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A Tecnologia do DNA Recombinante e suas Mltiplas Aplicaes

Francisco George Rodrigues de Andrade[1] INTRODUO Desde a elucidao da complexa estrutura da molcula de DNA, em 1953, segundo modelo proposto por Francis Crick e James Watson, a Cincia nunca mais foi a mesma. Mais tarde, em 1958, Crick relaciona o DNA, o RNA e as protenas, salientando o fluxo unidirecional da informao, do DNA protena. Apesar destas descobertas e dos avanos obtidos, de acordo com Nascimento et al (2003) at o incio da dcada de 70 o material gentico dos organismos era o componente qumico mais difcil de ser analisado, quando ento comearam a surgir as primeiras tcnicas de isolamento e purificao de genes especficos, atravs do processo de clonagem gnica. Muitas dessas tcnicas eram provenientes da Microbiologia, Bioqumica, Imunologia e Gentica Microbiana e permitiram que a molcula de DNA ganhasse um novo enfoque. A partir da tornaram o DNA mais fcil de ser analisado, possibilitando o isolamento de regies especficas da molcula, obt-las em grandes quantidades e determinar a sua seqncia numa velocidade de milhares de nucleotdeos por dia (NASCIMENTO et al, 2003; PIERCE, 2004). Em conjunto, estas descobertas foram decisivas e de fundamental importncia para o surgimento de uma nova rea de pesquisa dentro do campo da Biologia: a Tecnologia do DNA Recombinante. Segundo Pierce (2004), a Tecnologia do DNA Recombinante, tambm chamada engenharia gentica ou simplesmente biotecnologia, um conjunto de tcnicas para localizar, isolar, alterar e estudar segmentos de DNA. O termo recombinante devido freqentemente tais tcnicas serem usadas para combinar o material gentico de fontes distintas, tornando-o bem sugestivo. Atualmente, so em grande nmero os objetivos prticos da pesquisa biotecnolgica, desde a satisfao da curiosidade humana sobre a origem da vida ate ao controle e eliminao de doenas humanas, de outros animais e de plantas, enfim, melhoria da qualidade de vida. Mesmo desconhecidos, ainda, os limites da aplicao prtica da engenharia gentica, sem dvida agora dispomos de tecnologias para soluo de problemas de natureza variada (CANDEIAS, 1991), as quais sero aqui discutidas e analisadas, sob a tica de autores que so autoridades no assunto. O DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE Em ltima anlise, a Tecnologia do DNA Recombinante consiste na tcnica de reunio de DNAs derivados de fontes biologicamente diferentes. De acordo com BURNS & BOTTINO (1991), o processo geral baseia-se em trs enfoques experimentais principais: 1.Produo de fragmentos de DNA de fontes diferentes que contenham as seqncias gnicas de interesse; 2.Reunio desses segmentos em uma molcula de DNA capaz de se replicar, normalmente um plasmdeo bacteriano chamado vetor; 3.Transformao de clulas bacterianas com a molcula recombinante de modo que elas se repliquem e ento se expressem. O desenvolvimento desta nova tecnologia s foi possvel pela descoberta, no final dos anos 1960, das enzimas ou endonucleases de restrio. Este tipo de enzima atua como uma espcie

de "tesoura biolgica" que, aps reconhecer determinada seqncia nucleotdica, faz corte bifilamentar na ligao acar-fosfato da molcula de DNA, produzindo fragmentos. Elas so produzidas naturalmente por bactrias como forma de defesa contra infeco viral, onde clivam em diversos fragmentos o material gentico dos vrus, impedindo sua reproduo na clula bacteriana. Em contrapartida, a bactria protege seu prprio DNA dessa degradao, modificando sua seqncia de reconhecimento pela adio de grupos metila, fenmeno conhecido como metilao (PIERCE, 1994). Interessante notar que cada bactria tem suas prprias enzimas de restrio e cada enzima reconhece apenas um tipo de seqncia, independente da fonte de DNA. As enzimas de restrio so de vrios tipos, dependendo da sua estrutura, da sua atividade e de seus stios de reconhecimento e clivagem. Para a Tecnologia do DNA Recombinante as mais importantes