Instituto de Biotecnologa

Universidad Nacional Autnoma de Mxico

MAESTRA EN CIENCIAS BIOQUMICAS

Curso: MTODOS DE LABORATORIO

Tema: ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN.

Elaboran:

Ivn Arenas Sosa Jos Luis Lpez Snchez

Cuernavaca, Mor. Junio de 2004.

ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN. INTRODUCCION. El color de las cosas se mantiene cuando hay oscuridad total? El color es dependiente de una fuente externa de energa luminosa? Qu hace verde al vidrio verde? Por qu el agua es incolora? Cmo se obtiene el color de los juegos pirotcnicos? Estas y otras cuestiones que involucran la interaccin de la luz y la materia han ocupado las mentes de grandes cientficos como Max Planck, J. J. Balmer, Albert Einstein, entre otros y continan estudindose actualmente de manera exhaustiva. El estudio de la interaccin de la luz y la materia ha llevado al estudio de las configuraciones electrnicas y la qumica cuntica, temas que no sern tratados en este trabajo. Desde nuestras primeras etapas como estudiantes, se nos ha enseado que los tomos emiten radiacin electromagntica cuando son sometidos a la radiacin; se llevan a cabo transiciones electrnicas de estados energticos de baja energa a estados energticos de alta energa y viceversa. La demostracin ms simple se lleva a cabo cuando se somete a los elementos y compuestos a la flama, observndose un color que es caracterstico del tomo metlico presente en el compuesto. A este fenmeno se le conoce como espectroscopa de emisin. Si observamos una disolucin acuosa de Cu2+ a trasluz percibimos un color azulado. Esta coloracin se debe a la interaccin de los iones cobre con la radiacin lumnica que atraviesa la disolucin. Ms concretamente, se debe a la absorcin de algunas radiaciones lumnicas que corresponden al color complementario (en este caso el amarillo). Las radiaciones no absorbidas son las que atraviesan la disolucin sin obstculo alguno y llegan a nuestro ojo. En nuestro ejemplo, estas radiaciones transmitidas corresponden al color azul. Una solucin roja absorbe la luz verde y transmite o refleja la luz roja. En ausencia de luz, las sustancias no tienen color. Siguiendo con el ejemplo de la solucin de cobre, si comparamos el color de dos disoluciones de Cu2+ con diferente concentracin, observamos que a mayor concentracin corresponde una mayor intensidad de color azul de la disolucin. Por lo tanto podemos saber la concentracin de la sustancia segn la intensidad del color. Esta propiedad de la interaccin de la luz con una gran cantidad de especies qumicas nos permitir identificar y cuantificar analitos, dando lugar a una rama de la qumica analtica denominada espectrofotometra. La espectrofotometra estudia los fenmenos de interaccin de la luz con la materia. En general, cuando una lmpara ilumina cualquier objeto, pueden suceder algunos fenmenos: La luz puede ser emitida, reflejada, transmitida o absorbida. Desde que sabemos que la energa no puede ser destruida, la cantidad total de luz debe ser igual al 100%; por lo tanto, cuando un objeto es iluminado, se puede medir cunta radiacin ha sido reflejada o transmitida y podemos decir entonces cunta fue absorbida, cul es la cantidad que ha interactuado con el objeto. La espectroscopa de absorcin, est relacionada con el hecho de que una sustancia absorbe la luz, provocando que los electrones salten de un nivel de energa a otro mayor;

este fenmeno permite explicar por qu algunas sustancias son coloreadas como el I2 y el CrO42-, mientras que otras como el agua y el NaCl no. La espectroscopa ha jugado una parte importante en el desarrollo de la bioqumica. Se ha utilizado para medir velocidades de reaccin catalizadas por enzimas, para medir concentraciones de compuestos, determinar conformaciones estructurales e interacciones moleculares. En los aos sesentas y setentas esta tcnica se volvi muy utilizada que fue una continuacin de la colorimetra. En estas dcadas se hacan anlisis de sustancias inorgnicas, principalmente metales a niveles de traza. En combinacin con la extraccin lquido-lquido, se conseguan determinaciones de compuestos de inters. Las longitudes de onda utilizadas en el laboratorio comprenden a la luz visible y ultravioleta. Para entender mejor cmo se lleva a cabo el fenmeno de la espectroscopa, es necesario entender lo que es la radiacin electromagntica y la Ley de Lambert-Beer. Un espectrofotmetro es un instrumento utilizado para determinar a qu longitud de onda la muestra absorbe la luz y la intensidad de la absorcin. Aunque varan en el diseo, todos los espectrofotmetros consisten de una fuente de luz, un selector de longitud de onda, un contenedor transparente en el cual se deposita la muestra, un detector de luz y el medidor. Las aplicaciones de la espectrofotometra son amplias y variadas y en este trabajo se revisarn los conceptos ya enumerados con ms detalle. Revisin histrica. La espectroscopa de absorcin se comenz a utilizar para la determinacin de alcaloides. Las primeras referencias acerca del estudio del espectro de ultravioleta se remonta a 1833, en el que Brewster trabaj con la descomposicin y dispersin de la luz en slidos y fluidos. En la revista Philosophical Transactions of the Royal Society de 1852, est documentado el primer trabajo serio, realizado por Stokes. En 1885, William N. Hartley utiliz el espectrgrafo de cuarzo original de Miller y report el primer espectro ultravioleta en compuestos narcticos en la misma revista que public a Stokes, y describi los espectros de 32 alcaloides, entre los que se encontraban la morfina, codena, tebana, papaverina, diacetilmorfina, entre otros. Hartley determin que todos esos alcaloides contenan un ncleo condensado, derivado del benceno o de la piridina por la extensin de la banda de 2600 a 3000 Angstroms (fig. 1). Mostr tambin el efecto de las sustituciones de alquilo y acetilo sobre la curva de absorcin. Posteriormente en 1903, en el Journal of the Chemical Society, Dobbie public los espectros de otros alcaloides como la cotarnina, berberina, coridalina, laudanina, quinina, neopina y otros alcaloides de isoquinolina y discuti acerca de la constitucin molecular de esos compuestos basndose en los espectros obtenidos. Segn Lothian, quien en 1949 hizo un anlisis crtico de los primeros trabajos en espectroscopa de absorcin, en su libro Absorption Spectrophotometry menciona: Unfortunately, much of the work done prior to about 1910 was valueless, since the methods employed were entirely qualitative, or at best semi-quantitative, compared with those available today. Some uniformity was introduced however, by Hartley and other

workers after him who developed a method in which the wavelenghts at which various thicknesses of a given solution ceased to transmit were recorded photographically.

Fig. 1. Espectro de absorcin para la morfina (3), codena (2) y tebana (1) y los derivados acetilados de la morfina (5) y codena (4), segn Hartley (1885).

Henri, en 1913, fue el primero en graficar el logaritmo del coeficiente de extincin I molar contra la longitud de onda (fig. 2), de acuerdo a la ecuacin: = log 0 . Ntese que I el espectro para la codena muestra un mximo a 2830 Angstroms.

Fig. 2. Absorcin espectrofotomtrica de fenantreno (1), apomorfina (2) y codena (3)

En Physikalische Zeitschrift en 1913, Henri ampli el concepto de cromforo establecido por Hartley, es decir, que el espectro de absorcin no resulta de la accin de la radiacin incidente sobre la molcula total, sino sobre partes especficas de la molcula. Mostr que la cetonas simples exhiben una banda de absorcin con un ndice de absorbencia de casi 15 entre 270 y 300 nm con un mximo a 280 nm. Hans Fischer en 1925, crey que las impurezas juegan un papel mnimo en el anlisis espectrofotomtrico y estableci que la espectrofotometra no modifica la molcula al mismo tiempo que es identificada. En la figura 3 se muestran tres espectros obtenidos por Fischer, en donde grafica el logaritmo del coeficiente de extincin molar contra A, el nmero de onda. La similaridad de las curvas de absorcin del cido benzoico, benzoilecgonina y cocana se muestran en la figura 3.

Fig. 3. Curvas de absorcin obtenidas por Fischer. Izquierda: cido benzoico en hexano. Centro: Benzoilecgonina en agua. Derecha: Cloruro de cocana en agua.

Eisebrand en 1926, public que la morfina puede ser determinada en cantidades tan bajas como 0.2 mg, utilizando el espectro de absorcin.

En 1927 Acta Phytochimica public que Kitasato fotografi el espectro de absorcin de 42 alcaloides y clasific los alcaloides en cuatro clases principales con las siguientes estructuras bsicas:

II

El espectro electromagntico La luz se puede explicar como un conjunto de radiaciones que se mueven por todo el espacio. Aquellas detectables por nuestro ojo corresponden a la luz visible, pero la mayora son invisibles para nosotros. Estas radiaciones se pueden describir como partculas y como ondas. La descripcin como onda se basa en que la luz consta de campos elctricos y magnticos que oscilan sinusoidalmente y en forma perpendicular a la direccin de traslacin por el espacio.

En cada una de estas ondas, la distancia entre dos crestas (o valles) consecutivas es la longitud de onda, _. El producto de la longitud de onda por frecuencia _ (el nmero de ciclos por segundo en unidades Hertz, Hz), es la velocidad de la luz, c (esencialmente la velocidad de la luz en el vaco):
c =

En cualquier medio material, la velocidad de propagacin es inferior a sta y queda dada por nc = 2.9979 X 1010 (cm/s), donde n es el ndice de refraccin del medio. La radiacin slo se absorbe o emite en unidades definidas llamadas fotones. La energa de los fotones es proporcional a la frecuencia de radiacin:
E = h

donde h es la constante de Planck El conjunto de radiaciones electromagnticas se llama espectro electromagntico y es conveniente agruparlas en regiones para poder conocer sus propiedades. En la figura 4 se muestran las zonas del espectro segn la clasificacin ms aceptada. Como se puede observar la zona del visible (radiaciones percibidas por nuestro ojo) es muy pequea en comparacin con la gran amplitud del espectro. Aunque hablamos de una radiacin determinada (), fsicamente es imposible aislar dicha radiacin. Siempre podremos obtener un rango de radiaciones pequeo segn la exactitud del dispositivo de seleccin (difractares de radiacin y filtros), pero nunca una sola. De la misma manera que no podemos obtener o aislar un punto de una recta, sino un trozo pequeo (un conjunto de puntos).

