TEMA 8 RESPIRACIN CELULAR Metabolismo Conjunto muy ordenado de reacciones qumicas mediantelas cuales las clulas obtienen por

una parte Energa y Poder Reductor a partir de su entorno y por otra parte Sintetizan los componentes fundamentales de las macromolculas De piruvato a Acetil CoA Antes de entrar en el ciclo de Krebs, los esqueletos carbonatados de cidos grasos y azcares deben ser degradados al grupo acetilo del acetil-CoA. El piruvato es un cetocido que sufre una descarboxilacin oxidativa y pasa a ser un tioster. Es una reaccin muy favorable termodinmicamente. El enzima que cataliza estar sometida a regulacin. El complejo piruvato deshidrogenasa es muy grande. El piruvato se forma en el citosol, tiene que atravesar la membrana externa de la mitocondria, que es permeable por la colina. Cuando llega a las crestas mitocondriales necesita una protena transportadora. La reaccin global catalizada por el complejo de la piruvato deshidrogenasa es una descarboxilacin oxidativa, un proceso de oxidacin irreversible en el que el piruvato pierde un grupo carboxilo en forma de molcula de CO2 y los dos carbonos restantes se transforman en el grupo acetilo del acetil CoA. El NADH formado en esta reaccin libera un in hidruro a la cadena respiratoria. El complejo de la piruvaato deshidrogenasa, est formado por las enzimas:

E1: piruvato deshidrogenasa. Es la ms lenta, por lo que cataliza la reaccin limitante. E2: dihidroxilipoil transacetilasa E3: dihidroxilipoil deshidrogenasa Aparte de estos 3 enzimas, intervienen 5 cofactores o coenzimas: Tiamina (TPP) unida a E1 no covalentemente. cido lipoico, unido a E2 covalentemente FAD, unido a E3 fuertemente (pero no covalentemente) NAD CoA El complejo se localiza en las mitocondrias en eucariotas y en el citosol en bacterias. En E.coli el complejo de enzimas tiene la siguiente forma (suponemos que el complejo tiene forma de cubo): 24 cadenas polipeptdicas del enzima Es, que es un trmero (en eucariotas hay 8 trmeros). Se sitan en el centro del cubo. E1 es un dmero, y se sita sobre las 12 aristas del cubo. E3 est situado sobre el centro de cada una de las 6 caras del cubo. Tambin es un dmero Estructura de los coenzimas -Pirofosfato de tiamina El sitio activo en el carbono 2. Durante la reaccin enzimtica pierde un hidrgeno en forma de protn, quedndose como un carbanin. El N+ que tiene tira de los electrones, entonces el hidrgeno se podr desprender fcilmente. -CoA El grupo tiol es el grupo reactivo, que suele formar tisteres con cidos grasos (grupos acilo). Son compuestos de alta energa de

hidrlisis, por lo que tienen un elevado potencial para transferir

grupos acilo. -NADH En la imagen se puede ver dnde se sita el centro activo. Acepta un ion hidruro, transformndose en NADH + H+ -cido lipoico. Tiene dos grupos tiol que pueden experimentar una oxidacin reversible hasta formar un enlace disulfuro (-S-S-). Unido covalentemente a E2 a travs de su grupo carboxilo, se une a un grupo amino del enzima, perdindose una molcula de agua y se forma un enlace amida. El grupo amino pertenece a una cadena lateral de Lys. -FAD Intervienen en reacciones redox. Contiene riboflavina y FMN. La parte reactiva son dos tomos de nitrgeno, que aceptan dos tomos de hidrgeno. Primero acepta uno, conviertindose en un radical, y

cuando

acepta

el

otro

se

forma

el

FADH2.

