ISOLAMENTO DE BACTRIAS TOTAIS DO SOLO CULTIVADO COM CANA-DEACAR NA REGIO DE DOURADOS/MS NA PRESENA DE FIPRONIL Carlos Henrique S.

Milanezi; velyn C. C. Pinheiro; Emlia Maria da Silva3; Rmulo Scorza Junior4; Gisele Jane de Jesus5

UFGD-FCBA, Rodovia Dourados / Itahum, km 12, 79804-970 Dourados-MS, 1 PIVIC; 2 PIVIC; Docente da Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul; 4EMBRAPA-CPAO-Dourados; 5 Prof. Dra. Microbiologia Ambiental Aplicada

RESUMO: O seguinte trabalho teve como objetivo isolar uma parcela das bactrias totais do solo cultivado com cana-de-acar na regio de Dourados/MS na presena de fipronil, podendo-se ento, saber se h influncia do pesticida na microbiota do solo, em especial as bactrias. A populao bacteriana do solo excede a populao de todos os outros grupos de microrganismos. Altamente txico para peixes e invertebrados aquticos, o fipronil moderadamente txico para pequenos mamferos quando ingerido, para microrganismos ainda no foram realizados estudos seguros que comprove a interferncia do pesticida na microbiota do solo. A prtica da aplicao em larga escala desses agentes qumicos (pesticidas), embora aumente o rendimento agrcola, levanta problema referente aos efeitos a curto e longo prazo, devido sua disposio no solo. A pesquisa foi realizada em uma rea experimental cultivada com cana-de-acar, localizada na Embrapa Agropecuria Oeste no municpio de Dourados/MS. Os tratos culturais foram os utilizados na regio obedecendo s boas prticas agrcolas. Foram realizadas trs coletas cada uma com trs amostras para garantir a veracidade das atividades realizadas em laboratrio. Foram utilizadas as diluies de 10-2 a 105

e todas as amostras foram submetidas a estas diluies. Foram inoculados 0,1ml de cada

diluio por placa, seguindo-se espalhamento em superfcie e incubadas em estufa com temperatura pr-determinada, as que apresentarem melhor crescimento microbiano entre 30 e 300 UFC/mL foram escolhidas para avaliao. O meio de cultura para crescimento nutritivo das colnias de bactrias foi o Thorton. Como era de se esperar, maior nmero de bactrias foi constatado nos inculos menos diludos das amostras de solo, contudo, no se constatou proporcionalidade nas contagens. As mdias das triplicatas de placas das coletas mostram que no h uma influncia muito significativa entre o fipronil e as bactrias do solo deste cultivo. Palavras-chave: 1) Microbiologia do Solo 2) Biomassa Bacteriana 3) Fipronil

INTRODUO

Segundo Larpent e Parpent-Gourgaud (1975), o isolamento serve para determinar a espcie bacteriana presente. Do ponto de vista microbiolgico, o solo um ambiente estressante, limitado por nutrientes, mas capaz de sustentar uma populao microbiana extremamente diversa (DOMMERGUES et al., 1978; GOTTSCHAL, 1990). O papel mais importante dos micro-organismos do solo a sua funo de agentes biogeoqumicos na mineralizao do carbono, nitrognio, enxofre, fsforo e outros compostos orgnicos. Este processo essencial para a manuteno da vida neste planeta (PELCZAR et al., 1981). Para Pelczar et al. (1981), a populao bacteriana do solo excede a populao de todos os outros grupos de micro-organismos, tanto em nmero como em variedade, as modificaes na natureza qumica e na complexidade dos materiais nutritivos tero uma influncia seletiva sobre a microbiota do ambiente. As bactrias gram-positivas tm uma parede celular espessa, formada por mltiplas camadas, que consistem principalmente em peptidioglicano. O peptidioglicano essencial para a estrutura, a replicao e a sobrevivncia das clulas em condies normalmente hostis nas quais as bactrias crescem. Sem peptidioglicano, as bactrias morrem por lise, devido grande diferena de presso osmtica entre os dois lados da membrana. A remoo da parede celular produz um protoplasto que sofre lise com facilidade, a menos que esteja osmoticamente estabilizado (MURRAY et al. 2004). As vastas diferenas existentes na composio dos solos, junto com as diferenas em suas caractersticas fsicas e as prticas agrcolas neles aplicadas, resultam diferenas igualmente grandes no tamanho da populao microbiana, assim como nos tipos de microorganismos que constituem essa populao (PELCZAR et al.1981). Segundo Cardoso et al. (1992) os compostos orgnicos sintticos podem desaparecer do solo atravs de vrios processos, a saber: volatilizao, lixiviao e reaes qumicas, de natureza hidroltica ou por fotlise. Em muitas circunstncias, porm, o desaparecimento do agrotxico atribudo atividade microbiana do solo. A degradao microbiana se apresenta como o fator mais decisivo no comportamento e destino dos agrotxicos no solo. Se um composto qumico persistente, de durao temporria, ativado ou desativado, ou se vier a se constituir num problema residual, tudo isso depende muito de seu metabolismo pelos micro-organismos do solo (CARDOSO et al., 1992). A prtica da aplicao em larga escala desses agentes qumicos (pesticidas), embora aumente o rendimento agrcola, levanta problema referente aos efeitos a curto e longo prazo, devido sua disposio no solo. So eles degradados pelos microrganismos do solo? Qual a rapidez dessa degradao? Podem apresentar um efeito temporrio ou permanente sobre a