Fig. 4. Espectro de radiaciones electromagnticas

La espectrofotometra es una tcnica que mide la interaccin de molculas con la radiacin electromagntica. La luz que se encuentra en la luz visible y la luz ultravioleta de los espectros electromagnticos presenta una energa de 150- 400 kJmol-1. La energa de la luz es usada para promover electrones de un estado de excitacin a otro. Un espectro es obtenido cuando la absorcin de luz es medida en funcin de una frecuencia o longitud. Molculas con electrones deslocalizados en sistemas aromticos a menudo absorben la luz a 150-400 nm (ultravioleta) o en la regin visible de 400-800 nm. La espectrofotometra de absorcin es usualmente usada con molculas disueltas en un solvente transparente. La absorbancia de un soluto depende linealmente de la concentracin y por consiguiente la espectrofotometra de absorcin es ideal para hacer mediciones cuantitativas. La longitud de absorcin y la fuerza de absorbancia de una molcula no slo depende de la naturaleza qumica, si no del ambiente molecular en donde se encuentre el cromforo. La espectrofotometra de absorcin es por lo tanto una excelente tcnica para seguir reacciones de unin a ligando, catlisis enzimticas y transiciones

conformacionales en protenas y cidos nucleicos. Las mediciones espectroscpicas son muy sensibles y se requieren pequeas muestras de material para el anlisis. Las molculas absorben radiacin electromagntica Cuando una onda encuentra a una molcula, puede cambiar la direccin de propagacin (dispersin) de esa onda, o puede ser absorbida. En este ltimo caso, una molcula absorbe un fotn y su energa interna aumenta para entrar a un estado inestable, por lo que rpidamente vuelve a liberar esa energa sobrante y vuelve al estado inicial que es ms estable. El estado inicial se denomina estado fundamental y el estado ms energtico se llama estado excitado. La absorcin de radiacin produce un paso del estado fundamental al excitado (excitacin) y en el proceso contrario (llamado relajacin) hay una liberacin de energa. Esta energa liberada en la relajacin puede ser en forma de calor o en forma de radiacin electromagntica otra vez. Este ltimo proceso de desprendimiento de radiacin se llama de emisin. Estos procesos se pueden representar como una reaccin qumica y en un diagrama de energa.
Absorcin

M + h_
Emisin

M*

E N E R G A Absorcin Emisin

Estado excitacin

Estado fundamental

El aumento del nivel energtico interno de la molcula produce unos cambios en los enlaces intramoleculares y/o movimiento de los electrones alrededor del tomo. Estos enlaces se llaman transiciones y se clasifican en tres tipos:
Transiciones electrnicas Transiciones vibracionales Transiciones rotacionales tomos molculas o iones molculas o iones Energa requerida

As las radiaciones ms energticas (VIS, UV y mayores) comunican suficiente energa como para alterar el movimiento orbital de los electrones, tanto alrededor de un tomo solo, como de los orbitales de enlace entre tomos. Las radiaciones menos energticas (IR) producen cambios en los movimientos de vibracin y rotacin de la molcula. Estas ltimas son muy especficas de cada enlace y por lo tanto de cada molcula por lo que se utilizan como tcnicas de identificacin. Para realizar una identificacin generalmente se hace incidir sobre la sustancia estudiada radiaciones electromagnticas de diferente energa. Normalmente se estudia un rango de radiaciones y se va aumentando (o disminuyendo) la longitud de onda de las radiaciones incidentes desde un extremo del rango hasta el extremo opuesto. As se obtiene un espectro de absorcin de la sustancia, que se puede representar grficamente y este espectro es como una huella digital de esa molcula en donde se encuentran registrados todos los enlaces y sus transiciones correspondientes. Entonces, si tenemos el espectro de absorcin de una molcula podemos identificarla con bastante exactitud. La grfica de la

probabilidad de absorcin contra longitud de onda se denomina espectro de absorcin y la espectroscopa de absorcin se refiere a la adquisicin y anlisis de los datos de absorcin. La absorcin de energa de longitud de onda resulta de la diferencia de energa entre niveles si

hc E 2 E1

donde E1 es el nivel de energa de la molcula antes de la absorcin y E 2 es un nivel de energa alcanzado durante la absorcin. En cambio entre niveles de energa se llama transicin, que representa la energa requerida para mover un electrn de una rbita a otra. Ley de Lambert-Beer. La cantidad de radiacin electromagntica absorbida por un analito se puede relacionar cuantitativamente con la concentracin de dichas sustancias en solucin. La transmitancia (T) se define como la fraccin de radiacin incidente trasmitida por la disolucin. Si la potencia radiante que incide sobre la disolucin es P o y P la potencia radiante que sale, entonces:

Po

P P0 Adems se observa que la potencia de la energa trasmitida disminuye geomtricamente (exponencialmente) con la concentracin C y con la distancia b recorrida a travs de la disolucin. T=

T = 10 k c

T = 10 k 'b

donde k y k son constantes de proporcionalidad y combinando ambas y aplicando logaritmos T=10-a*b*c -log T = a*b*c=A que es la expresin matemtica de la Ley de Beer y que indica la relacin directa entre la absorbancia de un analito y su concentracin en disolucin. Cuando se usan unidades molares se llama absortividad molar () y se expresa en L/mol*cm. La probabilidad de absorcin en una longitud de onda est caracterizada por el coeficiente de absorcin molar a esa longitud de onda. Si la luz de intensidad I 0 pasa a travs de una sustancia de espesor d (en cm) y concentracin molar c, la intensidad de la luz transmitida obedece la Ley de Lambert-Beer:
I = I 0 10 dc

I o log I 0

= dc

donde _ es el coeficiente de absorcin molar o tambin denominado coeficiente de extincin molar. Una molcula o parte de una molcula que puede ser excitada por absorcin se llama cromforo. En sistemas biolgicos los cromforos generalmente tienen mximos de absorcin en el rango del UV lejano al visible. Los parmetros medidos generalmente son densidad ptica o _. La longitud de onda correspondiente al pico de mxima absorcin se denomina _mx y es a esta longitud de onda que se mide _. Algunas de las bandas de absorcin consisten de mltiples picos y las longitudes de onda correspondientes a los picos tienen coeficientes de absorcin molar ms pequeos En la tabla 1 se enlistan los valores de mx y para algunos cromforos importantes. Instrumentacin Espectrofotmetro El espectrofotmetro es el nombre genrico de todos los aparatos basados en esta tcnica. El espectrofotmetro puede estar equipado con un slo detector o un detector multicanal, configurados por medidas con un solo rayo (SB) o doble rayo (DB) y designados para la medicin de una longitud fija o para adquirir una espectro de absorcin completo. El espectrofotmetro de un solo detector es el ms comn y en este caso particular la banda de longitud de la fuente de radiacin es trasmitida por el selector de longitud a la muestra y finalmente al detector como se muestra en la figura 5a y 5b. Con el equipo SB un rayo pasa a travs de la muestra y este coincide con el detector. En los equipos DB (figura 5b), el rayo es desviado a una longitudes seleccionada con un espejo rotatorio obteniendo dos rayos, pasando alternativamente por la celda que contiene la muestra y la

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celda de referencia. El rayo que viene de la muestra y de la referencia se mezcla, y ste es llega hasta el detector. Componentes del espectrofotmetro A continuacin se enumeran las caractersticas de varios componentes del espectrofotmetro UV-visible.
Tabla 1. Absorcin mxima y coeficientes de extincin de cromforos en sistemas biolgicos.
Compuesto NADH FAD Absorcin mxima mx (nm) 260 340 260 375 445 ~450 231 234 280 219 274 222 193 257 206 188 258 258 ~235 Coeficiente de extincin molar x 10-3 (M-1cm-1) ~15 6.2 ~15 ~9 11 ~12 35 24.5 5.6 47 1.4 8 48 0.2 9.3 60 6.6 7.4 20

_-caroteno cido linolieco (trans-trans) cido linoleico (cis-trans) Triptofano Tirosina

Fenilalanina

DNA RNA Colesterol

Fuentes: Las fuentes de radiacin son generalmente laparas de tungsteno o tungsteno-halgeno para proveer de una radiacin continua adecuada del espectro visible al infrarojo cercano. Para la capacidad de radiar con los UV se necesita una lampara de H2 o D2. Una lampara de D2 es generalmente preferida que una lmpara de H2 por que emite una radiacin tres veces mayor. Por simplicidad, una lmpara de D2 y H2 puede servir como una sola fuente para emitir en la regin UV-visible aunque la radiacin en el espectro visible es ms pequea que la emitida por una lampara de tungsteno y al mismo tiempo poco estable. En algunos instrumentos la fuente de radiacin es modulada con un dispositivo mecnico. Selector de longitud: Una porcin de la radiacin emitida por la fuente es colectada y dirigida al selector de longitud o a la muestra con algunos lentes o espejos. En instrumentos con un solo detector, el selector de longitud es normalmente puesto antes del compartimento en donde se encuentra la muestra para minimizar el calentamiento o fotodescomposicin de la muestra por radiacin a longitudes no monitoreadas. Si este efecto no es significante, el selector de longitud puede ser pasado despus de la celda del compartimento de la muestra. Con espectrofotmetros multicanales, el detector multicanal 11

debe ser colocado en el plano focal del espectrogrfo; la celda con la muestra tiene que ser puesta antes que el selector de longitud e iluminado con radiacin blanca. Los fotmetros emplean la interferencia con filtros para seleccionar la longitud deseada, nicamente se necesita tener los filtros correspondientes. a) Fuente de radiacin Filtro o monocromador
Muestra Detector
Procesamiento y lectura

b) Fuente de radiacin Filtro o monocromador Muestra Selector

Procesamiento y lectura

Detector

Referencia

Fig. 5. Diagramas de diferentes tipos de espectrofotometros de absorcin molecular UV-visible. a) Se muestra un espectrofotmetro con detector simple y con un simple rayo. Un filtro del monocromador selecciona un rango de longitudes de onda de la fuente de radiacin para ser enviada a la muestra en el mismo compartimento. La radiacin trasmitida es detectada con un prototubo al vaco, un tubo fotomultiplicador o fotodiodo y convertido a una seal por un procesador de seales. b) Se muestra un espectrofotmetro con doble rayo. La radiacin de rayo es pasada por el selector de longitud despus es desviada y pasada alternativamente por la muestra y la referencia, posteriormente estos dos rayos son recombinados para llegar al detector. La informacin proporcional a la amplitud es extraido del poder radiante al ser pasado por la muestra y la referencia, para obtener una seal proporcional a la transmitancia o absorbancia.

En un espectrofotmetro con un detector, una imagen de la fuente es enfoncada en la entrada de una abertura del monocromador que hace que el rayo se disperse. En espectrofotmetros de un solo rayo es usado un monocromador de baja dispersin con una abertura fija (tpicamente de 2 a 20 nm) y un ajustador manual de longitud como se muestra en la figura 6. Los espectrofotmetros SB y DB de alta calidad estn basados en monocromadores como medios de dispersin. Dependiendo del instrumento, el espectro de puede ser variado, de 10 nm a 0.5 nm. Los espectrofotmetros de barrido (scanning) usualmente proporcionan amplios rangos de longitudes de onda para analizar (de 1 a 2000 nm min-1), algunos espectrofotmetros tpicos comerciales de doble rayo son mostrados en la figura 7. Los 12

espectrofotmetros rpidos basados en un componente ptico de oscilacin en el monocromador son capaces de adquirir espectros en un segundo o menos. Muchos espectrofotmetros de longitud fija o de barrido de varias longitudes ya sean automticos o manuales, permiten la colocacin de filtros en el tren ptico para reducir la prdida de radiacin de diferencias significativas en la longitud. En espectrofotmetros multicanales la resolucin de la longitud es determinada por el tamao del pixel en el diodo. Por lo tanto, la entrada a la abertura del espectrgrafo es fijada a la misma anchura de abertura que la anchura de un diodo; la resolucin es del orden de 1 a 2 nm.