1 etapa Descarboxilacin del piruvato

Al irse el protn de TPP, se queda el carbono cargado negativamente (requiere pH bsico, condiciones que se dan en el centro activo del enzima). Se produce una condensacin aldlica cuando el carbanin se adiciona al grupo carbonilo del piruvato. Despus se adiciona un protn y se produce un desplazamiento electrnico , que produzca la liberacin de CO2. Tiene lugar la reordenacin de un doble enlace. Despus se adiciona un protn, acabando la 1 etapa con la hidroxietil-TPP. Esta reaccin est catalizada por E1. 2 etapa Oxidacin

El grupo hidroxietilo unido al TPP se oxida para formar un grupo acetilo y acto seguido se transfiere a la lipoamida, un derivado del cido lipoico, unido a la cadena lateral de lisina (de E2) mediante un enlace amida. Se rompe en enlace disulfuro del cido lipoico y se forma un enlace tioster rico en energa. En esta reaccin el oxidante es el grupo disulfuro de la lipoamida, el cual se reduce a disulfhidrilo. Esta reaccin est catalizada por E2. 3 etapa Formacin del acetil-CoA

Se transfiere el grupo acetilo desde la acetil-lipoamida al CoA para formar acetil-CoA. Esta reaccin est catalizada por E2. 4 etapa Regeneracin de la forma oxidada de la lipoamida. E2 no puede realizar otro ciclo cataltico hasta que la dihidrolipoamida sea oxidada a lipoamida. Para ello, se transfieren dos electrones a un grupo prosttico FAD del enzima.

5 etapa

El NAD coge los dos hidrgenos del FADH2, dejndolo en su forma original.

Enzima E2 Ocupa una posicin central en el complejo. En E2 se distinguen varios dominios: -regin Amino terminal, donde se une el cido lipoico, por lo que contiene el residuo de Lys (dominio N-lipoil o lipoil N-terminal). El nmero de molculas de c. Lipoico vara dependiendo del organismo. En levadura una molcula, en mamferos dos, en E.coli tres. -Dominio central implicado en la unin con el enzima E1 y con E3. -Dominio Carboxilo terminal o aciltransferasa. Es el dominio cataltico. Los dominios estn separados por unas regiones flexibles llamadas conectores, ricas en aa de Pro y Ala y entremezcladas con residuos cargados. Estos conectores tienden a estar en su forma extendida, con lo que mantienen separados sus tres dominios. La unin del lipoato al extremo de la cadena lateral de una Lys en E2 da lugar a un brazo largo y flexible que puede desplazarse desde el sitio activo de E1 a los sitios activos de E2 y E3, una distancia de unos 5 nm o ms. Este brazo desempea un papel central en el mecanismo del complejo PDH al aceptar de E1 los dos electrones y el grupo acetilo procedentes del piruvato y pasarlos a E3.

La piruvato deshidrogenasa (E1) acepta dos tomos de pirvico. Estas reacciones slo tienen lugar cuando las condiciones son aerbicas, porque sino el NADH no se reduce para volver a su estado original. El enzima en eucariotas tiene estructura de dodecaedro. De E2 hay 20 trmeros dispuestos en los 20 vrtices del dodecaedro. En total seran 60 copias. E1 (tetrmero) tiene dos tipos de subunidades, alfa y beta. Existen 30 tetrmeros situados en las aristas del dodecaedro. De E3 hay 12 dmeros. Incluye adems una protena piruvato deshidrogenasa quinasa y otra piruvato deshidrogenasa fosfatasa. Ventajas del complejo enzimtico -Aumenta la velocidad de reaccin. Los metabolitos permanecen adheridos al complejo, acelerando la reaccin, porque no hay fase de difusin. -Evita la posibilidad de reacciones secundarias: el producto, al salir del complejo enseguida se encuentra con la siguiente enzima que lo cataliza. Esto se llama canalizacin. -Permite una regulacin conjunta de todos los enzimas. Regulacin La regulacin se explica ms abajo, ya que se entiende mejor tras haber explicado el ciclo de Krebs. CICLO DE KREBS Es el proceso mediante el cual se oxida acetil-CoA. Es comn para glcidos, lpidos y protenas. En cada vuelta del ciclo se produce la entrada de un grupo acetilo (dos carbonos) en forma de Acetil CoA y la salida de dos molculas de CO2. No se produce una prdida neta de oxalacetato; en teora, una sola molcula de este compuesto sera suficiente para promover la oxidacin de un nmero infinito de grupos acetilo, y de hecho, el oxalacetato se encuentra en las clulas en concentraciones muy bajas. El ciclo del cido ctrico transcurre en ocho pasos. 1. Formacin de citrato La primera reaccin del ciclo es la condensacin del acetil-CoA con oxalacetato para dar lugar a citrato, en una reaccin catalizada por la citrato sintasa. En esta reaccin, el carbono metlico del grupo acetilo se une al grupo carbonlico (C 2) del oxalacetato. El citril-CoA es un intermediario transitorio que se forma en el sitio activo del enzima y que se hidroliza rpidamente a CoA y citrato libres, que a continuacin abandonan el sitio activo. La