e mais usadas so as do Tipo II. Segundo Nascimento et al (2003), atualmente mais de 1000 enzimas de restrio diferentes j identificadas e isoladas de bactrias. A nomenclatura baseada na abreviao do nome do microorganismo de onde a enzima foi isolada. A primeira letra refere-se ao gnero e as outras duas espcie, seguido deum algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrio EcoRI purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de resistncia RI. Burns & Bottino (1991) afirmam que o stio de reconhecimento das enzimas de restrio do Tipo II normalmente uma seqncia palindrmica, ou seja, apresenta a mesma leitura nos dois filamentos, mas em direes opostas. Assim se a seqncia em um filamento GAATTC lida no sentido 5'3', a seqncia no sentido oposto CTTAAG lida no sentido 3' 5', mas quando ambos os filamentos so lidos no sentido 5' 3' a seqncia a mesma. Portanto, segundo eles, o palndromo apresenta-se da seguinte forma: 5' G A A T T C 3' 3' C T T A A G 5' Estas enzimas reconhecem seqncias especficas de 4 a 8 pares de bases (pb) na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. Os cortes podem ocorrer no eixo de simetria da seqncia especfica, gerando extremidades abruptas (no-desencontrada), ou fora do eixo de simetria, mas simetricamente, gerando extremidades coesivas (desencontradas, complementares). De acordo com Burns & Bottino (1991), estas ltimas so as de maior importncia para a tcnica do DNA recombinante, conforme a seguinte ilustrao: Pierce (2004) resume a relevncia das enzimas de restrio para a Tecnologia do DNA Recombinante da seguinte forma: As enzimas de restrio so as operrias da Tecnologia do DNA Recombinante e so usadas sempre que os fragmentos de DNA devem ser cortados ou unidos. Em uma reao tpica de restrio, uma soluo concentrada de DNA purificado colocada em um pequeno tubo com uma soluo tampo e uma pequena quantidade de enzima de restrio. A mistura da reao ento aquecida na temperatura tima para a enzima, geralmente 37 C. Dentro de algumas horas, a enzima corta todos os stios de restrio no DNA, produzindo um conjunto de fragmentos de DNA (PIERCE, 2004, p. 493). A famlia de fragmentos gerados pela digesto com enzima geralmente detectada pela separao destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram no gel em funo de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente. Depois disso, as bandas de DNA obtidas so visualizadas atravs da tcnica de corao com brometo de etdio, um tipo de corante que fluoresce em laranja brilhante quando iluminada com luz ultravioleta (NASCIMENTO et al, 2003; PIERCE, 2004). CONSTRUO DO DNA RECOMBINANTE

Segundo Burns & Bottino(1991), para construir uma molcula hbrida de DNA, os fragmentos obtidos a partir do tratamento de DNA de determinada fonte com enzimas de restrio so unidos a uma molcula capaz se reproduzir quando introduzida em clula bacteriana, geralmente um plasmdeo bacteriano. Os plasmdeos so facilmente isolados em grandes propores de bactrias e geralmente apresentam poucos e limitados stios de restrio. Note-se que as duas molculas de DNA so submetidas ao da mesma enzima, que produz pontas abruptas (desencontradas) em ambas. Assim um plasmdeo cortado com uma enzima de restrio pode unir-se a um fragmento de DNA exgeno (de fora) produzido por esta mesma enzima que, depois de ligados definitivamente por uma DNA-ligase, resultam numa molcula de DNA recombinante. (fig. 01). Este plasmdeo portador de um trecho de DNA estranho chamado vetor. Fagos vetores, que tambm usados da mesma maneira, tm a vantagem de poderem carregar fragmentos grandes de DNA exgeno. Fig. 01 Construo de um plasmdeo recombinante entre um plasmdeo bacteriano e o DNA genmico de outro organismo[2] O plasmdeo (ou fago) recombinante introduzido em uma bactria, de modo semelhante ao que ocorre na transformao. Burns & Bottino (1991) afirmam que, uma vez dentro da clula bacteriana, o plamdeo se replica e o nmero cresce. J que no procedimento so usados como vetores