(a)

Fig. 6. Se muestran dos ejemplos de espectrofotmetros de un solo rayo. Arriba. Una abertura en forma de v (entrance slit) se utiliza para ajustar el poder de la radiacin que incide en la celda de la muestra. Abajo. El turner 320. El monocromador se basa en el Eber y la lmpara actual es variada dependiendo de la intensidad de la radiacin que incide en la celda que contiene la muestra.

Compartimiento de la muestra y celdas para la muestra. El compartimiento de la muestra es un compartimiento ajustado a la luz con una tapa que da seguridad sosteniendo una o ms celdas con la muestra. La radiacin trasmitida por el selector de longitud (o de una fuente en un espectrofotmetro multicanal) es dirigida a la celda que contiene la muestra. En la mayora de los espectrofotmetros existen otros accesorios pticos usados para colimar el rayo de luz y enfocarla hacia el centro de la celda que contiene la muestra y la referencia. El cambio en la amplitud de la luz al pasar por la muestra puede ser mnima, as que todos los rayos viajan aproximadamente al mismo lugar. A menudo, diferentes lentes o espejos trasmiten la luz a la muestra y despus al detector.

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Es crtico que en el compartimiento de la muestra se permita insertar la celda de la muestra fcilmente y as mismo removerse para que la muestra pueda localizarse de la misma manera y por lo tanto ser reproducible. Una base para mltiples muestras puede ser de movimiento rotatorio o de movimiento lineal para que puedan ser cargadas varias muestras y colocadas en el mismo compartimiento en donde pasa el rayo de luz, esto puede ser de manera manual o automatizada.

Fig. 7. Esquema de dos espectrofotmetros de doble rayo con barrido en el tiempo. a) La ptica y el procesamiento electrnico de la seal de un espectrofotmetro esta basado en una fuente dual de luz y un monocromador de un solo paso. En los diagramas b) y c) se ilustra el camino ptico en el espectrofotmetro basado en un monocromador doble (cary17) y un monocromador de paso dual (Varian 2200) respectivamente. En el (b) la radiacin de la fuente es dispersada por un prisma y un monocromador enrejado en serie. Por otro lado el espectrofotmetro (c), utiliza el mismo enrejado (a diferentes proporciones) para dispersar la radiacin dos veces.

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Algunos espectrofotmetros pueden regular la temperatura de las muestras mediante la circulacin constante de agua en el compartimiento de la muestra, el agua debe de tener la temperatura que se necesita para la muestra. Alternativamente, existen dispositivos termoelctricos que son utilizados para el control de la temperatura. En este mismo compartimiento existe un agitador electromagntico que funciona para mezclar algunas soluciones que se le agregan a la muestra.

Fig. 7. Continuacin de la figura anterior

Existe una amplia variedad de celdas (diferentes materiales, tamaos y formas). Los materiales ms comunes de los que estn constituidos son vidrio, cuarzo, slice o varios plsticos. Las ms utilizadas son las celdas de cuarzo y slice para medir la absorbancia a longitudes de 300 n m , donde las celdas de vidrio y otros plsticos absorben significantemente. En el caso de muestras que se leen en el infrarrojo existen celdas especiales de materiales como NaCl, ArCl y KBr. La mayora de las celdas tiene la forma y las dimensiones que se muestran en la figura 8. La celda estndar de un espectrofotmetro se muestra en la figura 8a, sta presenta 1 cm de longitud interna y tiene un volumen interno de 2.5 mL. Para muestras pequeas existen semimicro y micro celdas (figura 8b) de 1 cm de longitud interna pero con un pequeo volumen interno. Algunas celdas pueden ser compradas con 1 m m a 5 cm de longitud interna. Las celdas con una pequea longitud interna (micro celdas) son utilizadas para soluciones de alta absorcin. Celdas con longitud de 10 cm presentan una forma

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cilndrica (figura 8c) y son apropiadas para medir la absorcin de soluciones o gases. En algunos espectrofotmetros simples o fotmetros son utilizadas unas celdas en forma de tubo que son de bajo costo (figura 8d). En las celdas estndar, las soluciones se agregan manualmente o en algunos casos automticamente con un dispensador electrnico. Diferentes celdas pueden ser utilizadas para diferentes soluciones. La celda de la muestra se vaca despus de ser ocupada y posteriormente se enjuaga para seguirse utilizando. La muestra tambin puede ser aumentada con el uso de varios tipos de celdas de flujo (figura 8e) que rellenan la celda de manera automatizada. Las soluciones de prueba y enjuagado se bombean a la celda y son detenidas para medir la absorbancia; es como un sistema de retroalimentacin, en donde primero se bombea la muestra, se mide la absorcin y despus se enjuaga. El tiempo de bombeo es ajustado para asegurar que las soluciones previas son completamente remplazadas por la siguiente solucin o muestra. Este sistema es utilizado con dispensadores automatizados para proveer un alto anlisis secuencial de un lote o varias muestras. Las celdas de flujo pueden ser utilizadas para medir la absorcin de un flujo, con anlisis basados en flujos continuos o discontinuos. Los buffers pueden mezclarse con los reactivos y bombeados al flujo de la celda. La proporcin del flujo y los datos adquiridos con el tiempo son controlados para medir la absorbancia debido a que la absorbancia se mide a tiempos apropiados. Existen celdas diseadas especialmente para detectores de absorcin en HPLC (figura 8f), en estas celdas regularmente se utilizan volmenes de 0.5 a 2 L y la proporcin del flujo es crtico para obtener una buena elusin. D e t e c t o r e s . Fototubos de vaco, fotodiodos, detectores fotnicos, fotomultiplicadores, arreglos lineares de fotodiodos y sistemas de transferencia de carga son utilizados como detectores en muchos fotmetros y espectrofotmetros de amplio espectro. Un espectrofotmetro de alta resolucin con un solo detector detecta muy poca luz, un tubo fotomltiple es usado normalmente como un transductor ptico para proveer una alta seal. Para aumentar la seal en la regin de los 600 nm a 1000 nm se requiere un tubo fotomltiple con una respuesta al rojo. Algunos pocos espectrofotmetros son capaces de medir absorbancia dentro del infrarrojo. Espectrofotmetros multicanales basados en arreglos de diodos normalmente son configurados para abarcar una rango de 190 a 850 nm. El detector debe de proveer una buena respuesta a longitudes grandes de 1100 a 1200 nm. Procesamiento de la seal y lectura. El detector da una seal que contiene informacin sobre el poder de radiacin trasmitido por una solucin de muestras o referencia. La seal puede ser procesada por un hardware o software para extraer la informacin deseada y para convertirla a una forma conveniente y desplegarla en un dispositivo de lectura. En todos los espectrofotmetros se requiere una seal anloga procesada. Con un espectrofotmetro de un solo detector o con un fotmetro, un amplificador operacional (op amp), una configuracin de voltaje (I-V) es transformada por el fotodiodo en un voltaje de amplitud conveniente. Con instrumentos no computarizados el procesamiento de la seal se logra con un circuito anlogo aunque los despliegues digitales son muy comunes. Con equipos computarizados de un solo detector, la seal de amplitud de voltaje es digitalizada por un convertidor anlogo-digital. Los datos digitales son almacenados en la memoria para despus ser procesado por el software. Los espectrofotmetros multicanales son siempre

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computarizados debido a la gran cantidad de datos generados en poco tiempo. As la informacin espectral de tpicamente 300 a 1000 fotodiodos puede ser leda, amplificada, digitalizada y almacenada en algunos milisegundos. Con espectrofotmetros no computarizados de un solo rayo pensando para medir a una longitud de onda fija, la conversin del voltaje es desplegada directamente dentro de un dispositivo para trasmitir la lectura. La lectura directa de la absorbancia es necesaria para convertir la foto seal a un voltaje proporcional a la absorbancia con circuitos logartmicos antes de desplegarla. El dispositivo de lectura en este caso es tpicamente un anlogo o voltmetro digital. Si la fuente es modulada, es necesario sincronizar la deteccin electrnica para extraer la informacin de la amplitud antes de desplegarla o hacer la conversin aritmtica.

Fig. 8. Se muestran tipos de celdas. (a) Celda estndar de un espectrofotmetro con 1 cm de longitud interna. (b) Celda para micro muestras (microcelda) para ser usada en pequeos volmenes. (c) celda cilndrica para grandes longitudes. Algunos espectrofotmetros utilizan celdas en forma de tubos (d). Para dispensadores automatizados se utilizan celdas de flujo (e). En equipos como HPLC se utilizan celdas con flujo en forma de Z (f).

El procesamiento de la seal con espectrofotmetros de doble rayo no computarizados es ms complicada. La amplitud de la seal de la muestra y de la referencia se extrae primeramente de la seal modulada, entonces la relacin o el logaritmo de la relacin de la seal de la muestra y la referencia es computarizada. Para instrumentos de barrido (scanning), los datos del espectro son trazados en tiempo real en un registrador anlogo. 17

Con espectrofotmetros basados en microcomputadoras, los pasos discutidos anteriormente son digitalizados, las seales de la muestra y la referencia son almacenadas por un software. El dispositivo de lectura puede ser un medidor digital, un trazador, una impresora o una cmara de video o una combinacin de estos dispositivos. En todos los espectrofotmetros, el ruido equivalente al ancho de banda (f) es controlado por algunas constantes de tiempo limitantes o la integracin de tiempo que este arriba de 1 s en instrumentos simples o controlando un rango de .01 a 10 s con los instrumentos ms sofisticados. En espectrofotmetros multicanales, f es determinada por la integracin del tiempo en donde el fabricante asegura que se encuentra antes de la saturacin de los diodos por la alta intensidad. Metodologa y caractersticas de uso En esta seccin se muestran los factores que influyen en el uso de la espectrofotometra de absorcin molecular. Usualmente la concentracin de un analito en una solucin analizada es evaluada de la absorbancia de la muestra y una curva de calibracin. La curva de calibracin se obtiene generalmente de la absorcin medida de un estndar externo. Consideraciones generales y anlisis cuantitativo Tratamiento de la muestra El tratamiento de la muestra vara considerablemente dependiendo de cada aplicacin. La mayora de las mediciones son determinadas en solucin o slidos que son disueltos. En algunas ocasiones el anlisis se puede realizar directamente de la absorbancia de la forma qumica original, pero comnmente es necesario derivatizar el compuesto por que las bandas de absorcin del analito en la forma qumica original poseen una inadecuada absorcin o absorben a longitudes inusuales. La derivatizacin envuelve la conversin del analito a una forma absorbente fuerte por una reaccin analtica selectiva con los reactivos apropiados. La absorbancia del producto de la reaccin es proporcional a la concentracin del analito por la calibracin externa. Generalmente, un exceso de reactivo es agregado a la reaccin analtica para llegar al equilibrio antes de hacer la medicin. Alternativamente, el rango de la reaccin qumica puede estar relacionado con la concentracin del analito o el analito puede ser titulado con un reactivo estndar que reacciona con una estequiometra conocida. La reaccin entre la muestra analizada o la muestra estndar y el reactivo puede llevarse a cabo directamente en la celda de la muestra o en cualquier contenedor conveniente, en el ltimo de los casos, una alcuota de la reaccin es transferida a la celda de la muestra despus de que la reaccin es completada. En algunas aplicaciones especializadas como estudios de titulacin, cinticas y determinaciones, la medida de la absorcin se realiza antes de completar la conversin del analito a una forma absorbente. A menudo son necesarios pasos de separacin (filtracin, extraccin con solventes, etc.) para eliminar interferencias y en algunas aplicaciones el espectrofotmetro es utilizado como una tcnica de deteccin para cromatografas.

