01 M y se enrasa a 25 ml con Agua Milli-Q. Este mtodo es rpido y eficaz, por lo que se concluy y se aceptaron estas condiciones de extraccin. Aplicacin de la tcnica de extraccin de la cafena de caf El caf contiene celulosa, que es un polmero de la glucosa y el principal material estructural de las clulas de todas las plantas. Dado que la celulosa es insoluble en agua, no presenta problemas en el procedimiento de separacin de la cafena. Los taninos tambin se disuelven en agua caliente utilizada para extraer los compuestos vegetales. El trmino tanino no se refiere a un compuesto nico homogneo, o inclusive a sustancias que tienen una estructura qumica similar; ste se refiere a una clase de compuestos que tienen ciertas propiedades en comn. Los taninos son compuestos de origen vegetal que tienen naturaleza de polifenoles (antioxidantes del caf de alta absorcin por el organismo humano) y un peso molecular entre 500 y 3000. Se usan ampliamente para teir el cuero. Los taninos se dividen normalmente en los que pueden ser hidrolizados con agua y los que no pueden hidrolizarse. Los taninos hidrolizables (glicos o piroglicos) se hidrolizan con facilidad tanto por cidos y lcalis como por va enzimtica. Se encuentran en este grupo los taninos glicos propiamente dichos que son polmeros del cido glico, steres de un poliol, generalmente de la glucosa con varias molculas de cido glico y los taninos elgicos o elagitaninos tambin son steres pero en este caso del cido hexahidroxidifnico y sus derivados. El cido hexahidroxidifnico se forma por acoplamiento oxidativo de dos molculas de cido glico.
Figura 35. Hidrlisis de taninos derivados del cido glico
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Los taninos no hidrolizables (condensados o proantocianidinas) se hidrolizan con dificultad y por el contrario, el tratamiento con calor y cidos minerales origina polmeros de alto peso molecular (flobafenos). Qumicamente son polmeros condensados del catequino o catecol (flavanol) Estos polmeros no son uniformes en su estructura; la molcula de catequino est normalmente ligada a la posicin 4 y 8 del anillo. Tambin se han encontrado casos de taninos en los cuales algunos de los grupos hidroxilo de la glucosa han sido esterificados con grupos digalolo.
Figura 36. Estructura de los taninos derivados del digalolo y catequino
Cuando los taninos se extraen con agua caliente, algunos de esos compuestos son parcialmente hidrolizados para formar cido glico. Los taninos son compuestos cidos, lo cual se debe a la naturaleza de los grupos fenlicos y del grupo carboxilo. El tratamiento qumico de los frutos vegetales (t, caf, nuez de cola, etc.) con una base, como por ejemplo carbonato de sodio, convierte a los taninos cidos en sus respectivas sales de sodio, las cuales son muy solubles en agua por su naturaleza inica. Aunque la cafena es soluble en agua, es mucho ms soluble en cloroformo y por eso puede ser extrada con este disolvente orgnico, mientras las sales de sodio del cido glico y los taninos permanecen en la fase acuosa. As, la extraccin con cloroformo de la solucin bsica separa la cafena casi pura. El sulfato de sodio anhidro acta eliminando toda el agua y las sales solubles en agua que se mantienen en el disolvente orgnico (capa orgnica) o accidentalmente transferido en la decantacin. El disolvente orgnico puede ser eliminado fcilmente por evaporacin o por destilacin, teniendo en cuenta su punto de ebullicin, o mediante vaco usando un equipo de evaporacin rotatoria, para conseguir la cafena.
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Extraccin La extraccin es un proceso mediante el cual una sustancia que se encuentra en una mezcla slida o disuelta en un determinado disolvente es transferida a otro disolvente. Las razones ms frecuentes por las que se usa una extraccin en Qumica Analtica son aislar, concentrar o separar un analito de una especie que interfera en su anlisis. La sustancia a separar puede tratarse tanto de un slido como de un lquido, y en funcin de tener una muestra slida o lquida, el mtodo de trabajo ser diferente. Por lo tanto, la extraccin puede clasificarse dependiendo del estado fsico de los materiales: slido-lquido o lquido-lquido.
Extraccin slido-lquido
La extraccin slido-lquido es una operacin bsica cuya finalidad es la separacin de uno o ms componentes contenidos en una fase slida, mediante la utilizacin de una fase lquida o disolvente. El componente que se transfiere a la fase lquida recibe el nombre de soluto, mientras que el slido insoluble se denomina inerte. La extraccin se lleva a cabo mediante un sistema de reflujo que consiste en calentar a ebullicin una mezcla que contenga, al menos un lquido en el interior del matraz, redondo, en la boca del cual se ha colocado un refrigerante de camisa o serpentn, de modo que los vapores generados en el matraz condensan en el refrigerante y vuelven a caer en el interior del mismo. Permite mantener la reaccin a temperatura constante (punto de ebullicin del disolvente), el tiempo que sea necesario y sin prdida de disolvente. La cafena es perfectamente soluble en agua caliente, por lo que se puede extraer eficazmente. La cafena pasa a la disolucin acuosa, pero acompaada de otros compuestos orgnicos que tambin son solubles en agua caliente, especialmente taninos (compuestos de origen vegetal que tienen naturaleza de polifenoles).
Figura 37. Extraccin slido-lquido mediante reflujo
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Extraccin lquido-lquido
El caso ms frecuente es la extraccin de una disolucin acuosa con un disolvente orgnico. Los disolventes orgnicos utilizados en extraccin deben tener baja solubilidad en agua, alta capacidad de solvatacin hacia la sustancia que se va a extraer y bajo punto de ebullicin para facilitar su eliminacin posterior. Cuando las dos fases se separan en dos capas, se dar un equilibrio tal que, a una temperatura dada, la razn de la concentracin del soluto en cada capa viene dada por una constante llamada coeficiente de distribucin o de particin, K, que es entonces definido por:
K= CA /CB (13)
Donde CA es la concentracin en gramos por litro del compuesto en el disolvente A y CB es la concentracin del mismo en el disolvente B. A nivel de laboratorio el proceso se desarrolla en un embudo de decantacin. La extraccin nunca es total, pero se obtiene ms eficacia cuando la cantidad del segundo disolvente se divide en varias fracciones y se hacen sucesivas extracciones que cuando se aade todo de una vez y se hace una nica extraccin.
Figura 38. Extraccin lquido-lquido con embudo de decantacin
Disolvente para la extraccin
La cafena es bastante ms soluble en un disolvente orgnico que en agua; as que agitando el filtrado en contacto con un cierto volumen de disolvente en el embudo de decantacin, la cafena pasa mayoritariamente a la fase orgnica. La eleccin del disolvente se realiza en cada caso teniendo en cuenta la solubilidad en el mismo de la sustancia a extraer y la facilidad con que puede separarse sta del disolvente. Se utiliz cloroformo por la gran solubilidad en el mismo de la mayor parte de los compuestos orgnicos y por su bajo punto de ebullicin (62C). Sin embargo, su gran volatilidad y su fcil inflamabilidad exigen manejarlo con la mxima precaucin.
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Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales Tabla 6. Disolvente escogido. Disolvente Cloroformo Peb (C) 61,3 Pf (C) -63,5 Constante dielctrica 4,7 Miscibilidad en agua -
Dado que el disolvente orgnico es ms denso que el agua, formar la capa inferior, que se podr recoger separada simplemente abriendo la llave del embudo. La glucosa se separa de la cafena extrayendo sta en el disolvente orgnico, en el que la glucosa no es soluble. La extraccin lquido-lquido con ayuda del embudo no puede ser demasiado vigorosa, para evitar la formacin de emulsiones que retardan drsticamente la definicin de las dos fases. Una emulsin es una dispersin de gotas muy finas de un lquido en otro inmiscible, y en los procesos de extraccin puede causar tropiezos.
Figura 39. Extraccin lquido-lquido con embudo de decantacin en la que se ven la fase orgnica y la fase acuosa.
Emulsiones
La extraccin lquido-lquido con ayuda del embudo no puede ser demasiado vigorosa, para evitar la formacin de emulsiones que retardan drsticamente la definicin de las dos fases. Una emulsin es una dispersin de gotas muy finas de un lquido en otro inmiscible, y en los procesos de extraccin puede causar tropiezos. Si la emulsin llegara a formarse, es aconsejable adicionar un compuesto inico como cloruro de sodio (NaCl) o sulfato de potasio (K2SO4) a la fase acuosa; los componentes inicos disminuyen la tensin en la superficie de las gotas de agua, e incrementan drsticamente la incompatibilidad entre el agua y los solventes orgnicos, facilitando la rpida y clara distincin de las dos capas.
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Filtracin La filtracin es la operacin unitaria en la que el componente slido insoluble de una suspensin slido-lquido se separa del componente lquido hacindolo pasar a travs de una membrana porosa que retiene a las partculas slidas en su superficie. Se le denomina prefiltrado a la suspensin slido-lquido alimentada, filtrado al componente lquido que pasa a travs de la membrana, a la membrana se le conoce como el medio filtrante y a los slidos separados se les llama torta del filtro. Todo equipo de filtracin, independientemente de su diseo, debe tener un soporte para el medio filtrante, un espacio para la acumulacin de slidos, canales para alimentar el prefiltrado y para retirarlo, y un medio para inducir el flujo del filtrado a travs del filtro. En algunas ocasiones es el lquido (el filtrado) el que constituye al producto deseado, y en otras ocasiones la torta del filtro. La filtracin puede efectuarse en caliente o fro, y realizarse por gravedad o por vaco. Se escogi la filtracin en caliente y por gravedad. La disolucin de la mezcla slida en el disolvente caliente, permite eliminar mediante filtracin las impurezas insolubles, mientras la muestra permanece disuelta en el disolvente caliente. La filtracin en caliente presenta algunas ventajas como: es ms rpida; y se mantiene a la temperatura del disolvente evitando la formacin de cristales en el papel de filtro y su contaminacin como resultado del enfriamiento de la solucin. Las filtraciones que se realizan en la separacin de la cafena se hacen con la solucin caliente para evitar la formacin de cristales y obtener un rendimiento ptimo. Esta operacin debe efectuarse con mucho cuidado y rpidamente, con un mnimo de evaporacin en el embudo y provisto de un filtro de pliegues para aumentar la velocidad de filtracin.
Figura 40. Filtracin en caliente a travs de un filtro de pliegues
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Evaporacin El objetivo de esta operacin es concentrar una solucin que consta de un soluto no voltil y un disolvente voltil. Se lleva a cabo vaporizando una parte del disolvente con el fin de obtener una solucin concentrada. Existen operaciones de extraccin en las que se le aaden grandes cantidades de disolventes orgnicos, que es necesario eliminar para obtener los extractos o los productos naturales en forma pura. El equipo que se utiliz para este tipo de operacin es una manta calefactora ya que permite realizar la evaporacin del disolvente en el matraz donde se introduce la disolucin, mediante calentamiento y eliminando los disolventes utilizados en la purificacin y aislamiento de compuestos orgnicos. Esto permite la formacin de una pelcula de lquido muy fina y una gran transferencia de calor entre la manta y el matraz, consiguindose una evaporacin muy rpida.
Figura 41.
Evaporacin de la solucin acuosa en la manta calefactora
Desecantes
Cuando se lleva a cabo una extraccin la fase orgnica arrastra cierta cantidad de agua por lo que, antes de realizar una posterior purificacin de los productos, hay que secarla. Para ello se usan sustancias qumicas que reaccionan de alguna forma con el agua o absorben sta, eliminndola, y que se denominan agentes desecantes. Se utiliz el sulfato sdico (Na2SO4) ya que es inerte e insoluble en los lquidos orgnicos por lo que se puede utilizar para secar cualquier tipo de compuestos. Es barato y presenta una gran capacidad, sin embargo, es lento pero eficaz. Adecuado para desecar compuestos fcilmente descomponibles, como cidos grasos, aldehdos, cetonas, halogenuros de alquilo. Dependiendo del producto comercial (yerba mate, caf, bebida de cola, guaran, chocolate, t o bebida energtica) que se utilice se opera con diferentes tcnicas para la separacin y purificacin de la cafena. Cada uno de los ensayos utilizados se describe paso a paso en los procedimientos normalizados de trabajo (PNTs) que se pueden observar en el anexo 4 del PFC1 que se adjuntan en este trabajo.
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5.5. PUESTA A PUNTO CROMATOGRFICO (HPLC)
DEL
MTODO
Se presenta el desarrollo, y puesta a punto de una metodologa analtica por cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC) para determinar y cuantificar la cafena en presencia de otros compuestos.
5.5.1.
Equipos:
Instrumentacin
Cromatgrafo Perkin Elmer Series 410 LCPump: Bomba PerkinElmer LC-410 Detector Perkin Elmer LC-410 Interfase Perkin Elmer 970 Jeringa: Tipo Hamilton de 50 L Columna de acero Inoxidable Nucleosil 100 (C18): Longitud: 100 mm, dimetro interno: 4,6 mm, tamao de partcula: 5 m
Reactivos:
Cafena anhidra Acetonitrilo HPLC Agua HPLC
5.5.2.
Puesta a punto del Sistema Cromatogrfico
Teniendo en cuenta las caractersticas fisicoqumicas del principio activo a evaluar: cafena, as como la solubilidad en los solventes recomendados para HPLC (acetonitrilo, agua, metanol), sus caractersticas de polaridad y sus propiedades de absorcin de la radiacin se decidi ensayar una fase mvil conformada por agua y acetonitrilo. Para la separacin cromatogrfica se emple una columna C18 para fase reversa y deteccin a 273 nm. Se propuso el sistema: Columna: Nucleosil 100 C18, 5 micrmetros, 100 x 4,6 mm. Detector: UV (273 nm). Flujo: 1 mL/min Volumen de inyeccin: 20 L
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En la puesta a punto del mtodo cromatogrfico se ajustaron las condiciones cromatogrficas, inicialmente encontradas en bibliografa, para conseguir una eficiente determinacin cuantitativa de la cafeina. Con este objetivo se realizaron diferentes ensayos, empezando por construir una recta de calibrado con soluciones patrn de cafena de concentracin conocida. Una vez obtenida dicha recta patrn, nos servir para interpolar en ella las areas correspondientes a nuestros problemas (cafena extraida de los distintos cafs ensayados) y obtener la cantidad de cafena que contienen.
1. Para la preparacin de las soluciones patrn se procedi a insertar un embudo
para pesar slidos dentro de la bscula, se tar (0 mg) y posteriormente se pesaron 40 mg de cafena anhidra pura (peso real: 39,90 mg). Despus, se prepar la solucin patrn A: estos 39,90 mg de cafena anhidra pura se pasaron mediante el mismo embudo para pesar slidos, a un matraz aforado de 100 ml y se enrasaron con agua Mili-Q filtrada HPLC. Obteniendo una concentracin de 399 ppm (399 mg/L). Para la preparacin de la solucin patrn B: se pipetearon 10 ml de la solucin patrn A y se pasaron a un matraz aforado de 100 ml donde se enrasaron con agua Mili-Q filtrada HPLC. Obtenemos una concentracin de 39,90 ppm (39,90 mg/L). Seguidamente, se prepararon las siguientes diluciones:
(5 ml de la solucin patrn B + 2 ml de solucin HCl 0,01M)/ 50 ml agua Mili-Q filtrada HPLC = 3,99 ppm (5 ml de la solucin patrn B + 1 ml de solucin HCl 0,01M)/ 25 ml agua Mili-Q filtrada HPLC = 7,98 ppm (10 ml de la solucin patrn B + 1 ml de solucin HCl 0,01M)/ 25 ml agua Mili-Q filtrada HPLC = 15,96 ppm (15 ml de la solucin patrn B + 1 ml de solucin HCl 0,01M)/ 25 ml agua Mili-Q filtrada HPLC = 23,94 ppm (20 ml de la solucin patrn B + 1 ml de solucin HCl 0,01M)/ 25 ml agua Mili-Q filtrada HPLC = 31,92 ppm
2. Para la preparacin de las soluciones de cafena de caf obtenidas mediante
extraccin (ver Captulo 5).
Se propuso empezar a ensayar con diferentes proporciones de la fase mvil teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la puesta a punto del sistema cromatogrfico, realizada antes de que el cromatgrafo de lquidos (HPLC) se estropeara. El desarrollo de la puesta a punto se puede ver al completo en el Anexo 1.
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Se empez a ensayar con diferentes muestras de cafena de caf y la misma fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 70:30.
Tabla 7. Fase mvil estudiada con diversas muestras de cafena SOLUCIN DE CAFENA FASE MVIL COMPOSICIN TIEMPO DE RETENCIN (min) 1,27 1,28 1,31 1,31 1,31
Solucin patrn 15,95 ppm Muestra de cafena de caf Costa Rica 1 (sin HCl 0,01 M) Muestra de cafena de caf Costa Rica 2 (sin HCl 0,01 M) Muestra de cafena de caf Costa Rica 1 (con HCl 0,01 M) Muestra de cafena de caf Costa Rica 2 (con HCl 0,01 M)
Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo
70:30 70:30 70:30 70:30 70:30
Para una fase mvil de 70% de agua y 30% de acetonitrilo:
Figura 42.
Cromatograma de la fase mvil 70% de agua y 30% de acetonitrilo con la solucin patrn de cafena de 15,96 ppm.
De las diversas inyectadas realizadas de las muestras de cafena, utilizando como fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 70:30 se obtuvieron cromatogramas en los cuales poda apreciarse que la cafena sala de la columna a unos tiempos de retencin que oscilaban entre 1,27 y 1,31 minutos.
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Se propuso seguir ensayando con una proporcin diferente de la fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 80:20.
Tabla 8. Fase mvil estudiada con diversas muestras de cafena SOLUCIN DE CAFENA FASE MVIL COMPOSICIN TIEMPO DE RETENCIN (min) Muestra de cafena de caf Costa Rica 2 (con HCl 0,01 M) Solucin patrn 15,96 ppm de cafena de Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo 80:20 80:20 1,29 1,32
Figura 43. Cromatograma de la fase mvil 80% de agua y 20% de acetonitrilo con la solucin patrn de cafena de 15,96 ppm.
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Se propuso cambiar la proporcin de la fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 85:15.
Tabla 9. Fase mvil estudiada con diversas muestras de cafena SOLUCIN DE CAFENA FASE MVIL COMPOSICIN TIEMPO DE RETENCIN (min) 2,15 2,19 1,88 2,07 1,97
Solucin patrn 15,96 ppm
de
cafena
de
Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo
85:15 85:15 85:15 85:15 85:15
Muestra de cafena de caf Costa Rica 2 (con HCl 0,01 M) Solucin patrn B de cafena de 39,90 ppm Muestra de cafena de caf Kenia 2 (con HCl 0,01 M) Solucin patrn 31,92 ppm de cafena de
Figura 44.
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Se propuso cambiar la proporcin de la fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 90:10.