apenas plasmdeos que portam um ou mais genes marcadores de resistncia a antibiticos, quando cultivadas em um meio contendo antibitico, apenas as bactrias transformadas com o plasmdeo vetor recombinante sobrevivem e crescem. Cada molcula hbrida resulta em uma populao de bactrias com o mesmo fragmento de DNA exgeno presente em todas elas. Assim o fragmento de DNA exgeno de interesse foi clonado em vrias cpias, cada cpia dentro de cada bactria da cultura obtida. O processo com todas as suas etapas chamado clonagem molecular. Para Burns & Bottino (1991), uma das mais importantes aplicaes da clonagem molecular a possibilidade de se ter fragmentos de DNA de todo o genoma de um organismo clonado em plasmdeos, o que constitui a chamada livraria gnica. Ela representa uma coleo de plasmdeos contendo fragmentos que suficiente grande para garantir que todo o DNA genmico seja produzido pelo menos uma vez (fig. 02). Depois das sucessivas reprodues das bactrias transformadas com os plasmdeos, os clones desses plasmdeos so ento mantidos na populao bacteriana. Algumas tcnicas podem ser utilizadas para sondar a livraria para linhagens especficas de bactria contendo um fragmento com determinada seqncia de interesse. Uma delas o isolamento de mRNA transcrito de um tecido que esteja produzindo grande quantidades da protena cujo gene est sendo procurado. Esse RNA marcado radioativamente e, por capilaridade de Southern, colocado para reagir com vrios clones da livraria, em que se hibridiza apenas com os clones que possuem seqncias complementares de DNA. Fig. 02 Procedimento de clonagem "shotgem" e criao de uma livraria gnica[3]. Outra maneira de identificar clones que portam genes especficos atravs da clonagem com cDNA. O mRNA transcrito do gene em questo pode ser isolado e feita uma cpia de DNA desse RNA com transcriptase reversa. O DNA cpia, ou simplesmente cDNA, pode ser inserido em um plasmdeo e clonado em uma bactria. O cDNA clonado ento usado como sonda para identificar clones da livraria portadores desse gene especfico. Por meio dessas e outras tcnicas hoje possvel isolar e clonar qualquer gene cujo produto protico seja conhecido (BURNS e BOTTINO, 1991). A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE E SEU VASTO CAMPO DE APLICAO Nas ltimas dcadas, a Tecnologia do DNA Recombinante tem sido aplicada em diversas reas, em todas elas somando grandes benefcios. Segundo Pierce (2004), alm de dar valiosas informaes sobre os genes, sua estrutura, natureza e funo, tem sido utilizada para

produo de substncias teis (farmacuticas ou no), cultivo de bactrias especializadas e melhoramento gentico artificial de plantas e animais importantes sob ponto de vista econmico. Sua aplicao tambm se estende rea mdica, onde pode ser usada at mesmo para corrigir ates mesmo defeitos genticos humanos. Uma das grandes novidades do uso da tecnologia a sua utilizao na percia forense, onde tem sido um instrumento de investigao criminal e para identificao de restos humanos. Vejamos de forma mais detalhada sua efetiva aplicabilidade nas principais reas consideradas de maior interesse humano (e comercial) no momento. Farmacologia A Tecnologia do DNA Recombinante tem grande aplicao na fabricao de produtos farmacuticos. Desde sua descoberta, j foram desenvolvidas diversas alternativas melhores e mais eficazes para o tratamento de doenas e distrbios humanos. Um delas a produo de insulina humana em escala comercial a partir de bactrias transformadas por plasmdeos portadores do gene humano codificador da referida protena. Antes disso a insulina usada no tratamento de diabticos era isolada do pncreas de animais utilizados na pecuria de corte, mas no funcionava em todas as pessoas, pois algumas delas apresentavam incompatibilidade com a protena exgena. Outros frmacos que tambm so produzidos incluem o hormnio de crescimento humano (para crianas com problemas de crescimento), fatores de coagulao (para hemoflicos), ativador de plaminognio (usado para