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Condiciones en solucin En procedimientos analticos primero se debe determinar la forma absorbente del analito que se va a utilizar. La naturaleza de las especies absorbidas influye en gran medida en la determinacin de la concentracin, la sensibilidad de la calibracin, el lmite de deteccin, la precisin, la exactitud y la linealidad. En el anlisis, la absorbancia de algunas especies puede ser muy grande para obtener una buena deteccin y precisin. Por otro lado, la naturaleza qumica de algunas especies puede afectar la interaccin con algunos interferentes o tomar parte en un equilibrio que puede afectar la linealidad, simplemente las caractersticas espectrales de cada especie determina el potencial para sobrelapar el espectro con otras especies. El solvente y algunas condiciones de la solucin como el pH, la fuerza inica y la temperatura deben ser optimizados y controlados para minimizar las interferencias y mantener la linealidad (para prevenir la descomposicin por oxidacin, fotodescomposicin u otros mecanismos). Por otro lado se debe de mantener el equilibrio y maximizar el tiempo de estabilidad de la forma absorbente. Cuando una reaccin analtica es usada para formar un derivado capaz de absorber, la concentracin del reactivo puede ser optimizada para lograr el objetivo que se sigue. Adicionalmente, el tiempo y la temperatura requerida para formar el producto, el orden de adicin de los reactivos y la reaccin concomitante pueden ser considerados. Los reactivos enmascarados, son algunas veces agregados para bloquear la reaccin concomitante con el reactivo analtico, idealmente, la conversin del analito a una forma cuantificable por absorbancia. Por otro lado, la eficiencia de conversin podra ser constante a la concentracin del analito o los concomitantes. Cuando se emplea un solvente para la extraccin se puede evaluar: el efecto del tipo de solvente en la eficiencia de la extraccin del analito y concomitantes, la absorbancia molar, y las posiciones espectrales de las bandas de absorcin. Opciones de longitud y el ancho de banda espectral (bandpass) Para procedimientos cuantitativos estndar, el espectro de absorcin de la forma absorbente del analito esta disponible en la literatura, en donde la longitud (0), el ancho de banda conveniente y las condiciones de la solucin (concentraciones de reactivos) tambin son especificadas. Cuando se desarrolla un mtodo cuantitativo para determinar la concentracin del analito, las opciones de las especies de absorcin, la banda de absorcin particular y la longitud son utilizadas para un anlisis crtico. Para tomar esas decisiones, el espectro de absorcin visible-UV de todas las especies relevantes (el analito o la forma absorbente, los reactivos y las potenciales interferencias), son obtenidas con espectrofotmetro de barrido o un espectrofotmetro multicanal. Para la obtencin exacta de la absorcin verdadera de una forma y anchura, el ancho de banda es menos ajustado que la anchura promedio de la banda de absorcin en el espectro. Del espectro de absorbancia de un analito, la longitud de mayor absorbancia (max) y la anchura promedio () de todas las bandas de absorcin pueden ser caracterizadas. Cuando son presentadas varias bandas de absorcin, la banda de absorcin seleccionada puede favorecer la regin de longitud que corresponde a la alta radiacin relativa de la fuente, alta respuesta del detector y una alta referencia del factor de transmisin (por ejemplo una minina absorbancia de la muestra y la solucin blanco), para 19

maximizar la referencia fotocatdica (ir) y la precisin. Si es posible, la regin de longitud seleccionada para el anlisis puede no sobrelapar bandas de absorcin de contaminantes en la muestra o de cualquier reactivo utilizado. Aunque esto es posible para compensar la absorbancia de los reactivos con un reactivo blanco propuesto, esto es mejor para escoger una banda de longitud o un anlisis de la longitud en donde la absorcin de los reactivos es mnima, porque la cantidad exacta de exceso de reactivo despus de la reaccin es regularmente desconocida. A menudo la o es escogida para ser equivalente a max de la banda de absorcin utilizada. Esto provee una curva de calibracin ms grande y minimiza la no linealidad debido a la radiacin policromtica. Hay dos razones para escoger el anlisis de un rango de longitud preciso en una banda de absorcin, primero max puede estar fuera del rango de la longitud del espectrofotmetro o fotmetro usados para el anlisis o a los extremos de una rango de longitud donde la proporcin de la seal del ruido es pobre. Segundo, el reactivo puede ser significativo o interferir en la mxima banda de absorcin que no puede ser compensada con un reactivo como blanco. La absorcin de un reactivo blanco puede ser reducida al igual que la seal de ruido. Si es posible, puede ser ajustada la anchura de la abertura a s</10 cuando o=max para maximizar la linealidad debido a la radiacin policromtica. La medicin debe ser realizada dentro de un rango de la banda de absorcin, esto mejora la determinacin experimental del ancho de bada espectral que provee la linealidad deseada. Opciones de instrumentacin Existen varios espectrofotmetros, el tipo de instrumento que se va a utilizar depende del costo, simplicidad, precisin, exactitud y detectabilidad. Para una rutina analtica estable, los procedimientos involucran la determinacin de la misma especie en un gran nmero de muestras, un fotmetro simple de bajo costo es muchas veces adecuado para estos anlisis. Un espectrofotmetro provee mayor versatilidad en la longitud que puede ser necesaria para la determinacin de muchas diferentes tipos de especies o para el desarrollo de nuevos procedimientos. Los espectrofotmetros con un ancho de banda espectral fijo de bajo costo son convenientes para mucho procedimientos rutinarios. Los espectrofotmetros ms caros y de alta calidad proveen un amplio rango de longitudes y mejores lmites de deteccin. La linealidad es mejorada por que la prdida de radiacin es baja y el ancho de banda espectral puede ser ajustado a un pequeo valor de una banda de absorcin Los espectrofotmetros computarizados que proveen relativamente rpido la capacidad de escasear o explorar y particularmente los espectrofotmetros incremente significativamente el anlisis de muestras en donde se requieren muchos espectros o mltiples longitudes. Instrumentos con tratamiento de muestras automatizado y con capacidad de introduccin de muestras proveen el anlisis de un gran nmero de muestras, de manera automatizada para una determinacin rutinaria. Instrumentos espectrales de un solo rayo son poco complejos y de bajo costo, proveen alta radiacin y poco ruido de fondo por que tienen menos componentes pticos. La eleccin entre un espectrofotmetro de doble rayo y un espectrofotmetro de un solo rayo no es tan clara como en el pasado. Anteriormente, un espectrofotmetro de doble rayo era necesario para obtener espectros y a menudo una mejor compensacin en el ruido del 20

parpadeo de la fuente por que la seal de la muestra y la referencia eran continuamente rastreadas. Tambin el paso de la luz a travs de la muestra puede ser alto, pues no es necesario la alternancia manual de la muestra y la medicin de la absorbancia de la referencia o blanco. Algunos espectrofotmetros modernos computarizados de un solo rayo (con un solo detector o multicanal) permite adquirir un buen espectro y de alta calidad. El alto poder que suministra la lmpara y la generacin de estabilidad ptica, minimiza el parpadeo de la lmpara y permite que la medicin de algunas muestras puedan ser realizadas despus de medir una referencia inicial. La mayora de los fabricantes de espectrofotmetros proveen los valores para una lista estndar de especificaciones que se muestran en la tabla 1. Estas especificaciones pueden ser utilizadas para hacer una buena eleccin en la compra de un espectrofotmetro. Los parmetros reportados son obtenidos aplicando procesos estandarizados de prueba. El rango de longitud es usado particularmente para decidir si tiene capacidad de radiar luz UV o NIR dependiendo de lo que se requiera. La exactitud de la longitud es evaluada por la comparacin de la longitud de un monocromador a una longitud conocida a una lnea mxima de emisin de una fuente de Hg a baja presin o una lmpara de D2 en el espectrofotmetro. La repetibilidad de la longitud es una medida de la precisin de una medida anterior. Los valores del ancho de banda del espectro indican la utilidad del instrumento para una banda de absorcin estrecha. El porcentaje de la radiacin del rayo es evaluado a una longitud especfica y a un ancho de banda espectral con soluciones de absorbancia fuerte o con filtros. La exactitud de la fotometra es determinada por la comparacin de la medida de absorbancia a una absorbancia certificada de un estndar, considerando que la reproducibilidad de la fotometra es la precisin obtenida por la repeticin de la medida en un estndar. La linealidad fotomtrica indica la habilidad del espectrofotmetro para proveer linealidad a un grupo de estndares conocidos para seguir la Ley de Beer. El nivel bsico de ruido usualmente indica el ruido existente en una unidad de absorbancia de cresta a cresta a una longitud especfica y a un ancho de banda espectral. La estabilidad bsica especifica la tendencia en una seal a 0 unidades de absorbancia por hora despus de un tiempo especfico. El rango fotomtrico indica la transmitancia y la absorbancia desplegada en un dispositivo de lectura o de un instrumento que pueda ser usado. Caractersticas de uso Ahora se van a considerar algunas caractersticas importantes: la precisin, el lmite de deteccin, linealidad y la exactitud. Precisin. La precisin en la determinacin de la concentracin del analito en una muestra puede no ser tan buena como la medida precisa de una muestra (la precisin con que una muestra absorbe al ser medida en una solucin). La medida precisa de la muestra es determinada por la resolucin de la lectura, el ruido de fondo, la reproducibilidad de la lectura de la muestra y la absorbancia de la muestra. Las especificaciones instrumentales de reproducibilidad fotomtrica proveen informacin para seleccionar algunos valores de absorbancia y longitud para diferentes mediciones que pueden ayudar a reproducir los datos. En una curva de calibracin lineal, la desviacin estndar relativa en la determinacin de una concentracin es equivalente a la desviacin estndar relativa de la medicin de la absorbancia de una muestra y este es el rango limitante de error.