Tabla 10. Fase mvil estudiada con diversas muestras de cafena SOLUCIN DE CAFENA FASE MVIL COMPOSICIN TIEMPO DE RETENCIN (min) 2,04
Solucin patrn 31,92 ppm
de
cafena
de
Agua-Acetonitrilo
90:10
Figura 45.
Utilizando como fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 90:10 se obtuvo un cromatograma en en el cual poda apreciarse que la cafena sala de la columna a un tiempo de retencin de 2,04 minutos. Al ver que aumentando cada vez ms el porcentaje de agua de fase mvil se consegua un pico ms definido aunque con una base ancha. Se propuso hacer lo contrario cambiando la proporcin de la fase mvil aumentando cada vez ms la cantidad de acetonitrilo de la fase mvil.
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Se cambi a una fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 30:70 y se prob ir aumentando cada vez ms la velocidad de flujo con el fin de definir ms la forma del pico.
Tabla 11. Fase mvil estudiada con diversas muestras de cafena SOLUCIN DE CAFENA FASE MVIL COMPOSICIN TIEMPO DE RETENCIN (min) 1,19
Solucin patrn de cafena de 31,92 ppm Solucin patrn de cafena de 31,92 ppm Solucin patrn de cafena de 31,92 ppm Muestra de cafena de caf Costa Rica 2 (con HCl 0,01 M)
Agua-Acetonitrilo (velocidad de 1 ml/min) Agua-Acetonitrilo (velocidad de 1,2 ml/min) Agua-Acetonitrilo (velocidad de 1,5 ml/min) Agua-Acetonitrilo (velocidad de 1,5 ml/min)
30:70
30:70
1,00
30:70
0,81
30:70
0,80
Para una fase mvil de 30% de agua y 70% de acetonitrilo a una velocidad de 1 ml /min:
Figura 46.
De las diversas inyectadas realizadas de las muestras de cafena, utilizando como fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 30:70 se obtuvieron cromatogramas en los cuales poda apreciarse que la cafena sala de la columna a unos tiempos de retencin que descendan a medida que aumentaba la velocidad: de 1,19 minutos a 1 minuto y finalmente hasta los 0,80 minutos.
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Se comprob que manteniendo la misma proporcin de fase mvil pero aumentando progresivamente la velocidad, se conseguan unos picos mucho ms definidos aunque su tiempo de retencin disminua significativamente. As que se decidi seguir probando con diferentes proporciones de fase mvil pero con una velocidad constante de 1 ml/min. Se sigui ensayando con diferentes proporciones de fase mvil:
Tabla 12. Fases mviles estudiadas con muestras patrn de cafena SOLUCIN DE CAFENA FASE MVIL COMPOSICIN TIEMPO DE RETENCIN (min) 1,22 1,21
Solucin patrn 31,92 ppm Solucin patrn 31,92 ppm
de de
cafena cafena
de de
Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo
35:65 40:60
Para una fase mvil de 35% de agua y 65% de acetonitrilo.
Figura 47.
Utilizando como fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 35:65 se obtuvo un cromatograma en el cual poda apreciarse que la cafena sala de la columna a un tiempo de retencin de 1,22 minutos.
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Para una fase mvil de 40% de agua y 60% de acetonitrilo.
Figura 48.
Utilizando como fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 40:60 se obtuvo un cromatograma en el cual poda apreciarse que la cafena sala de la columna a un tiempo de retencin de 1,21 minutos. Se siguieron probando diferentes proporciones de fase mvil:
Tabla 13. Fases mviles estudiadas con muestras patrn de cafena SOLUCIN DE CAFENA FASE MVIL COMPOSICIN TIEMPO DE RETENCIN (min) 1,25 1,27
Solucin patrn 31,92 ppm Solucin patrn 31,92 ppm
de de
cafena cafena
de de
Agua-Acetonitrilo Agua-Acetonitrilo
25:75 20:80
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Figura 49.
Utilizando como fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 25:75 se obtuvo un cromatograma en el cual poda apreciarse que la cafena sala de la columna a un tiempo de retencin de 1,25 minutos. Para una fase mvil de 20% de agua y 80% de acetonitrilo:
Figura 50.
Utilizando como fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 2:80 se obtuvo un cromatograma en el cual poda apreciarse que la cafena sala de la columna a un tiempo de retencin de 1,27 minutos y un pico definido, menos ancho en su base.
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Una vez realizadas todas las pruebas necesarias y de acuerdo con los resultados obtenidos, la fase mvil ptima que permita una mejor interaccin con la fase estacionaria y la mejor separacin era la compuesta por la fase mvil aguaacetonitrilo en proporcin 20:80. Al trabajar en una cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) en fase reversa, la fase estacionaria de la columna es apolar y la fase mvil es polar. Esto hace que primero eluya el ms polar que es el agua y despus eluya el menos polar que es el acetonitrilo. Por lo que a la proporcin de 20% de agua eluye primero (pasa de largo sin interaccionar con la cafena) y el 80% de acetonitrilo retiene durante ms tiempo la cafena haciendo que su aparicin sea alrededor de entre los 1,28 y 1,30 minutos de tiempo. Al aumentar la polaridad de la fase mvil se aumenta el tiempo de retencin. Por ello, en los primeros ensayos al ir aumentando ms la cantidad de agua (polar) que de acetonitrilo (menos polar) se obtena un tiempo de retencin superior de alrededor de los 2 minutos pero con un pico con una forma definida aunque con una base ancha. Por eso se decidi ir probando diferentes proporciones de fase mvil con una mayor cantidad de acetonitrilo que de agua hasta encontrar la composicin ptima de fase mvil agua-acetonitrilo en proporcin 20:80 que nos permita obtener un tiempo de retencin superior al minuto (se gasta menos cantidad de producto que si hubieran sido 2 minutos) y una forma de pico muy bien definida.
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5.6. PUESTA A PUNTO ESPECTROFOTOMTRICO UV
DEL
MTODO
Se presenta el desarrollo y puesta a punto de una metodologa analtica por espectrofotometra UV-VIS para determinar y cuantificar la cafena.
5.6.1.
Instrumentacin
Agilent 8453 Sistema de Espectroscopa UV-Visible Cubeta de cuarzo de 10 mm
Equipos:
Reactivos:
Cafena anhidra Agua Milli-Q (Millipore). cido clorhdrico 0,01 M
5.6.2.
Puesta a punto del Sistema Espectrofotomtrico
Teniendo en cuenta las caractersticas fisicoqumicas del principio activo a evaluar, as como el disolvente utilizado para la preparacin de las muestras, se decide realizar espectros UV en el rango de longitudes de onda entre 300 y 190 nm ya que tericamente a 273 nm, la cafena presenta un mximo de absorcin. En la puesta a punto del mtodo espectrofotomtrico se pens empezar a ensayar con las soluciones patrn y las soluciones de cafena de caf obtenidas mediante extraccin, para as poder comparar las concentraciones de cafena con el fin de saber las cantidades necesarias de caf para realizar la extraccin: 1) Patrones: 10, 20, 40, 60 y 80 ppm. La preparacin de las soluciones diluidas conteniendo 10, 20, 40, 60 y 80 microgramos por mililitro de cafena se puede encontrar ampliamente detallada en el Captulo 5. Una vez se han preparado los patrones y se ha efectuado la recta de calibrado que relaciona concentraciones y valores de absorbancia, se observa que el rango de concentraciones no es el adecuado, ya que a partir de los 20 ppm ya no se cumple la ley de Beer (ver Capitulo 4). Se decidi disminuir las concentraciones de los patrones.
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2) Patrones: 4, 8, 16, 24 y 32 ppm. Siguiendo los pasos descritos en la preparacin de las muestras patrn indicados en el captulo 4, se preparan soluciones diluidas conteniendo 4, 8, 16, 24 y 32 microgramos por mililitro de cafena. Una vez se han preparado los patrones y se ha efectuado la recta de calibrado, se observa que las concentraciones son ptimas, ya que en ese rango se cumple la ley de Beer. Se realizan una serie de pruebas para garantizar la recta que mejor se ajuste a los datos experimentales.
Tabla 14. Datos de la recta de calibrado en cada una de las pruebas Prueba 1 Coeficiente k1 (mg/L) Desviacin estndar de k1 (mg/L) Desviacin estndar de calibrado (mg/L) Coeficiente de correlacin (R )
2
Prueba 2 21,0910 0,2985 0,6208 0,9992
Prueba 3 21,0880 0,3133 0,6519 0,9991
Prueba 4 19,7090 0,1868 0,4170 0,9996
21,2220 0,2563 0,5298 0,9994
Despus de realizar diferentes ensayos, la que proporciona mejor resultado es la cuarta prueba, ya que se ha obtenido un valor de R2 = 0,9996.
Figura 51. Espectro de las muestras patrn de la cuarta prueba
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Figura 52. Recta de calibrado de la cuarta prueba
Este valor, garantiza la bondad del ajuste de los puntos experimentales a la recta de calibrado. 3) Peso de caf: 400 mg de caf Siguiendo los pasos descritos en el mtodo de extraccin (captulo 5), se decide extraer la cafena de un caf comercial (caf natural Carrefour), iniciando la extraccin con 400 mg de caf.
Tabla 1. Absorbancia del caf Carrefour SOLUCIN DE CAFENA Muestra de cafena de caf Carrefour Longitud de onda (nm) 271 271 271 Absorbancia (AU) 1,5544 1,5595 1,5586
Se observa que la absorbancia obtenida en este caf es elevada, ya que contiene una concentracin comprendida entre los 24-32 ppm.
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4) Peso de caf:300 mg de caf Se decide disminuir el peso de caf a 300 mg, para realizar el procedimiento de extraccin. Se decide extraer la cafena de dos cafs: Caracolillo y Costa Rica de tostadero Bon Mercat.
Tabla 2. Absorbancia del caf Caracolillo y Costa Rica SOLUCIN DE CAFENA Muestra de cafena de caf Caracolillo Longitud de onda (nm) 266 266 266 Muestra de cafena de caf Costa Rica 271 271 271 Absorbancia (AU) 1,1881 1,1901 1,1898 0,8433 0,8468 0,8492
El peso de caf utilizado es ptimo ya que nos proporciona unos valores intermedios, que permiten interpolar en la recta de calibrado. Finalmente, como conclusin de la puesta en marcha de este sistema, se analizarn las muestras pesando una cantidad aproximada de caf de 300 mg. Se comprueba que el peso de caf utilizado es ptimo ya que nos proporciona unos valores intermedios, que permiten interpolar en la recta de calibrado y disminuir el error. Tambin, se trabaj representando una curva patrn con valores distintos de concentracin de cafena. Estos patrones seleccionados contienen una concentracin de 4, 8, 16, 24 y 32 ppm.
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CAPTULO 6: RESULTADOS Y DISCUSIN
Para la identificacin y cuantificacin de la cafena preparamos las muestras tal y como se indica en el Capitulo 5. Dentro de las muestras de caf, se han analizado diferentes tipos de caf segn sus caractersticas; tales como la variedad del caf, el pas de origen, procesado y la preparacin. Cada muestra de caf se analiza por separado. Para los cafs de tostadero se preparan soluciones por triplicado de extracciones diferentes. En los cafs de marcas comerciales se desarrollan soluciones por duplicado de extracciones distintas. Las soluciones se analizan por cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) y por espectrofotometra UV, hallndose de esta manera la concentracin de cafena presente en cada una de las muestras.
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6.1.
RESULTADOS OBTENIDOS POR (HPLC)
A partir de los resultados obtenidos en la puesta a punto del sistema cromatogrfico, se defini que la fase mvil que permita una mejor determinacin cuantitativa de la cafena era la compuesta por la fase mvil aguaacetonitrilo en proporcin 20:80. Se empez a inyectar las soluciones patrn realizadas nuevamente y las soluciones de cafena obtenida por extraccin (ver Captulo 4) en diferentes tipos de cafs. Se inyectaron 20 l de muestra (volumen del loop de inyeccin) con una velocidad de flujo de fase mvil de 1 ml/min con elucin de modo isocrtico y a temperatura ambiente. Las soluciones patrn de cafena con concentraciones: 4,00 ppm, 8,00 ppm, 16,00 ppm, 24,00 ppm y 32,00 ppm se inyectaron por separado en el sistema cromatogrfico y se registraron los siguientes cromatogramas:
Figura 53.
Cromatograma de la solucin patrn 4 ppm.
Figura 54. Cromatograma de la solucin patrn 8 ppm.