dissolver cogulos sanguneos em pacientes com ataques cardacos).e atualmente esto sendo testadas drogas oligonucleotdicas para o tratamento de AIDS e cncer (PIERCE, 2004; BURNS e BOTTINO,1991) Bactrias Especializadas Conforme Burns & Bottino (1991), uma das primeiras das tcnicas do DNA Recombinante foi provavelmente a combinao de vrios genes para metabolizar petrleo em um nico plasmdeo e introduzi-lo em bactria marinha, tornando este organismo capaz de limpar mancha de petrleo nos oceanos. Alm disso, muitas bactrias podem ser modificadas por meio da engenharia gentica de maneira que funcionem mais eficientemente em diversos processos industriais nos desempenham papel importante tais como a produo de etanol a partir de material vegetal, lixvia de minrios, tratamento de esgotos e detritos, dentre outros (PIERCE, 1994). Setor Produtivo Agropecurio A engenharia gentica tem sido utilizada no desenvolvimento de plantas e animais de grande valor comercial com caractersticas especiais. Sabendo que plantas infectadas com linhagens atenuadas de vrus so resistentes a infeces virulentas, os geneticistas, com base nesse conhecimento, j conseguiram criar resistncia viral em plantas transferindo genes de protenas virais para clulas vegetais. Como exemplo, um abbora geneticamente modificada, chamada Freedom II, possui genes do mosaico 2 de melancia e o vrus do mosaico zucchini yellow que protege a abbora de infeces virais. Outra conquista da biotecnologia foi a possibilidade de manipular geneticamente a resistncia a pestes em plantas para reduzir a dependncia de pesticidas qumicos. O gene codificador da toxina capaz de matar larvas de certas pragas de insetos foi isolado da bactria Bacillus thuringiensis e transferido para o milho, tomate, batata e plantaes de algodo. Assim, quando o gene expresso produz a toxina inseticida, as larvas comem a planta morrem. Mas outro problema freqente na agricultura o controle de ervas daninhas que competem com a planta do cultivo por gua, luz solar e nutrientes. Em reas de cultivo, os herbicidas so efetivos para matar as ervas, porm eles tambm podem danificar os cultivos das plantas

juntamente com elas. Uma soluo aplicvel atravs da engenharia gentica tem sido o desenvolvimento de resistncia das plantas aos herbicidas. Genes que conferem resistncia a herbicidas de amplo espectro foram transferidos para tomates, soja, algodo, semente oleaginosas e outros cultivos comercialmente importantes. Quando os campos contendo tais cultivos so pulverizados com herbicidas, as ervas daninhas morrem, mas as plantas geneticamente modificadas no. Como se pode ver, o uso de cultivos geneticamente modificados apresenta vrios benefcios potenciais. Alm de aumentar a resistncia a pestes, eles tm o potencial de reduzir o uso de substncias prejudiciais ao meio ambiente e aumentar a produtividade, dando mais alimentos por hectare, o que reduz a quantidade de terra utilizada na agricultura. No setor pecurio, as tcnicas do DNA Recombinante tm sido utilizadas no melhoramento gentico de animais para que produzam mais leite, para que desenvolvam maior massa corporal para produo de carne, ou mesmo para produo de carne com menos colesterol. Como exemplo, o gene para o hormnio de crescimento foi isolado de gado e clonado em Escherichia coli. Estas bactrias produzem grandes quantidades de hormnio do crescimento bovino, que administrado ao gado leiteiro para aumentar a produo de leite. Alm disso, outros animais geneticamente modificados esto sendo desenvolvidos para levar genes codificadores de produtos farmacuticos. Como exemplo, ovelhas transgnicas portadoras do gene humano que codifica o fator VIII de coagulao sangnea produzem leite esta protena que pode ser usado no tratamento de hemoflicos (PIERCE, 2004). Terapia Gnica Terapia gnica a transferncia direta de genes em humanos para tratar uma doena, constituindo uma das aplicaes mais recentes da tcnica do DNA recombinante. Ela tornou-se uma realidade em 1990 quando