CHAPITRE6 Lachromatographieliquidehaute g p q p performance(HPLC) ( )

0.1

5 7

1. Introduction
Absorbance at 273nm

0.09 0.08

2. Pompes 3. 3 Injecteurs 4. ColonnesetPhases 5. Dtecteurs 6. 6 Applications

8 10 2 4 3 6 9 12 13 11 14 15

0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 01 0 0 10

20

30 40 Retention Time (min)

50

60

Analysisofphotodegradationproductsof metoclopramidesolutions A.Maquille,B.TilquinandJ. L.HabibJiwan A Maquille B Tilquin and J L Habib Jiwan

1.INTRODUCTION 1 INTRODUCTION
HPLC: phasemobileliquide phasestationnairetrsfinementdivise Injectiondelluantsousdespressionsdeplusieurscentaines debarspourobtenirundbitsuffisant. d b b i dbi ffi Possibilitdagirdemaniretrsprcisesurlaslectivit b l d d l l entrelescompossparlechoixdelaPSetdelacomposition delaPM de la PM Exploitationdesinteractionssolut/PM/PS

2.POMPES 2 POMPES
Pompesdbitmtriquesconuespourmaintenirundbitnon P dbit t i i t i dbit pulsetstable. Prsencedegazdissous(N O CO ) dans les solvants Prsence de gaz dissous (N2,O2,CO2,)danslessolvants ncessitdedgazerlessolvantsparultrasonsoubarbotage dhlium. Eluantdecompositionfixe:modeisocratique 1pompe Eluantdecompositionvariable gradient dlution Eluant de composition variable =gradientd lution pompe pompe binaire,ternaireouquaternaireselonlenombredesolvants quellepeutmlanger

solvantA

solvantB

solvantA

solvantB

vanne proportionnelle

chambredemlange

Contrleur Contrleur dedbit

pompe1

pompe2

pompehaute pression i

colonne

chambredemlange

Gradientbassepression

Gradienthautepression

Pompequaternaire

3.INJECTEURS 3 INJECTEURS
Injectionrapidedunvolumeprcis vannehautepression I j ti id d l i h t i plusieursvoiesmanuelleouautomatique Fonctionnementen2temps:
Chargement:communicationentrepompeetcolonneseulement, introductiondelchantillonpressionatmosphriquelaidedune i d i d l h ill i h i l id d seringuedansunpetitvolumetubulaireappelboucle(nombreuxchoix devolumes) Injection:insertiondelchantillondanslefluxdePMparrotationdela vanne inversiondusensdecirculationdanslaboucle

Bonnereproductibilitdesvolumessilaboucleattotalement remplieparlchantillon(volumeprlevde510fois>volume boucle)

Boucledinjection

reproductibilitduvolumeinject

4.COLONNESETPHASES 4 COLONNES ET PHASES

Colonne=tubedroit,calibr,enacier C l t b d it lib i Phasestationnairemaintenueentre2disquesporeuxsitusses extrmitsdontlesvolumesmortssontaussifaiblesquepossible Tendance:rductiondelalongueuretdudiamtreinterne DiminutiondudbitjusququelquesL/min Consommationrduitedluant C ti d it dl t Meilleurersolution Plusgrandesensibilit CouplageLC/MSplusfacile Couplage LC/MS plus facile

Colonnes:
Type Analytical Solventsaver 4.6 3.0 ID (mm) SampleLoad (approx.) 0.1 1.5mg 150 500g Typical FlowRate 0.53ml/min 0.3 1.5ml/min + Relative Sensitivity Applications Standardseparations Savesolvent StandardHPLC instruments Highsensitivity Limitedsample LC/MS Highsensitivity High sensitivity Limitedsample LC/MS Veryhighsensitivity LC/MS Peptidesandproteins Veryhighsensitivity LC/MS Peptidesandproteins mgpreparativeseparation Hundredsmgupto1g Hundreds mg up to 1 g