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6.1.1. Determinacin de la cafena por cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC)

Determinacin de la concentracin de cada muestra Utilizamos la recta de calibrado obtenida y que relaciona concentraciones de cafeina (abscisas) y reas de pico (en ordenadas), para interpolar en ella las reas de cada pico correspondiente a cafena (aprox. tr= 1,28 min) en los diferentes cafs ensayados y conocer as su concentracin. En la siguiente tabla se muestran los resultados obtenidos de las inyectadas de las soluciones patrn.
Tabla 3. Concentraciones patrn de cafena y sus reas CONCENTRACIN DE CAFENA (mg/ml) 4 8 16 24 32 REA 1.195.488,17 2.344.794,17 4.664.782,50 6.921.478,17 9.499.379,17 TIEMPO DE RETENCIN 1,26 1,27 1,28 1,29 1,30
En la siguiente figura se representaron grficamente las reas obtenidas con las soluciones patrn frente a sus correspondientes concentraciones (ppm).
CURVA PATRN DE HPLC 10.000.000,00 8.000.000,00 Area (uVs) 6.000.000,00 4.000.000,00 2.000.000,00 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 Concentracin de cafena (ppm)
Figura 58.
Curva de calibrado obtenida con HPLC
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Se interpol el rea del pico correspondiente a la muestra de cafena de caf en la curva estndar y se obtuvo la concentracin de la muestra inyectada (ver recorrido de las flechas rojas).
CURVA PATRN DE HPLC 10.000.000,00 8.000.000,00 Area (uV s) 6.000.000,00 4.000.000,00 2.000.000,00 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 Concentracin de cafena (ppm)
Figura 59. Interpolacin de solucin patrn en la curva de calibrado
Para realizar estos clculos se necesita la regresin lineal de la curva de calibrado que fue:
Y = 294.506 x 22.523 (14)
R2= 0,99940061 As que teniendo en cuenta que la ecuacin obtenida en la curva de calibrado es:
Y=mx+b (15)
Donde:
Y: rea m: Pendiente de la curva de calibrado x: Concentracin de cafena de las muestras inyectadas (ppm) b: Ordenada en el origen de la curva de calibrado
A partir de las reas de los cromatogramas obtenidos y con la ecuacin de la curva de calibrado se obtiene la cantidad de cafena contenida en las muestras de caf. Para la preparacin de las muestras de cafena de caf obtenidas mediante extraccin (Ver captulo 4). Clculos En los clculos para cuantificar la cantidad de cafena en cada caf, se utilizaron todos los valores de reas resultantes de las diversas inyectadas de muestras de cafena de caf, a excepcin de los valores de reas que despreciamos, ya que pensamos que pudieron haber prdidas en el proceso de extraccin. En el Anexo 1, se pueden ver la totalidad de los resultados obtenidos de las diferentes muestras de cafs, as como los resultados tabulados. A continuacin se muestran unos ejemplos de clculo de la concentracin de cafena de cada uno de los tipos de caf.
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Silvia Calle Aznar
Caf de tostadero En la siguiente tabla se representan las reas de los picos de los cromatogramas obtenidos de las muestras de cafena del caf natural de Brasil de tostadero Bon Mercat y el tiempo de retencin de las diferentes inyectadas realizadas.
Tabla 4. Muestras de cafena de caf, tiempo de retencin y reas Caf Brasil natural. Tostadero Bon Mercat HPLC Nombre Valoracin 1 2 1 2 1 2 Tiempo retencin (min) 1,31 1,31 1,33 1,31 1,32 1,32 rea 3.107.982,5000 3.190.141,0000 3.007.938,0000 2.950.290,0000 3.365.353,0000 3.312.392,0000 rea media
Brasil 1
3.149.061,7500
Brasil 2
2.979.114,0000
Brasil 3
3.338.872,5000
La concentracin del caf natural Brasil del tostadero Bon Mercat se desarrolla con los resultados obtenidos de todas las extracciones, ya que los resultados son muy similares.
rea media del caf Brasil natural de tostadero (uVs) = 3.155.682,75 Para realizar el clculo de concentracin de cafena se necesita la regresin lineal de la curva de calibrado que fue:
Y = 294.506 x 22.523 (16)
Se sustituye la Y por la media de las reas obtenidas:

3.155.682,75 = 294.506 x 22.523 (17)
Y despejando x se obtiene la concentracin de cafena en:
Concentracin de cafena en HPLC = 10,79 ppm
Figura 60.
Cromatograma de la muestra de cafena del caf Brasil Bon Mercat.

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Caf natural En la siguiente tabla se representan las reas de los picos de los cromatogramas obtenidos de las muestras de cafena del caf natural 100% arabiga Saimaza Brasil y el tiempo de retencin de las diferentes inyectadas realizadas.
Tabla 5. Muestras de cafena de caf, tiempo de retencin y reas Caf molido de tueste natural 100% Arbiga. Saimaza Brasil. HPLC Nombre Valoracin 1 Saimaza Brasil 1 2 3 1 Saimaza Brasil 2 2 3 Tiempo retencin (min) 1,33 1,33 1,32 1,32 1,33 1,32 rea 3.018.386,0000 2.964.731,5000 2.943.600,0000 3.292.049,8300 3.154.807,0000 3.087.855,0000 3.178.237,28 2.975.572,50 rea media
La concentracin del caf natural Saimaza Brasil se desarrolla con los resultados obtenidos de todas las extracciones, ya que los resultados son muy similares.
rea media del caf natural Saimaza Brasil (uVs) = 3.076.904,89 Para realizar el clculo de concentracin de cafena se necesita la regresin lineal de la curva de calibrado que fue:
Y = 294.506 x 22.523 (18)

3.076.904,89 = 294.506 x 22.523 (19)
Y despejando x se obtiene la concentracin de cafena:
Figura 61.
Cromatograma de la muestra de cafena del caf Brasil Saimaza
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Caf mezcla En la siguiente tabla se representan las reas de los picos de los cromatogramas obtenidos de las muestras de cafena del caf mezcla (50% natural y 50% torrefacto) Bonka y el tiempo de retencin de las diferentes inyectadas realizadas.
Tabla 6. Muestras de cafena de caf, tiempo de retencin y reas Caf molido mezcla (50 % natural y 50 % torrefacto). Bonka HPLC Nombre Valoracin 1 Bonka mezcla 50/50 1 2 3 1 Bonka mezcla 50/50 2 2 3 Tiempo retencin (min) 1,32 1,32 1,32 1,31 1,32 1,32 rea 4.352.926,5000 4.488.246,0000 4.126.301,0000 4.224.099,0000 4.222.980,0000 4.377.748,0000 4.274.942,33 4.322.491,17 rea media
La concentracin del caf mezcla Bonka se desarrolla con los resultados obtenidos de todas las extracciones, ya que los resultados son muy similares.
rea media del caf mezcla Bonka (uVs) = 4.298.716,75 Para realizar el clculo de concentracin de cafena se necesita la regresin lineal de la curva de calibrado que fue:
Y = 294.506 x 22.523 (20)

4.298.716,75 = 294.506 x 22.523 (21)
Figura 62. Cromatograma de la muestra de cafena del caf Bonka.

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Caf natural descafeinado En la siguiente tabla se representan las reas de los picos de los cromatogramas obtenidos de las muestras de cafena del caf natural descafeinado gran aroma Marcilla y el tiempo de retencin de las diferentes inyectadas realizadas.
Tabla 7. Muestras de cafena de caf, tiempo de retencin y reas Caf molido descafeinado de tueste 100% natural. Gran Aroma Marcilla HPLC Nombre Valoracin 1 2 3 1 2 3 Tiempo retencin (min) 1,27 1,27 1,27 1,27 1,27 1,27 rea 1.046.912,1400 1.085.960,0000 1.072.296,0000 920.685,5100 972.508,0000 972.180,0000 955.124,5033 1.068.389,38 rea media
Marcilla descafeinado natural 1 Marcilla descafeinado natural 2
La concentracin del caf natural descafeinado Marcilla se desarrolla con los resultados obtenidos de todas las extracciones, ya que los resultados son muy similares.
rea media del caf descafeinado Marcilla (uVs) = 1.011.756,94 Para realizar el clculo de concentracin de cafena se necesita la regresin lineal de la curva de calibrado que fue:
Y = 294.506 x 22.523 (22)
Se sustituye la Y por la media de las reas obtenidas: 1.011.756,94 = 294.506 x 22.523 Y despejando x se obtiene la concentracin de cafena:
(23)
En este caso se tuvo que extrapolar ya que el rango de las soluciones patrn abarcan de los 4 a los 32ppm. Los 3,51 ppm estn por debajo de ese rango.
Figura 63.
Cromatograma de la muestra de cafena del caf Marcilla.

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Caf mezcla descafeinado En la siguiente tabla se representan las reas de los picos de los cromatogramas obtenidos de las muestras de cafena del caf mezcla (50% natural y 50% torrefacto) descafeinado Da y el tiempo de retencin de las diferentes inyectadas realizadas.
Tabla 8. Muestras de cafena de caf, tiempo de retencin y reas Caf molido mezcla descafeinado (50 % natural y 50 % torrefacto). Dia HPLC
Nombre Valoracin 1 Da mezcla 50/50 descafeinado 1 2 3 1 Da mezcla 50/50 descafeinado 2 2 3 Tiempo retencin (min) 1,26 1,26 1,26 1,28 1,27 1,29 rea 602.392,0000 673.412,5000 618.109,2200 346.080,0000 380.568,9300 439.161,5000 388.603,4767 631.304,5733 rea media
La concentracin del caf mezcla descafeinado Da se desarrolla con los resultados obtenidos de todas las extracciones.
rea media del caf mezcla descafeinado Da (uVs) = 509.954,02 Para realizar el clculo de concentracin de cafena se necesita la regresin lineal de la curva de calibrado que fue:
Y = 294.506 x 22.523 (24)
Se sustituye la Y por la media de las reas obtenidas: 509.954,02 = 294.506 x 22.523 Y despejando x se obtiene la concentracin de cafena:
(25)
Figura 64. Cromatograma de la muestra de cafena del caf Da.