W. Freench Anderson e seus colegas no U.S. National Institutes of Health (NIH) transferiram um gene funcional de adenosina desaminase para uma jovem com doena de imunodeficincia combinada grave, uma condio autossmica recessiva que produz prejuzo da funo imunolgica. Atualmente milhares de pacientes j receberam terapia gnica, enquanto muitas tentativas clnicas esto em curso. A terapia gnica est sendo usada para tratar doenas genticas, cncer, doena cardaca e mesmo algumas doenas infecciosas tais como a AIDS. Todas essas tentativas dependem da habilidade de um gene introduzido produzir uma protena teraputica. Diferentes mtodos para transferir genes para clulas humanas esto atualmente em desenvolvimento. Os vetores geralmente usados so os retrovrus geneticamente modificados, os adenovrus e os vrus adenoassociados, todos eles com suas vantagens e desvantagens. Um mtodo de transferncia gnica remover clulas (tais como glbulos brancos) do corpo de uma paciente, adicionar vrus contendo genes recombinantes e ento reintroduzir as clulas de volta ao corpo do paciente. Em outros casos, os vetores so infetados diretamente no corpo. A terapia gnica feita hoje em dia trabalha apenas com clulas no-reprodutivas, as clulas somticas. A correo de defeitos genticas nessas clulas (terapia gnica somtica) proporciona resultados positivos aos pacientes, porm no afeta os genes das geraes futuras. A terapia gnica que altera clulas reprodutivas (terapia gnica reprodutiva da linhagem germinativa) tecnicamente possvel, mas levante vrias questes ticas significativas, uma vez que tem a propriedade de alterar o conjunto gnico das geraes futuras (PIERCE, 2004). Mapeamento Gnico Os recentes avanos das tcnicas de biologia molecular resultaram na capacidade de se determinar a presena de genes responsveis por vrios distrbios humanos, habilidade essa conhecida como mapeamento gnico. O processo consiste na sondagem por meio de

marcadores genticos (seqncias de DNA radioativamente marcadas) que procuram em todo o genoma de uma clula uma seqncia alvo especfica. Esta seqncia um trecho de DNA imediatamente adjacente ao gene da doena em questo. Ao se ligar seqncia alvo, o marcador utilizado pode ser localizado pela sua marcao radioativa. Caso a seqncia alvo seja sempre herdada pelas vtimas da doena, ento o gene defeituoso deve estar prximo dela. Um grupo de marcadores usado em mapeamento gnico so os polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrio (RFLP), em que a essncia do enfoque a mesma que a usada no Fingerprinting de DNA, que ser discutida logo adiante (PIERCE, 2004; BURNS e BOTTINO,1991). Fingerprinting de DNA O fingerprinting de DNA consiste no uso de DNA para identificar uma pessoa, sendo um poderoso instrumento para testes de paternidade, investigaes criminais e outras aplicaes forenses. Seu funcionamento reside no desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante e permite um exame da seqncia nica de DNA de um indivduo. Numa aplicao tpica, o fingerprinting de DNA pode ser usado para confirmar se um suspeito esteve presente na cena de um crime objeto de investigao. A tcnica funciona da seguinte forma: uma amostra de DNA do sangue, smen, cabelo ou outro tecido corpreo coletada do local do crime. Se a amostra for muito pequena, pode ser usada a PCR (reao em cadeia da polimerase) para amplific-la, de modo a ter DNA suficiente para o teste. Amostras adicionais de DNA so coletadas de um ou mais suspeitos. Cada amostra cortada com uma ou mais enzimas e os fragmentos resultantes so separados por eletroforese em gel. Os fragmentos do gel so desnaturados e transferidos para o papel de nitrocelulose pela transferncia de Southern. Uma ou mais sondas radioativas so hibridizadas com a nitrocelulose e detectadas por auto-radiografia. O padro das bandas produzidas pelo DNA da amostra coletada no local do crime comparado com os padres produzidos com o DNA dos suspeitos (PIERCE, 2004). Para determinao da paternidade, so comparados os