microbiota do solo? Um composto pesticida ideal deveria ser uma droga capaz de destruir rapidamente a praga, sofrendo decomposio a substncias elementares no txicas. O solo o poo que recebe os pesticidas e da microbiota do solo depende a degradao dessas drogas. (PELCZAR et al., 1981). A cultura de cana-de-acar destaque no cenrio agrcola do Brasil, sendo cultivada em vrios tipos de ambiente e manejo, sem que tenha sido avaliado o impacto decorrente do manejo na microbiota do solo. O estudo dos diferentes cultivares com tratos culturais diferenciados auxiliam a maximizar a explorao da cultura, indicando prticas mais adequadas, de acordo com as propriedades biolgicas do solo (BEZERRA et al., 2008). O inseticida fipronil pertence classe dos fenilpirazis (TINGLE et al., 2004). aplicado no solo em culturas de batata, cana-de-acar e milho, em folhas nas culturas de algodo, arroz, cana-de-acar, milho e soja, em sementes de arroz, cevada, soja e feijo e na gua para irrigao de arroz. Tambm utilizado como preservante de madeira, no controle de pulgas e carrapatos em animais e domesticamente contra baratas e formigas (COUTINHO et al., 2005). Extremamente ativo, o fipronil atua no sistema nervoso central do inseto inibindo o receptor do cido gama aminibutrico (GABA). O sistema receptor-GABA, responsvel pela inibio da atividade neural anormal, previne o estmulo excessivo dos nervos. Quando a funo desse sistema regulador bloqueada pelo fipronil ocorre hiperexcitao neural e conseqentemente a morte do inseto (PAN, 2005; COUTINHO et al., 2005). O fipronil sofre degradao lenta em gua e sedimentos em condies anaerbias, com tempo de meia-vida variando entre 116 e 130 dias. estvel hidrlise em pH moderadamente cido a neutro. Em condies aerbias degrada-se lentamente mediante oxidao, reduo e hidrlise (meio alcalino). Quando exposto a luz, o composto sofre fotodegradao e sua meia-vida de 3,6 horas em gua e 34 dias em solo argiloso. Produz diversos metablitos (produtos da fotodegradao), dentre os quais o fipronildissulfinil que extremamente estvel e mais txico que o composto original (NPTN, 2005; COUTINHO et al., 2005). Altamente txico para peixes e invertebrados aquticos, o fipronil moderadamente txico para pequenos mamferos quando ingerido. Apresenta tendncia para se ligar aos sedimentos e baixa solubilidade em gua que podem reduzir sua toxicidade. Em relao sade humana existem poucos dados, contudo clulas humanas foram usadas em alguns estudos de carcinogenicidade nos quais nenhum efeito adverso foi detectado (PAN, 2005; COUTINHO et al., 2005).