hidrlisis de este intermedio tioster de elevada energa hace que la reaccin sea exoergnica; esto resulta esencial para el funcionamiento del ciclo a consecuencia de la baja concentracin de oxalacetato normalmente presente. El CoA liberado en esta reaccin se recicla. La citrato sintasa es la enzima que cataliza esta reaccin. Cada subunidad del enzima homodimrico es una sola cadena polipeptdica con dos dominios, uno de ellos grande y rgido y el otro pequeo y flexible. El sitio activo se sita entre los dos. El oxalacetato, primer sustrato que se une al enzima, induce un gran cambio de conformacin en el dominio flexible, que provoca la aparicin de un sitio de unin para el segundo sustrato, el acetil-CoA. Cuando se ha formado el citril-CoA en el sitio activo del enzima, otro cambio conformacional produce la hidrlisis del tioster con liberacin de CoA-SH. Se trata de una condensacin de Claisen, en la que interviene un tioster (acetil CoA) y una cetona (oxalacetato). 2. Formacin de isocritato va cis-aconiato El enzima aconitasa (denominado formalmente aconitato hidratasa) cataliza la formacin reversible del citrato en isocitrato a travs de la formacin intermedia del cido tricarboxlico cis-aconitato, que normalmente no se disocia del sitio activo. La aconitasa puede promover la adicin reversible de H2O al doble enlace del cisaconiato unido al enzima mediante dos vas diferentes, de las que una conduce a citrato y la otra a isocitrato. En la clula la reaccin transcurre hacia la derecha gracias a la rapidez del consumo de isocitrato en siguiente paso del ciclo. La aconitasa contiene un centro ferro-sulfurado que

acta tanto en la fijacin del sustrato en el sitio activo como en la adicin o eliminacin catalticas del H2O. 3. Oxidacin del isocitrato a -cetoglutarato y CO2. En el paso siguiente la isocitrato deshidrogenasa cataliza la descarboxilacin oxidativa del isocitrato, dando lugar a la formacin de -cetoglutarato. El Mn2+ del sitio activo interacciona con el grupo carbonilo del intermedio oxalsuccinato que se forma fugazmente sin dejar el sitio de unin hasta que la descarboxilacin lo convierte en -cetoglutarato. Hay dos formas diferentes de isocitrato deshidrogenasa en todas las clulas, una de las cuales requiere NAD+ como aceptor de electrones, mientras que la otra requiere NADP+.

4. Oxidacin del -cetoglutarato a succinil-CoA y CO2. Es otra descarbixalicin oxidativa por la que -cetoglutarato se convierte en succinil CoA y CO2 por accin del complejo de la cetoglutarato deshidrogenasa; el NAD+ acta como aceptor de electrones y el CoA es el transportador de grupo succinilo. La energa de oxidacin del -cetoglutarato se conserva gracias a la formacin del enlace tioster del succinil CoA. Esta reaccin es virtualmente idntica a la reaccin de la piruvato deshidrogenasa, y el complejo de la cetoglutarato deshidrogenasa es muy parecido al complejo de la PDH. Posee tres enzimas homlogos a E1, E2 y E3 del complejo de la PDH, as como TPP unido al enzima y tambin lipoato, FAD, NAD y coenzima A. 5. Conversin de succinil-CoA en succinato. El succinil Co-A tiene un enlace tioster con una energa libre estndar de hidrlisis altamente negativa (G0=-36kJ/mol). La energa liberada en la rotura de este enlace se utiliza para promover la sntesis de un enlace fosfoanhdrido del GTP o del ATP con una G 0 neta de slo -2,9 kJ/mol. En el proceso se forma succinato. El enzima que cataliza esta reaccin es la succinil-CoA sintetasa o succnico tioquinasa. Esta reaccin presenta un paso intermedio en el que la misma molcula de enzima queda fosforilada en un residuo His

