MS 10310030076

Imuno-HAI

CHAGAS
Kit para determinao qualitativa e semi-quantitativa de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi no soro humano por hemaglutinao indireta.
CD. 34096-H: 96 determinaes CD. 34192-H: 192 determinaes CD. 34380-H: 380 determinaes

WAMA Diagnstica
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IMPORTNCIA CLNICA A doena de Chagas ou Tripanossomiase Americana uma infeco endmica, de evoluo essencialmente crnica, causada por um protozorio, o Trypanosoma cruzi, e transmitida ao homem por um inseto, o triatomneo. Imunologicamente, 3 estgios podem ser considerados: agudo, latente ou indeterminado e crnico. Na fase aguda, verificam-se febre, miocardiopatia, linfoadenopatia, hepatoesplenomegalia e parasitemia. A multiplicao intracelular dos parasitas nos msculos lisos e estriados e clulas do sistema retculo endotelial acarreta a formao de pseudocistos. Na fase intermediria ou latente no h sintomas. A doena pode evoluir para a fase crnica com sinais de miocardiopatia, degenerao das clulas ganglionares do sistema nervoso central e perifrico, hipertrofia e dilatao de certos rgos, tais como esfago e clon, constituindo os mega. Pelos altos ndices de prevalncia e morbidade, ela se tornou um dos maiores problemas de sade pblica em toda a Amrica Latina. Como a minoria dos indivduos com sorologia positiva para T. cruzi desenvolve evidncias clnicas da doena crnica, as informaes prestadas pelo laboratrio clnico tornam-se decisivas no diagnstico

etiolgico. Vrios so os mtodos utilizados para o diagnstico da doena de Chagas: reao de fixao de complemento, aglutinao, precipitao, imunofluorescncia, hemaglutinao e imunoenzimtico. Destes, os mais utilizados so as reaes de hemaglutinao indireta (HAI), as reaes de imunofluorescncia indireta (IFI) e os imunoenzimticos (ELISA). PRINCPIO DO MTODO Eritrcitos de aves estabilizados, sensibilizados com componentes antignicos do Trypanosoma cruzi altamente purificados, mostram aglutinao quando reagem com anticorpos contra esses antgenos presentes no soro do paciente. APRESENTAO DO KIT CD. 34096-H (96 testes qualitativos) 1. Suspenso de hemcias sensibilizadas com componentes do Trypanosoma cruzi (1 x 2,4ml) 2. Soluo diluente (1 x 40ml) 3. 2-Mercaptoetanol (0,5ml) 4. Soro controle positivo (1ml) 5. Soro controle negativo (1ml) 6. Placa de microtitulao descartvel com fundo em

V (1 x 96 cavidades) 7. Instrues para uso CD. 34192-H (192 testes qualitativos) 1. Suspenso de hemcias sensibilizadas com componentes do Trypanosoma cruzi (1 x 4,8ml) 2. Soluo diluente (1 x 60ml) 3. 2-Mercaptoetanol (1ml) 4. Soro controle positivo (1ml) 5. Soro controle negativo (1ml) 6. Placa de microtitulao descartvel com fundo em V (2 x 96 cavidades) 7. Instrues para uso CD. 34380-H (380 testes qualitativos) 1. Suspenso de hemcias sensibilizadas com componentes do Trypanosoma cruzi (2 x 4,8ml) 2. Soluo diluente (2 x 60ml) 3. 2-Mercaptoetanol (1ml) 4. Soro controle positivo (1ml) 5. Soro controle negativo (1ml) 6. Placa de microtitulao descartvel com fundo em V (4 x 96 cavidades) 7. Instrues para uso MATERIAL NECESSRIO, MAS NO FORNECIDO Tubos de ensaio 13 x 75 mm para diluio e titulao Pipetas sorolgicas