Este trabalho tem como objetivo isolar as comunidades bacterianas do solo cultivado com cana-de-acar acompanhando o impacto que o fipronil provoca na biomassa bacteriana do solo proporcionando entendimento e conhecimento a respeito das comunidades bacterianas encontradas em solo cultivado com cana-de-acar, realidade em destaque no Estado. MATERIAIS E MTODOS rea de coleta do solo original antes da aplicao do fipronil: A pesquisa foi realizada em uma rea experimental de 2500 m2 (50 x 50m), cultivada com cana-de-acar, localizada na Embrapa Agropecuria Oeste no municpio de Dourados/MS (Latitude 22o 16 26 S e Longitude 54o 48 50 W). O plantio da cana-deacar ocorreu em outubro de 2009 utilizando-se a cultivar RB 867515 com espaamento de 1,40 m entre linhas e 18 gemas/m. Os tratos culturais foram os utilizados na regio obedecendo s boas prticas agrcolas. O solo da rea classificado como Latossolo Vermelho disfrrico tpico de textura muito argilosa. Coleta das amostras de solo com cana-de-acar e isolamento da microbiota presente: As amostras de solo coletadas foram colocadas em sacos plsticos estreis e escuros, mantendo-se sob refrigerao e encaminhadas para anlises laboratoriais. A microbiota ativa do solo em forma de unidades formadoras de colnias (UFC/ml) foi avaliada pela tcnica de plaqueamento em superfcie, em triplicata, utilizando meio especfico de crescimento, Thorton. Todos os testes microbianos foram realizados sob condies estreis. Trs sub-parcelas (do quadrante da rea experimental) foram sorteadas para coleta de amostras de solo na profundidade de 0-30 cm. Estas amostras foram utilizadas para determinar a microbiota presente no solo, antes da aplicao do fipronil. Sub-amostras foram misturadas, peneiradas, pesando-se cerca de 10g desta mistura, a qual foi triturada cuidadosamente em um graal esterilizado, juntando-se soluo salina esterilizada at o volume de 50 mL aproximadamente. Esta pasta de solo foi vertida para um erlenmeyer esterilizado, acrescentando-se mais 50 mL de soluo salina, sendo esta suspenso inicial agitada vigorosamente por 5 minutos. Dessa suspenso, foi transferido 1 ml para o tubo de ensaio contendo 9ml de soluo salina e homogeneizada em agitador do tipo vortex. Novamente, foi feita a diluio serial decimal, em salina, at 10-9 (segundo sugesto de NEDER, 1992, adaptado).

Foram inoculados 0,1ml de cada diluio por placa, seguindo-se espalhamento em superfcie e incubadas em estufa com temperatura pr-determinada, as que apresentarem melhor crescimento microbiano entre 30 e 300 UFC foram escolhidas para avaliao. Crescimento das comunidades microbianas em laboratrio: As culturas puras de bactrias foram armazenadas em temperatura controlada em torno de 30oC, pelo perodo de 48h, aps foram submetidas tcnica de Colorao de Gram. RESULTADOS E DISCUSSO A contagem de micro-organismos do solo em placas de Petri mostra apenas uma parte da comunidade real existente neste ambiente. Devido ao fato de haver uma diversidade muito grande de micro-organismos no solo, diferentes procedimentos podem ser utilizados para otimizar o crescimento microbiano e revelar nmero maior de espcies. Porm, quando se trabalha com um nmero grande de amostras e os resultados so exigidos em curto espao de tempo, a tcnica de diluio em placa de Petri torna-se um instrumento de grande utilidade. Portanto, as condies de cultivo, como por exemplo, o meio de cultura, a temperatura e o perodo de incubao devem ser escolhidas com cuidado (SORHEIM et al., 1989). Como era de se esperar, maior nmero de bactrias foi constatado nos inculos menos diludos das amostras de solo, contudo, no se constatou proporcionalidade nas contagens. Dessa forma observou-se nas bactrias totais o efeito da diluio sobre as contagens, variando 34,80 vezes a relao entre o inculo mais diludo e o mais concentrado da primeira coleta, 15,01 vezes a relao entre o inculo mais diludo e o mais concentrado da segunda coleta e variando 9,91 vezes na terceira coleta. Na Tabela 01 esto reunidos os dados de crescimento das bactrias totais da primeira coleta isolados do solo em funo das condies estudadas neste trabalho. Como se observa, as contagens variaram de 188 x 10-2 UFC/mL para a terceira amostra a 0 x 10-5 UFC/mL para a primeira amostra (Figura 1). Pode-se observar que na diluio 10-2 apresentou-se um nmero 6,5 vezes maior de bactrias que na diluio 10-3 que por sua vez apresentou um nmero 3,3 vezes maior que a diluio 10-4 e esta com nmero 1,6 vezes maior que as bactrias totais encontradas na diluio 10-5. Tabela 1: Valores totais das bactrias encontradas na primeira coleta. Amostras I II 10-2 153 181 10-3 23 20 10-4 3 11 10-5 0 7