en el sitio activo. Este grupo fosforilo, que posee un elevado potencial de transferencia de grupo, es transferido a ADP (o bien GDP) para formar ATP (o bien GTP). Las clulas animales tienen dos isozimas de la succinil-CoA sintetasa, uno especfico para ADP y otro para GDP. El enzima tiene dos subunidades, la , que contiene el sitio de unin para el CoA y el residuo P-His, y la beta, que confiere especificidad por ADP o GDP. El sitio activo se encuentra en la interfase entre subunidades. El GTP formado por la succinil CoA sintetasa puede donar su grupo fosfato terminal al ADP para formar ATP, en una reaccin reversible catalizada por la nuclesido difosfato quinasa: GTP + ADP ---> GDP + ATP G0=0kJ/mol

6. Oxidacin del succinato a fumarato El succinato formado a partir de succinil-CoA seoxida a fumarato por la flavoprotena succinato deshidrogenasa. En eucariotas, la succinato deshidrogenasa se encuentra unida fuertemente a la membrana mitocondrial interna. El enzima contiene tres agrupaciones de hierroazufre diferentes y una molcula de FAD unida covalentemente. Los electrones pasan desde el succinato a travs del FAD y los centros ferro-sulfurados antes de entrar en la cadena de transportadores electrnicos. 7. Hidratacin del fumarato a malato La hidratacin reversible del fumarato a L-malato est catalizada por la fumarasa (formalmente fumarato hidratasa). El estado de transicin en esta reaccin es un carbanin. Este enzima es altamente estereoespecfico; cataliza la hidratacin del doble enlace en trans del

fumarato, pero no el doble enlace en cis del maleato 8el ismero cis del fumarato). 8. Oxidacin de malato a oxalacetato La L-malato deshidrogenasa ligada a NAD cataliza la oxidacin del Lmalato a oxalacetato. El equilibrio de esta reaccin se encuentra muy desplazado hacia la izqda en condiciones termodinmicas estndar, pero en clulas intactas el oxalacetato es eliminado continuamente por la reaccin altamente exergnica de la citrato sintasa. Esto mantiene la concentracin intracelular de oxalacetato extremadamente baja, lo que empuja la reaccin de la malato deshidrogenasa hacia la formacin de oxalacetato.

Dos tomos de carbono salieron del ciclo como CO2 debido a la oxidacin del isocitrao y el cetoglutarato. Los tomos de carbono que salen en la primera vuelta no son los del grupo acetato que entra como acetil CoA. La energa liberada en estas oxidaciones se conserv reduciendo tres NAD+ y un FAD, y la produccin de un ATP o GTP. A pesar de que el ciclo del cido ctrico en s genera directamente slo un ATP por vuelta, los cuatro pasos de oxidacin en el ciclo proporcionan un gran flujo de electrones hacia la cadena respiratoria va NADH y FADH2, y de este modo posibilita la formacin de un gran nmero de molculas de ATP. Como balance total, 2840 kJ/mol se generan tras la oxidacin completa de la glucosa, pero cuando se corrige por la energa libre real necesaria para sintetizar ATP dentro de las clulas la eficiencia calculada para este proceso es de aproximadamente el 65%. Esta ruta puede parecer innecesariamente complicada y no en consonancia con principio biolgico de mxima economa. Sin

embargo, esta ruta ocurre as porque, bajo ciertas coircunstancias metablicas, los intermediarios son retirados del ciclo para ser utilizados como precursores en una multitud de vas biosintticas. El -cetoglutarato y el oxalacetato pueden, por ejemplo, servir como precursores de los aminocidos aspartato y glutamato por simple transaminacin. Se utilizan entonces para sintetizar otros aminocidos as como nucletidos de purina y pirimidina. El oxalacetato se convierte en glucosa mediante gluconeognesis. El succinil CoA es un intermediario central en la sntesis del anillo de profirina de los grupos hemo.