 Estante para tubos e rack de ponteiras Recipiente para descarte de material. PREPARAO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES SUSPENSO DE HEMCIAS SENSIBILIZADAS (1): pronta para uso. Estvel at a data do vencimento se conservada entre 2-8C. No congelar . Homogeneizar bem antes do uso, sempre com movimentos circulares do frasco entre as mos e por inverso do frasco, mas nunca por agitao, pois esta pode acarretar hemlise e/ou autoaglutinao. Antes de ser usada, deixar em temperatura ambiente. SOLUO DILUENTE (2): conservar entre 2-8C. No momento do uso, acrescentar 70l de 2mercaptoetanol para cada 10ml da soluo diluente. Esta soluo diluente com 2-mercaptoetanol usada para diluir as amostras do soro. O uso do 2mercaptoetanol tem como objetivo a retirada de anticorpos interferentes. SORO CONTROLE POSITIVO (3): pronto para uso. Estvel at a data do vencimento se conservada entre 2-8C SORO CONTROLE NEGATIVO (4): pronto para uso. Estvel at a data do vencimento se conservada entre 2-8C

AMOSTRAS Usar soros de pacientes em jejum, frescos ou conservados a -20C. Evitar o congelamento e descongelamento repetidos do soro. Os soros envelhecidos tendem a gelificar em contato com 2mercaptoetanol, provocando resultados falsopositivos. Recomenda-se o uso de soro inativado (no obrigatrio). PROCEDIMENTO A. Teste qualitativo 1. Colocar a placa sobre um pano mido para neutralizar as foras eletrostticas. 2. Usar 1 cavidade de placa por amostra, incluindo sempre os controles positivo e negativo. 3. Utilizar diluio 1/32 da amostra com a soluo diluente com 2-mercaptoetanol (2). Recomenda-se diluir em um tubo de ensaio 10l da amostra + 0,31ml da soluo diluente com 2-mercaptoetanol. 4. Pipetar 25l do soro controle positivo, negativo e da diluio 1/32 de cada amostra nas respectivas cavidades da placa. Sugere-se: A1 controle positivo, A2 controle negativo e A3, A4, A5... soros a serem testados. 5. Adicionar 25l da suspenso homognea de hemcias (1) em cada cavidade. 6. Agitar a placa por vibrao mecnica (agitador de

placas) ou batendo, com os dedos, nas bordas da placa por 3 a 4 minutos. 7. Deixar em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibraes (IMPORTANTE). 8. Fazer leitura. LEITURA Reao Negativa : quando as hemcias se depositam no fundo da cavidade formando um boto. Reao Positiva: quando as hemcias se depositam no fundo da cavidade como um tapete, s vezes com bordas irregulares. B. Teste quantitativo Os soros que mostram reao positiva no teste qualitativo devem ser titulados. 1. Partir de uma diluio do soro de 1/32 conforme item 3 do teste qualitativo. 2. Pipetar 25l da soluo diluente com 2mercaptoetanol (2), a partir da segunda cavidade da placa, at a diluio que se pretende estudar. Ex.: se pretender diluir o soro at 1/512, pipetar 25l do diluente nas cavidades A2, A3, A4 e A5. No pipetar na A1. 3. Transferir 25l da diluio do soro 1/32 para a primeira (A1) e segunda (A2) cavidades. Homogeneizar bem o soro com o diluente na segunda

cavidade (diluio 1/64) e transferir 25l para a terceira cavidade (diluio 1/128) e assim sucessivamente, desprezando 25l no final. 4. Pipetar 25l da suspenso homognea de hemcias (1) em todas as cavidades. 5. Agitar a placa por vibrao mecnica (agitador de placas) ou batendo, com os dedos, nas bordas da placa por 3 a 4 minutos. 6. Deixar em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente, em local livre de vibraes (IMPORTANTE). 7. Fazer leitura. TTULO DA AMOSTRA: Maior diluio que mostra uma reao positiva. O ponto final quando o tapete de hemcias cobre 50% do fundo da cavidade. INTERPRETAO Ttulos menores do que 1/32: NO REAGENTES. Ttulos iguais ou maiores que 1/32: REAGENTES. NOTA: Para uma maior segurana na pesquisa de anticorpos anti-T. cruzi recomendvel a associao de mais de um tipo de teste, buscando uma maior sensibilidade e possibilidade de confronto de resultados. A WAMA produz o kit Imuno-Con CHAGAS, por imunofluorescncia e o Imuno-ELISA CHAGAS, por enzimaimunoensaio.