Narrowbore

2.1

50 120g

0.1 0.5ml/min

++

Microbore

1.0

10 50g

10 100L/min

+++

Capillary

0.5 0.3

1 10g

115l/min

++++

Nano Semiprep Preparative

0.1 0.1 0.075 9.4 21

100 200ng 100 200 ng 1 10mg 20 250mg 20 250 mg

200 500nl/min 200 500 nl/min 5 10ml/min 20 60ml/min 20 60 ml/min

+++++

Phases: Chromatographiesurphasenormale g p p Chromatographiesurphaseinverse Chromatographieparpairesdions Chromatographie par change dions (cf chap 7) Chromatographieparchanged ions(cfchap7) Chromatographieparexclusionstrique(cfchap7) Chromatographiechirale Fast HPLC FastHPLC

Classificationdesphases: Classification des phases : Type(monolithique,poreuse,nonporeuse) Matriauxdebase(silice,zircone,polymre,) Gomtrie(surface,volumeetdiamtredespores,taille Gomtrie (surface, volume et diamtre des pores, taille etformedesparticules,) Chimiedesurface(typedeligandslis,) Chimie de surface (type de ligands lis )

Type yp
Majorit:particulesporeusesdediamtreentre3et10m Laporositaugmentelasurfacencessairelartentiondel analyte(de100 La porosit augmente la surface ncessaire la rtention de lanalyte (de 100 400m2/g). Lespaceinterparticulepermetdesdbitsde13mL/minavecdespressions acceptables. t bl

1995:introductiondesparticulessphriquesnonporeuses But:augmenterlefficacit Mais: volumeinterparticuleimportant p p delasurface largissementdespics g p

delacapacitdechargement

ncessitd injecterdesmicrovolumes ncessit dinjecter des microvolumes

19902000: Colonnesmonolithiques: macroporesde40006000 macropores de 4000 6000 etmsoporesde20500 occupant80%duvolumedela colonne

Matriauxdebasedelacolonne Matriaux de base de la colonne Matriaux Silice Alumine Zircone GammedepH Gamme de pH 28 28 612 713

Polymres (styrne/divinylbenzne) 113 Graphiteporeux 113

Gomtrie

Diamtredesparticules Uniformitdesparticules Tailledespores

Particulesphriquede silicemacroporeuse

Chimiedelasilice
Trspolaireparlaprsencedesfonctionssilanols lescoefficientsdadsorption sparationbasesur

Hydrogen bonded vicinalsilanol goups

Siloxane bonds Isolated I l t d silanol goups

Geminal silanol goups

Modificationschimiquesdelasilice:lessilicesgreffes
Fixationdemolculesorganiquessurlesfonctionssilanolspardesliaisons Fi i d l l i l f i il l d li i covalentes ajustementdelapolarit sparationbasesurlescoefficients departage

Couche Couche monomrique

monochlorosilane

di outrichlorosilane

Couche Couche polymrique

R=(CH R = (CH2)17CH3 R=(CH2) 7CH3 R (CH R =(CH2)3C6H5 R=(CH2)6C6H5 R (CH R=(CH2)3NH2 R=(CH2)3CN R=(CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH ( ( )

octadecyl(C18) octadecyl (C18) octyl(C8) phenylpropyl phenyl propyl phenylhexyl aminopropyl cyanopropyl diol Bonded phases

Endcapping
Silanisationsecondaireavecdu TMS dsactivationdessitesde silanolsrestslibres

solut
Si Si O OH OH OH OH O

Augmentationdutauxdecouverture Moinsdinteractionssoluts silanols

solut

X
Si Si O O O O Si Si Si O Si O

Moinsdinterfrencesdansleprocessus chromatographique Moinsdetailing Meilleurereproductibilit

Chromatographiesurphasenormale siliceporeuse g p p

SiO2

Phasenormale:modedinteraction

Adsorption
Interactionspolaires pontshydrognes Phasestationnairepolaire Phasemobile:solvantsnonoupeupolaires