III Total

188 522

37 80

10 24

8 15

Na Tabela 02 esto reunidos os dados de crescimento das bactrias totais da segunda coleta isolados do solo em funo das condies estudadas neste trabalho. Como se observa, as contagens variaram de 99 x 10-2 UFC/mL para a primeira amostra a 2 x 10-5 UFC/mL para a mesma amostra (Figura 2).
Coleta I
200 180 160 140 120 100 80 60 40
A o tra I ms A o tra II ms A o tra III ms

P e t c l p r T s a i d M

20 0 2 3

Potncia Negativa de 10

Figura 01: Mdia das triplicatas de placas nas diferentes diluies das amostras I, II e III da primeira coleta. Entre a primeira e a segunda coleta notvel a diminuio da variao entre as diluies, pois enquanto que na primeira coleta a variao era de 34,80 vezes nesta segunda coleta a variao de 15,01 vezes entre a mdia de triplicata de placa com maior abundncia e a de menor abundncia. Pode-se observar que na segunda coleta a diluio 10-2 apresentou um nmero 2,52 vezes maior de bactrias que na diluio 10-3 que por sua vez apresentou um nmero 2,14 vezes maior que a diluio 10-4 e esta com nmero 2.76 vezes maior que as bactrias totais encontradas na diluio 10-5, o que demonstra a diferena entre a primeira e a segunda coleta nas variaes de diluies.

Tabela 2: Valores totais das bactrias encontradas na segunda coleta. Amostras I II III Total 10-2 99 81 75 255 10-3 34 28 39 101 10-4 11 19 17 47 10-5 2 4 11 17

Na Tabela 03 esto reunidos os dados de crescimento das bactrias totais da terceira coleta isolados do solo em funo das condies estudadas neste trabalho. Como se observa, as contagens variaram de 87 x 10-2 UFC/mL para a terceira amostra a 7 x 10-5 UFC/mL para a primeira amostra (Figura 3).
Coleta II
120 100 80 60 40 20 0
Am ostra I Am ostra II Am ostra III

P e t c l p r T s a i d M

Potncia Negativa de 10

Figura 02: Mdia das triplicatas de placas nas diferentes diluies das amostras I, II e III da segunda coleta. Observa-se que na terceira coleta a diluio 10-2 apresentou um nmero 1,87 vezes maior de bactrias que na diluio 10-3 e esta por sua vez apresentou um nmero 2,35 vezes maior que a diluio 10-4 que por sua vez apresentou um nmero 2,25 vezes maior que as bactrias totais encontradas na diluio 10-5. Isto corrobora que no h proporcionalidade entre as mdias das triplicatas de placas das amostras das trs coletas no perodo estudado. Tabela 3: Valores totais das bactrias encontradas na terceira coleta. Amostras I II III 10-2 72 79 87 10-3 41 49 37 10-4 18 27 09 10-5 7 9 8

Total

238

127

54

24

A mdia dos valores encontrados em cada amostra nas quatro diluies diferentes na contagem total de bactrias (Figura 4) permite notar a enorme diferena na diluio 10-2 da primeira coleta, que indica que houve um decrscimo muito expressivo entre a primeira e a segunda coleta nesta diluio o que mostra que o fipronil pode estar inibindo o crescimento de bactrias que melhor apareceriam na diluio 10-2, visto que, no foram apresentados valores expressivos entre as diluies das outras coletas.
Coleta III Mdia das Triplicatas de Placas
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 3 4 5 Amos I tra Amos II tra Amos III tra

Potncia Negativa de 10

Figura 03: Mdia das triplicatas de placas nas diferentes diluies das amostras I, II e III da terceira coleta. Em trabalho de Coutinho et al. (2005) sobre pesticidas e seus mecanismos de ao, degradao e toxidez cita o NPIC (Centro Nacional de Informao de Pesticida, 2004) fixa que o fipronil atxico para minhocas, micro-organismos do solo e plantas aqutica. Porm notado na Figura 4 que houve uma queda bastante significativa da primeira para as demais coletas na diluio a 10-2, que como j foi explicado pode ser devido ao fipronil influenciar de forma negativa as bactrias que esto melhor adaptadas a concentraes nutricionais mais relacionadas com as encontradas no meio cultura com a diluio mais concentrada.

Figura 4: Mdia das amostras por coleta nas quatro diluies diferentes, onde 2 esta relacionado com 10-2, 3 com 10-3, 4 com 10-4 e 5 com 10-5.