Reacciones anapletricas A medida que los intermediarios son retirados del ciclo de Krebs para servir como precursores biosintticos, son repuestos mediante reacciones anapletricas. Todas ellas convierten piruvato o fosfoenolpiruvato en oxalacetato o malato en diversos tejidos y organismos. La reaccin anapletrica ms importante en hgado y rin de mamferos es la carboxilacin reversible del piruvato por el CO2 para formar oxalacetato, catalizada por la piruvato carboxilasa. La adicin enzimtica de un grupo carboxilo al piruvato requier energa, que es aportada por el ATP. La piruvato carboxilasa es un enzima regulador que se encuentra prcticamente inactivo en ausencia de

acetil-CoA,

su

modulador

alostrico

positivo.

La reaccin de la piruvato carboxilasa requiere la presencia de la protena biotina, que acta como grupo prottico del enzima. Los grupos carboxilo son activados en una reaccin que consume ATP y une CO2 a la biotina ligada al enzima. Este CO2 "activado" se transfiere entonces a un aceptor (piruvato en este caso) en una reaccin de carboxilacin. La piruvato carboxilasa se compone de cuatro subunidades idnticas, cada una de las cuales contiene una molcula de biotina unida covalentemente a travs de un enlace amida al grupo -amino de un residuo especfico Lys en el sitio activo del enzima. La carboxilacin del piruvato tiene lugar en dos pasos: primero, un grupo carboxilo procedente del HCO3- se une a la biotina y a continuacinn el grupo carboxilo se transfiere al piruvato para formar oxalacetato. Estos dos pasos tienen lugar en sitios activos diferentes; el brazo largo y flexble de la biotina transfiere los grupos carboxilo activados desde el primer sitio activo (en un monmero del tetrmero) al segundo (en el monmero adyacente), actuando de un modo muy similar al del larfo brazo lipoil-lisina de E 2 en el complejo de la PDH. La clara de huevo contiene una gran cantidad de la protena avidina, que se une muy fuertemente a biotina e impide su absorcin por el intestino.

Regulacin del ciclo de Krebs La regulacin se da a dos niveles: la conversin del piruvato en acetilCoA, el material de partida del ciclo, y la entrada de acetil-CoA en el ciclo. El complejo PDH de mamferos es fuertemente inhibido por el ATP, as como por el acetil-CoA y el NADH, los productos de la reaccin catalizada por el complejo. AMP, CoA y NAD+, todos los cuales se acumulan cuando fluye demasiado poco acetil-CoA hacia el ciclo del cido ctrico, activan alostricamente el complejo de la PDH. El complejo de la PDH es inhibido mediante la fosforilacin reversible de un residuo Ser especfico de las dos subunidades de E1. Una protena quinasa especfica fosforila y de este modo inactiva E1, y una fosfoprotena fosfatasa especfica elimina el grupo fosforilo por hidrlisis y as activa E1. La quinasa es activada por ATP. El complejo PDH de plantas, localizado en la matriz mitocondrial y en los plstidos, es inhibido por sus productos NADH y acetil CoA. El enzima mitocondrial de plantas tambin est regulado por fosforilacin reversible; el piruvato inhibe la quinasa, activando as el complejo de la PDH y el NH4+ la estimula, lo que es causa de la inhibicin del complejo. En E.coli, PDH est bajo regulacin alostrica de modo similar al enzima de mamferos, pero no parece estar regulado por fosforilacin. La pir Dhasa fosfatasa se activa con Mg2+ y Ca2+. La Pir Dhasa quinasa se activa con Acetil CoA y NADH y se inhibe con Ca2+, Mg2+ elevado, K+, piruvato y ADP. Hay venenos, como el arsnico (tanto sus derivados orgnicos como inorgnicos). El mercurio inhibe enzimas que usan cido lipoico. Las carencias vitamnicas inhiben el complejo. Cada una de las tres etapas altamente exergnicas en el ciclo, las catalizadas por citrato sintasa, isocitrato deshidrogenasa y la cetoglutarato deshidrogenasa, puede llegar a ser la etapa limitante