Chromatographiesurphaseinverse g p p

PartageentrePMetPS
Phasestationnaireapolaire Phasemobile:solvantspolaires

SiO2

ExempleRP C18

Source:ThermoFisher

Reverse phaseavec100%H2OcommePM???
MeCN H2O H2O MeCN MeCN MeCN MeCN H2O MeCN H2O MeCN

conditionsnormales ex:H2O/ACN50/50

conditionsinitiales 100%H 100% H2O

H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O

aprs10volumesdecolonne dePM100%H2O

Reverse phaseavec100%H OcommePM:solution Reverse phase avec 100% H2O comme PM solution polarshielding

MeCN H2O

MeCN M CN H2O H2O

MeCN H2O MeCN MeCN

P
MeCN

Phasesgreffesetinteractionshydrophiles HILICmode
Peuttreconsidrecommeunechromatographieenphasenormaleavec unephasemobileaqueuseorganique h bil i ColonnesHILICpluspolairesquecolonnesRP augmentationdu%deau danslaPM diminutiondelartention(inversedelaRP)

SparationdoligosaccharidesparHILIC,variationdu%eaudelaPM

Exemples:HILICmode
Phaseaminopropyl

Mixte:RP,HILIC,changeanionfaiblesuivantPM

Source:Phenomenex

Phasecyanopropyl

AccepteurpontH Accepteur pont H

CN

Diltiazem
N C N O O O

Verapamil

Nicardipine

H N H3CO OCH3 O O NO2

Nifedipine p
Source:GraceDavison

PhaseZicHILIC

zwitterionic

Source:SeQuant

C18RPmode

NH2 RPmode
S.U.BajadetalJCA,1125(2006)7688

CNHILICmode CN HILIC d
H HO

CH 2 OH O H OH H H NH 2 OH H

SiO2 HILICmode

O O H2N N H

OH O N H NH2

AmideHILICmode
N

NH2

NH2 HILICmode

O O

OH

OH

Phaseengraphiteporeux: Particulessphriquesdecarboneporeux Adsorption Ad ti Interactions: Interactions : Hydrophobes Diplesdiplesinduits

SourceThermoFisher

Phaseengraphiteporeux:

SourceThermoFisher

Phasesmobiles Phases mobiles

Choixdusolvant: Choix du solvant : QualitHPLC pasdestabilisants,filtrs0.45m,dgazs

Modeisocratique:un(mlangede)solvant(s) Modegradient:variationdelacompositiondurantllution Phasenormale:solvantpeuounonpolaire(Hexane,CH2Cl2) Phaseinverse:solvantpolaire(H2O,MeOH,ACN) ModificationdelapolaritdelaPM modificationducoefficientdedistributionK(CS/CM) modificationdufacteurdertentionk

4typesdinteractionsentremolculesdesolvantetdesolut: ionique(quandsolutetsolvantontdesmomentsdipolaires) ( d l l d d l ) dedispersion(duelattractionentreellesdesmolculesvoisines) dilectriques(favorisentladissolutiondessolutsioniquesdansles solvantspolaires) l t l i ) parpontsH(entredonneuretaccepteurdeprotons)

Solvant l Indicede d d polarit 10 5.1 5.8 3.9 4 Densit (g/ml) 1 0.791 0.786 0.785 0.881 0 881 LimiteUV (nm) 190 205 190 210 220 Indicede d d rfraction 1.333 1.326 1.341 1.384 1.405 1 405 Pt dbullition (C) 100 65 82 82 66

Eau Mthanol Actonitrile Isopropanol Tetrahydro furane

Solventpropertiesandmiscibility

SourceThermoFisher

Forceluantedessolvantsetslectivit Force luante des solvants et slectivit

AnalysesurRP18avecdiffrentsmlangesCH3CN/H20 Dbit:1ml/min

100%ACN PP+NB

40%ACN PP+NB

sec. 80%ACN PP NB 30%ACN 30 % ACN 30%ACN 30 % ACN PP+NB

sec.

sec. 60%ACN PP NB 20%ACN NB PP

sec.

sec.

sec.