Fonte: Embrapa CPAO

Figura 5: Mdia diria das temperaturas em C de novembro entre 2009 janeiro de 2010. A influncia do calor muito maior em meios cidos que em meios alcalinos. A consistncia do solo tambm influi na penetrao do agente e as altas concentraes de carboidratos aumentam, em geral, a resistncia trmica dos micro-organismos. Para Pelczar et al. (1981) todos os micro-organismos so dependentes da gua, a maior parte de sua massa constituda pela gua e todas as suas atividades so desenvolvidas em ambiente aquoso. Dessa forma a umidade relativa do ar interfere na densidade de microorganismos no solo. A umidade relativa do ar no ms de novembro de 2009, ms em que

houve a primeira coleta, estava a baixo da umidade dos meses seguintes e a temperatura estava maior, isto poderia explicar a abundncia da primeira coleta em relao as outras na diluio a 10-2, porm a mesma proporcionalidade deveria ser vista nas outras diluies. As Figuras 5 e 6 expresso a mdia das temperaturas e umidade relativa durante os meses de coleta, porm, as alteraes ocorridas entre temperatura e umidade no primeiro ms de coleta esto contidos em valores mdios.

Fonte: Embrapa CPAO

Figura 6: Mdia diria da umidade relativa do ar em porcentagem entre novembro de 2009 janeiro de 2010. CONCLUSES O isolamento das comunidades bacterianas do solo cultivado com cana-de-acar no decorrer da aplicao do pesticida fipronil foi de suma importncia para acompanhar o impacto sobre a biomassa bacteriana provocado pelo pesticida. Este estudo pode mostrar a interferncia que o fipronil provoca no crescimento de colnias de bactrias que melhor se desenvolve em meios nutritivos mais concentrados como na diluio 10-2. Constata-se ainda que de forma cronolgica as coletas obtiveram um decrscimo no proporcional de acordo com as aplicaes do pesticida o que comprova a interferncia do mesmo sobre a biomassa bacteriana. Contudo estudos mais profundos com maior nmero de coletas para anlises seria interessante para acompanhar de fato a linha de degradao dos microrganismos como um todo de acordo com o uso do pesticida fipronil, que hoje muito utilizado no cultivo da canade-acar que realidade no estado de Mato Grosso do Sul e em especial na regio de Dourados, importante setor agroindustrial do centro-oeste brasileiro.

AGRADECIMENTOS A Fundao de Apoio e Desenvolvimento do Ensino, Cincia e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul FUNDECT, pelo apoio financeiro concedido. A Universidade Federal da Grande Dourados, pela concesso de apoio financeiro. A Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, pela parceria realizada nas pesquisas. A Embrapa CPAO/ Dourados por conceder as amostras de solo para anlise. REFERNCIAS BEZERRA, R. G. D.; SANTOS, T. M. C.; ALBUQUERQUE, L. S.; CAMPOS, V. B.; PRAZERES, S. S. Atividade Microbiana em Solo Cultivado Com Cana-de-acar Submetido a Dose de Fsforo. Mossor: Revista Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentvel. V. 3, n. 4, p. 64-68, 2008. CARDOSO, E. J. B. N.; TSAI, S. M.; NEVES, M. C. P. Microbiologia do Solo. Sociedade Brasileira de Cincias do Solo. Campinas, 1992. 360p. COUTINHO, C. F. B.; TANIMOTO, S.T.; GALLI, A.; GARBELLINI, G.S.; TAKAYAMA, M.; AMARAL, R.B. do; MAZO, L.H.; AVACA, L.A.; MACHADO, S.A.S. Pesticidas: Mecanismo de Ao, Degradao e Toxidez. Instituto de Qumica de So Carlos (IQSC), So Carlos-SP, 2005. DOMMERGUES, Y. R.; BELSER, L. W.; SCHMIDT, E. L. Limiting factors for microbial growth and activity in soil. Advances in Microbial Ecology, v. 2, p.49-104, 1978. GOTTSCHAL, J. C. Phenotypic response to environmental changes. FEMS Microbiology and Ecology, v. 74, p.93-102, 1990. LARPENT, J. P.; LARPENT-GOURGAUD, M. Microbiologia Prtica. Edgard Blcher, v. nico. 1975. MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S.; KOBAYASHI, G. S. PFALLER, M. A. Microbiologia Mdica. Guanabara Koogan, v.4, 2004.

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