Estructura y Funcin de Biomolculas

Clase 2

Tcnicas para el estudio estructural de protenas 1 Dicrosmo circular

JJC

Qu nos interesa saber de una protena?

TERCIARIA Baja resolucin (~nm) microscopa electrnica (EM) microscopa fuerza atmica (AFM) difraccin de rayos X RMN Dicrosmo circular (CD) Infrarojo (IR) Dispersin de luz (LS)

Estructura

Alta resolucin (~) SECUNDARIA CUATERNARIA

Dinmica (flexibilidad)

(rayos X, B factors) RMN tcnicas pticas (CD, fluorescencia, etc)

Estabilidad

CD Fluorescencia Termodinmica: Kb Cintica: kon, koff

Interaccin con ligandos

Cmo interacciona la radiacin electromagntica con la materia? En nuestro caso una protena.
Dispersin h.ex
SLS (esttica) DSL (dinmica) Difraccin de Rayos X Dispersin Raman

Radiacin incidente h.ex

Absorcin h.ex

Absorbancia UV-VIS-IR Actividad ptica (CD, ORD) RMN EPR Turbidimetra

Luminiscencia Fluorescencia Fosforescencia h.em

Absorcin de protenas: transiciones entre estados cunticos

Magnticos

Rotacionales

Vibracionales

Electrnicos

Radio (105-1 m)

Microondas (10-1-10-3 m)

IR (10-4-10-6)

UV-VIS (10-7-10-9 m)

(ms arriba en energa siguen los neutrones, rayos-x, rayos-, electrones)

Absorcin de protenas
IR (amidas 1600 cm-1)
estructura secundaria

Luz natural (no polarizada) Luz polarizada: lineal circular (CD)

UV-VIS (190-300 nm)

estructura terciaria y secundaria (CD)

Cromforos:

Unin peptdica: n * (max~210-220 nm, max=100) * (max~190 nm, max=7000) Cadenas laterales:

CD UV lejano

His, Arg, Glu, Asp, Gln, Asn (max ~ 210 nm). (normalmente tapadas por las amidas) puentes disulfuro (max=250 nm, max= 300) CD UV lejano residuos aromticos: TRP (max= 280 nm, max= 5600) TYR (max= 274 nm, max= 1400) PHE (max= 257 nm, max= 200)
CD UV cercano

Absorcin de protenas UV cercano

La absorbancia en el UV cercano (230-310 nm) est dominada por TRP y TYR Aplicaciones: -Principalmente para cuantificar -El espectro de absorbancia es poco sensible al entorno y en general usa la derivada cuarta del espectro para seguir cambios conformacionales:

Ejemplo: FABP wt y 98 (apo y holo)

Podemos determinar la estructura de una protena en solucin con alguna tcnica que no sea RMN?
Depende del nivel de detalle que busquemos. Podemos determinar el contenido de estructuras secundaria (hlice , hoja ). Tambin podemos decir si ante algn tratamiento (temperatura, pH, urea, etc) se vi afectada la estructura terciaria. No podemos determinar como es dicha estructura, pero s podemos decir si cambi.

Dicrosmo circular

Hoja beta

Random coil

Hlice alfa

Ejemplo: aglutinina de soja + urea

Far UV: 180-250 nm Absorben amidas y S-S Estructura secundaria Near UV: 250-350 nm Absorben aromticos Estructura terciaria

Hoja beta

Actividad ptica
Cuando un analito interacciona de forma diferencial con luz circularmente polarizada derecha e izquierda:

Diferencias en (ndice de refraccin):

ORD (optical rotatory dispersion)

D I

Diferencias en (absortividad molar):

CD (dicrosmo circular)

D I

Deben existir centros asimtricos en la molcula

Luz polarizada:
No polarizada (natural)
Z Z

Linealmente polarizada

propagacin
Z

propagacin

Circularmente polarizada

Elpticamente polarizada

propagacin

propagacin

Luz linealmente polarizada = mezcla de luz circular derecha e izquierda, con la misma fase y de igual intensidad

Medio pticamente activo: depende del sentido de giro

= c /v

Una componente se retrasa respecto del otro:

La luz sale polarizada, pero en un plano diferente de la luz incidente

ORD
Entrada Salida

Espectro: vs

Medicin de ORD

Aplicaciones: identificar y cuantificar azcares

Si existe una absorcin de luz, y es diferencial para luz circular derecha e izquierda:

D I

Entrada

Salida

Sale luz elpticamente polarizada

CD
Espectro: vs Necesitamos un cromforo asimtrico, o inmerso en un entorno asimtrico