Elutiongradient: Utilisequandllutionisocratiquenepermetpasunebonnesparation ouquelasparationesttroplongue Gradient:changementcontinudelaphasemobilependantlasparation

Sparationdunmlange d herbicidessurRPC18: dherbicides sur RP C18: a) Isocratique:ACN/H2050/50 b) Isocratique:ACN/H2070/30 c) Gradient:3085%dACN en7minutes

Diffrentsprofilsdegradient

Elutiongradient:effetduprofildegradient

ChoixdunecolonneHPLC
organic soluble MW<2000 aqueous q soluble Sample

organic soluble MW>2000 MW 2000 aqueous soluble l bl

hexane soluble organic soluble methanol methanol/H2O acetonitrile acetonitrile/H2O / soluble THF soluble

MW<2000

nonionic aqueous soluble ionic

hexane soluble

normalphase adsorption normalphase p bonded

organic soluble

MW<2000

methanol methanol/H2O acetonitrile acetonitrile/H2O soluble

reversed phase

reversed phase bonded

THF soluble
gelpermeation GPC

nonionic

reversed phase bonded

MW<2000 aqueous soluble

reversed phase bonded b d d using ionization control

ionic

reversed phase bonded using i i ionpairing ii ionexchange

organic soluble

gelpermeation

MW>2000
gelfiltration l fl

aqueous soluble

ionexchangemode with wide porematerial

reversephasemode with wide porematerial

Chromatographieparpairesdions g p p p
Objectif: amliorerlasparationdecompossioniquesoutrspolairesquiont troppeud affinitpourunePSapolaire trop peu daffinit pour une PS apolaire Ncessitdaugmenterlartention Solutions: ModifierlepH AjouterlaPMuncomposporteurlafoisdunechanecarboneetdun groupementdechargeopposecelleducompossparer Crationdunepairedionsglobalementneutre,stableetlipophilequisera retenuesurlaPS retenue sur la PS Solut ionis Paire dions
(acides) A+R+ AR+
+ +

diminutiondeleurcaractreionique

(bases) BH +R BH R Soluthydrophile Moins retenu en RP

(R=agentpairant) (R t i t)

Pairedionshydrophobe Mieux retenue enRP

Basedelartention: Base de la rtention : SoitunsolutacideionisA pairparR+. Lapairedionsformeensolutionestretenueparlacolonne,lquilibrede p p , q rtentiondusolutestdcritpar: AR+ (phasemobile)AR+ (phasestationnaire) Lartentiondpendde: 1) lafractiondesmolculesdesolutAdanslaPM(dtermineparlepHde laPMetlepKadusolut) la PM et le pKa du solut) 2) laconcentrationdelagentpairantetsatendanceformerunepaire dions 3) lavaleurdek(facteurdertentionoudecapacit)delapairedionsAR+

Agentspairanttypiques: Alkylsulfonates(RSO3),acidescarboxyliques(TFA,),BF4,ClO4,) Selsdetetraalkylammonium(R4N+)

X:principeactif,baseforte X1,X2,X3:produitsdedgradationdeX,basesfortes MP,PP:methyletpropylparaben MP, PP : methyl et propylparaben BetHP:acidebenzoqueetacidehydroxybenzoque,produitsdedgradationdeMPetPP Conditionschromatographiques: a)30%MeOH/70%actate,pH=3.5 ) 30% M OH/70% t t H 3 5 b)45%MeOH/55%actate+65mMoctanesulfonate

Chromatographiechirale(nantioslective) g p ( )
Pourquoi? Propritspharmacologiquesdesstroisomresparfoistrsdiffrentes. h l d f d ff Exemple:stroslectivitdanslactiondesmdicaments.

