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OBJETIVOS
Ejemplificar la diversidad del mundo microbiano: hongos, bacterias, protozoos y
virus. Introducir al alumno en la aplicación de normas de bioseguridad y de técnicas
asépticas. Uso del microscopio de campo claro. Familiarizar al alumno con las
técnicas de estudio de la morfología microscópica y macroscópica de bacterias y
hongos (miceliares y levaduriformes).
CUESTIONARIO DE ORIENTACIÓN
1- Compare los tamaños de los siguientes microorganismos: paramecio,
levaduras (Saccharomyces cerevisiae), bacterias (Escherichia coli),
adenovirus, bacteriófago .
2- ¿Cuáles de los microorganismos antes mencionados podría observar en un
microscopio de campo claro, empleando el objetivo de 10X, 40X y 100X?
3- Ubique los microorganismos mencionados en los dominios (Bacteria,
Archaea, Eukarya).
4- ¿Qué información acerca de la estructura bacteriana le brindan la
microscopía de campo claro (preparaciones en fresco y tinciones diferenciales
y no diferenciales), de campo oscuro, de fluorescencia, de contraste de fase y
electrónica en la observación de microorganismos? Ver anexo microscopía.
5- ¿Cuáles son las principales diferencias entre una célula procariota y una
eucariota?. Compare la ultraestructura de cada tipo celular.
6- ¿Qué formas y tamaños pueden presentar las bacterias?
7- En el estudio microscópico de bacterias se utilizan las tinciones de azul de
metileno, Gram, Ziehl-Neelsen. ¿Qué información brindan dichas tinciones?
8- ¿Cuáles son las principales diferencias en las envolturas de bacterias Gram
positivas y Gram negativas?.
9- ¿Cuáles son las principales diferencias en la composición de la pared y
membrana citoplasmática de bacterias y levaduras?
10- ¿Qué características morfológicas de los hongos miceliares pueden
distinguirse con un microscopio óptico de campo claro (hifas, conidios, etc.)?
Ver anexo.
11- ¿Qué es un virus? ¿Cuál es su composición química? Discuta el
requerimiento de células vivas para replicarse.
12- ¿Cuáles son las principales diferencias entre virus y clamidias?
13- ¿Qué entiende por Técnica aséptica en el laboratorio de microbiología?
14- Introducción a las normas de bioseguridad. Ver anexo Bioseguridad.
BIBLIOGRAFÍA
Brock, Biología de los Microorganismos 8a y 10a Ed. Pearson Prentice Hall. Madigan,
Martinko, Parker.
Capítulos (8a Ed.): 1, 3, 8 (8.1 al 8.4 y 8.7), 16 (16.23 y 16.31) y 18 (18.2 y 18.4).
Capítulos (10a Ed.): 2, 4, 9 (9.1, 9.8 y 9.11), 12 (12.23 y 12.27) y14 (14.8 y 14.9).
Primer día
Ejemplos de la diversidad del mundo microbiano: Hongos, bacterias,
protozoos y virus
a- Hongos miceliares: Ej.: Penicillium sp., Aspergillus sp., Geotrichum sp., Fusarium
sp. y Rhizopus sp.
Observación microscópica (40X) de preparados coloreados con Azul de lactofenol:
Tipos de micelio, conidios, formas de fructificación.
Observación macroscópica de colonias gigantes en medio Sabouraud y Czapek:
Color de la superficie y del reverso, tamaño, textura y bordes.
d- Virus.
Observación macroscópica de placas con células eucariotas infectadas por virus
animales(efecto citopático: placas de lisis), y de cultivos de bacterias sensibles
infectadas por producidas por bacteriófagos (placas de lisis).
e- Protozoos.
Observación microscópica (40X) de preparaciones de un protozoo flagelado (Ej.:
Trichomonas vaginalis) teñidas con Giemsa.
Segundo día
Bacterias y hongos unicelulares
a- Observación macroscópica del crecimiento de bacterias y levaduras en un medio
de cultivo líquido
Ud. recibirá cultivos en caldo tripteína soja (TSB) correspondientes a la muestra
analizada y un caldo TSB sin inocular.
Observe las características del desarrollo microbiano en medio líquido: turbidez
uniforme, formación de película, sedimento.
Coloración de Gram
Cubrir el preparado con Violeta de genciana. Dejar actuar 20 s
Lavar con agua de la canilla
Cubrir con lugol (mordiente). Dejar actuar 30 s.
Decolorar con alcohol-acetona (3:1) 10 s
Lavar con agua
Cubrir con safranina (contracolor). Dejar actuar 20 s
Lavar con agua.
Secar y observar con objetivo 100x con aceite de inmersión.
Medios de cultivo
Agar glucosa 4% según Sabouraud (Merck)
Peptona 10 g/l
D (+) glucosa 40 g/l
Agar-agar 15 g/l
pH final 5.6 +/- 0.2 a 25°C
Medio Czapek. Medio químicamente definido.
Nitrato de Sodio 2 g/l
Fosfato bipotásico 1 g/l
Cloruro de potasio 0,5 g/l
Sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g/l
Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/l
Sacarosa 30 g/l
Agar-agar 15 g/l
pH final 4.2 +/- 0.2 a 25°C
Nivel de bioseguridad 1
El trabajo se realiza generalmente sobre mesadas abiertas y se usan técnicas
microbiológicas adecuadas.
No se requiere equipamiento de contención ni diseño especial de infraestructura.
El personal de laboratorio debe tener capacitación continua y supervisión de un
profesional habilitado.
El personal debe usar indumentaria de protección adecuada.
Nivel de bioseguridad 2
El personal de laboratorio debe tener entrenamiento específico para manipular
agentes patógenos y estar supervisado por un profesional habilitado.
El acceso al laboratorio debe estar restringido al personal autorizado.
Se deben tomar precauciones extremas con elementos corto punzantes
Las operaciones generadoras de aerosoles potencialmente infecciosos deben ser
realizadas con equipamiento y/o procedimientos de contención física (ej. flujos
laminares).
El personal debe usar indumentaria de protección adecuada.
Nivel de bioseguridad 4
El laboratorio debe estar aislado del resto de las instalaciones y el acceso al mismo
debe ser estrictamente controlado (ingreso y egreso documentados).
Dentro de las áreas todas las actividades deben estar confinadas a gabinetes de
seguridad biológica Tipo III o gabinetes de seguridad biológica Tipo II con traje
presurizado para el operador.
Se debe realizar el tratamiento “in situ” de los efluentes.
Se debe usar filtración absoluta doble HEPA del aire extraído, y aplicar presión
negativa en el laboratorio.
Gabinetes de seguridad biológica
Los gabinetes de seguridad biológica son dispositivos destinados a la manipulación
segura de material biológico.
Referencias bibliográficas
1- Micucci HA. Bioseguridad como epidemiología del accidente y las
condiciones de trabajo como causas del mismo. En Temas de Zoonosis II. Editores
Cacchione R, Durlach R y Larghi O. Edición Asociación Argentina de Zoonosis.
Buenos Aires. 2004, p. 423-428.
2- de Torres RA. Niveles abordables de bioseguridad. Bioseguridad en el
laboratorio. Acta Bioquim Clin Latinoam., Suplemento 4. 1988. p. 1-4.