Dicroismo circular (CD)

ORD y CD son manifestaciones de un mismo fenmeno, la interaccin de la luz polarizada (ED y EI) con molculas quirales En ORD se mide el cambio de velocidades de los haces a traves de cambio en el ndice de refraccin:

D I

travs del cambio en la absorcin

En CD se mide el cambio de amplitud (ED EI) de los haces a

D I

ORD y CD son fenmenos relacionados y en la prctica ocurren al mismo tiempo. Se vinculan mediante una transformada de Fourier (transformada de Kronig-Kramer):

El efecto Cotton es la manifestacin del fenmeno de interaccin de la luz polarizada con la materia quiral:

Absorcin

CD Efecto Cotton positivo ORD

ORD Efecto Cotton negativo CD

Absorcin de luz circularmente polarizada

Si la transicin electrnica involucra un desplazamiento lineal de cargas y un movimiento circular, la transicin tiene asociada un momento dipolar y un momento magntico:

+
Absorcin electrnica pura

Absorcin magntica pura

Actividad ptica

Estado excitado

Ejemplo: transicin n * de amidas

Estado basal

Si el cromforo se encuentra en un entorno asimtrico: la probabilidad de la transicin va a depender del sentido de giro de la radiacin incidente:

D I O sea que al medir la absorbancia: A = AD - AI

Medicin de dicrosmo circular

Con un espectropolarmetro, un espectrofotmetro modificado
derecha izquierda

lmpara monocromador polarizador

celda Pockels

muestra

PM

Para ver una banda de CD es necesario que el cromforo absorba !!! Desafo tcnico: medir diferencias de absorbancia (AD AI) del orden del 1/10000 de la seal: Espectrofotmetro: U$S 1000-6000 En CD se grafica la elipticidad: Espectropolarmetro: U$S 100.000 grados.cm2.dmol-1

[] = 3300. (I - D)

Se relaciona con la asimetra de la elipse de salida:

Tan-1 () = b /a

b a

CD es ms utilizado hoy da que ORD

Existe instrumentacin superior para CD (naturaleza alternada de la deteccin en CD) La forma de las bandas de CD (de un solo signo y ms angostas: menor spread) permite mayor facilidad en la asignacin y mejor resolucin espectral

La asimetra de los cromforos en protenas (amidas, grupos aromticos y puentes SS) se induce por la interaccin con grupos vecinos (el entorno qumico)
Jasco J-815 CD spectrometer

El espectro de ORD se asemeja a la derivada del espectro de CD, sin embargo la dependencia con es diferente Por esto, es posible medir actividad ptica en zonas alejadas del mximo de absorcin (ej. azcares) En protenas, en cambio, dada su absorcin en el UV, se mide CD y la concentracin se expresa en trminos del peso promedio del residuo de aminocido: MRW=MW / # residuos

Las transiciones en protenas:

Enlace peptdico: n* (br, w) ~ 210 nm * (sh, s) ~ 190 nm Cistina:

Zona UV lejana (180-250 nm)

y residuos aromticos (ver luego) Residuos aromticos (pticamente inactivos per se, pero ubicados en entornos asimtricos): W, Y, F, H, Cistina (w, ~ 280 nm) tambin grupos prostticos (ej. hemo) y metaloprotenas

Zona UV cercana (250-340 nm)

Las estructuras secundarias presentan espectros caractersticos:

CD en el UV lejano (180-250 nm) Ejemplo: FABP wt y 98 (apo y holo) Far UV

Hoja beta

Random coil

Hlice alfa

Near UV

En el UV-cercano se ve el entorno de los residuos aromticos

Aplicaciones:
Estimar contenido de estructura secundaria por anlisis de componentes mltiple: () = a -helice() + b hoja-() + c rancom coil() Seguir cambios conformacionales Medir unin de ligandos

Protenas todo alfa:

(+) 191-193 nm

(-) 208 nm

(-) 222 nm

Protenas todo beta:

Protenas + :

Protenas /:

Protenas desordenadas:

(-) 200 nm

Espectro de dicrosmo circular del pptido AKQ9, en presencia de trifluoroetanol, un inductor de hlices.