Principe: deuxnantiomresRetSconduisentdeuxpicsdontlesairessont deux nantiomres R et S conduisent deux pics dont les aires sont proportionnelleslabondancedechacunedesdeuxformes. Formationdecomplexesdiastromresrversiblesentreles2nantiomresetun agentcomplexantchiral(slecteurchiral,CS) (R)X+(R)CS(R)X(R)CS Deuxmthodes: h d PSchirale PM+additifchiral PM dditif hi l et (S)X+(S)CS(S)X(S)CS

Phasemobileavecslecteurchiral PSclassiqueenphaseinverseouenphasenormale PMcontenantunadditifchiralenconcentrationapproprie tablissementdquilibresmultiples: Formationdecomplexesentreslecteur(R)CSetnantiomres(R)Xet (S)XdanslaPM(cstdassociation) ( ) ( ) Distributiondesnantiomres(R)Xet(S)XentrePMetPS(cstde ) distribution) DistributiondescomplexesXCSentrePMetPS(cstdedistribution)

Phasestationnairechirale Moyenleplussimpleetlepluspratiquepourlessparationsdnantiomres. Leslecteurchiralestlideprfrenceparliaisoncovalente(alternativementpar forteadsorptionphysique)ausupportdelaPS,habituellementdesparticulesde siliceporeuse. LaPMestachirale. La PM est achirale. Pendantlamigrationdelchantillondanslacolonne,lesnantiomressont retenusparassociationavecleslecteurdelaPS.Descomplexes diastrosisomresseformentdanslaPS.Sileurvaleurdekestsuffisamment di t i f td l PS Si l l d k t ffi t diffrente,leursparationestpossible. NcessitdunePSchiralequiinteragisseplusfortementavecundesdeux nantiomre.

Mcanismesdelareconnaissancechirale Modle 3points :ncessitdavoiraumoins3pointsdinteractionpour quunslecteurchiralpuissedistinguer2nantiomres(rgledeDagliesh) Complmentaritdetailleetdeformeentreanalyteetslecteurchiral Interactionsintermolculairesnoncovalentes(principalementlectrostatiques): Interactionsioniques Pontshydrogne Iondiple,diplediple, I di l di l di l Interactions Sileslecteuretlanalytepossdentdesrgionshydrophobescorrespondantes, liaisonparinteractionshydrophobes

Exemplesdephasesstationnaireschirales Slecteursmacromolculairesdoriginesemisynthtique(polysaccharides) Slecteursmacromolculairesdoriginesynthtique(poly(met)acrylamide) Slecteursmacromolculairesdoriginenaturelle(protines) Slecteursoligomriquesmacrocycliquesoudetailleintermdiaire (cyclodextrines) ( ) Entitsioniquessynthtiquesdefaiblepoidsmolculairepourchange q ionique Slecteurschlatantspourchangedeligandchiral

Lescyclodextrines Les cyclodextrines =enchanementscycliquesde57molculesdeglucosegreffespar lintermdiairedun bras dequelquesatomesdecarbonesurlaPS. Deformecylindrique,ellesprsententunecavithydrophobetandisquela paroiexterneesthydrophile. Inclusionslectivedecompossquiformentlasurfacedelaphase chiraledescomplexesdiastroisomresrversibles

cyclodextrine

FastHPLC
Tendance:sparationstrsrapides,demoinsduneminutepourleschantillons simplesquelquesminutespourdesmlangespluscomplexes. simples quelques minutes pour des mlanges plus complexes. Unefoisoptimiseslesvaleursdeketde (optimisationdelacapacitetdela slectivit),larsolutionetletempsdanalysenedpendentplusquedeN. Lesconditionsquifavorisentlessparationsrapidesincluentlutilisationdepetites particules,decolonnespluscourtesetdedbitsplusimportants. Ladiminutiondutempsd analyse(sansperted efficacitN)peuttreeffectuepar La diminution du temps d analyse (sans perte defficacit N) peut tre effectue par lutilisationde Ultrahautepression=UPLCouUHPLC(>6000psiou400bar) Tempratureplusleve=HTHPLC Particulesspciales

UPLC UHPLC
Evolutiondestaillesdeparticules E l ti d t ill d ti l

10min Late1960s 40mpellicularnonporouscoated 100500psi(740bar) 100 500 psi (7 40 bar) 10min 10 i 5,000plates/meter Early1970s 10mIrregularmicroporous 1000 2500psi(70 180bar) 10002500 psi (70180 bar) 40,000plates/meter 10min 1980stopresentday 3.5 5msphericalmicroporous 15004000psi(110280bar) 80,000 115,000plates/meter

