Electroforesis Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan

una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo). El movimiento de las molculas esta gobernado tambin por dos fuerzas adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado difusin. La energa cintica de las molculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusin. La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren de una manera homognea, de tal manera que, si las molculas son colocadas en un cierto lugar d e solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las molculas empleando un medio que oponga ms resistencia a dicho movimiento. Una forma comn de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migracin electrofortica de las molculas ser ms lenta, pero el ensanchamiento del frente se ver reducido tambin. Espectrofotometra de absorcin atmica La cantidad de energa absorbida por la muestra sera proporcional al nmero de tomos de la muestra y a la capacidad de cada tomo de absorber energa. Se utiliza en el analisis cuantitativo. Hay tres factores que permiten diferenciar la energa de absorcin y la de emisin:1. Sensibilidad del mtodo, mayor en la energa de absorcin. Ley de Bozman , donde Ni es el nmero atmico del excitador, "g" se corresponde con la multiplicidad de estados y E la energa.2. Influencia de la temperatura, es menor en la energa de absorcin. Para una variacin de la temperatura la I de la radiacin emitida vara mucho mientras que la variacin en el nmero de tomos es nula. Las oscilaciones de temperatura no influyen en la exactitud. Fotometra de llama se emplea para determinar el sodio y el calcio en una muestra biolgica, debemos conseguir que ese sodio, en la forma que este en la muestra, pase a estar en forma de tomo de sodio libre

en fase gaseosa. Debe producirse la activacin de ese tomo pasando el electrn de valencia del nivel fundamental a niveles excitados, al volver de ese nivel al fundamental emite energa, se trata de cuantificar la intensidad de la enrga emitida por los electrones al volver a su nivel fundamental Necesitamos: Fuente de radiacin, Monocromador, DetectorLa fuente de radiacin que provoca la activacin de los tomos es una llama. El monocromador ser en aparatos complejos filtros interferenciales y en aparatos sencillos redes de bajo poder de resolucin. Los detectores podrn ser clulas fotovoltaicas o fototubos, pueden medir intensidades relativamente altas. Elisa. El ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro. ELISA Directo. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capa z de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Indirecto.Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavad o para eliminar los anticuerposmarcados que no hayan reaccionado. Adicin de antianticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. Osmometria. La Osmometra de Presin de Vapor es una tcnica til para determinar el peso molecular promedio en nmero de un polmero. El contenido del vdeo se puede dividir en tres partes: En la primera se muestra el fundamento fsico de la tcnica, en la segunda se describen las pa rtes

de que consta el aparato de medida y su funcionamiento, y por ltimo en la tercera se realiza el calibrado del mismo, as como una medida para determinar el peso molecular de un polmero. LA QUIMIOLUMINISCENCIA La luminiscencia es definida como la emisin de luz asociada con la disipacin de energa con una sustancia electrnicamente excitada. Si los electrones de un componente luminiscente son estimulados por una luz en estado normal, estos dan energa en forma de luz cuando ellos regresan al estado. Tipos de luminiscencia. Hay diferentes formas de luminisce ncia, distinguindose por el mecanismo que causa la En fotoluminiscencia tambin conocida como fluorescente la sustancia es estimulada por fotones de luz, la emisin de la luz con un trazador fluorescente es diferente. En bioluminiscencia, una reaccin qumica medida por enzimas es responsable por la excitacin, y esta reaccin est siempre emparentada a organismos vivos. En quimioluminiscencia, la emisin de luz es causada por los productos de una reaccin especfica qumica, en la cual se involucran las siguientes sustancias segn el sistema automatizado que sea utilizado: ster de acridina, perxido -cido, hidrxido de sodio, fosfatasa alcalina. En el caso de esta reaccin el agente quimioluminiscente es el ster de acridina que es oxidado por el perxido -cido y el hidrxido de sodio. AGLUTINACIN

Reaccin inmunoqumica que produce la agregacin de partculas o clulas recubiertas de anticuerpo. La reaccin de la aglutinacin se divide en dos fases, la primera en la que se produce e antgeno-anticuerpo sobre la superficie de la partcula (o clu la) empleada, y la segunda en partculas se agregan y se puede visualizar la aglutinacin. Podra ocurrir que se produjese la pri pero no la segunda, ello se debera a la presencia de anticuerpos incompletos (subaglutina aglutinantes) que podran generar falsos negativos. Ello puede solucionarse modificando las cond reaccin. Las reacciones de aglutinacin pueden ser, adems de cualitativas, semicuantitativas. Lo cual s empleando diluciones seriadas de antisuero, valorndose como resultado la mayor dilucin