Unin de ligandos: calcio-calmodulina

Calmodulina

Calmodulina + Cd2+ Calmodulina + Ca2+

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La unin de un intercalador a DNA de doble cadena

Dos equilibrios ligados: plegamiento de la protena P y unin de ligandos aninicos

Dos protenas estructuralmente muy similares con mecanismos de plegamiento muy diferentes: alfa-lactalbmina bovina (-LA) y lisozima (HEWL) Transicin de dos estados (HEWL) vs transicin con intermediario (-LA)

HEWL apo -LA

HEWL

270 nm

222 nm

apo -LA

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Un ejemplo de molten globule (MG): conservacin de estructura secundaria con prdida de interacciones terciarias, un paso crtico en la insercin de colicina A en membranas en los endosomas cidos

pH 2 pH 2 pH 7 pH 7

Cinticas de plegamiento detectadas por CD (time resolved CD)

El caso del citocromo c (Elve, Englander, Roder) 1ro: secundaria 2do: terciaria

Estabilidad medida por CD: FABP (fatty acid binding protein) vs 98

FABP 98

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Conformacin de cidos nucleicos por CD:

Qu sucede luego de la absorcin de luz? S2

relajacin vibracional conversin interna IC

S1

relajacin vibracional cruce intersistemas ISC

T1
kNR IC

hA S0

hF
fluorescencia

kNR ISC

hP

fosforescencia

LA CLAVE ES LA ESCALA DE TIEMPO DE LOS PROCESOS: ABSORCION: ~ 10-15 seg CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg La absorcin y de emisin son extremadamente rpidos, los ncleos no llegan a moverse (principio de Franck-Condon). La absorcin slo da informacin del entorno inmediato a la molcula que absorbe. La escala de tiempo de fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de movimientos moleculares, el espectro de fluorescencia posee informacin de un entorno ms amplio que el de absorcin.

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DESEXCITACION
+
-

- +
+
-

+ -

+ -

+
+-

S1

relajacin del solvente (10-12 seg)

RET

kF hF
kNR

Quenching

kT= (1/0)(R0/r)6 A1

hA S0
+
-

kQ [Q] Q*

A0

- +
+

+
+
+

LAS CUATRO TECNICAS FUNDAMENTALES: 1) ESPECTRO DE EMISIN:cambios en el entorno del fluorforo 2) QUENCHING: accesibilidad del fluorforo 3) RET (O FRET): cercana entre dos molculas 4) ANISOTROPIA: difusin rotacional

QUENCHING: retorno no radiativo al estado basal por contacto con una segunda molcula (metales pesados, acrilamida, I-, Cl-, O2, etc). Depende de la accesibilidad del fluorforo al quencher.

Q h

S1 kF hA S0
kQ [Q] Q

hF
Q*

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Se pueden ver distintos estados conformacionales de una protena. Ejemplo: CI2 con clivajes en el C-terminal El mximo de emisin del Trp5 se correlaciona con el nivel de quenching (cuanto ms expuesto, mayor EM y mayor el quenching)

mayor exposicin

RESONANCE ENERGY TRANSFER (RET o FRET):

EX D EM D A EX

EM A

EX D

*
EM A

La eficiencia de la transferencia depende de: la distancia entre D y A el grado de solapamiento entre el espectro de emisin de D y el de absorcin de A la orientacin relativa entre D y A el tiempo de vida de D* La constante de velocidad del proceso es: kT (r) = (1 / D) (R0 / r)6 R0: distancia de Fster (depende del par D-A) r: distancia D-A

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Cmo haran para medir Ca2+ intracelular en clulas intactas?

CFP CaM YFP
La conformacin de la CaM vara con [Ca2+], cambiando las distancia ECFP-EYFP. Al agregar calcio los extremos C y N se acercan.

La relacin de intensidades en los mximos se correlaciona con la concentracin de Ca2+

Y sto se puede cuantificar adentro de una clula:

ANISOTROPIA
Qu ocurre cuando se excita con luz linearmente polarizada? Se excitan preferencialmente aquellas molculas cuyo momento de transicin es paralelo al plano de polarizacin

y la emisin a su vez sale polarizada

r = (I - I) / (I + 2 I) Para un fluorforo fijo: I=0 => r =1 (en realidad el mximo posible es 0.4)

Para un fluorforo muy mvil: I = I => r = 0

Para qu sirve medir r?

medir microviscosidades (por ejemplo de una membrana) determinar bindings (ligando-protena, protena- protena, etc) seguir cambios conformacionales

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Ejemplo: unin de GlcMan9GlcNAc2-ANS-FITC a CRT

r
CRT
FITC

Kd (M) [Ca2+] = 1 mM [Ca2+] = 10 M [EGTA] = 10 mM

25C 0.24 0.06 0.20 0.05 0.30 0.06

37C 0.9 0.2 1.0 0.2 1.1 0.2

GlcMan9GlcNAc2-ANS-FITC Man9GlcNAc2-ANS-FITC TRIS-FITC

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