ExemplesdePSutilisesenUHPLC C18 TrifunctionallyBondedC18 P ProprietaryEndcapping i t E d i WidestpHrange C8 TrifunctionallyBondedC8 ProprietaryEndcapping Widest pH range WidestpHrange ShieldRP18 Monofunctionallybonded Monofunctionally bonded Embeddedpolargroup Phenyl y TrifunctionallyBondedC6Phenyl ProprietaryEndcapping

LechallengedelacourbedeVanDeemter g

A+

B + (CS + C M )u u

Particule=lmentcentraldela sparation Pluspetitesparticules meilleures sparationssurdeplusgrandes plagesdevlocits augmentationdelavitesseetde larsolutiondelasparation la rsolution de la sparation

Exemples

SourceThermoFisher

SparationengradientUHPLCdunedigestionlatrypsinedalbuminedeserumbovin. Capacitdepics:500entre48et168min Capacit de pics : 500 entre 48 et 168 min

HT HPLC
Augmentationdelatemprature: Diminution de la viscosit de la PM DiminutiondelaviscositdelaPM dbit plus lev pression gale dbitpluslevpressiongale, quivalentuneaugmentationdelapression(cfUHPLC) Augmentationducoefficientdediffusiondusolut mmeefficacitundbitpluslevetuntempsdanalysepluscourt efficacitamlioretempsdanalysegal

Inconvnients Dgradation des chantillons haute t Dgradationdeschantillonshautet Possibilitdegradientsdet danslacolonne Instabilitdescolonnes Diminutiondelaslectivit meilleure temprature=compromisentreNmax etmax! ill t t i t N t manqueduniformitdelat

Augmentationdelatemprature: H A t ti d l t t

A+
C

B + (CS + C M )u u
quandT

5.Dtecteurs 5 Dtecteurs
Lanalyseparchromatographieaprincipalementpourbutdereprerla prsenceoudedoseruncomposprsentpourlequelonachoisiun dtecteurbienadapt. Qualitsdudtecteur: Q alits d dtecte r
Sensibilit Bruitngligeable Largegammedynamique Large gamme dynamique Rponseindpendantedesvariationsdesparamtresdutilisation (pression,temprature,dbit,compositiondelaphasemobile) Faiblevolumemort Faible volume mort Nondestructif Stableaucoursdutemps Slectivit Slectivit Grandevitessederponse

Modesdedtectionlespluscourantsbasssurlespropritsoptiques descomposs:absorption,fluorescence,indicederfraction

Limitesdedtectionetdequantification q LOD=pluspetiteconcentrationdunanalytedtectable(pas ncessairementquantifiable) LOQ=pluspetiteconcentrationdunanalytequantifiableavecune prcisionetunejustesseacceptables

Rapportsignalsurbruit(S/N)

LOD LOQ

S/N=3 S/N=10

Detector

Relative sensitivity

Usefulwith gradient Yes

T sensitivity

Analytes

IR
Refractive Index Conductivity UVVis ELSD Electrochemical Fluorescence MS +

Presenceof SpecificIRbands High Universal

No

++ +++ +++ +++ ++++ ++++

No Yes Yes No Yes Yes Y

Moderate

Chargedcompounds Presenceofchromophores p Universal

Moderate

Electroactivecompounds Electroactive compounds Fluorophore Universalwith U i l ith selectivedetectionpossible

Dtecteurindicederfraction
Unfaisceaulumineux(mono oupolychromatique)passetraversunecellule deuxcompartimentsdontlunestrempliaveclaPMseuleetlautreaveclaPM sortantdelacolonne.Ladiffrencedindicederfractionentrelesdeuxliquides q quiapparatlorsquunanalyteestmlanglaPMprovoqueundplacement angulairedurayondiffract.