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Si es posible, la concentracin del analito en el estndar y en la muestra puede ser ajustada para que sus absorbancias se encuentren en el rango donde la medida sea ms precisa. La precisin de la medida de un fotmetro simple y un espectrofotmetro con un dispositivo de lectura de baja resolucin es a menudo limitado de 1 a 2% por la resolucin del lector para absorbancias en un rango de 0.2 a 0.9. Para instrumentos de alta calidad con una adecuada resolucin de lectura, la desviacin estndar relativa puede ser de 0.1% o mejor por las mayores absorbancias a 0.1. Esta precisin es mantenida de 1 a 3 unidades de absorbancia dependiendo del lmite de la fuente. Para un anlisis a una longitud dada, la anchura de la abertura es la variable primaria que puede variar para cambiar la forma de la curva precisa. Para medir absorbancias pequeas, el lmite de deteccin, con la precisin de una determinacin espectrofotomtrica es a menudo limitada por la reproducibilidad de la absorbancia de una muestra, el tratamiento de una muestra, la colocacin de la muestra o el paso de calibracin. El conjunto de la desviacin estndar relativa puede ir de 0.3 a 5 %, dependiendo de la situacin.
Tabla 2. Especificaciones del espectrofotmetro. Especificaciones Rango de longitud (nm) Exactitud de la longitud (nm) Repetibilidad de la longitud (nm) Ancho de banda espectral o resolucin (nm) Radiacin del rayo (luz) (%) Exactitud fotomtrica (unidades de absorbancia) Repetibilidad fotomtrica Linealidad fotomtrica Nivel bsico de ruido Estabilidad de absorbancia cero (unidad de absorbancia h-1) Tiempo de respuesta o constante de tiempo (s) Rango fotomtrico Valores a 185-3200 0.2 (0.8 en NIR) 0.05 (0.2 en NIR) 0.05-5 (0.2-20 en NIR) 340-1000 2 1 10

<0.000012(<0.002 en NIR) 0.003 a 1

0.3 0.003 a 0.4

0.001 --<0.0002 <0.0005

--1% T 0.001 0.003

0.2-10

---

-5 a 5

0a2

a Los valores en la primera columna son de un espectrofotmetro de doble rayo y alta calidad (Perkin-Elmer lambda 9). Los valores de la segunda columna se refieren a espectrofotmetro de baja exactitud, simple, de un solo rayo con un ancho de banda espectral fijo (Bausch and Lomb Spectronic 21 MV).

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Lmite de deteccin. El lmite de deteccin (DL) est determinado por la desviacin KS bk estndar del blanco (Sbk) y la inclinacin de la curva de calibracin DL = . El valor de b Sbk depende del instrumento y las condiciones instrumentales, tales como el anlisis de la longitud y el ancho de la abertura, as tpicamente varan de 10-3 a 10-5 unidades de absorbancia. El lmite de deteccin puede ser mejorado por tcnicas de preconcentracin reduciendo el ruido de la muestra blanco. En general, las condiciones instrumentales pueden ser ajustadas para minimizar la proporcin de Sbk a . Observe que si la longitud o la anchura de la abertura es ajustada a un valor tal que no es equivalente al valor mximo de la banda de absorcin (m), entonces se pierde la linealidad con altas absorbancias. Si la colocacin de la celda de la muestra limita la precisin, entonces la muestra puede quedar en el compartimiento de la celda mientras las soluciones son agregadas y removidas. La resolucin de la lectura puede ser mejorada si limita la deteccin. El lmite de deteccin prctico en muestras complejas reales puede ser mayor al calculado anteriormente, debido a la variabilidad de la absorbancia descompensada de un blanco de muestra a muestra. En algunos casos el valor prctico de Sbk puede ser 10-2 unidades de absorbancia o mayor. Linealidad. El rango de linealidad es confirmado por mediciones experimentales. Como se describi anteriormente la anchura media de la banda de absorcin puede ser usada para estimar el ancho de banda espectral de un monocromador o el filtro de anchura media necesario para minimizar la desviacin debido a la radiacin policromtica. La no linealidad se debe al equilibrio qumico o a otros efectos qumicos que pueden ser distinguidos por mediciones de la misma solucin en celdas con capacidad para dejar pasar diferentes longitudes. Los efectos instrumentales son generalmente peores para soluciones en celdas de alta longitud en donde la absorbancia es mayor, considerando que la no linealidad debido al efecto qumico es independiente de la longitud y dependiente de la concentracin. Si las mediciones son realizadas en las porciones no lineales de la curva de calibracin entonces el estndar puede ser medido para asegurar que la funcin de calibracin es conocida con precisin. En algunas aplicaciones, los factores de alta dilucin no pueden ser usados por que la pequea absorbancia del analito es medida sobrepuesta en la cima de un gran fondo de absorbancia. En este caso, caractersticas instrumentales tales como la perdida de radiacin pueden ser apropiadas para obtener una linealidad. Exactitud. Para obtener resultados exactos con estandarizaciones externas, una muestra y un estndar de la misma concentracin de analito deben de dar la misma medida de absorbancia. Usualmente, este no es el caso en errores al azar y errores sistemticos. Algunas cosas que causan errores sistemticos como blancos e interferencia con el analito son discutidas ms abajo. La interferencia del blanco a menudo limita la exactitud de mediciones espectrofotomtricas y usualmente son interferencias en el espectro que causan la contribucin del factor de transmisin de la referencia (T r) al factor de transmisin de la muestra (Ts) para ser diferentes la muestra y el estndar. As la interferencia del espectro es

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causada por contaminantes o partculas presentes en la muestra analizada, pero que se encuentra ausente en el estndar que absorbe a una longitud, que fluoresce significativamente cambiando la perdida de reflexin o que altera el enfoque del rayo proveniente de la muestra en el detector. Cuando una reaccin analtica es utilizada para convertir el analito a una forma con mayor absorbancia, tambin se aumenta la interferencia espectral blanco de especies en la muestra que no necesariamente absorben, pero que reaccionan con el reactivo analtico para formar una especie absorbente al anlisis de la longitud. La mayora de las interferencias con el analito en la naturaleza no son espectrales y son causadas por especies en la muestra, pero no en el estndar, stas afectan la concentracin de la forma absorbente del analito o la absorcin molar de la forma absorbente. As, las interferencias no espectrales ocurren cuando la matriz de la muestra da lugar a que cualquiera de los factores que afecten la linealidad o el acostamiento de la curva de calibracin puedan ser diferente entre el estndar y la muestra. Los concomitantes en una reaccin pueden afectar el equilibrio entre diferentes formas del analito, la fraccin del analito en la forma absorbente, el ambiente electrosttico, la absorcin molar y la contribucin relativa policromtica o prdida de la radiacin para la medicin. Tambin, la conversin eficiente de la reaccin analtica puede ser alterada por especies que interaccionan con el analito y que previenen esta reaccin con el reactivo o que consume una fraccin significante del reactivo. Los efectos de interferencia se reducen cuidando el anlisis de la longitud, el ancho de banda espectral y la reaccin analtica para lograr una selectividad por el analito. El cuidado de las condiciones de las soluciones como la concentracin del reactivo, el tipo de solvente, el pH y la fuerza inica puede aumentar la selectividad y previene el cambio en el equilibrio debido a una sola especie en la muestra. La separacin del analito de algunos interferentes por extraccin con solventes u otras tcnicas es esencial. A menudo la filtracin es recomendada para reducir potencialmente los interferentes. Normalmente, en reacciones analticas se recomienda un blanco interno, aqu la absorcin obtenida debido a especies que se encuentran en la muestra original que no reaccionan con el reactivo analtico puede ser compensado con un blanco que es la mnima mezcla de reaccin de la muestra y el reactivo crtico necesario para que la reaccin analtica se lleve a cabo. En algunos casos, el blanco interno se puede hacer adicionando otro reactivo que bloquea la formacin de formas absorbentes. Tcnicas estandarizadas de adicin pueden ser usadas cuando los interferentes afectan la calibracin. Otros factores que afectan interfiriendo y que pueden causar errores sistemticos incluyendo errores de calibracin (por ejemplo, utilizar un estndar errneo), errores en la muestra, contaminacin y prdida, descomposicin y diferencias en las condiciones de medicin (por ejemplo, pH , temperatura, celdas para la muestra con diferentes caractersticas) para las muestras y el estndar. Exactitud absoluta. En varias aplicaciones es necesario conocer las absorbancias verdaderas. Las especificaciones instrumentales de la exactitud fotomtrica es una medida de la habilidad del instrumento para medir valores de absorbancia exactos. De la ley de Lambert-Beer (A=bc), , b o c pueden ser determinados si las absorbancias absolutas son medidas exactamente y dos de las otras tres cantidades son conocidas. Por ejemplo, la absorcin molar puede ser determinada de la absorbancia si la concentracin del analito es 24

conocido. Para la calibracin de b o c, o para estudios fundamentales relacionados con parmetros de medidas de absorcin para cuantificaciones fundamentales (por ejemplo, probabilidad de transicin) o estructuras moleculares, es necesario un valor exacto de la absorbancia molar. Similarmente, se puede determinar el cambio de longitud de una muestra con la absorbancia de una solucin con un analito a una concentracin y una absorcin molar conocida. Para determinar exactamente o b se debe de tener extremo cuidado en la preparacin de las soluciones con concentraciones conocidas de analito. En aplicaciones analticas, la concentracin del analito en la muestra puede ser calculada directamente de la medicin de absorbancia de la muestra y valores conocidos de b y sin acudir a un estndar externo. Esto es comn, en donde los componentes son puros o con ensayos enzimticos clnicos porque los estndares puros de enzimas y protenas no estn disponibles. Cuando se realizan medidas absolutas, las condiciones experimentales pueden ser ajustadas para asegurar linealidad. Para un trabajo muy exacto las causas ms sutiles de no linealidad o errores sistemticos tal como mltiples reflexiones y cambios en el paso de la longitud deben ser considerados. Un ngulo de incidencia de 3% normalmente causan un error positivo del 0.1%. La preparacin de la solucin blanco y su medicin debe ser conducida a un camino en donde el factor de transmisin referencia (Tr) es el mismo en la muestra y la solucin blanco. Adicionalmente, la longitud dada por el monocromador puede ser calibrada exactamente. Errores en la calibracin de la longitud de 1 a 2 nm puede causar errores absolutos en la absorbancia de 0.1 a 1%, dependiendo del ancho de banda espectral y la anchura de la abertura de la banda de absorcin. Errores de medidas. Hay dos errores de lectura inherentes al detector espectromtrico. El primero se produce cuando hay una gran cantidad de analito y, por lo tanto, una gran absorbancia de radiacin. Al detector llega muy poca potencia radiante y se encuentra en la zona lmite de deteccin, con lo que no responde bien a pequeas variaciones de absorbancia. El segundo se produce cuando hay muy poco analito y, por tanto, muy poca absorbancia. Esto implica que casi toda la potencia incidente atraviesa la disolucin y llega al detector. Entonces, el detector espectromtrico est en la zona de saturacin y no detecta las pequeas variaciones en la absorcin. Otros errores relacionados con el aparato son debidos a que los espectrofotmetros no pueden seleccionar una radiacin de fija, sino un rango. Esto introduce un error ya que hay interacciones con otras absorciones. En la medida que el aparato sea ms exacto en la seleccin de , este error se minimiza. Errores qumicos. Hay analitos que tienen una ionizacin parcial y la especie ionizada puede tener diferente absorbancia que la especie molecular. Esto condiciona la absorbancia al desplazamiento del equilibrio. AH
Absorbe

