Biologia molecolare

La biologia molecolare una branca della biologia che studia gli esseri viventi a livello dei meccanismi molecolari alla base della loro fisiologia, concentrandosi in particolare sulle interazioni tra le macromolecole, ovvero proteine e acidi nucleici (DNA e RNA). Per biologia molecolare si intendono spesso una serie di tecniche che consentono la rilevazione, l'analisi, la manipolazione, l'amplificazione (PCR) e la copia (clonaggio) degli acidi nucleici.

Tecniche della biologia molecolare

Sin dai primi anni 1960, i biologi molecolari hanno scoperto come caratterizzare, isolare e manipolare le componenti molecolari delle cellule e degli organismi. Tra queste componenti citiamo il DNA, il depositario dell'informazione genetica; l'RNA, che funge da copia temporanea operativa di DNA e pu svolgere funzione strutturale e catalitica nell'apparato deputato alla traduzione; le proteine, che ricoprono ruoli strutturali ed enzimatici nelle cellule.

Clonaggio di espressione
Una delle tecniche di base della biologia molecolare per lo studio della funzione delle proteine il clonaggio di espressione. In questa tecnica, il DNA codificante una proteina di interesse clonato (tramite PCR e/o enzimi di restrizione) in un plasmide (noto come vettore di espressione). Questo plasmide pu avere promotori speciali che portino alla produzione della proteina di interesse, e generalmente portano anche un marcatore (ad esempio, la resistenza ad un antibiotico) per facilitare lo studio delle dinamiche del plasmide. Il plasmide pu essere inserito in cellule batteriche o animali: nel primo caso si parla di trasformazione, e pu essere effettuata sfruttando diverse tecniche, tra cui elettroporazione, microiniezione, assunzione passiva o coniugazione. L'introduzione di DNA in cellule eucariotiche, ad esempio cellule animali, viene chiamata trasfezione: sono disponibili all'uopo diverse tecniche, tra cui la trasfezione con calcio fosfato o con liposomi. Il DNA pu essere introdotto nelle cellule anche usando come vettori virus o batteri patogeni: in questo caso, la tecnica viene definita trasduzione virale (o batterica). In ogni caso, quando il DNA codificante la proteina di interesse all'interno della cellula, la proteina pu essere espressa - per facilitare l'espressione ad alti livelli sono disponibili diversi sistemi, quali promotori inducibili e fattori specifici di cell-signaling - ed essere indagata.

Reazione a catena della polimerasi ( Polymerase chain reaction PCR)

La reazione a catena della polimerasi o PCR una tecnica estremamente versatile per copiare il DNA. In breve, la PCR consente la copia o l'alterazione in un modo predeterminato (milioni di volte) di una sequenza di DNA singola. Ad esempio, la PCR pu essere usata per introdurre siti di restrizione o mutare particolari basi azotate della sequenza del DNA. La PCR pu anche essere usata per determinare se un particolare frammento di DNA si trova in una library di cDNA. La PCR presenta molte variazioni.

Elettroforesi su gel
L'elettroforesi su gel una delle metodologie principali della biologia molecolare. Il principio base sta nella possibilit di separare DNA, RNA e proteine sfruttando un campo elettrico. Con l'elettroforesi su gel di agarosio, si possono separare acidi nucleici in base alle dimensioni. Le proteine possono essere separate in base alle dimensioni o in base alla carica elettrica (in quest'ultimo caso si parla di gel isoelettrico) usando un gel di poliacrilammide (eventualmente in presenza di sodio dodecilsolfato).

Southern blot
Questo metodo serve a sondare la presenza di specifiche sequenze di DNA in un campione di DNA: i campioni, prima e dopo una digestione con enzimi di restrizione sono separati tramite elettroforesi su gel e dunque trasferiti su una membrana sfruttando la capillarit. La membrana pu dunque essere indagata usando una sonda di DNA marcata complementare alla sequenza di interesse (i protocolli originariamente prevedevano maracatura con isotopi radioattivi, ora sono disponibili marcature non radioattive). Il Southern blot una tecnica ora meno usata, considerata la capacit della PCR di individuare specifiche sequenze di DNA da un campione, ma il Southern blot pu essere usato per altre applicazioni, quali la conta del numero di copie di un transgene in un topo transgenico o l'ingegnerizzazione di geni knockout in linee di cellule staminali embrionali.

Northern blot
Il Northern blot usato per studiare l'espressione di specifiche molecole di RNA da specifici campioni in comparazioni relative. Sostanzialmente una combinazione di elettroforesi su gel di RNA denaturato e di un blotting. In questo processo, l'RNA separato in base alle dimensioni ed poi trasferito ad una membrana che viene sondata con una sequenza complementare marcata alla sequenza di interesse. I risultati possono essere visualizzati in modi diversi a seconda della marcatura utilizzata: in generale, si rivelano bande la cui intensit correlata alla quantit dell'RNA di interesse nel campione indagato. La procedura comunemente usata per studiare quando e quanto il gene viene espresso.

Western blot
Sono stati sintetizzati anticorpi contro molte proteine iniettando una piccola quantit della proteina in un animale quale topo, coniglio, pecora o asino (anticorpi policlonali). Questi anticorpi possono essere usati per diverse tecniche analitiche o preparative. Nel Western blot le proteine sono separate in base alle dimensioni tramite SDS-PAGE e trasferite su una membrana di supporto, generalmente di nitrocellulosa o nylon. La membrana pu essere sondata con soluzioni di anticorpi. Gli anticorpi che legano specificamente la proteina di interesse possono essere visualizzate con tecniche diverse, tra cui prodotti colorati, chemioluminescenza o autoradiografia. Metodi analoghi al Western blot possono essere usati per colorare specifiche proteine in sezioni di tessuto o in cellule. Queste tecniche (si parla di immunostaining sono tipicamente utilizzate in biologia cellulare. I termini "Western" e "Northern" sono frutto di un gioco di parole: i primi blots erano effettuati con il DNA ed erano noti come "Southerns" in onore al loro inventore, Ed Southern. Il blot seguente, inventato da Patricia Thomas, divenne noto come "Northern". Per portare avanti il gioco di parole, si possono trovare riferimenti in letteratura a "Southwestern blots" (che indagano le interazioni proteina-DNA) e "Farwestern blots" (per interazioni proteina-proteina).