PRUEBAS

DE

COOMBS

Permite demostrar la presencia de anticuerpos incompletos mediante el uso de un segundo

anticuerpo, que es una antiglobulina. NEFELOMETRA Cuando un haz de luz choca contra una partcula en suspensin sufre una serie de fenmenos: La DISPERSIN de la luz depende de varios factores, que son: Tamao y peso molecular de las partculas,Longitud de onda de la luz incidente, Distancia del detector a la cubeta, Concentracin de partculas. Todos estos factores se relacionan mediante complejas frmulas matemticas, por la Ley de Rayleigh.DETECCIN DE LUZ DISPERSADA: Se utilizan dos mtodos para detectar la dispersin: NEFELOMETRA: Es la medida de la luz dispersada en ngulos distintos al de incidencia. Lo ms frecuente es que sea entre los 15 19. La medida se realiza en aparatos diseados con el sistema de deteccin situado a ngulos predeterminados. La Cromatografa en Capa Fina. La separacin de mezclas de molculas median te la cromatografa de capa fina se basa en el principio del reparto entre dos fases. En general, una cromatografa se realiza permitiendo que la mezcla de molculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase mvil) que es inmicible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta para "lavar" (elur) a las molculas en la muestra. Debido a que las distintas molculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase mvil "lavar" a los distintos componentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern eludos ms rpido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria. Para ilustrar esto, supongamos que tenemos una serie de vasos de precipitado llenos con agua hasta la mitad. Se aade al primero de los vasos una mezcla de las molculas A y B. A posee una Kr(hexano:agua) de 0.9, en tanto que la Kr de B es 0.1 . A continuacin se aade un volumen de hexano al primer vaso, se agita, se permite la separacin de las fases y se recupera dicho hexano. El hexno recuperado en este primer vaso se aade al segundo y se aade ms hexno limpio al primer vaso. Ambos se ag itan, se dejan separar las fases y se recupera el hexano. El hexano del segundo vaso se pasa al tercero el del primero al segundo y se anade hexano nuevo al primer vaso. Este procedimiento se repite hasta que todos los vasos se llenen con hexano Si juntamos los vasos 1 al 3 por un lado y los vasos 6 al 8 por otro y evaporamos el solvente, habremos separado la substancia A de la B con una mnima prdida (lo que se qued en los vasos 4 y 5). En la cromatografa de capa fina, la fase estacionaria es una delgad a capa de un soporte slido granulado, tal como gel de slica, alumina, cido silsico u otros, que se depositan sobre una placa de vidrio, aluminio u otro soporte inerte. Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de fase estacionaria se aglutin a con una pequea cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante. Las muestras se aplican

aadiendo pequeas gotas de solucin en un pequeo circulo cerca del extremo inferior de la placa. La gota se deja secar y si se desea poner ms muestra se pueden aplicar ms gotas, cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande. La placa seca se sumerge en un pequeo volumen de fase mvil (mezcla de solventes). La polaridad de la mezcla de solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se d esea separar. En cromatografa de capa fina la fase estacionaria est hidratada, por lo que se le considera como la fase polar. Como slo la base de la placa queda sumergida, el solvente comienza a mojar la fase estacionaria y asciende por capilaridad. Al recorrer la placa la fase movil v arrastrando a las substacias apolares y aquellas ms polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separacin. La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tia a las substancias de inters. La movilidad relativa o R f es la relacin entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto, dividida por la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la placa del solvente. En un sistema de TLC bien caracterizad o, las substancias pueden identificarse comparando los valores de R f con los de estndares, que se han analizado previamente o durante la chomatografa. Si se desea, las substancias pueden recuperarse raspando la slica de la placa del lugar en el que se detect la mancha. Para ello, es necesrio emplear mtodos de revelado que no destruyan a la muestra. Hemoclasificacin: a membrana de los eritrocitos contiene ms de 300 determinantes antignicos distintos, cuya estructura molecular est determinada por gran nmero de genes. Se habla de grupo sanguneo al referirse a cualquier sistema bien definido de antgenos eritrocit arios controlados por un locus que tiene un nmero variable de genes allicos, como lo son A, B y O en el sistema ABO. El tipo de sangre se refiere al fenotipo antignico, que es la expresin serolgica de los genes del grupo sanguneo heredado. Es posible tener aloanticuerpos: en forma natural (es decir en ausencia de estmulo conocido de eritrocitos extraos), en respuesta a la transfusin teraputica o durante el embarazo. Es posible tambin clasificar individuos segn su tipo de sangre, haciendo reacci onar sus glbulos rojos con antisueros especficos, para los determinantes antignicos de su superficie. Los glbulos rojos pueden ser clasificados segn los antgenos en A, B, O, Rh (D)La hemoclasificacin de rutina solamente verifica los sistemas ABO y Rh, dado que son los que en clnica pueden causar mayor problema, en lo que se refiere a reacciones transfusionales. El sistema antignico ABO permite diferenciar cuatro grupos distintos de sangre: El A, el B, el AB y el O, de acuerdo con el tipo de antg eno presente en la membrana celular. Los antgenos responsables de estos grupos son oligosacridos que se encuentran no slo en los eritrocitos humanos, sino tambin en algunas bacterias entricas y en algunos alimentos vegetales. La produccin de estos antgenos est controlada genticamente por un locus con tres alelos, localizado en el brazo largo del cromosoma 9. El sistema Rh cuyo locus se localiza en el cromosoma

1, tiene un juego de tres determinantes antagnicos; C o c, E o e, y D o d. El antgeno D es el ms inmungeno de este sistema de grupos sanguneos. Cerca del 15% de la poblacin carece del antgeno D, por tanto son Rh negativos. Hay aloanticuerpos en forma natural para el sistema ABO, mientras que es ne cesaria la sensibilizacin para desarrollar anticuerpos contra Rh en este sistema. Cromatografa de gases. Es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica . La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inert e.