A- + H+
Transparente

En este caso el error se puede evitar fijando el pH de la disolucin en con un tampn. Otro error esta relacionado con la variacin en el ndice de refraccin de la disolucin. Este efecto es significativo en disoluciones de elevada concentracin. En estos 25

casos la manera de evitar el error es realizar la calibracin de la tcnica con patrones que se mezclan con la disolucin problema. Calibracin. Dado que hay una serie de fenmenos que no permiten la aplicacin de la Ley de Beer, en la prctica se realiza siempre una calibracin de la tcnica de medida, con la cual obtenemos una relacin matemtica entre la concentracin y la absorbancia. El proceso de la calibracin se basa en medir la absorbancia de varias disoluciones patrn (de concentracin conocida), en las mismas condiciones que se mide la absorbancia de la disolucin problema, y se hace una interpolacin. Parmetros de calidad. La calidad de una tcnica espectrofotomtrica expresada en trminos de incertidumbre, se basa esencialmente en tres parmetros: sensibilidad, lmite de deteccin y rango de linealidad. a) Sensibilidad: Es la concentracin requerida para dar un 1% de absorbancia (99% de transmitancia o lo que es lo mismo 0,0044 unidades de absorbancia. A medida que esta concentracin es menor, la sensibilidad de la tcnica es mayor por que es necesaria menos concentracin para producir para producir una seal en el detector. b) Lmite de deteccin: Es la mnima concentracin que se puede medir con la tcnica y con un elevado nivel de certidumbre. Est relacionado con el ruido de fondo del aparato, es decir, la seal que mide el aparato cuando se introduce un blanco. Una manera de calcularlo es multiplicar por tres la seal correspondiente al ruido de fondo. c) Rango de linealidad: Es el intervalo de concentraciones dentro del cual podemos medir una muestra problema con un elevado nivel de certidumbre. Generalmente a partir del valor mximo de este rango, la seal (absorbancia) deja de tener una relacin lineal con la concentracin y la curva se hacer horizontal, tendiendo a un valor mximo de absorbancia. Las muestras o patrones que estn fuera de ese rango no se pueden medir con seguridad con la tcnica empleada. La espectrofotometra en biomolculas. Las molculas de inters biolgico tienen una variedad de cromforos UV intrnsecos adems de los que estn asociados con otros cromforos UV y visible en la forma de cofactores, grupos prostticos y sustratos. El grupo de pptidos de la cadena principal de una protena absorbe la luz en un rango de 180 a 230 nm. Las cadenas que tienen residuos aromticos solo absorben la luz en un rango de 240 a 300 nm (Tabla 2), esta regin es llamada ultravioleta cercano o regin aromtica. Los puentes disulfuro que se forman entre dos residuos de cistena se muestran en bandas de absorbancia de 260 nm. Muchos cofactores de protena absorben la luz en la regin ultravioleta y en la luz visible. El NADH reducido (dinucletido de nicotinamida y adenina) y FADH2 reducido (dinucletido de flavina y adenina) muestran espectros en el ultravioleta cercano. Algunos grupos metlicos y cofactores que contienen cobre absorben en la regin visible, por lo tanto la hemoglobina es roja y la plastocianina es azul. Cuando los grupos peptdicos y los residuos aromticos son parte de una estructura asimtrica o que se encuentran inmovilizados en un ambiente asimtrico (como plegamientos de protenas) presentan amplias absorbancias cuando se le hace circular luz polarizada. Este fenmeno es llamado dicrosmo circular.

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Tabla 2. Absorbancias de aminocidos aromticos. Componentes max (nm) Triptofano 280 Tirosina 275 Fenilalanina 258
a b

amax(M-1cm-1) 5600 1400 200

b280(M-1cm-1) 5500 1490

Coeficiente de absorcin a max en agua a pH neutral Coeficiente de absorcin a 280 nm; promedio de valores en funcin de la protena plegada.

Protenas. Las protenas, dependiendo de su composicin de aminocidos, tienen un espectro de absorcin amplio con picos en la regin de 275 a 290 nm. Este pico se presenta debido a mltiples contribuyentes de residuos de fenilalanina, tirosina y triptofano y un poco por la cistena (puentes disulfuro) (figura 11). Por ejemplo, la enzima malato deshidrogenasa mitocondrial de corazn de vaca, carece de residuos de triptofano y su espectro de absorcin puede ser descrito principalmente en trminos de residuos de tirosina (la contribucin de la fenilalanina es mucho menor debido a su bajo coeficiente de extincin molar a estas longitudes de onda). Debido a las mltiples contribuciones de los diferentes residuos en una protena, frecuentemente en una variedad de ambientes especficos, en cualquier protena es difcil obtener informacin til de su espectro de absorcin de UV. Una protena consiste de una cadena peptdica con varias cadenas laterales en los carbonos _ entre cada enlace peptdico, que es el cromforo dominante y tiene una transicin n_!* a casi 220 nm y una transicin intensa !_!* a casi 195 nm. Las transiciones electrnicas de muchas cadenas laterales ocurren a menos de 200 nm dominadas por la transicin intensa !_!* de las amidas. Las excepciones son fenilalanina, tirosina, triptofano, cistena, metionina y grupos disulfuro, los cuales comienzan sus transiciones electrnicas debajo de los 300 nm. Los sistemas ! de fenilalanina, tirosina y triptofano tienen las transiciones !_!* mostradas en la figura 9. En la figura 10, en el espectro de la poli-L-lisina se observan las transiciones electrnicas para las distintas conformaciones estructurales de una protena: el enrrollamiento aleatorio, la alfa hlice y la beta plegada. Ntese que las transiciones para la beta plegada y para el enrrollamiento aleatorio son muy similares, en comparacin con la alfa hlice, que presenta un hombro a 205 nm y el mximo a 190 nm. Esto significa que hay una prdida de intensidad para la alfa hlice, debido a la interaccin del grupo amida con otros cromforos amdicos, en comparacin con el enrrollamiento aleatorio que es slo la absorcin del grupo amida del enlace peptdico, segn la teora del excitn que predice la diferencia para la absorcin entre la alfa hlice y el enrrollamiento aleatorio. En la figura 10, en el espectro de la poli-L-lisina se observan las transiciones electrnicas para las distintas conformaciones estructurales de una protena: el enrrollamiento aleatorio, la alfa hlice y la beta plegada. Ntese que las transiciones para la beta plegada y para el enrrollamiento aleatorio son muy similares, en comparacin con la alfa hlice, que presenta un hombro a 205 nm y el mximo a 190 nm. Esto significa que hay una prdida de intensidad para la alfa hlice, debido a la interaccin del grupo amida con otros cromforos amdicos, en comparacin con el enrrollamiento aleatorio que es slo la

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absorcin del grupo amida del enlace peptdico, segn la teora del excitn que predice la diferencia para la absorcin entre la alfa hlice y el enrrollamiento aleatorio.

Fig.9. Espectro de absorcin electrnica para las cadenas laterales aromticas en solucin acuosa, pH 5 a 7: fenilalanina ( ); tirosina (------); triptofano ( _____ ).

Fig. 10. Espectro de absorcin para el cloruro de poli-L-lisina en solucin acuosa como enrrollamiento aleatorio a pH 6.0 a 25 C (); _-hlice a pH 10.8 a 25 C (-----); hoja _ a pH 10.8 a 52 C (_)

Las absorbancias de Trp y Tyr depende del microambiente de sus cromforos y ellos cambian ligeramente hacia al rojo cuando se transfieren de un ambiente polar a uno no polar, al igual que si se encuentra en el exterior o interior de una protena. Como consecuencia en protenas nativas los residuos que son expuestos al solvente y aquellos ocultos contribuyen de manera diferente al coeficiente de absorcin. Estas diferencias son pequeas, sin embargo, tpicamente es del 5%.

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De acuerdo a esto, el coeficiente de absorcin de una protena puede ser calculado en una muestra. Primero tiene que ser contado el nmero de Trp, Tyr y los puentes disulfuro de la cistena (ntrp, nTyr y nss respectivamente) y entonces es calculada utilizando la siguiente ecuacin como combinacin lineal de la contribucin individual de estos residuos de aminocidos: 280 (Lmol-1cm-1)= 5500 X ntrp + 1490 X nTyr + 125 X nss De la tabla 1 los coeficientes de extincin molar para Trp, Tyr y los puentes disulfuro de la Cys son 5500, 1490 y 125 M -1cm-1 respectivamente, estos valores representan el promedio de los valores de los cromforos en protenas plegadas. Los valores calculados con este simple procedimiento muestran una exactitud de 5%. Peace y colaboradores (1995), calculan los valores calculados y valores experimentales 280 de varias protenas. Si se requieren valores 280 ms exactos, pueden ser analizados dos soluciones con la misma concentracin de protena, uno que contenga slo buffer y otro que contenga buffer con cloruro de guanidinio 6 M. Las absorbancia de protenas no plegadas que exponen al solvente sus cromforos pueden ser entonces modeladas usando como referencia los valores 280 para el Trp, Tyr y los puentes disulfuro de los cromforos determinados en cloruro de guanidinio 6 M.

Fig. 11. Espectro diferencial pH inducido de la RNasa T 1. Obsrvese que a longitudes de onda menores a 285 nm hay cambio en el intervalo de pH de 3.54 a 4.29. A. pH 3.54. B. pH 4.29.

