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ELECTROFORESIS DEL ADN EN GELES DE AGAROSA

La concentracin e integridad del ADN extrado, as como el tamao de distintos fragmentos de ADN (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separacin de molculas (protenas, isoenzimas, cidos nucleicos) a travs de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidn). La matriz funciona como un filtro, separando las molculas en un campo elctrico, de acuerdo al tamao y la carga neta que poseen. En el caso de los cidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (nodo) durante la electroforesis (Posso y Ghneim 2008). La resolucin y velocidad de separacin de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a travs de la concentracin de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamao migran ms rpidamente hacia el nodo que aquellos de mayor tamao. Al aumentar la concentracin de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolucin en los fragmentos de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migracin de los fragmentos en el gel (Posso y Ghneim op cit.). Los cidos nucledos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tincin con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentracin mediante un anlisis comparativo con patrones de concentracin conocida. Los colorantes fluorescentes actan mediante insercin entre las pares de bases que conforman el cido nucleco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualizacin de ADN y ARN. Sin embargo, ste es un reactivo altamente txico, con propiedades mutagnicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados especficamente para reducir los riesgos potenciales de mutagnesis. La tcnica para la cuantificacin de ADN consiste simplemente en la utilizacin de una secuencia de concentraciones de solucin patrn de ADN con la que se comparan muestras de ADN de concentracin desconocida. El clculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta segn la fluorescencia. Debe evitarse la exposicin prolongada a la luz ultravioleta, incluso con mscara de proteccin. La estimacin de las concentraciones de ADN puede realizarse sobre una fotografa digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imgenes (Posso y Ghneim op cit.). La concentracin de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamao del segmento de ADN que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamao, el del ADN total

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por:Duina Posso Duque

2 (proveniente de una extraccin de ADN), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y a voltajes de 60V para evitar la fragmentacin del mismo. Los segmentos de 1500pb en adelante con geles al 1%, los segmentos de 500pb a 1500pb en geles 1,5% o 2% y los pequeos segmentos de de 100pb a 500pb (los microsatlites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede variar de 20V a 120V de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el ADN, a voltajes elevados ms rpido corren las muestras. La pureza de la agarosa y de la solucin tampn (TAE o TBE) puede variar segn la finalidad del ensayo. Es posible reutilizar una solucin de agarosa para fines de una simple visualizacin de algn producto de PCR. No se debe reutilizar cuando con se va a cuantificar ADN ni a extraer bandas a partir del gel. Para reutilizar la solucin de agarosa se recomienda guardar el gel en un envase con tapa, esto evita la evaporacin y la entrada de polvo. En caso dado de que se evapore algo de la solucin se puede completar el volumen con solucin tampn limpia.

PREPARACIN DE GELES DE AGAROSA

PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UN GEL AL 1% (250 mL) 1. Materiales

-Pipetas de 2-20uL y de 20-200uL -Cmara de electroforesis horizontal -Peines para las bandejas -Bandeja para la preparacin del gel -Fuente de poder -Probetas de 50mL, 100mL y 1000mL -Botella de vidrio con ms de dos veces el volumen de la solucin de agarosa a preparar. -Guantes de ltex -Guantes para calor 2. Reactivos

-Syber safe o Bromuro de etidio -Agarosa grado molecular -TBE 10X -Agua Destilada

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3 3. Preparacin de soluciones A) Preparacin de geles de agarosa de diferentes concentraciones (%) para diferentes volmenes

40 % Gel 2 1,5 0,8 Agarosa (g) 0,80 0,60 0,32

Volumen del gel (mL) 120 TBE 10X Agarosa TBE 10X (mL) (mL) (g) 2 2,4 6 2 1,8 6 2 0,96 6

250 Agarosa (g) 5 3,75 2 TBE 10X (mL) 12,5 12,5 12,5

B) Preparacin de un litro de TBE 10X Reactivo Tris Base Acido Brico EDTA 0.5M Cantidades 108g 55g 40mL

Nota: Agregue todos los reactivos a 500mL de agua destilada mezcle bien y complete el volumen con agua destilada.

4. Protocolo de preparacin de un gel de agarosa al 1%

1. Prepare la bandeja sellando los bordes por presin o con cinta adhesiva (esto depende del modelo de cmara utilizado) y pngale los peines. 2. Pese 2,5 gr. de agarosa. 3. Coloque la agarosa dentro de un envase de vidrio que contenga 250 mL de buffer TBE 0,5X y caliente en el microondas o en el bao de Mara hasta su completa disolucin. 4. Cuando la solucin de agarosa haya alcanzado una temperatura soportable por la mano, agregue 2,5 ul de bromuro de etidio* (Solucin madre 10 mg. mL-1) o 25 uL de SYBR Green *1 (dilucin final de la solucin comercial es 1 en 10.000). 5. Mezcle bien, agitando el recipiente en forma circular, evitando que se formen burbujas en la solucin.

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4 6. Sirva la solucin en la bandeja de corrida vertiendo la solucin lentamente por uno de los extremos de la bandeja y retire las burbujas que queden sobre el rea de corrida de las muestras con una punta limpia. 7. Deje polimerizar la agarosa

8. Para la corrida, llene el tanque de la cmara de electroforesis con buffer TBE 0,5X hasta cubrir el gel. 9. Conecte los electrodos de la cmara a la fuente de poder, grade el voltaje deseado y corra las muestras. Nota 1. El bromuro de etidio es un fuerte agente mutgeno y posiblemente tambin cancergeno y teratgeno. Debe ser manipulado con extrema precaucin en el laboratorio. El uso de guantes, lentes de proteccin y bata de laboratorio es obligatorio. 2. SYBR Green exhibe un efecto mutagnico mucho menor que el bromuro de etidio, sin embargo, se recomienda el uso de proteccin personal durante su manipulacin.

5. Bibliografa Duina Posso Duque, Thaura Ghneim Herrera. 2008. Uso de Marcadores Microsatlites para la Estimacin de Diversidad Gentica en Plantas. Ediciones IVIC.

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