fingerprintings da me, da criana e do suposto pai. Neste caso, metade das bandas da criana veio da me e a outra metade do pai. Todas as bandas de origem paterna no fingerprinting do DNA da criana devem se ajustar ao do suposto pai para que a identificao de paternidade seja positiva (BURNS e BOTTINO, 1991). A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE, SUAS IMPLICAES TICAS E SEUS POSSVEIS IMPACTOS NA NATUREZA. Apesar dos grandes avanos obtidos e dos inmeros benefcios proporcionados, alguns obstculos ainda precisam ser superados com a aplicao da tecnologia do DNA Recombinante em algumas reas, tanto em experimentos que envolvem questes ticas, como em relao falta de estudos conclusivos sobre os possveis impactos negativos que possam causar ao homem e natureza. Uma implicao tica envolvendo o uso da biotecnologia em relao aos testes genticos para triagem de doenas para as quais ainda no existe cura ou tratamento, como o mal de Huntington, que um distrbio autossmico dominante que aparece na meia-idade, causando progressiva deteriorao fsica e mental e depois a morte. Testes deste tipo podero ser indevidamente utilizados para triagem de empregados quanto a distrbios genticos que possam apresentar e assim os empregadores podem no querer empregar ou promover algum que possa desenvolver uma doena gentica debilitante em um futuro prximo. Alm do mais, ao saber que possui doenas desta natureza, muitas pessoas cometeram suicdio e outras tiveram que ser internadas por depresso.

A engenharia gentica de produtos agrcolas bastante controversa e j causou intensos debates nos governos de diversos pases a respeito da liberao do cultivo dos to falados transgnicos. Uma preocupao que pode haver escape gnico de plantas geneticamente modificadas e conseqente contaminao de plantas nativas, o que acarretar em desequilbrio ecolgico, mas a extenso e o efeito dessa transferncia ainda so incertos. Como exemplo, teme-se que a resistncia a herbicidas construda em cultivospossa ser transferida para ervas daninhas, que por sua vez desenvolveriam resistncia aos herbicidas hoje utilizados para seu controle. Outra preocupao abrange questes de sade pblica associadas presena de produtos transgnicos em alimentos naturais, pois no se sabe quais so as conseqncias ao organismo humano que possam ocorrer a longo prazo. Alguns crticos defendem a rotulao de todos os alimentos geneticamente modificados que contenham DNA ou protenas transgnicos. Tal rotulao j exigida em pases da Unio Europia, mas no nos Estados Unidos (PIERCE, 2004; BURNS e BOTTINO,1991). CONSIDERAES FINAIS Como visto, a Tecnologia do DNA Recombinante tem proporcionado grandes benefcios, desde sua aplicao na agricultura sua utilizao em investigao forense. um conhecimento ainda em construo. Embora j estejamos experimentando muitos desses benefcios, existe ainda um longo caminho a ser percorrido e muitos obstculos a serem superados. So necessrios estudos que estabeleam os possveis riscos que o uso dessa tecnologia no setor agropecurio, possa causar, a longo prazo, ao meio ambiente, natureza e ao prprio homem. Mas vista sob o enfoque otimista, ela pode ser utilizadas para fins nobres, como melhorar a qualidade de vida das pessoas. O aumento da expectativa de vida atravs do tratamento mais barato e acessvel de diabticos um exemplo disso. A fascinante abrangncia do uso desta tecnologia tem mudado a histria da Cincia nos ltimos 50 anos. A realizao do projeto genoma e as tcnicas de mapeamento gentico so reflexos dessa grandiosidade. Com o progressivo desenvolvimento cientfico nesta rea h a esperana de que se resolvam muitos dos problemas enfrentados pela humanidade atualmente como a erradicao da fome no planeta, atravs de melhores e mais eficazes tcnicas de cultivos (transgnicos), e o tratamento de doenas que hoje so incurveis, com a terapia gnica.

Fonte: http://www.webartigos.com/articles/10701/1/A-Tecnologia-do-DNA-Recombinante-eSuas-Multiplas-Aplicacoes/pagina1.html#ixzz1C8rHJ5hQ