En protenas con un plegamiento nativo, los residuos aromticos que se encuentran ocultos en un ncleo hidrofbico de la molcula pueden mostrar un pequeo cambia hacia el rojo en su absorbancia, esto ocurre de manera inversa cuando estos aminocidos son expuestos al solvente. Esto se ilustra en la figura 6 con la protena ribonucleasa T 1. Las mximas diferencias en la absorbancia ocurren en la regin 285-295 nm. Las diferencias en los espectros muestran algunas bandas entre los 280-300 nm que son originadas por las 5 tirosinas y un solo residuo de triptofano. Generalmente las diferencias en las absorbancias

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de las protenas nativas y la forma desplegada son pequeas, pero son muy utilizadas para monitorear cambios conformacionales de una protena. Las protenas nativas pueden ser desplegadas por calor o ser desnaturalizadas con urea o cloruro de guanidinio. La transicin de una protena a un estado desplegado o desnaturalizado puede medirse siguiendo los cambios de absorbancia de 287 a 292 nm en funcin en la temperatura o la concentracin del agente desnaturalizante. Las absorbancias de una protena nativa y una desnaturalizada pueden depender de la temperatura. El ndice refractivo disminuye con la temperatura al igual que la concentracin de protena (debido a la extensin trmica de la solucin) y puede cambiar la ionizacin de grupos disociados. Cuando un agente desnaturalizante se agrega, las absorbancias de Tyr y Trp a 287 y 291 nm respectivamente se incrementa ligeramente, igual que en ausencia de transiciones estructurales. Los cambios en el ndice refractivo del solvente se originan por la concentracin del cloruro de guanidinio o urea. Otros efectos similares han sido observados cuando son utilizados otros agentes desnaturalizantes. cidos nucleicos. En los cidos nucleicos, las bases nucleotdicas son los cromforos, mientras que los azcares y los fosfatos que constituyen el eje catenario, tienen sus transiciones a energas mayores. Las estructuras electrnicas de las bases comunes (adenina, guanina, citosina, timina y uracilo) se dan en la tabla 3. En la figura 11 se muestra el sistema de electrones ! del sistema de anillos de la pirimidina y purina de las bases nucleotdicas, que aumentan las transiciones intensas !_!* que se observan en el espectro de absorcin electrnico. Las bases pueden ser protonadas y por lo tanto, los espectros del DNA y RNA son sensibles al pH. A pH neutro, la absorcin mxima es de 253 nm (guanosina) y 271 nm (citosina), por consecuencia, un polmero de DNA y RNA muestra una amplia y fuerte absorbancia a 260 nm. En DNAs nativos, las bases estn orientadas al centro hidrofbico de la doble hlice, por lo tanto, la absorbancia es considerablemente menor que la de un DNA de cadena sencilla donde las bases con anillos aromticos expuestos al solvente. Como el espectro de absorcin para un cido nucleico es graficado por monmero, podemos esperar que el espectro de absorcin sea el espectro promedio para las bases ponderadas que lo componen de acuerdo a la composicin del polmero y modificadas por las interacciones. Las interacciones degeneradas dan una divisin y una redistribucin de la intensidad, pero no un cambio neto en la intensidad. Las interacciones no degeneradas pueden llevar a un cambio neto en la intensidad como se observa en la figura 12 en el que la absorcin del DNA de Escherichia coli es casi del 60% del espectro promedio ponderado para las bases componentes. Esta prdida de intensidad de la interaccin no degenerada en el DNA se conoce como hipocromismo. El hipocromismo es muy til porque este cambio de intensidad puede ser utilizado para seguir la fusin de la estructura secundaria para cidos nucleicos con un cambio en el solvente o en la temperatura. En la figura 12 se grafica el incremento fraccional en la intensidad para la banda de 260 nm para DNA como una funcin de la temperatura. Vemos que como el DNA se desenrolla y pierde la interaccin entre las bases, la intensidad a 260 nm se incrementa. El valor mximo para la fusin completa es menor que el promedio ponderado para los monmeros (casi 88%) porque aun con enrrollamiento aleatorio el DNA tiene interaccin entre las bases que causa hipocromismo. La temperatura de fusin est 30

definida como la temperatura a la cual la mitad de la fusin se ha llevado a cabo. Vara con el tipo de DNA, la concentracin de la sal y el pH. La renaturalizacin durante el enfriamiento es incompleta porque en la mezcla de muchas secuencias distintas una hebra tendr gran dificultad en encontrar a su antiparalela.
Tabla 3. Estructura electrnica de las bases.

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Fig. 11. Espectro de absorcin electrnica para cinco desoxirribonucletidos en solucin acuosa a pH 7.

Fig. 12. Espectro de absorcin del DNA nativo de E. coli () y el espectro promedio para los cuatro componentes desoxinucletidos en solucin acuosa (------)

La densidad ptica a 260 nm del DNA se incrementa si el DNA es calentado en un rango de temperaturas especficas. El hipercromismo es una medida de la desnaturalizacin o una transicin hlice-enrrollamiento y resulta del desenmaraamiento de las bases del DNA asociadas con la separacin continua de las dos hebras de polinucletidos. La determinacin de la densidad ptica en el DNA nos permite conocer la estabilidad del DNA en relacin con la temperatura, pH, fuerza inica y la adicin de 32

pequeas molculas adicionadas con solventes polares y no polares. Entre las propiedades del DNA que se han determinado utilizando esta tcnica, se encuentran: i) La estabilidad del DNA se incrementa con el contenido de G-C. ii) Si aumenta la temperatura no al punto de mxima absorbancia y despus disminuye a una temperatura en la cual no se incrementa la densidad ptica, la densidad ptica cae inmediatamente a su valor original, indicando que si la separacin de las dos cadenas no es completa, la estructura nativa se regenera. iii) La separacin de las cadenas no ocurre sino hasta que se ha rebasado la regin de transicin ptica, estimada en 77.5 C, porque la separacin de las ltimas pares de bases tiene un efecto dbil sobre el cambio total en la absorbancia. iv) Si el DNA se calienta a temperaturas que propicia la separacin de cadenas y despus se enfra, hay una disminucin de la absorbancia en presencia de una fuerza inica alta (NaCl 0.1 M), debido a que los enlaces de hidrgeno intra e intercatenarios vuelven a formarse aleatoriamente; esto quiere decir que cuando el DNA desnaturalizado se encuentra en un ambiente de alta fuerza inica, se regenera. v) La renaturalizacin del DNA se presenta cuando en un ambiente de alta fuerza inica que vara de 0.5 a 1.0 M de NaCl y en una temperatura menor al punto de fusin (Tm), en pocas horas la densidad ptica vuelve al valor inicial (antes de la desnaturalizacin). En DNA de doble cadena o en un RNA duplex, las dos cadenas estn unidas por fuerzas no covalentes, primero por puentes de hidrgeno e interacciones de Van de Waals entre nos anillos aromticos de las bases. Estas interacciones se pueden romper por calor y esto se puede seguir mediante un aumento en la absorbancia a 260 nm. Una grfica de la absorbancia en funcin con la temperatura es llamada como una curva de fusin y la temperatura a la que el incremento en la absorbancia al 50% es definida como la temperatura de fusin del cido nucleico de doble hlice que es estudiado. La temperatura de fusin de una molcula DNA de doble hlice depende de la naturaleza del solvente y el contenido relativo de G + C vs A + T. En una doble cadena de DNA, las cargas negativas del los grupos fosfato del esqueleto de la cadena se repelen uno con otro y entonces disminuye la estabilidad del duplex. Esta repulsin electrosttica desfavorable se analiza progresivamente con un conteo de iones (tpicamente en forma de NaCl) agregando concentraciones cada vez mayores. De tal manera que la estabilidad de la cadena duplex aumenta fuertemente con la concentracin de las sales en el solvente. Los pares de bases GC, forman tres puentes de hidrgeno por lo tanto son ms estables que los pares de bases AT que forman slo dos puentes de hidrgeno. Por lo tanto, la temperatura de fusin del DNA duplex incrementa de acuerdo al contenido de G + C; de hecho ell contenido de G + C del DNA puede ser determinado a partir de su temperatura de fusin. Un DNA duplex largo contiene regiones con diferentes contenidos de G + C, de manera que se pueden tener diferentes puntos de fusin. Factores que afectan las propiedades de absorcin de un cromforo. El espectro de absorcin de un cromforo est determinado inicialmente por la estructura qumica de la molcula, pero un gran nmero de factores ambientales producen

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cambios detectables en mx y . Los factores ambientales son el pH, la polaridad del solvente o molculas vecinas y la orientacin relativa de los cromforos vecinos. Las caractersticas generales de estos efectos ambientales son las siguientes: Efectos de pH. Los espectros de absorcin de ultravioleta permiten conocer grupos disociables en la vecindad de los residuos aromticos en protenas. Walz encontr un espectro diferencial para la ribonucleasa T1, que consiste de dos regiones. La regin de 270 a 288 nm titulada con un pKa de 3.54, la regin de 285 a 310 nm titulada a pKa 4.29. La ribonucleasa T1, tiene la caracterstica extraordinaria de tener grandes porcentajes de cadenas laterales aromticas y carboxlicas, consider de inters estudiar el proceso de ionizacin de sus grupos carboxilo, conociendo que el Glu-58 est flanqueado por Trp-59 y Tyr-57 en la estructura primaria de la enzima. Walz obtuvo un espectro diferencial para la ribonucleasa T 1 (fig 12). Por los resultados obtenidos se sugiere que dos componentes independientes del espectro reflejan procesos de ionizacin distintos. Los cambios a longitud de onda mayores, con pKa 4.29 se sugiere que se originan debido a la ionizacin del glutamato-58, resultante de la perturbacin de triptofano 59. Los cambios a longitud de onda ms corta, con pKa 3.54, se cree que son debidos a la perturbacin de un residuo de tirosina como resultado de la ionizacin de otro grupo carboxilo.

Fig. 12. Espectro diferencial pH inducido de la RNasa T 1. Obsrvese que a longitudes de onda menores a 285 nm hay cambio en el intervalo de pH de 3.54 a 4.29. A. pH 3.54. B. pH 4.29.

Interaccin de las cadenas de protenas. La espectroscopa diferencial ultravioleta se ha utilizado para estudiar reacciones de asociacin y disociacin en protenas multimricas. La glucosa deshidrogenasa es un tetrmero estable a pH 6.5 que consiste de cadenas polipeptdicas idnticas en tamao y carga y muestra la capacidad inusual de una disociacin completamente reversible a protmeros inactivos en condiciones muy suaves (pH 8.5). La disociacin genera una seal azul en la regin de 285 a 300 nm en aumento, provocada por los residuos de triptofano expuestos despus de la disociacin. La regin positiva del espectro en el rango por debajo de los 285 nm muestra contribuciones menores de los residuos de tirosina y fenilalanina adems de una contribucin positiva del triptofano (fig. 14).

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Fig. 14. Espectro de absorcin diferencial de la glucosa deshidrogenasa expuesta a disociacin que muestra las alteraciones del microambiente de los residuos aromticos. (Pauly and Pfleiderer, 1977)

Efectos de polaridad. El espectro de absorcin de un aminocido aromtico es sensible al cambio en el ambiente en que se encuentran. En general, el cambio en la longitud de la mxima absorcin predomina, se observa un cambio al color azul del espectro cuando la polaridad del solvente se incrementa. Por ejemplo, la mxima absorcin de la tirosina cambia por casi 3 nm, de 277 a 274 nm cuando el solvente es cambiado de carbn tetraclorito a agua. Este cambio en el espectro combinado con los cambios menores en la fuerza de la absorbancia y la estructura fina del espectro, lleva al mximo las diferencias espectrales en el espectro original, esto es en la regin 285-288 nm para Tyr y 290-300 nm en Trp. Para cromforos polares, el valor de _mx para las transiciones n_!* ocurren a longitudes de onda ms cortas en solventes hidroxlicos polares que en solventes no polares. Para las transiciones !_!* el corrimiento es hacia longitudes de onda mayores y es la transicin ms comn en las molculas biolgicas. Los cambios en el ambiente de los residuos aromticos como resultado de cambios conformacionales inducidos por enlaces a ligandos, se han estudiado por espectroscopa diferencial ultravioleta. El enlace de Darabinitol 1,5 difosfato (Ara-P2), un inhibidor competitivo, a la aldolasa del msculo del conejo, causa un cambio en el ambiente del residuo del triptofano, generando un mnimo muy pronunciado a 298 nm, en comparacin al 1,5-pentanodiol difosfato (Pen-P2) que no tiene un mnimo a 298 nm y al pequeo mnimo mostrado por el fostato inorgnico (figura 15), lo que sugiere que los grupos hidroxilo del arabinitol son necesarios para producir cambios en el ambiente alrededor del residuo de triptofano (Crowder et al, 1973) que son enmascarados por el efecto de carga en el P i. Crowder y colaboradores tambin demostraron que los cambios conformacionales se deben a la interaccin del triptofano con el solvente, y que ste no afecta la afinidad o la estequiometra del enlace al inhibidor (figura 16).