LeRIestutiledanslecasdecompossquinepossdentpasdechromophores (UV),fluorophores(F),depotentielredox(lectrochimique),oud activitionique (UV) fluorophores (F) de potentiel redox (lectrochimique) ou dactivit ionique (conductimtre) Gnralementutilisenconjonctionavecuneautretechniquededtection Applications:Sucres,Alcools,Lipides,Polymres,

Avantages Rponseuniverselle Dtectetoutcequisetrouveensolution. SaufsilanalyteaexactementlemmeRIquelaphasemobile Utilisationfacile Peudeparamtres Trsrobuste Peusensiblelencrassementetauxbulles Dsavantages Faiblesensibilit Absencedeslectivit Sensibleauxchangementsdedbit,tempratureetviscosit S ibl h t d dbit t t t i it Pasdutilisationdegradients

DtecteurspectrophotomtriqueUVVisible:
MesurelapertedintensitdelumireUVouVis.lorsdupassagedansune solution DtectionbasesurlaloideLambertBeer(A=lC):labsorbanceAdela phasemobileestmesureensortiedecolonne,lalongueurdonde ou plusieurslongueursd ondedansl UVoulevisible. plusieurs longueurs donde dans lUV ou le visible

LaPMnedoitpas,outrspeu,absorberparelle mme. La PM ne doit pas ou trs peu absorber par ellemme Lasensibilitoptimaleestobtenueenutilisantledtecteurlalongueur dondeolabsorbanceducomposdintrtestlaplusgrande(max) LedtecteurUV/VisestleplusrpanduenHPLC Bienqu ayantdeslimitations(particulirementpourlescompossquine Bien quayant des limitations (particulirement pour les composs qui ne possdentpasdechromophoreUV),ilpossdelameilleurecombinaison de: Sensibilit Linarit Gammedynamique Robustesse R b t Facilitdutilisation Sipasdespectred absorptionexploitable Si pas de spectre dabsorption exploitable composs. ncessitdedrivatiserles ncessit de drivatiser les

Avantages Trsrobuste Facilitdutilisation Compatibleaveclesgradients Nondestructif Haute sensibilit Hautesensibilit ~70%despublicationsHPLCutilisentunUV/Vis.

Dsavantages Pasuniversel Pasaussislectifquedautrestechniques(Fluo,MS,ECD) Dtectionaffecteparlacompositiondelaphasemobile

Dtecteurbarrettedediodes(PDAouDAD)

Soit: Soit : Changementdelongueurdondeencoursdanalyse Enregistrementdel absorbanceplusieurslongueursd onde Enregistrement de labsorbance plusieurs longueurs donde simultanment Enregistrementdelabsorbancesurtoutundomainedelongueurs g g donde

Absorbanceen3D EnregistrelabsorbancesurtoutlespectreUVVis Permetlacrationdebibliothquesspectrales

LePDAacquiertunspectreparunitdetempsenfonctiondelavitesse dacquisitiondudtecteur Lespectreacquisausommetdupicestconsidrcommerfrence Lalgorithmedepuretdepicanalysetouslesspectresdunpicparrapport auspectrederfrence p

Avantages DtectionuniverselleUVVis BonneSlectivit Gammedynamique SpectresUVVisdespics Confirmation Bibliothques Estimationdelapuretdunpic

Dsavantages M i MoinssensiblequelUVclassique ibl lUV l i Complexe PlusdebruitquundtecteurUVclassique Compossdemmefamillepossdentlemmespectre

Caractristiquesdequelqueschromophores:

SourceThermoFisher

SourceThermoFisher

Dtecteurspectrofluorimtrique
Lescompossfluorescentsrmettentsousformedelumiretoutouune partiedurayonnementdelasourcelumineuseauquelilssontsoumis. Lintensitdefluorescenceestproportionnellelaconcentrationdelanalyte.