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Caf soluble En la siguiente tabla se representan las reas de los picos de los cromatogramas obtenidos de las muestras de cafena del caf soluble natural Nescaf y el tiempo de retencin de las diferentes inyectadas realizadas.
Tabla 9. Muestras de cafena de caf, tiempo de retencin y reas Caf soluble de tueste 100% natural. NESCAF Classic Natural HPLC
Nombre Valoracin 1 Nescaf soluble natural 1 2 3 1 Nescaf soluble natural 2 2 3 Tiempo retencin (min) 1,33 1,33 1,31 1,33 1,33 1,33 rea 8.615.776,5000 8.796.931,5000 8.531.189,5000 8.972.830,0000 8.875.422,0000 8.974.824,0000 8.941.025,33 8.647.965,83 rea media
La concentracin del caf soluble natural Nescaf se desarrolla con los resultados obtenidos de todas las extracciones.
rea media del caf soluble natural Nescaf (uVs) = 8.794.495,58 Para realizar el clculo de concentracin de cafena se necesita la regresin lineal de la curva de calibrado que fue:
Y = 294.506 x 22.523 (26)
Se sustituye la Y por la media de las reas obtenidas: 8.794.495,58 = 294.506 x 22.523

(27)
Figura 65. Cromatograma de la muestra de cafena del caf Nescaf.

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Caf soluble descafeinado En la siguiente tabla se representan las reas de los picos de los cromatogramas obtenidos de las muestras de cafena del caf soluble natural descafeinado Carrefour y el tiempo de retencin de las diferentes inyectadas realizadas.
Tabla 10. Muestras de cafena de caf, tiempo de retencin y reas Caf soluble descafeinado de tueste 100% natural. Carrefour HPLC Nombre Carrefour soluble descafeinado natural 1 Carrefour soluble descafeinado natural 2 Valoracin 1 2 1 2 Tiempo retencin (min) 1,30 1,32 1,31 1,30 rea 845.436,0000 810.408,0000 924.346,0000 896.527,7500 827.922,0000 rea media
910.436,8750
La concentracin del caf soluble natural descafeinado Carrefour se desarrolla con los resultados obtenidos de todas las extracciones.
rea media caf soluble descafeinado Carrefour (uVs) = 869.179,43 Para realizar el clculo de concentracin de cafena se necesita la regresin lineal de la curva de calibrado que fue:
Y = 294.506 x 22.523 (28)
Se sustituye la Y por la media de las reas obtenidas: 869.179,43 = 294.506 x 22.523 Y despejando x se obtiene la concentracin de cafena:
(29)
Figura 66. Cromatograma de la muestra de cafena del caf Carrefour.
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Clculos para la determinacin del tanto por ciento de cafena en los diferentes cafs analizados. Seguidamente, una vez determinadas las reas de cada una de las muestras, se determina la concentracin de cafena que poseen en tanto por cien (%). En los clculos iniciales se supuso que los cafs contenan un 1,2 % de cafena y se trabaj pesando 300 mg de caf. Se procedi a determinar la cantidad de cafena hallada mediante las reas de los picos correspondientes a la cafena en los distintos cromatogramas obtenidos. Datos: Peso de caf real = 300 mg Solucin A = mg cafena extrada / 100 ml agua Milli-Q Solucin B = 10 ml solucin A / 25 ml agua Milli-Q En estos factores de conversin se pueden apreciar los clculos de uno de los cafs anteriormente descritos. Caf soluble natural descafeinado Carrefour:
100 ml sol A
25 ml sol B 3,03 mg cafena en caf = 0,7575 mg cafena en caf 10 ml sol A 1000 ml sol B
0,7575 mg cafena en caf 100 = 0,25% 300 mg de caf
Por lo tanto, se estara hablando de que el caf soluble natural descafeinado Carrefour posee una concentracin real de 0,25% de cafena. Los clculos de los dems cafs se pueden ver tabulados y representados en el Anexo 1.
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Discusin de resultados Se representa en tanto por ciento la concentracin de cafena de los diferentes cafs y se observa la variacin entre cada uno de ellos. En los siguientes diagramas, se muestran las diferencias de concentraciones de las 32 muestras analizadas, en funcin de los cafs de diferente origen adquiridos en el tostadero Bon Mercat (muestras de la 1 a la 7) y segn los diferentes tipos de caf de marcas comerciales: naturales (muestras de la 8 la 18), mezcla (muestras de la 19 a la 24), naturales descafeinados (muestras 25 y la 26), mezclas descafeinados (muestras 27 y 28), solubles naturales (muestras 29 y 30) y solubles descafeinados (muestras 31 y 32) .
Porcentaje de cafena presente en el caf de todas las muestras analizadas

3,00 2,49 2,62 1,71 1,27 1,48 1,58 1,31 1,05 1,48 0,89 0,55 0,89 0,81 1,01 0,82 0,88 0,95 0,90 0,95 1,04 0,98 1,30 1,22 1,41 1,13 0,29 0,17 0,15 0,46 1,29 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
2,50
2,00
% Cafena
1,50
1,00
0,00
Muestra
Figura 67. Representacin de la concentracin de cafena de todas las muestras analizadas
Como se puede observar hay una gran similitud de concentracin de cafena entre cada uno de los diferentes tipos de caf. Los cafs solubles son los que muestran una mayor concentracin de cafena. Todos los cafs, los clculos de los porcentajes y las grficas resultantes se pueden encontrar tabulados y representados en el Anexo 1. En los siguientes diagramas, se muestra la diferencia de concentraciones en funcin de los cafs de diferente origen adquiridos en el tostadero Bon Mercat y segn los diferentes tipos de caf de marcas comerciales.
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0,25 0,24
0,50
Segn cafs de tostadero: En el siguiente diagrama se representan 7 muestras de cafs diferentes, se encuentran cafs de Kenya, Costa Rica, Caracolillo (Nicaragua), Guatemala, Brasil, Colombia y Sumatra. Los siete cafs utilizados para el anlisis pertenecen a la variedad arbiga.
Porcentaje de cafena presente en el caf natural de tostadero
1,80 1,60 1,40 1,27 1,71 1,58 1,48
% Cafena
1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Kenya Costa Rica Nicaragua Guatemala Brasil Colombia Sumatra 0,95 0,90 0,95
Muestra
Figura 68. Representacin de la concentracin de cafena segn pas de origen
Se observa que el caf de Kenya es el que ms concentracin de cafena contiene con 1,71%, seguido del caf de Colombia que posee un 1,58%. A diferencia de los dems, el caf de Brasil, es el que contiene menor cantidad de cafena. El caf natural crudo o tostado tiene un contenido en cafena que sera normal entre 0,8% y 2,4%, segn tipo y variedad. Los datos bibliogrficos encontrados, informan que la variedad de caf arbiga contiene poca cafena, comprendida entre 0,7 y 1,5%. Por lo tanto, todas las concentraciones de cafena obtenidas en nuestros ensayos estn dentro del rango definido, ya que los resultados oscilan entre 0,90% y 1,71%. Teniendo en cuenta que los siete tipos de caf son 100 % arbigas, el caf de Kenya y el caf de Colombia sobrepasan por poco el rango definido de concentracin de cafena.
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Segn el tipo de caf de marcas comerciales: Las muestras de caf de marcas comerciales que se han analizado en el laboratorio, se han clasificado en 6 tipos diferentes. Entre ellos se encuentra los cafs de tueste natural, los cafs de mezcla, los cafs descafeinados 100 % naturales, los cafs descafeinados de mezcla, los cafs solubles 100 % naturales y los cafs solubles 100 % naturales descafeinados. Primero, se muestran los resultados obtenidos en los ensayos realizados con los cafs naturales de diferentes marcas comerciales. Las marcas utilizadas son: Carrefour natural, Carrefour Colombia, Carrefour Etiopa, Carrefour Arbiga, Saimaza Colombia, Saimaza Brasil, Senseo Kenya, Senseo Brasil, Hacendado natural, Bonka Colombia y Mexique Chiapas. El siguiente diagrama muestra el tanto por ciento de concentracin de cafena presente en cada una de las muestras de caf natural.
Porcentaje de cafena presente en los cafs de tueste natural segn marca comercial
1,80 1,60 1,40 1,29 1,01 0,81 0,82 0,88 1,31 1,05 0,89 0,55 1,48
% Cafena
1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0,89
Figura 69. Representacin de la concentracin de cafena de los cafs naturales de marcas comerciales
Estos resultados presentan variaciones an siendo los mismos tipos de caf. Puede observarse, que la concentracin de cafena en el caf Hacendado natural es mayor que en las dems marcas de caf, mientras que el caf de Mexique Chiapas presenta menos cantidad de cafena que todos los dems. Algunos de estos cafs tienen pases de origen diferentes, por lo que los niveles de cafena hallados pueden variar segn el lugar de procedencia. Tambin, en ausencia de ms informacin sobre sus caractersticas, es posible que algunos de estos cafs comerciales sean mezclas de variedad robusta y arbiga, por lo que el primero podra incrementar su concentracin debido a que posee mayor cantidad de robusta que otros. Atendiendo a la definicin anterior sobre la proporcin de cafena en el caf natural crudo o tostado, se pueden aceptar los resultados como vlidos, ya que todos oscilan en el intervalo descrito entre 0,7 y 1,5%.
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fo ur na ar tu re ra fo l ur C ol om C ar bi a re fo ur Et C io ar p re a fo ur Ar b Sa ig im a az a C ol om Sa bi a im az a Br as Se il ns eo K en ya Se ns eo H B ac ra en sil da do na tu Bo ra nk l a C ol om M ex bi iq a ue C hi ap as
ar re
Muestra
En segundo lugar, se exponen los valores de tanto por ciento de cafena presente en los cafs mezcla de diversas marcas comerciales existentes en el mercado. Los cafs con mezcla natural y torrefacto se consumen habitualmente, puesto que la utilizacin exclusiva de caf natural produce una infusin poco densa y con un color claro, y al mezclarlo con caf torrefacto se obtiene ms cuerpo y color. Entre ellos tenemos muestras de Soley mezcla (50 % natural y 50 % torrefacto), Bonka mezcla Especial (30 % natural y 70 % torrefacto), Bonka mezcla (70 % natural y 30 % torrefacto), Bonka mezca (50 % natural y 50 % torrefacto), Dia Express mezcla (70 % natural y 30 % torrefacto) y Dia mezcla (50 % natural y 50 % torrefacto).
1,60 1,40 1,20
Porcentaje de cafena presente en los cafs mezcla segn marca comercial

1,41 1,30 1,04 1,22 1,13 0,98
% Cafena
1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Soley mezcla
Bonka mezcla 30/70
Bonka mezcla 70/30
Bonka mezcla 50/50
Dia Express mezcla 70/30
Dia mezcla 50/50
Muestra
Figura 70. Representacin de la concentracin de cafena de los cafs mezcla de marcas comerciales.
Puede observarse que la cantidad de cafena existente en las mezclas de caf es bastante variable. Los cafs que contienen 70% natural y 30% torrefacto, muestran un nivel de cafena superior a las dems mezclas analizadas. Los cafs con mezcla 50% natural y 50% torrefacto presentan valores muy similares en cuanto a la proporcin de cafena, ya que sus concentraciones oscilan entre 1,04 y 1,22%. El caf Bonka de mezcla 30% natural/70% torrefacto, contiene 0,98% y es el de menor concentracin de cafena. Observando las diferencias halladas en cuanto a la concentracin de cafena en las diferentes mezclas, podra decirse que en funcin del mtodo de tueste, el nivel de cafena presente oscila, decreciendo a medida que se aumenta la proporcin de caf torrefacto. Pero, para poder corroborar esta hiptesis se deberan analizar ms muestras de caf mezcla 70/30, por lo que sera arriesgado validar esta suposicin.
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A continuacin, se muestran los resultados obtenidos en los anlisis efectuados con los cafs descafeinados de tueste natural de diferentes marcas comerciales existentes en el mercado. El objetivo de la descafeinacin es producir un caf que retenga su aroma y sabor a pesar de los procesos que son necesarios para eliminar la cafena. Como la mayora de los componentes que dan el sabor al caf se desarrollan durante el tostado, el caf es normalmente descafeinado en grano verde, antes del tostado. Las marcas utilizadas son: Marcilla descafeinado 100% natural y Carrefour descafeinado 100% natural.
Porcentaje de cafena presente en los cafs descafeinados de tueste natural segn marca comercial
0,35 0,30 0,25 0,29
% Cafena
0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Marcilla descafeinado natural
0,17
Muestra
Carrefour descafeinado natural
En la representacin grfica, se puede apreciar como la cantidad de cafena presente en estos tipos de caf es insignificante. La proporcin de cafena presente en las muestras analizadas en el laboratorio, presentan desigualdad ya que los valores hallados son de 0,29% y 0,17%. Esta disconformidad puede ser consecuencia del mtodo de extraccin, ya que durante su separacin el procedimiento debe ser muy riguroso debido a que el contenido del principio activo en estos cafs es pauprrimo.
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Seguidamente, se exponen los valores de tanto por ciento de cafena presente en los cafs descafeinados mezcla, de diferentes marcas comerciales presentes en el mercado. Como se ha comentado anteriormente, el objetivo de la elaboracin de caf descafeinado es mantener su aroma y sabor excluyendo el principio activo. La extraccin se aplica sobre el caf verde, pudiendo seleccionar las proporciones necesarias para su tostado natural y torrefacto, y elaborar la mezcla deseada. Para poder estudiar los niveles de cafena presentes en los cafs descafeinados de mezcla se han utilizado dos cafs diferentes como son: Da descafeinado mezcla (50% natural y 50% torrefacto) y Da Expresss descafeinado mezcla (80% natural y 20% torrefacto).
Porcentaje de cafena presente en los cafs descafeinados mezcla segn marca comercial
0,50 0,45 0,40 0,35 0,46
% Cafena
0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Dia mezcla 50/50 descafeinado Dia Express mezcla 80/20 descafeinado 0,15
Muestra
Figura 72. Representacin de la concentracin de cafena de los cafs descafeinados mezcla de marcas comerciales.
Puede observarse que la proporcin de cafena existente en las mezclas de caf descafeinado es discordante y que el nivel de cafena hallado es muy pequeo. Atendiendo a lo comentado anteriormente sobre los cafs descafeinados, la cantidad de cafena extrada en las muestras analizadas, presentan desigualdad con valores de 0,15% y 0,46%, ya que el procedimiento de separacin ha de ser minucioso. Rescatando la discusin expuesta en los cafs mezcla y observando la representacin de los cafs descafeinados mezcla, se puede ver como la concentracin de cafena aumenta a medida que se disminuye la proporcin de caf torrefacto. Pero, es atrevido aceptar esta hiptesis ya que solo se disponen de dos muestras en el anlisis.
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Silvia Calle Aznar
A continuacin, se presentan los resultados adquiridos en los anlisis efectuados con los cafs solubles de tueste natural de diferentes marcas comerciales existentes en el mercado. El caf instantneo y soluble es caf seco en polvo o granulado, que se puede disolver rpidamente en agua caliente para ser consumido. En este caso el caf tostado se muele para permitir la extraccin de los slidos solubles con agua a altas temperaturas y presin. El caf soluble tiene hoy su mercado y, aunque la calidad es inferior al grano o molido, posee algunas ventajas como son la facilidad de preparacin, que no necesita cafetera, diversidad de usos en repostera, etc. Este tipo de caf contiene cafena siempre en una cantidad superior al 2,5%. En el siguiente diagrama se representan 2 muestras de cafs diferentes, se encuentran Nescaf y Auchan soluble natural.
Porcentaje de cafena presente en los cafs solubles de tueste natural comerciales