PRECAUES E ADVERTNCIAS 1. No utilizar reagentes de lotes diferentes. 2. Ao deixar as placas em repouso, estas no devem sofrer vibraes, pois prejudica a qualidade da leitura. 3. O frasco de hemcias deve ser armazenado em posio vertical correta para evitar auto-aglutinao irreversvel. 4. USAR EXCLUSIVAMENTE A PLACA DO KIT, que no deve ser reutilizada. 5. Pode ocorrer reao cruzada com Leishmaniose visceral e tegumentar. 6. Os ttulos de anticorpos nas reaes de hemaglutinao no costumam apresentar relao com a extenso das leses ou gravidade clnica. 7. Todos os materiais humanos usados na preparao dos controles foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-HIV, antgeno de superfcie da hepatite B (HBsAg) e antiHCV, porm, como nenhum mtodo diagnstico oferece completa segurana da ausncia destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar os soros controles humanos como materiais potencialmente infecciosos. 8. No congelar os reagentes. 9. Como se emprega azida sdica a 0,1% como conservante, alm de txica quando ingerida, o descarte dos reagentes deve ser acompanhado de

grandes volumes de gua para evitar o acmulo de resduos de azida nos encanamentos, podendo formar sais altamente explosivos. 10. Seguir as Boas Prticas de Laboratrio (BPLs) na conservao, manuseio e descarte dos materiais.

BIBLIOGRAFIA
1. Bing, D.H.; Weyand, J.G.M.; Stavitsky, A.B.: Hemagglutination with aldehyde-fixed erythrocytes for assay of antigens and antibodies. Proc. Soc. Exp. Bio., 124: 11661170, 1967. 2. Bon, G. J.; Parent, G.: Stearic acid, an essential growth factor for Trypanosoma cruzi. J. Gen. Microbiol., 31: 261-266, 1993. 3. Boyden, S.V.: The adsorption of proteins on erythrocytes treated with tannic acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera. J. Exp. Med., 93: 107-120, 1951. 4. Camargo, M.E.; Hoshino, S.; Siqueira, G.R.V.: Hemagglutination with preserved, sensitized cells, a practical test for routine serologic diagnosis of American trypanosomiasis. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo, 15(2): 81-85, 1973. 5. Camargo, M.E. et al.: Hemagglutination test for Chagas' disease with chromium chloride, formalin-treated erythrocytes, sensitized with Trypanosoma cruzi extracts. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo, 13(1): 45-50. 1971. 6. Dias, J.C.P.: Doena de Chagas. In: Cimerman, B. e Cimerman, S.: Parasitologia humana e seus fundamentos gerais. Atheneu: 81-111, 1999. 7. Ferreira, A.W. e vila, S.L.M.: Doena de Chagas. In: Ferreira, A.W.; vila, S.L.M. (eds). Diagnstico laboratorial das principais doenas infecciosas e autoimunes. Guanabara Koogan: 114-149, 1996. 8. Hoshino-Shimizu, S. et al.: A control chart method for evaluating hemagglutination reagent used in Chagas' disease diagnosis. PAHO Bull., 20(2): 170-178, 1986. 9. Luquetti, O.A.; Castro, A.M.: Diagnstico sorolgico da doena de Chagas. In: Dias, J.C.P. e Coura, J.R. (eds). Clnica teraputica da doena de Chagas. Um manual para o clnico geral. Rio de Janeiro: Fiocruz: 99-114, 1997. 10. Oddo, D. et al.: Acute Chagas' disease (trypanosomiasis americana) in acquired immunodeficiency syndrome.. Hum. Pathol., 23: 41-44, 1992.

V EDIO: 12/2004

TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnstica garante a troca deste conjunto diagnstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria tcnica que no houve falhas na execuo, manuseio e conservao deste produto. A WAMA e seus distribuidores no se responsabilizam por falhas no desempenho do kit sob essas condies.