Lampeaudeuteriumouauxenon dexcitationslectionneparunfiltreouunmonochromateur Isolementdela d missionparunsecondfiltreoumonochromateur Isolement de la dmission par un second filtre ou monochromateur dmissiondirigeverslephotodtecteur

Ladtectionparfluorescencealieuquandunemolculeabsorbedela La dtection par fluorescence a lieu quand une molcule absorbe de la lumire,atteignantainsiunniveaudnergiepluslev(excitation). Quandlamolculeretournesontatnergtiqueinitial,l nergie Quand la molcule retourne son tat nergtique initial, lnergie perdueestmisesousformedelumire(mission) Lamolcule fluoresce. LeFLenregistrelafoisleslongueursdondedexcitationetdmission,ce quidonnelieudetrsgrandesslectivitetsensibilit. Ceslongueursdondesontspcifiqueschaquecomposfluorescent. C l d d t ifi h fl t

Avantages Sensibilit 101000xplussensiblequ unUV 10 1000x plus sensible quun UV Recherchedetraces Slectivit Faiblebruitdefond Techniquesimpleetnondestructive Dsavantages Peudecompossfluorescents Besoindedrivatiserlesanalytes Reproductibilitinterlabo RponsedpenddeT,pH,viscosit,polaritsolvant LesEx etEmpeuventvarier N Ncessiteplusieursscanspourtrouverlesvaleursoptimales i l i l l i l

Dtecteurlectrochimique(ampromtrique)
Lescomposspouvanttrerduitsouoxydsenprsencedunpotentiel lectriquepeuventtredtectsdetrsfaiblesconcentrationspardes mesureslectrochimiquesslectives. q Potentielconstant variationducourant

LaPMdoittrelectriquementconductrice La PM doit tre lectriquement conductrice

Dtecteurconductimtrique q
Mesurelechangementdeconductivitlectriqueduelaprsenced'un solutdanslaphasemobile(defaonabsolueoudiffrentielle). Avantage: dtecteurutilispoursolutsioniques. Inconvnient: sensibilittrsgrandelatemprature.

DtecteurELSD(EvaporativeLightScatteringDetector) ( p g g )
EvaporationdelaPMsuiviedelamesuredelalumirediffuseparles particulesdanalytenonvolatile. UtilepourtouslessolutsayantunevolatilitplusfaiblequelaPM. Lintensitdelalumirediffusedpenddelatailledesparticules danalyte.

3tapes: Nbulisation:effluenttransformenarosol b l ffl f l vaporation:lapartievolatiledeleffluentestlimine(solvants),les compossnonvolatilesrestentsousformedeparticulessolides composs non volatiles restent sous forme de particules solides Dtection:lesparticulesinterceptentunrayondelumire,lintensit delumirediffracteestproportionnellelaquantitdeparticules p p q p dtectes

Source:Grace

Avantages DtectelescompossquinabsorbentpasenUVVis. Pe t tre tilis a ec des sol ants q i absorbent bea co p en UV PeuttreutilisavecdessolvantsquiabsorbentbeaucoupenUV. Utilisationdegradients(avantagesurRI). PossibilitdevarierlaT denbulisationpouroptimiserladtection. Applications:Sucres,Polymres,Triglycrides Dsavantages Pasdetampons/additifsnonvolatils Techniquedestructive. q Besoindegazdenbulisation(habituellementN2). TOUSlesELSDsontnonlinaires. Moins sensible que dautres dtecteurs (UV par exemple) Moinssensiblequed autresdtecteurs(UVparexemple).

Dtecteurdemasse
OptimisationdesdtecteursdemassepourtravailleraveclUPLC Vitessesd acquisitionde10000da/s Vitesses dacquisition de 10000 da/s Vitessesdechangementdemodedionisationminimiss ESI + ESI ESI APCI+ APCI Dwelltimesminimiss Simpleettriplequadruple Tempsdevol(TOF,QTOF)

Principauxdtecteursutiliss Pi i dt t tili

6.Applicationsenpharmacie 6 Applications en pharmacie

Drugdiscovery D di Prformulation Pharmacocintiqueetmtabolisme Dveloppementprocess Dveloppementformulation