2,65 2,62 2,60
% Cafena
2,55
2,50
2,49
2,45
2,40 Nescaf soluble natural Auchan soluble natural
Muestra
Figura 73. Representacin de la concentracin de cafena de los cafs solubles naturales de marcas comerciales.
Estos resultados presentan similitud ya que los valores son bastante aproximados. Se aprecia, que la concentracin de cafena en el caf soluble natural Auchan es ligeramente mayor que el caf soluble de la marca Nescaf. Es posible que algunos de estos cafs comerciales sean mezclas de variedad robusta y arbiga, por lo que este primero podra incrementar su concentracin debido a que posee mayor cantidad. Segn datos bibliogrficos, la variedad robusta es usada por la industria alimentaria en la elaboracin de caf soluble. En consecuencia, el resultado es aceptable, ya que los cafs robusta contienen una cantidad de cafena comprendida entre 2% y 3,5%. Las muestras de caf, contienen 2,49% y 2,62%, que se encuentra en el rango estimado.
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Seguidamente, se exponen los valores de tanto por ciento de cafena presente en los cafs descafeinados solubles, de diferentes marcas comerciales presentes en el mercado. Actualmente, los mtodos de produccin del caf soluble descafeinado permiten conservar el aroma y el sabor con una disminucin considerable del principio activo estimulante, lo que ha hecho que el caf soluble descafeinado se implante en muchos pases del mundo. Segn la normativa espaola, los cafs descafeinados solubles no pueden contener ms un 0,3 por ciento (ver anexo 3).
Porcentaje de cafena presente en los cafs solubles de tueste natural descafeinados comerciales
0,26 0,25 0,25
% Cafena
0,25
0,24
0,24
0,24
0,23 Carrefour soluble descafeinado natural Nescaf soluble descafeinado natural
Muestra
Figura 74. Representacin de la concentracin de cafena de los cafs solubles descafeinados naturales de marcas comerciales.
En la representacin grfica, se puede obsevar como la cantidad de cafena hallada en estos tipos de caf es inapreciable. El tanto por ciento de cafena presente en las muestras analizadas en el laboratorio, presentan similitud ya que los valores hallados son de 0,25% y 0,24%. Esta semejanza puede ser consecuencia de la solubilidad del caf en polvo o granulado en el proceso de extraccin, ya que beneficia la separacin de la escasa cafena existente en esos tipos de caf. Tambin, pude apreciarse como la proporcin encontrada en la cromatografa HPLC se asemeja al porcentaje mximo de cafena estimado por la legislacin en estos tipos de cafs. La marca comercial Nescaf, supera el mximo permitido, pero la desviacin es muy leve.
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A continuacin, se representan los porcentajes de cafena presentes en los diferentes tipos de cafs analizados en el laboratorio, con la idea de elaborar una comparacin sobre la proporcin de este principio activo.
Porcentaje de cafena presente en los diferentes tipos de caf

3,00 2,56 2,50 2,00
% Cafena
1,50 1,00 0,50 0,00
1,26 1,00
1,18
0,23
0,30
0,24
Natural de to stadero
Natural co mercial
M ezcla co mercial
Descafeinado natural co mercial
Descafeinado mezcla co mercial
So luble natural So luble natural co mercial descafeinado co mercial
Muestra
Figura 75. Representacin de la concentracin de cafena de los diferentes tipos de caf
Mediante esta representacin grfica puede observarse como los cafs solubles naturales contienen una proporcin de cafena superior a los dems tipos de caf, ya que como se ha comentado anteriormente, son elaborados con los granos de caf de variedad robusta. En ltimo lugar, tenemos los cafs descafeinados naturales y solubles naturales, con una proporcin de cafena de 0,23 y 0,24% respectivamente.
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Segn el pas de origen: Observando los valores hallados en los cafs de marca comercial, en los que resalta su marketing segn el pas de origen, y los resultados experimentales obtenidos en los cafs de tostadero, se puede determinar una comparativa en cuanto a la concentracin de cafena en cada uno de ellos.
Porcentaje de cafena presente en el caf segn pas y continente de origen
1,48 1,31 1,27 0,95 0,81 1,05 0,90 0,88 0,89 0,89 0,82 0,55 0,95 1,58
1,80 1,60 1,40
1,71
% Cafena
1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00
Ke ny a C K ar en re ya fo ur Et io p C C a ar os ac ta ol R il lo ic a N ic ar ag ua G ua te m al a Se n se o
Figura 76. Representacin de la concentracin de cafena segn pas y continente de origen con cafs de tostadero y comerciales
Los cafs estn representados por colores dependiendo del pas y continente del que proceden los cafs ms conocidos. En colores anaranjados se encuentran los del continente africano, en gama de colores verdosos los pases del continente suramericano y en color lila los del continente asitico. En primer lugar, se encuentra el caf de Kenya del tostadero Bon Mercat y el caf Kenya de la marca Senseo. Como se puede ver en el diagrama, con un crculo de color naranja, ambos presentan resultados variables, aun tratndose del mismo pas de procedencia. A continuacin, se observan los diferentes tipos de caf analizados en el laboratorio segn el pas de origen de Brasil. Estos valores estn indicados grficamente por un eclipse de color verde oscuro. Estas muestras son: el caf Brasil de tostadero Bon Mercat, el caf Brasil de la marca Senseo y el caf Brasil de la marca Saimaza. El tanto por ciento de cafena presente en estos cafs presentan similitud, ya que los valores hallados son de 0,90%, 1,05% y 0,88%. Finalmente, hay otros 4 tipos de cafs diferentes que coinciden en el pas de procedencia. Se trata del caf de Colombia que est indicado en la representacin grfica rodeado por un smbolo elptico de color verde. Entre ellos tenemos muestras de caf de Colombia del tostadero Bon mercat, Carrefour Colombia, Bonka Colombia y Saimaza Colombia. Como puede verse, los valores son bastante equivalentes, a exepcin del caf del tostadero que se diferencia mucho de los otros tres tipos. Los cafs de marca comercial, se encuentran entre un rango de valores comprendico entre 0,82% y 1,58%.
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Br Se as ns il eo B Sa ra im sil az a Br as il C C ar ol re om fo bi ur a C ol Bo om nk bi a a C Sa ol im om az bi a a C M ol ex om iq bi ue a C hi ap as Su m at ra
Muestra
Silvia Calle Aznar
6.2. RESULTADOS OBTENIDOS ESPECTROFOTMETRO UV-VIS
POR
Se empez a ensayar con las soluciones patrn realizadas nuevamente y las soluciones de cafena de caf obtenidas mediante extraccin (ver captulo 5) para inyectar como muestras. La deteccin se hace a 273 nm, ya que la cafena presenta, a esa longitud de onda, un mximo de absorcin. Las soluciones patrn de cafena con concentraciones: 4,00 ppm, 8,00 ppm, 16,00 ppm, 24,00 ppm y 32,00 ppm se registraron los correspondientes espectrofotogramas.
6.2.1.
Determinacin de la cafena por Espectrofotometra UV
Determinacin de la curva de calibrado En esta tabla se muestran los resultados obtenidos de las absorbancias de las soluciones patrn.
Tabla 11. Concentraciones patrn de cafena y absorbancias CONCENTRACIN DE CAFENA (mg/ml) 4,00 8,00 16,00 24,00 32,00 ABS (273 nm) 0,2179 0,4267 0,8298 1,2315 1,6018 ERROR (%) 0,3004 0,3003 0,3000 0,3004 0,3002
En la siguiente figura se representaron grficamente las absorbancias obtenidas con las soluciones patrn frente a sus correspondientes longitudes de onda (nm).
Figura 77. Espectro de las muestras patrn