de la velocidad vabo determinadas circunstancias. La disponibilidad de los sustratos para la citrato sintasa (acetil CoA y oxalacetato) vara con el estado metablico de la clula. El NADH, un prooducto de oxidacin del isocitrato a -cetoglutarato, se acumula bajo ciertas condiciones, y a elevada [NADH]/[NAD+] ambas reacciones de deshidrogenacin resultan gravemente inhibidas por la accin de masas. Dentro de la clula, la reaccin de la malato deshidrogenasa est esencialmente en equilibrio, y cuando [NADH]/[NAD+] es alta, la concentracin de oxalacetato es baja, lo que enlentece el primer paso del ciclo: el succinil-CoA inhibe la -cetoglutarato deshidrogenasa y tambin la citrato sintasa); el citrato bloquea la citrato sintasa, y el produto final, ATP, inhibe tanto la citrato sintasa, como la isocitrato deshidrogenasa. La inhibicin de la citrato sintasa por parte del ATPes mitigada por el ADP, un activador alostrico de este enzima. En el msculo de los vertebrados, el Ca2+, la seal para la contraccin y para el aumento concomitante en la demanda de ATP activa tanto la isocitrato deshidrogenasa como la -cetoglutarato deshidrogenasa, as como al complejo de la PDH. Crecen las pruebas de que dentro de la mitocondria los enzimas del cido ctrico existen en forma de complejos multienzimticos. Tales complejos se denominan metabolones. Se han aislado de forma conjunta varios enzimas del ciclo del cido ctrico en forma de agregados supramoleculares o bien se han encontrado asociados con la membrana mitocondrial interna, o se ha demostrado que difunden en la matriz mitocondrial a una velocidad ms lenta de la que cabra esperar de la protena individual en solucin. CICLO DEL GLIOXILATO Es una variante del ciclo de Krebs que se da en semillas ricas en cidos grasos cuando las semillas van a germinar (nunca se da en animales). Los glioxisomas son peroxisomas de semillas en germinacin; es donde se produce el Ciclo. 1reaccin Una molcula de acetil CoA se condensa con oxalacetato, igual que en el ciclo de krebs. En Krebs el exocitrato se transforma en cetoglutrico, producindose una prdida de dos CO2, sin sntesis neta de ningn compuesto de carbono. En este ciclo, las enzimas catalizan la conversin neta de acetato en succinato o en otro intermedio de cuatro tomos de carbono del ciclo de Krebs:

2 Acetil CoA + NAD+ + 2H2O --> succinato + 2CoA + NADH + H+ En el ciclo del glioxilato, el acetil CoA (procedente de la degradacin de cidos grasos) se concenda con el oxalacetato para formar citrato y se concinvierte en isocitrato, igual que en el ciclo de Krebs, pero en el siguiente paso, el isocitrato se parte por la mitad generando una molcula de succinato (4 tomos de carbono) y otra de glioxilato por la isocitrato liasa. Entra otra molcula de acetil CoA y el glioxilato se condensa con dicha molcula para dar malato en una reaccin catalizada por la malato sintasa. El malato se oxida posteriormente a oxalacetato, el cual puede condensarse con otra molcula de acetil CoA para comenzar otra vuelta al ciclo. En este paso se reduce una molcula de NAD. El succinato puede convertirse a travs de fumarato y malato en oxalacetato, el cual puede convertirse en fosfoenolpiruvato por la PEP carboxiquinasa, y as hasta glucosa por la gluconeognesis. Es decir, se eliminan lpidos y se generan glcidos antes de generar los rganos fotosintticos. Los vertebrados no poseen los enzimas especficos del ciclo del glioxilato (isocitrato liasa y malato sintasa) y por tanto, no pueden producir sntesis neta de glucosa a travs de lpidos. Los enzimas comunes a los ciclos del cido ctrico y del glioxilato tienen dos isozimas, uno especfico de mitocondrias y el otro de glioxisomas. A partir del exocitrato se elige entre el ciclo de Krebs o del glioxilato, y al elegir uno se inhibe el otro. El isoctrita e sun intermediario crucial en el punto de ramificacin entre estos dos ciclos.La isocitrato deshidrogenasa se encuentra regulada mediante modificacin covalente: una protena quinasa especfica la fosforila, con lo que inactiva la deshidrogenasa. Esta inactivacin desca el isocitrato hacia el ciclo del glioxilato, donde inicia su ruta sinttica hacia la glucosa. Una fosfoprotena fosfatasa elimina el grupo fosforilo de la isocitrato deshidrogenasa, reactivando el enzima y enviando ms isocitrato a travs del ciclo del cido ctrico generador de energa.