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Fig. 15. Diferencias espectrales por el enlace de concentraciones de saturacin de arabinitol (Ara-P2), pentanodiol (Pen-P2) y fosfato inorgnico (Pi) a la aldolasa

Fig. 16. Representacin esquemtica del cambio conformacional del triptofano en presencia del etilnglicol (A) y la perturbacin del residuo de triptofano por el ligando (B).

Un ejemplo ms del cambio de conformacin Efectos de orientacin. Las caractersticas geomtricas frecuentemente tienen efectos fuertes sobre mx y . El mejor conocido es el hipocromismo de cidos nucleicos, es decir, el coeficiente de absorcin de un nucletido disminuye cuando el nucletido est contenido en un polinucletido de cadena sencilla en la cual las bases del nucletido estn muy cercanas. Posteriormente hay una disminucin en un polinucletido de doble cadena porque las bases estn en un arreglo ms ordenado. Enlace a ligandos. Muchas enzimas usan sustratos que son cromforos o que pueden transformarse en cromforos cuando son enlazados a enzimas. Esa transformacin puede ser verificada por espectroscopa diferencial en ultravioleta tal como lo hicieron Cross y Fischer, al probar la unin de diversas coenzimas y anlogos a la glutamato deshidrogenasa. En la figura 17 se observan tres regiones de absorbancia diferencial. Los cambios en la absorbancia en la regin de 330 a 380 nm resulta de la perturbacin de los cromforos de nicotinamida reducida de las coenzimas; las caractersticas finas en la regin de 280 a 290 nm resulta de cambios en la absorcin del aminocido aromtico de la enzima

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y la regin de 260 nm muestra caractersticas debido a cambios en la absorcin de adenina de los ligandos. Esto sugiere que la molcula de la glutamato deshidrogenasa contiene al menos, seis subsitios separados capaz de combinarse con un grupo ligando funcional especfico. Anlisis qumico por espectroscopa de absorcin utilizando la luz visible y ultravioleta. Medicin de concentracin. El uso ms comn de las mediciones de absorbancia es determinar la concentracin. Algunas veces, el material a medir consiste de partculas que absorben la luz en suspensin ms que en solucin, tal es el caso de bacterias, en el que se determina la densidad ptica. Un ejemplo lo dan Paz y Pinto (2002), que utilizaron etanol al 42% para extraer pigmentos a partir del licor de cerezas. Con luz visible obtuvieron el espectro para distintos periodos de remojo de cerezas en etanol y pudieron determinar no slo la concentracin del pigmento, sino el tipo de compuesto (fig. 18). Los valores del espectro de absorcin ptico revelaron que hay una regin de absorcin centrada en 525 nm, que atribuyeron a la presencia de pigmentos de antocianina. La concentracin de cidos nucleicos en solucin son normalmente determinadas por su absorbancia a 260 nm. Para cidos deoxirribonuclecos (DNA) de doble cadena una unidad de absorbancia A260 equivale a 50 g de DNA; para DNA de cadena sencilla esto es equivalente a 33 g y para cido ribonucleico (RNA) de cadena sencilla esto es equivalente a 40 g de RNA. Todas estas cantidades habran causado 1 unidad de absorbancia disuelta en 1 mL y medida en una celda de 1 cm. Muchas protenas absorben ms pobremente que los cidos nucleicos. Algunas protenas contaminantes pueden alterar en el clculo de la concentracin de cidos nucleicos, cuando se hacen mediciones a 260 nm, en una mezcla 1:1 de cidos nucleicos y protenas se ha demostrado que las protenas contribuyen solo al 2% de la absorbancia total a 260 nm.

Fig. 17. Espectro de enlace diferencial de coenzimas y ADP a la glutamato deshidrogenasa.

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Fig. 18. Espectro de absorcin visible de licor de cereza a 23 C para diferentes tiempos de maceracin de cerezas.

El mtodo ptico para determinar concentracin es no destructivo. Si en una mezcla de aminocidos es fraccionada, la concentracin de triptofano puede determinarse por la absorbancia a 280 nm usando el valor de = 5600M -1cm-1. As, si la absorbancia en una cubeta de 4 cm de espesor es de 0.26, la concentracin es: 0.26/4(5600) = 1.16 x 10-5 M. Ensayos de reacciones qumicas. Muchas reacciones qumicas pueden ensayarse si uno de los reactivos cambia en absorbancia durante el curso de la reaccin. Una enzima cataliza la conversin de uno o varios sustratos a uno o varios productos. El grado de reaccin catalizada o la actividad de una enzima puede ser determinado al medir el decremento en la concentracin del sustrato o el incremento en la concentracin de los productos como una funcin del tiempo de reaccin. Cuando el sustrato (S) y el producto (P) difieren en la absorbancia, el progreso de una reaccin enzimtica se puede seguir directamente por el monitoreo del cambio de absorbancia en funcin del tiempo. Los cambios de absorbancia son relacionados linealmente con los cambios en la concentracin (relacin de la va Lambert-Beer) y por lo tanto el intervalo de reaccin puede ser calculado directamente a partir de los datos de absorbancia, cuando se conocen los coeficientes de absorcin de las especies de la reaccin. Las reacciones enzimticas unidas a la NADH, como las catalizadas por la lactato, malato o alcohol deshidrogenasas son excelentes ejemplos para ensayos enzimaticos basados en la absorbancia. El anillo de nicotinamida reducido en NADH, muestra un mximo de absorbancia a los 340 nm (340 = 6220 L mol-1 cm-1), el cual se pierde en la oxidacin al NAD+. Entonces las actividades de estas deshidrogenasas pueden ser medidas directamente siguiendo la disminucin de la absorbancia a 340 nm en funcin del tiempo (figura 19). Cuando no ocurren cambios en la absorbancia durante la reaccin de una enzima con su sustrato natural, a menudo pueden ser sintetizados derivados de color con grupos reporteros cromofricos. Un reportero comnmente usado es el 4-nitrofenolato, el cual absorbe a 400 nm. Este grupo puede ser esterificado con cido actico a 4-nitrofenilacetato (que sirve como sustrato para proteasas), con fosfato (como sustrato para fosfatasas) o con azucares (para probar amilasas o glicosidasas).

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NAD+ A bs A or b a n ce
250
250

NADH max= 340 nm

300
300

350

400

_(nm) (nm)

350

Fig. 19. Espectro de absorcin de la coenzima NAD cuando ha sufrido una reaccin enzimtica.

En casos favorables una reaccin enzimtica silenciosa, es decir, con un producto que carece o da poco color, puede ser acoplada con otra reaccin enzimtica que use el producto de la primera reaccin enzimtica a una conversin que la conduzca a un cambio en la absorbancia. A menudo, las reacciones silenciosas son acopladas a un paso de consumo o produccin de NADH. Como se menciono anteriormente, los cambios en la concentracin de NADH, pueden seguirse fcilmente por un cambio fuerte en la absorbancia a 340 nm. Es esencial que en los ensayos enzimticos acoplados el grado de la reaccin indicadora sea mucho ms alto que el grado de la reaccin primaria. Por lo tanto se requiere usar una enzima indicadora a una concentracin alta. Interpretacin de espectros de absorcin. Existen reglas empricas para la interpretacin del espectro de absorcin de molculas biolgicas, como resultado del gran nmero de estudios, en diferentes condiciones, de molculas bien conocidas y a continuacin se enumeran: 1) Si los aminocidos Trp, Tyr, Phe e His se corren a un ambiente menos polar, mx y aumentan. Por consiguiente: a) Si el espectro de un aminocido en una protena en un solvente polar muestra que mx y son mayores que para los aminocidos libres en el mismo solvente, entonces ese aminocido debe estar en una regin interna de la protena (oculto) y rodeado por aminocidos no polares.

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b) Si el espectro de una protena es sensible a cambios en la polaridad del solvente, el aminocido que muestra un cambio en mx y debe estar en la superficie de la protena. c) Para usar esta regla se debe establecer que el cambio en la polaridad no causa un cambio en la conformacin que pudiera llevar a un aminocido a la superficie. Tales cambios generalmente no ocurren con el solvente utilizado. 2) Para aminocidos en los que mx y siempre aumentan un grupo titulable est cargado (por ejemplo, el OH de la tirosina, el grupo imidazol de la histidina y el sulfhidrilo de la cistena). Por lo tanto, cuando el pH cambia: a) Si ningn cambio espectral se observa para uno de estos cromforos y si el cambio de pH es tal que la titulacin de un aminocido libre podra haber ocurrido, el cromforo debe estar oculto en una regin no polar de la protena. b) Si el cambio espectral como funcin del pH indica que el grupo ionizable tiene el mismo pK como estara en solucin libre, entonces el aminocido se encuentra en la superficie de la protena. c) Si el cambio espectral como funcin del pH indica un muy diferente pK, entonces es probable que el aminocido se encuentre en un ambiente fuertemente polar (por ejemplo, tirosina rodeada de grupos carboxilo) 3) Para purinas y pirimidinas, disminuye conforme sus sistemas anulares se tornan paralelos y se acercan uno a otro (ms amontonados). El valor de disminuye en las siguientes series: base libre > base en un polinucletido no amontonado de una cadena > base en un polinucletido amontonado de una sola cadena > base en un polinucletido de cadena doble. Cuando d = 1 cm, A es comnmente llamado OD_ o densidad ptica, en el cual el subndice indica la longitud de onda a la cual se hizo la medicin. Espectroscopia diferencial ultravioleta. Plegamiento de cadenas polipeptdicas. Cuando una protena se encuentra en su conformacin nativa algunos de sus residuos aromticos se localizarn en la parte externa de la molcula y algunos en la parte interna. El espectro de absorcin de la protena nativa ser producto de las contribuciones de los cromforos externos que estn expuestos al solvente acuoso y de los cromforos internos que estn protegidos del solvente acuoso por un ambiente hidrofbico. Cuando la molcula se desdobla debido a la presencia del cloruro de guanidinio o la urea, los residuos hidrofbicos son expuestos al solvente y sufren un cambio en las propiedades de absorbancia. La diferencia entre los espectros de la protena nativa y la desnaturalizada permite seguir el proceso de desnaturalizacin espectralmente. El proceso de desnaturalizacin puede seguirse por los cambios en las propiedades pticas de los cromforos aparte de los residuos de protena. Por ejemplo, la desnaturalizacin de varias protenas hemo puede seguirse por la disminucin en la absorbancia de la banda de Soret (405 a 410 nm) cuando el grupo hemo es liberado de la protena.

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