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En la siguiente figura se representaron grficamente las absorbancias obtenidas con las soluciones patrn frente a sus correspondientes concentraciones (ppm).
Figura 78.
Curva de calibrado obtenida con espectrofotmetro UV-Vis
Se interpol la absorbancia correspondiente a una muestra de cafena de caf en la curva estndar y se obtuvo la concentracin de la muestra (ver recorrido de las flechas rojas).
Figura 79.
Interpolacin de una muestra de caf en la curva de calibrado
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Silvia Calle Aznar
Para realizar estos clculos se necesita la regresin lineal de la curva de calibrado que fue:
y = 0, 0496 x + 0,029
(30)
R2= 0,9996 As que teniendo en cuenta que la ecuacin obtenida en la curva de calibrado es:
Y=mx+b
(31)
Donde: Y: Absorbancia m: Pendiente de la curva de calibrado x: Concentracin de cafena de las muestras (ppm) b: Ordenada en el origen de la curva de calibrado As que teniendo en cuenta que la ecuacin obtenida en la curva de calibrado es: A partir de las absorbancias de los espectros obtenidos y con la ecuacin de la curva de calibrado se obtiene la cantidad de cafena contenida en las muestras de caf. Para la preparacin de todas las muestras de cafena de caf obtenidas mediante extraccin (ver Captulo 5).
Clculos En los clculos para cuantificar la cantidad de cafena en cada caf, se utilizaron todos los valores de absorbancias resultantes de las diversas muestras de cafena de caf, a excepcin de los valores de absorbancias que despreciamos, ya que pensamos que pudieron haberse producido prdidas en el proceso de extraccin. En el Anexo 1, se pueden ver los resultados obtenidos en cada una de las extracciones de los diferentes cafs, as como los resultados tabulados. Las muestras extradas de caf se analizan en el espectro y se determina la absorbancia de cada una de ellas.
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Seguidamente se representan los espectros del caf Guatemala del tostadero Bon Mercat como ejemplo de clculo de la concentracin de cafena.
Figura 80. Espectro del caf de Guatemala de la primera extraccin con ajuste espectral de 190 a 340 nm
Figura 81. Espectro del caf de Guatemala de la primera extraccin con ajuste espectral reducido de 245 a 340 nm
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Silvia Calle Aznar
Una vez se ha identificado el caf de Guatemala de la primera extraccin individualmente, se lee la absorbancia de esta por triplicado.
Figura 82. Espectro del caf de Guatemala de la primera extraccin por triplicado con ajuste espectral de 190 a 340 nm
Figura 83. Espectro del caf de Guatemala de la primera extraccin por triplicado con ajuste espectral reducido de 245 a 340 nm
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A continuacin, se representan conjuntamente los espectros de las tres extracciones de cafena realizadas al caf de Guatemala de los tostaderos Bon Mercat.
Figura 84. Espectro del caf de Guatemala de todas las extracciones con ajuste espectral de 190 a 340 nm
Figura 85. Espectro del caf de Guatemala de todas las extracciones con ajuste espectral reducido de 245 a 340 nm
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En la siguiente tabla se representan las absorbancias de los espectrofotogramas obtenidos de las muestras de cafena del caf Guatemala y la longitud de onda.
Tabla 12. Muestras de cafena de caf, pico y absorbancias Caf Guatemala natural. Tostadero Bon Mercat Espectrofotometra UV-Vis (246nm-340nm) Nombre Valoracin 1 Guatemala 1 2 3 1 Guatemala 2 2 3 1 Guatemala 3 2 3 Pico (nm) 273,0 273,0 273,0 271,0 271,0 271,0 272,0 272,0 272,0 Abs(AU) 0,5840 0,5876 0,5862 0,6189 0,6224 0,6216 0,6059 0,6094 0,6082 0,6078 0,6210 0,5860 Abs media (AU)
La concentracin del caf Guatemala natural de tostadero se desarrolla con los resultados obtenidos de todas las extracciones.
Absorbancia media caf Guatemala (AU) = 0,6049
Para realizar el clculo de concentracin de cafena se necesita la regresin lineal de la curva de calibrado que fue:
Y = 0, 0496 x + 0,029
(32)
Se sustituye la Y por la media de las absorbancias obtenidas y se despeja la x:
x = (0,6049 -0,029)/0,0496
(33)
Concentracin de cafena en espectrofotometra UV-VIS = 11,6110 ppm
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Como se ha comentado anteriormente, se utilizan las muestras de cafena de caf que proporcionen resultados equivalentes y se desprecian las muestras de cafena de caf en las que se pens que pudieron haberse producido prdidas en el proceso de extraccin. Un ejemplo es el caf Costa Rica de tostaderos Bon Mercat, en el que puede observarse la diferencia entre los espectros de las diferentes extracciones.
Figura 86. Espectro del caf de Costa Rica de todas las extracciones con ajuste espectral de 190 a 340 nm
La tercera extraccin es la que presenta mejores resultados. La primera y segunda extraccin, se desprecian, ya que los resultados obtenidos son misrrimos y proporcionaran un resultado final errneo (ver Anexo 1).
Figura 87. Espectro del caf de Costa Rica de la tercera extraccin por triplicado con ajuste espectral reducido de 245 a 340 nm
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Silvia Calle Aznar
Clculos para la determinacin del tanto por ciento de cafena en los diferentes cafs analizados. Seguidamente, una vez determinadas las absorbancias de cada una de las muestras, se determina la concentracin de cafena que poseen. En los clculos iniciales se supuso que los cafs contenan un 1,2 % de cafena y se trabaj pesando 300 mg de caf. Se procedi a determinar la cantidad de cafena hallada mediante la absorbancia de la espectrofotometra UV. Datos: Peso de caf real = 300 mg Solucin A = mg cafena extrada / 100 ml agua Milli-Q Solucin B = 10 ml solucin A / 25 ml agua Milli-Q En estos factores de conversin se pueden apreciar los clculos de uno de los cafs anteriormente descritos. Caf Guatemala natural de tostadero Bon Mercat:
100 ml sol A
25 ml sol B 11,61mg cafena en caf = 2,90 mg cafena en caf 10 ml sol A 1000 ml sol B
2,90 mg cafena en caf 100 = 0,97% 300 mg de caf
Por lo tanto, se estara hablando de que el caf Guatemala natural de tostadero Bon Mercat posee una concentracin real de 0,97% de cafena. Los clculos de los dems cafs se pueden ver en el Anexo 1.
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Discusin de resultados Se representa en tanto por ciento la concentracin de cafena de los diferentes cafs y se observa la variacin entre cada uno de ellos. En los siguientes diagramas, se muestran las diferencias de concentraciones de las 32 muestras analizadas, en funcin de los cafs de diferente origen adquiridos en el tostadero Bon Mercat (muestras de la 1 a la 7) y segn los diferentes tipos de caf de marcas comerciales: naturales (muestras de la 8 la 18), mezcla (muestras de la 19 a la 24), naturales descafeinados (muestras 25 y la 26), mezclas descafeinados (muestras 27 y 28), solubles naturales (muestras 29 y 30) y solubles descafeinados (muestras 31 y 32) .
Figura 88. Representacin de la concentracin de cafena de todas las muestras analizadas
Como se puede observar hay una gran similitud de concentracin de cafena entre cada uno de los diferentes tipos de caf. Los cafs solubles son los que muestran una mayor concentracin de cafena. Todos los cafs, los clculos de los porcentajes y las grficas resultantes se pueden encontrar tabulados y representados en el Anexo 1. En los siguientes diagramas, se muestra la diferencia de concentraciones en funcin de los cafs de diferente origen adquiridos en el tostadero Bon Mercat y segn los diferentes tipos de caf de marcas comerciales.
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Silvia Calle Aznar
Segn cafs de tostadero: Estos cafs estn elaborados al natural, ya que son cafs de tostadero, en los que se pretende rescatar el caf de antao y degustar cafs excelentes de diferente denominacin de origen. Se pueden conseguir cafs de diferentes pases ya que existen tostaderos pequeos que importan caf directamente de los pases de produccin. As los tostaderos pueden importar cantidades pequeas de caf, de una calidad bastante buena, que han sido especialmente seleccionados. En el siguiente diagrama se representan 7 muestras de cafs diferentes, se encuentran cafs de Kenya, Costa Rica, Caracolillo (Nicaragua), Guatemala, Brasil, Colombia y Sumatra. Los siete cafs utilizados para el anlisis pertenecen a la variedad arbiga.
2,50 2,13 2,00 1,50 1,00
Porcentaje de cafena presente en el caf natural de tostadero segn pas de procedencia

2,09
% Cafena
1,36 0,97 0,62 1,00 1,10
0,50 0,00 Kenya Costa Rica Caracolillo Guatemala Brasil Colombia Sumatra
Muestra
Figura 89. Representacin de la concentracin de cafena segn pas de origen
Se observa que el caf de Kenya es el que ms concentracin de cafena contiene con 2,13%, seguido del caf de Colombia que posee un 2,09%. A diferencia de los dems, el caf de Caracolillo, que es muy apreciado por su paladar maduro y afrutado, es el que contiene menor cantidad de cafena. El caf natural crudo o tostado tiene un contenido en cafena que sera normal entre 0,8% y 2,4%, segn tipo y variedad. Los datos bibliogrficos encontrados, informan que la variedad de caf arbiga contiene poca cafena, comprendida entre 0,7 y 1,5%. Por lo tanto, todas las concentraciones de cafena obtenidas en nuestros ensayos estn dentro del rango definido, ya que los resultados oscilan entre 2,13% y 0,62%. Teniendo en cuenta las definiciones encontradas en la bibliografa sobre los cafs de variedad arbiga, y sabiendo que los siete tipos de caf son 100 % arbigas, se encuentran discrepancias en los resultados, no siendo aceptables el caf de Kenya y el caf de Colombia, ya que sobrepasan el rango definido de concentracin de cafena.
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Segn el tipo de caf de marcas comerciales: Las muestras de caf de marcas comerciales que se han analizado en el laboratorio, se han clasificado en 6 tipos diferentes. Entre ellos se encuentra los cafs de tueste natural, los cafs de mezcla, los cafs descafeinados 100 % naturales, los cafs descafeinados de mezcla, los cafs solubles 100 % naturales y los cafs solubles 100 % naturales descafeinados. Primero, se muestran los resultados obtenidos en los ensayos realizados con los cafs naturales de diferentes marcas comerciales. Las marcas utilizadas son: Carrefour natural, Carrefour Colombia, Carrefour Etiopa, Carrefour Arbiga, Saimaza Colombia, Saimaza Brasil, Senseo Kenya, Senseo Brasil, Hacendado natural, Bonka Colombia y Mexique Chiapas. El siguiente diagrama muestra el tanto por ciento de concentracin de cafena presente en cada una de las muestras de caf natural.
1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00
Porcentaje de cafena presente en los cafs de tueste natural segn marca comercial
1,60 1,34 1,14 0,97 0,85 0,92 0,96 0,94 0,97 0,88 1,40
% Cafena
C
Estos resultados presentan variaciones an siendo los mismos tipos de caf. Puede observarse, que la concentracin de cafena en el caf Hacendado natural es mayor que en las dems marcas de caf, mientras que el caf de Carrefour Etiopa presenta menos cantidad de cafena que todos los dems. Algunos de estos cafs tienen pases de origen diferentes, por lo que los niveles de cafena hallados pueden variar segn el lugar de procedencia. Tambin, en ausencia de ms informacin sobre sus caractersticas, es posible que algunos de estos cafs comerciales sean mezclas de variedad robusta y arbiga, por lo que el primero podra incrementar su concentracin debido a que posee mayor cantidad. Atendiendo a la definicin anterior sobre la proporcin de cafena en el caf natural crudo o tostado, se pueden aceptar los resultados como vlidos, ya que todos oscilan en el intervalo descrito.
fo ur C na ar tu re ra fo l ur C ol om C ar bi re a fo ur Et C io ar p re a fo ur Ar Sa b im ig a az a C ol om Sa bi a im az a Br as Se il ns eo K en ya Se ns eo H B ac ra en sil da do na tu Bo ra nk l a C ol M om ex bi iq a ue C hi ap as
ar re
Muestra
Figura 90. Representacin de la concentracin de cafena de los cafs naturales de marcas comerciales.
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Silvia Calle Aznar
En segundo lugar, se exponen los valores de tanto por ciento de cafena presente en los cafs mezcla de diversas marcas comerciales existentes en el mercado. Los cafs con mezcla natural y torrefacto se consumen habitualmente, puesto que la utilizacin exclusiva de caf natural produce una infusin poco densa y con un color claro, y al mezclarlo con caf torrefacto se obtiene ms cuerpo y color. Entre ellos tenemos muestras de Soley mezcla (50 % natural y 50 % torrefacto), Bonka mezcla Especial (30 % natural y 70 % torrefacto), Bonka mezcla (70 % natural y 30 % torrefacto), Bonka mezca (50 % natural y 50 % torrefacto), Dia Express mezcla (70 % natural y 30 % torrefacto) y Dia mezcla (50 % natural y 50 % torrefacto).
1,60 1,55 1,50
Porcentaje de cafena presente en los cafs mezcla segn marca comercial

1,55 1,49 1,44 1,38 1,37
% Cafena
1,45 1,40 1,35 1,30 1,25
1,36
Soley mezcla Bonka mezcla Bonka mezcla Bonka mezcla Dia Express 30/70 70/30 50/50 mezcla 70/30
Dia mezcla 50/50
Muestra
Puede observarse que la cantidad de cafena existente en las mezclas de caf es bastante variable. Los cafs que contienen 70% natural y 30% torrefacto, muestran un nivel de cafena superior a las dems mezclas analizadas. Los cafs con mezcla 50% natural y 50% torrefacto presentan valores equitativos en cuanto a la proporcin de cafena, ya que sus concentraciones oscilan entre 1,441,36%. El caf Bonka de mezcla 30% natural/70% torrefacto, contiene 1,38% que se encuentra entre el rango de valores hallados en los cafs de mezcla 50/50. Observando las diferencias halladas en cuanto a la concentracin de cafena en las diferentes mezclas, podra decirse que en funcin del mtodo de tueste, el nivel de cafena presente oscila, decreciendo a medida que se aumenta la proporcin de caf torrefacto. Pero, para poder corroborar esta hiptesis se deberan analizar ms muestras de caf mezcla 70/30, por lo que sera arriesgado validar esta suposicin.
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A continuacin, se muestran los resultados obtenidos en los anlisis efectuados con los cafs descafeinados de tueste natural de diferentes marcas comerciales existentes en el mercado. El objetivo de la descafeinacin es producir un caf que retenga su aroma y sabor a pesar de los procesos que son necesarios para eliminar la cafena. Como la mayora de los componentes que dan el sabor al caf se desarrollan durante el tostado, el caf es normalmente descafeinado en grano verde, antes del tostado. La legislacin europea y espaola, permiten etiquetar el producto como descafeinado si el mximo de cafena contenida no supera el 0,12% en el caf tostado de grano o molido. Las marcas utilizadas son: Marcilla descafeinado 100% natural y Carrefour descafeinado 100% natural.
0,45 0,40 0,35 0,30
Porcentaje de cafena presente en los cafs descafeinados de tueste natural segn marca comercial
0,39
% Cafena
0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Marcilla descafeinado natural
0,21
Carrefour descafeinado natural
Muestra
En la representacin grfica, se puede apreciar como la cantidad de cafena presente en estos tipos de caf es insignificante. La proporcin de cafena presente en las muestras analizadas en el laboratorio, presentan desigualdad ya que los valores hallados son de 0,39% y 0,21%. Esta disconformidad puede ser consecuencia del mtodo de extraccin, ya que durante su separacin el procedimiento debe ser muy riguroso debido a que el contenido del principio activo en estos cafs es pauprrimo. Tambin, pude apreciarse como la proporcin encontrada en la espectrofotometra UV-Vis no se asemeja al porcentaje mximo de cafena estimado por la legislacin en estos tipos de cafs. Ambas marcas comerciales superan el lmite permitido.
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Silvia Calle Aznar
Seguidamente, se exponen los valores de tanto por ciento de cafena presente en los cafs descafeinados mezcla, de diferentes marcas comerciales presentes en el mercado. Como se ha comentado anteriormente, el objetivo de la elaboracin de caf descafeinado es mantener su aroma y sabor excluyendo el principio activo. La extraccin se aplica sobre el caf verde, pudiendo seleccionar las proporciones necesarias para su tostado natural y torrefacto, y elaborar la mezcla deseada. Para poder estudiar los niveles de cafena presentes en los cafs descafeinados de mezcla se han utilizado dos cafs diferentes como son: Dia descafeinado mezcla (50% natural y 50% torrefacto) y Dia Expresss descafeinado mezcla (80% natural y 20% torrefacto).
0,80 0,70 0,60
Porcentaje de cafena presente en los cafs descafeinados mezcla segn marca comercial
0,72
% Cafena
0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Dia mezcla 50/50 descafeinado 0,18
Muestra
Dia Express mezcla 80/20 descafeinado
Figura 93. Representacin de la concentracin de cafena de los cafs descafeinados mezcla de marcas comerciales.
Puede observarse que la proporcin de cafena existente en las mezclas de caf descafeinado es discordante y que el nivel de cafena hallado es muy pequeo. Atendiendo a lo comentado anteriormente sobre los cafs descafeinados, la cantidad de cafena extrada en las muestras analizadas, presentan desigualdad con valores de 0,18% y 0,72%, ya que el procedimiento de separacin ha de ser minucioso. Rescatando la discusin expuesta en los cafs mezcla y observando la representacin de los cafs descafeinados mezcla, se puede ver como la concentracin de cafena aumenta a medida que se disminuye la proporcin de caf torrefacto. Pero, es atrevido aceptar esta hiptesis ya que solo se disponen de dos muestras en el anlisis. Finalmente, evaluando los resultados de estas dos marcas comerciales, pude apreciarse como la proporcin examinada en la espectrofotometra UV-Vis es discrepante con el porcentaje mximo de cafena declarado por la legislacin.
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Despus, se presentan los resultados adquiridos en los anlisis efectuados con los cafs solubles de tueste natural de diferentes marcas comerciales existentes en el mercado. El caf instantneo y soluble es caf seco en polvo o granulado, que se puede disolver rpidamente en agua caliente para ser consumido. En este caso el caf tostado se muele para permitir la extraccin de los slidos solubles con agua a altas temperaturas y presin. El caf soluble tiene hoy su mercado y, aunque la calidad es inferior al grano o molido, posee algunas ventajas como son la facilidad de preparacin, que no necesita cafetera, diversidad de usos en repostera, etc. Este tipo de caf contiene cafena siempre en una cantidad superior al 2,5%. En el siguiente diagrama se representan 2 muestras de cafs diferentes, se encuentran Nescaf y Auchan soluble natural.
2,58 2,56 2,54
Porcentaje de cafena presente en los cafs solubles de tueste natural segn marca comercial
2,57
% Cafena
2,52 2,50 2,48 2,46 2,44 Nescaf soluble natural 2,49
Muestra
Auchan soluble natural
Figura 94. Representacin de la concentracin de cafena de los cafs solubles naturales de marcas comerciales.
Estos resultados presentan similitud ya que los valores son bastante aproximados. Se aprecia, que la concentracin de cafena en el caf soluble natural Auchan es ligeramente mayor que el caf soluble de la marca Nescaf. Es posible que algunos de estos cafs comerciales sean mezclas de variedad robusta y arbiga, por lo que este primero podra incrementar su concentracin debido a que posee mayor cantidad. Segn datos bibliogrficos, la variedad robusta es usada por la industria alimentaria en la elaboracin de caf soluble. En consecuencia, el resultado es aceptable, ya que los cafs robusta contienen una cantidad de cafena comprendida entre 2% y 3,5%. Las muestras de caf, contienen 2,49% y 2,57%, que se encuentra en el rango estimado.
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Silvia Calle Aznar
Seguidamente, se exponen los valores de tanto por ciento de cafena presente en los cafs descafeinados solubles, de diferentes marcas comerciales presentes en el mercado. Actualmente, los mtodos de produccin del caf soluble descafeinado permiten conservar el aroma y el sabor con una disminucin considerable del principio activo estimulante, lo que ha hecho que el caf soluble descafeinado se implante en muchos pases del mundo. Segn la normativa espaola, los cafs descafeinados solubles no pueden contener ms un 0,3 por ciento.
0,32 0,31 0,30
Porcentaje de cafena presente en los cafs solubles de tueste natural descafeinados segn marca comercial
0,31
% Cafena
0,29 0,28 0,28 0,27 0,26 Carrefour soluble descafeinado natural Nescaf soluble descafeinado natural
Muestra
Figura 95. Representacin de la concentracin de cafena de los cafs solubles descafeinados naturales de marcas comerciales.
En la representacin grfica, se puede apreciar como la cantidad de cafena hallada en estos tipos de caf es inapreciable. El tanto por ciento de cafena presente en las muestras analizadas en el laboratorio, presentan similitud ya que los valores hallados son de 0,28% y 0,31%. Esta semejanza puede ser consecuencia de la solubilidad del caf en polvo o granulado en el proceso de extraccin, ya que beneficia la separacin de la escasa cafena existente en esos tipos de caf. Tambin, pude apreciarse como la proporcin encontrada en la espectrofotometra UV-Vis se asemeja al porcentaje mximo de cafena estimado por la legislacin en estos tipos de cafs. La marca comercial Nescaf, supera el mximo permitido, pero la desviacin es muy leve.
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A continuacin, se representan los porcentajes de cafena presentes en los diferentes tipos de cafs analizados en el laboratorio, con la idea de elaborar una comparacin sobre la proporcin de este principio activo.
Porcentaje de cafena presente en los diferentes tipos de caf

3,00 2,50 2,00 2,53
% Cafena
1,50 1,00 0,50 0,00
1,28
1,43 1,09 0,45
0,30
0,30
Natural de to stadero
Natural co mercial
M ezcla co mercial
Descafeinado Descafeinado mezcla natural co mercial co mercial
So luble natural co mercial
Muestra
So luble natural descafeinado co mercial
Figura 96. Representacin de la concentracin de cafena de los diferentes tipos de caf
Mediante esta representacin grfica puede observarse como los cafs solubles naturales contienen una proporcin de cafena superior a los dems tipos de caf, ya que como se ha comentado anteriormente, son elaborados con los granos de caf de variedad robusta. En ltimo lugar, tenemos los cafs descafeinados naturales y solubles naturales, con una proporcin de cafena de 0,30 %.
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Silvia Calle Aznar
Segn su pas de origen: Observando los valores hallados en los cafs de marca comercial, en los que resalta su marketing del pas de origen, y los resultados experimentales obtenidos en los cafs de tostadero, se puede determinar una comparativa en cuanto a la concentracin de cafena en cada uno de ellos.
Figura 97. Representacin de la concentracin de cafena segn pas y continente de origen con cafs de tostadero y comerciales
Los cafs estn representados por colores dependiendo del pas y continente del que proceden los cafs ms conocidos. En colores anaranjados se encuentran los del continente africano, en gama de colores verdosos los pases del continente suramericano y en color lila los del continente asitico. En primer lugar, se encuentra el caf de Kenya del tostadero Bon Mercat y el caf Kenya de la marca Senseo. Como se puede ver en el diagrama, con un crculo de color verde, ambos presentan resultados variables, aun tratndose del mismo pas de procedencia. A continuacin, se observan los diferentes tipos de caf analizados en el laboratorio con pas de origen Brasil. Estos valores estn indicados grficamente por un eclipse de color rojo. Estas muestras son: el caf Brasil de tostadero Bon Mercat, el caf Brasil de la marca Senseo y el caf Brasil de la marca Saimaza. El tanto por ciento de cafena presente en estos cafs presentan similitud, ya que los valores hallados son de 1,00%, 0,94% y 0,96%. Finalmente, hay otros 4 tipos de cafs diferentes que coinciden en el pas de procedencia. Se trata del caf de Colombia que est indicado en la representacin grfica rodeado por un smbolo circular de color azul. Entre ellos tenemos muestras de caf de Colombia del tostadero Bon mercat, Carrefour Colombia, Bonka Colombia y Saimaza Colombia. Como puede verse, los valores son bastante equivalentes, a exepcin del caf del tostadero que se diferencia mucho de los otros tres tipos. Los cafs de marca comercial, se encuentran entre un rango de valores comprendico entre 0,97%-0,92%.
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Comparacin de los resultados por HPLC y Espectrofotometra UV Para cuantificar el contenido de cafena presente en las soluciones obtenidas por la extraccin de las muestras de los diferentes tipos de caf se han utilizado dos tcnicas: HPLC y espectrofotometra UV. Seguidamente, se representan los porcentajes de cafena presentes en los diferentes tipos de cafs analizados en el laboratorio, con la idea de elaborar una comparacin sobre la proporcin de este principio activo.
Figura 98. Representacin de la concentracin de cafena en todas las muestras analizadas por HPLC y Espectrofotometra UV
Como se observa en el diagrama de barras, las dos tcnicas utilizadas para cuantificar la cafena de los diversos cafs, presentan resultados bastante concordantes. En las muestras 1, 3, 6, 18, 19 y 20 se observa una ligera diferencia lo que puede ser debido a algn error experimental. Para ver las tablas con todos los resultados ver Anexo 1.
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CAPTULO 7: CONCLUSIONES
En este aparatado de conclusiones del presente proyecto se pretende comprobar que se han conseguido los objetivos marcados al principio de ste. Adems de cualquier otra informacin que se haya considerado interesante de mencionar. Los objetivos marcados al principio del proyecto se han logrado de manera parcial. Es decir, hemos obtenido resultados favorables en las tcnicas estudiadas para intentar establecer una comparacin entre la cafena y las diferentes caractersticas del caf (variedad del caf, el pas de origen, procesado), pero todava quedaran muchos ensayos que realizar y muestras que analizar. Una de las mayores dificultades con la que nos encontramos en este proyecto, es la utilizacin de una metodologa de extraccin eficaz. Durante este proceso puede perderse una cantidad de cafena considerable, por lo que durante su separacin el procedimiento debe ser muy riguroso. Este proyecto nos ha servido para darnos cuenta del enorme trabajo y la cantidad de horas que supone lograr las condiciones necesarias para la puesta a punto de un mtodo. Tambin nos ha permitido el aprendizaje de dos tcnicas analticas que desconocamos. Las soluciones se analizan por cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) y por espectrofotometra UV, hallndose de esta manera la concentracin de cafena presente en cada una de las muestras de caf.
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Silvia Calle Aznar
A continuacin se expondrn una serie de conclusiones que en ningn caso son concluyentes. Ambas tcnicas utilizadas para la cuantificacin de cafena presente en los diferentes cafs analizados en el laboratorio, presentan una gran exactitud. Los resultados son bastante concordantes, excepto en algunos resultados en los que se haya podido producir algn error aleatorio. Tambin se ha podido producir algn error sistemtico que se podra haber producido debido a una mala tcnica extractiva o un error en la inyectada, en los que se podra haber minimizado ese error haciendo ms repeticiones de las muestras, aunque en nuestro caso, debido al gran nmero de muestras y el tiempo limitado, no se pudo realizar. Como se ha podido comprobar, hay una gran similitud de concentracin de cafena presente en los diferentes tipos de cafs analizados en el laboratorio. En ambas tcnicas estudiadas, se ha observado que el caf soluble es el tipo de caf que contiene mayor contenido de cafena. Sin embargo, los cafs descafeinados naturales y solubles naturales contienen una proporcin de cafena inferior a los dems. Estos resultados hallados son bastante evidentes, ya que los cafs solubles estan elaborados en la industria alimentaria con granos de caf de variedad robusta, que contienen una cantidad de cafena comprendida entre 2% y 3,5%. En el caso de los cafs descafeinados, presentan una insignificante cantidad de cafena, ya que como su nombre indica, son cafs elaborados eliminando casi por completo el principio activo. Los cafs de tostadero y comerciales, presentan resultados variables segn el pas y continente del que proceden. Los pases africanos contienen cafs con un nivel de proporcin de cafena mayor que los dems, seguido de los cafs del continente suramericano. Finalmente, observamos como los cafs que proceden del continente asitico son los que contienen una proporcin de cafena inferior a los dems. A continuacin, hemos podido observar como los cafs mezcla (cafeinados y descafeinados) presentan una desigualdad significativa en funcin del mtodo de tueste, ya que a medida que aumenta la proporcin de caf tostado al natural, aumenta tambin la concentracin de cafena. Atendiendo la normativa espaola y europea, as como datos bibliogrficos, encontramos que algunos de los resultados hallados mediante las diferentes tcnicas utilizadas, no se encuentran en el intervalo estimado por la legislacin en funcin del tipo de caf. Principalmente, queremos destacar los cafs descafeinados, ya que en estos tipos de caf hemos encontrado diferencias significativas. Los cafs descafeinados 100% naturales y los mezcla descafeinados superan el 0,12% de porcentaje mximo de cafena declarado por la legislacin. Esto puede ser debido a que a menor concentracin de cafena se produce un mayor porcentaje de error o a un mal proceso de extraccin de la cafena de los cafs. Sin embargo, los valores de cafena obtenidos en los cafs solubles descafeinados no exceden del 0,3% mximo legislado. Finalmente, queremos destacar que estas conclusiones no son determinantes, ya que los resultados dependen, en gran medida, de la exactitud con el que se elabore el proceso de extraccin. Tambin, cabe destacar, que sera necesario analizar ms muestras de caf de los diferentes tipos utilizados para corroborar las conclusiones descritas.
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CAPTULO 8: EVALUACIN ECONMICA
Para asegurar la viabilidad de cualquier proyecto experimental se debe hacer una evaluacin econmica. El coste total del proyecto se ha dividido en cinco partes:
Costes energticos (electricidad y agua) Coste en material y reactivos Amortizaciones Costes personales Coste total
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Silvia Calle Aznar
8.1.
Costes energticos
En este apartado se detalla la parte de electricidad y agua. Se ha estimado el consumo en el laboratorio para calcular los costes aunque el clculo del coste energtico es aproximado. Para calcular el gasto de electricidad se han de tener en cuenta los siguientes conceptos:
Potencia: es el resultado de multiplicar la potencia contratada por la duracin del proyecto, en este caso en meses, y por el precio (kW). Consumo: es el resultado de multiplicar el consumo del periodo por el precio en kWh. Impuesto elctrico: es la suma de la potencia y el consumo multiplicado por el coeficiente establecido por la ley. Conservacin del aparato: es el resultado de multiplicar el precio del alquiler de los equipos por el nmero de meses que cubre la factura.
Para calcular este gasto se ha estimado una potencia de 4,4 kW, teniendo en cuenta que el proyecto dura 4 meses y que se ha trabajado con una dedicacin de 8 horas por da, se obtiene el coste total de electricidad del proyecto. Para calcular el coste total de electricidad se tiene que aplicar un 18% de IVA.
Tabla 13. Gastos de electricidad Importe () 2,7841 18 % IVA 0,5011
Concepto Potencia Consumo Impuesto sobre electricidad Conservacin del aparato
Clculos 4,4 kW/mes x 4meses x 1,581887 /kW 1 kW x 8 h/sesin x 55 sesiones x 0,16 /kWh 33,78 x 1,05113 x 4,864 % 4 meses x 0,27 /mes
Total () 3,2853 27,6907 2,0379 1,2744 34,2883
23,4667 4,2240 1,7271 1,0800 0,3109 0,1944
Total
En la tabla se ha calculado la potencia suponiendo que el laboratorio es utilizado por unos 10 estudiantes y se ha considerado en el consumo que al menos 3 estudiantes a la vez utilizan el laboratorio.
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Para calcular los gastos en agua se ha decidido fijar el consumo en 0,01 L/h de agua de la red, ya que se utiliza para realizar experimentos y para limpiar el material antes y despus de su uso. Se obtiene una estimacin del coste total del agua del proyecto durante estos 4 meses (440h) aplicando un 8% de IVA al consumo de agua.
Tabla 14. Gastos de agua Servicios de agua Consumo Canon Alcantarillado Volumen (L) 35 35 35 Sesiones (das) 55 55 55 Volumen proyecto (L) 1925 1925 1925 Precio unitario (/L) 0,00400 0,00039 0,00014 Importe () 7,7000 0,7508 0,2695 8,7203
Total servicios
En la tabla se ha calculado el consumo de agua estimado de unos 35 litros de agua gastados por sesin, multiplicado por unas 55 sesiones de trabajo. Estos clculos han dado un resultado de 8,7203 que aplicando el correspondiente 8% de IVA da un total de 9,42 .
Tabla 15. Coste total de electricidad y agua Coste electricidad Coste de agua Coste total energtico 9,42 34,29 43,71
El coste total de electricidad y agua es de 43,71 .
8.2.
Costes de material y reactivos
En este apartado se tiene en cuenta todo el material utilizado en el proyecto y todos los productos y reactivos necesarios para la realizacin de los experimentos. En la siguiente tabla se detallan los precios del material de vidrio utilizado:
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Silvia Calle Aznar Tabla 16. Costes de material Precio Material Cubeta espectrofotmetro Cuentagotas Desecador vidrio Embudo alemn Embudo Bchner Embudo decantacin Embudo pesar slidos Equipo de filtracin HPLC Equipo de reflujo Esptulas Filtros de jeringa HPLC Jeringa plstico Jeringa Hamilton HPLC Matraz aforado Matraz aforado Matraz aforado Matraz erlenmeyer Matraz kitasato Matraz redondo fondo plano 25 mL 50 mL 100 mL 100 mL 1000 mL 250 mL 5 mL grande mediano mediano 250 mL Caractersticas Cantidad 1 2 1 1 2 2 2 1 1 2 4 1 1 2 2 2 2 1 2 2 40 2 2 mL 5 mL 10 mL 20 mL 1 mL 1 1 1 1 1 2 100 mL 1 32 150 50 mL 100 mL 500 mL 2 1 1 unitario () 70,23 0,13 83,73 1,66 8,46 18,82 10,71 150,00 11,57 1,45 0,50 0,12 34,22 2,07 2,09 2,37 8,27 12,73 2,10 2,10 0,07 4,29 1,54 1,54 1,76 2,17 1,43 8,35 3,85 0,03 0,01 0,81 0,85 1,37 Total
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Precio material () 70,23 0,26 83,73
16,92 37,64 21,42 150,00 11,57 2,90 2,00 0,12 34,22 4,14 4,18 4,74 16,54 12,73 4,20 4,20 2,80 8,58 1,54 1,54 1,76 2,17 1,43 16,70 3,85 0,96 1,50 1,62 0,85 1,37 530,45
Matraz redondo fondo redondo 250 mL Papel de filtro Pera de goma Pipetas aforadas Pipetas aforadas Pipetas aforadas Pipetas aforadas Pipetas graduadas Soportes Probeta graduada Tubos de ensayo Tubos eppendorf Vaso de precipitados Vaso de precipitados Vaso de precipitados
Hay que sealar que estos gastos son amortizables a unos 4 aos as que el gasto real queda reducido a:
530,45 4 meses = 44,20 4 aos 12 meses
(34)
En la siguiente tabla se detallan los costes de los productos y reactivos utilizados:

Tabla 17. Coste de reactivos Precio unitario () 0,13 1,35 3,00 32,50 1,60 1,92 1,50 22,24 55,00 3,68 59,55 0,69 12,15 3,83 5,22 1,56 Total Precio productos () 67,00 1,35 3,00 65,00 1,60 1,92 1,50 22,24 55,00 3,68 59,55 0,69 12,15 3,83 5,22 1,56 305,28
Producto Agua Mili-Q Acetato de plomo Acetona Acetonitrilo HPLC cido clorhdrico cido ntrico cido sulfrico Cafena anhidra 32 Cafs Carbonato de sodio Cloroformo Cloruro 0,25M de amonio grado
Cantidad 5000 mL 25 mL 250 mL 2,5L x 2 10 mL 20 mL 25 mL 100 g 30 g 150 g 1500 mL 25 g 500 mL 150 g
Isopropanol Sulfato de sodio
Tampn acetato 0,2 M pH5 500 mL Vaselina
El coste total de material y reactivos es de:
Tabla 18. Coste total de material y reactivos Coste de material Coste de reactivos Coste total 44,20 305,28 349,48
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Silvia Calle Aznar
8.3.
Amortizaciones
Se debe tener en cuenta que al utilizar los aparatos en el laboratorio, sufren un desgaste. Hay que considerar este desgaste como parte del coste del proyecto. El mtodo de clculo es el siguiente:
Cuota anual =
Valor amortizable ( ) Tiempo de vida til (ao )
(35)
Se adapta la definicin al mbito del proyecto y se tiene en consideracin que un ao tiene dos cuatrimestres tiles, por lo tanto:
Cuota cuatrimestral =
Valor adquisicin ( ) 2 Tiempo de vida til (ao ) N proyectos
(36)
En la tabla siguiente se muestra el material amortizable para este proyecto:

Tabla 19. Gastos de amortizacin Precio Amortizacin Material Cromatgrafo HPLC Columna Espectrofotmetro Balanza analtica Ultrasonidos Purificador de agua Mili-Q Vitrina extractora Manta calefactora Precio () Aos amortizacin 30.000,00 900,00 11.600,00 950,00 385,71 890,00 1.800,00 314,00 24 10 10 20 10 10 20 10 anual () 1.250,00 90,00 1.160,00 47,00 38,00 89,00 90,00 31,00 Total Precio amortizacin cuatrimestral () 312,00 22,00 290,00 11,00 9,00 22,00 22,00 7,00 695,00
Los costes de amortizacin de los aparatos utilizados en el laboratorio hacen un total de 695,00 .
- 146 -
8.4.
Costes de personal
En este proyecto se han dedicado unas 300 horas de laboratorio y unas 140 de oficina para la teora y la redaccin del proyecto Los costes de personal han sido calculados a partir de la siguiente frmula:
SBA + SS ( Costes personales() = RH
) ao persona horas trabajadas ao
(37)
Donde: RH: recursos humanos asignados al proyecto (hora persona) SBA: salario bruto anual SS: cuota de empresa de la seguridad social, es un 32% sobre el SBA
Costes personales() = 440
12000 + 3840 = 5.280 1320
(38)
Los costes de personal tambin se han calculado como si el proyecto fuera realizado por una empresa. Se ha considerado un total de horas anuales de 1320 y una categora profesional de personal de laboratorio.
Tabla 20. Clculo del SBA + SS Cargo Personal de laboratorio Salario bruto anual (SBA) () SS=32% SBA () SBA + SS () 12.000 3.840 15.840
Tabla 21. Clculo del personal en una empresa Categora Personal laboratorio Horas/ao 1.320 RH (h) 440 SBA + SS() 15.840 Coste total () 5.280
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Silvia Calle Aznar
8.5.
Coste Total
En la siguiente tabla se muestra la suma de todos los costes realizados anteriormente.
Tabla 22. Coste totales del proyecto Costes energticos Costes material y reactivos Amortizaciones Coste de personal Subtotal 10% Imprevistos Total 44 349 695 5.280 6.368 637 7.005
El coste total del proyecto suma 7.005
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CAPTULO 9: SEGURIDAD Y MEDIO AMBIENTE
En el laboratorio estamos sometidos a riesgos constantemente por eso hay que prevenirlos y llevar a cabo las medidas de seguridad en el laboratorio. Referente a la seguridad en el laboratorio:
Se debe utilizar bata, guantes, gafas de seguridad, calzado cerrado y llevar el pelo recogido en el caso de llevarlo largo. Se deben realizar los experimentos en el laboratorio y en el caso de emanar gases se debe utilizar la campana extractora. Hay que llevar cuidado con el agua ya que en contacto con aparatos elctricos puede inutilizarlos en caso de vertido o puede provocar cortocircuitos. Hay que tener el lugar de trabajo limpio y ordenado para evitar riesgos de vertidos y llevar cuidado con el material de vidrio y no influir en su rotura.
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Silvia Calle Aznar
Referente a la seguridad con los productos qumicos:
Antes de usar un producto qumico se debe leer la etiqueta observando el pictograma de peligrosidad, hacer uso de las fichas de seguridad y de las frases R y S. Toda esta informacin est ampliamente detallada en el Anexo 6. En cuanto a los residuos generados al finalizar los experimentos se deben clasificar segn su contenido.
Medio ambiente En el laboratorio se generan residuos lquidos y slidos que se deben separar y clasificar segn sus componentes para despus poder gestionarlos segn su peligrosidad y no contaminar el medio ambiente. La cafena no se degrada as que puede contaminar ros y el mar si llega a travs de los desages.
Figura 99. Soluciones de cafena de caf
Se habilit un bidn donde se contenan los residuos de la extraccin de cafena de caf (caf, cafena, carbonato de sodio, cloroformo) debidamente sealizados con la etiqueta correspondiente.
Figura 100. Bidn de residuos de caf y cloroformo
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Los residuos procedentes de la salida del detector del HPLC (acetonitrilo, agua, metanol) se habilitaron en un bidn etiquetado como mezclas de disolventes no halogenados de HPLC.
Figura 101. Bidn de residuos del HPLC
Los dems productos con los que se ha trabajado deben ser depositados en los bidones del laboratorio para despus ser procesados segn la normativa vigente de gestin de residuos (ver anexo X Gestin de residuos).
Figura 102. Garrafas y bidones de residuos de laboratorio
- 151 -
CAPTULO 10: BIBLIOGRAFA
10.1. Bibliografa de Consulta

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10.2. Pginas web de consulta

www.federacioncafe.com www.nestle.es www.saralee.com www.carrefour.es www.saimaza.es www.mercadona.es www.dia.es www.alcampo.es www.panreac.com www.jpselecta.es www.mt.com www.perkinelmer.com www.agilent.es
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Memòria

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Volumen I

PROYECTO FINAL DE CARRERA

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Barcelona, 12 de Junio de 2011

Tutor proyecto: Eva Mara Carral Maha

8.1. 8.2. 8.3. 8.4. 8.5.

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Figura 1. Planta de caf o cafetos (coffea spp).

Silvia Calle Aznar

Figura 2. Granos de caf verde

Figura 3. Granos de caf tostados

Caractersticas del caf

Silvia Calle Aznar

Pases consumidores de caf

Figura 4. Pases consumidores de caf en kilogramos por persona y ao

Para el consumo hay dos variedades importantes:

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Pases productores de caf arbica y robusta

Silvia Calle Aznar

Tipos de caf segn su Origen

Segn el lugar donde se producen tenemos los siguientes tipos de caf:

Cafs rabes: Caf moka

Cafs africanos: Caf de Tanzania Caf de Kenia Caf de Etiopia

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Pases exportadores e importadores de caf

Figura 6. Pases productores de caf

Figura 7. Pases importadores de caf

Silvia Calle Aznar

2.2. ELABORACIN DEL CAF

Cosecha y preparacin de los granos

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Silvia Calle Aznar

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Tueste del caf

Silvia Calle Aznar

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Silvia Calle Aznar

Tipos de caf segn su procesado

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

CAPTULO 3: LA CAFENA EN EL CAF

3.1. EL PAPEL DE LA CAFENA EN EL CAF

Figura 9. Estructura molecular de la cafena

Silvia Calle Aznar

Figura 10. Estructura molecular de la cafena

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

Vida media y eliminacin de la cafena

Propiedades fisiolgicas de la cafena en el caf

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

CAPTULO 4: MTODOS ANALTICOS PARA LA DETERMINACIN Y CARACTERIZACIN DE LA CAFENA

Silvia Calle Aznar

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

4.1. MTODO CROMATOGRFICO

Silvia Calle Aznar

estacionaria y fase mvil:

2. Segn los estados de las fases implicadas, en especial de la fase mvil:

Determinacin analtica de la cafena en diferentes productos comerciales

3. Si nos centramos en la cromatografa lquida podemos clasificarla, tambin,

segn el mecanismo de interaccin del soluto con la fase estacionaria:

4.1.3. Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC)