MTODOS DE ULTRACENTRIFUGACIN ANALTICA EN EL CIB: Consideraciones generales y aspectos prcticos.

Velocidad de Sedimentacin Fundamentos. En un experimento de velocidad de sedimentacin las macromolculas se someten a un campo centrfugo elevado tal que la fuerza de centrifugacin es mayor que la de difusin, por lo que existe un transporte neto de material hacia el fondo de la celda. Es un mtodo hidrodinmico de transporte que permite fraccionar las macromolculas en base a las diferencias en coeficiente de sedimentacin (una funcin de la masa, la densidad y la forma macromolecular). Aplicaciones. La primera informacin que estos experimentos nos darn es el grado de homogeneidad o heterogeneidad de las especies macromoleculares que sedimentan. Este fraccionamiento tambin puede ser muy til para detectar y cuantificar la estequiometra y la afinidad de complejos macromoleculares. De esta informacin podemos tambin estimar la forma aproximada de macromolculas en disolucin. Anlisis preliminar. Clculo de coeficientes de sedimentacin: programas SEDFIT y SVEDBERG (accesibles en los enlaces relacionados indicados en la pgina web del Servicio).

Aspectos prcticos. La absorbancia de la muestra frente a su correspondiente tampn ha de ser menor de 1,3 (unidades de absorcin a la longitud de onda de trabajo). Es necesario poner en cada celda de la ultracentrfuga el tampn de muestra (que se usa como referencia). Se recomienda hacer el experimento a varias concentraciones (al menos tres). Volumen de muestra: 300-400 L. Tiempo aproximado del experimento: 2 h.

Equilibrio de Sedimentacin Fundamento. En la modalidad de equilibrio de sedimentacin las muestras se someten a campos centrfugos moderados hasta que se igualan las fuerzas opuestas de centrifugacin y difusin (condicin de equilibrio). En estas condiciones, las especies macromoleculares se distribuyen formando un gradiente de concentracin que se caracteriza porque a) no vara con el tiempo, b) es independiente de las propiedades hidrodinmicas (forma) de las macromolculas y c) depende nicamente de la masa molecular de la especie que sedimenta. Este ltimo punto es muy importante, ya que implica que esta tcnica permite estudiar procesos de asociacin en los que no es posible separar fsicamente las diferentes especies moleculares presentes (por ejemplo, interacciones dbiles). Si conocemos la dependencia con la composicin de la masa molecular, es posible modelar dicha dependencia en el contexto de diferentes esquemas de asociacin. Aplicaciones. Esta tcnica permite la determinacin de la masa molecular de las especies macromoleculares que sedimentan, as como la deteccin y el anlisis cuantitativo (en trminos de estequiometra, afinidad y reversibilidad) de las asociaciones que dan lugar a la formacin de complejos macromoleculares en disolucin. Anlisis preliminar. Clculo de masas moleculares promedio: programas EQASSOC y XLAEQ, paquete de programas de anlisis que se suministran con el equipo, y SEDPHAT (accesibles en el sitio RASMB, ver enlaces relacionados). Aspectos prcticos. La absorbancia de cada muestra en la celda, medida frente a su correspondiente tampn, ha de estar en el intervalo de 0.1-0.6 unidades de absorcin a la longitud de onda elegida (preferiblemente en un mximo de absorcin, en el intervalo entre 220 y 600 nm). Es necesario poner en cada celda de medida de la ultracentrfuga el tampn de muestra (que se usa como referencia). La medida de la absorbancia se suele realizar en un espectrofotmetro con una cubeta de paso ptico de 1 cm. Para correlacionar esta medida con la seal que se detectar en las celdas de la ultracentrfuga debe tenerse en cuenta el paso ptico de dichas celdas. A) Las piezas centrales que se emplean ms habitualmente tienen un paso ptico de 1.2 cm. En este caso, una absorbancia de 1.0 en el espectrofotmetro dara 1.2 en la ultracentrfuga. B) Si las muestras

dan una absorbancia superior a 0.6 pueden emplearse celdas de paso ptico de 0.3 cm (donde una absorcin de 1.0 UA, medida espectrofotomtricamente, dara una seal en la ultracentrfuga de 0.3). Se recomienda hacer el experimento a varias concentraciones de muestra (al menos tres) y a varias velocidades angulares (al menos dos). Volumen de muestra: normalmente 80 L, aunque puede ser de 60-120 L (a mayor volumen mayor precisin en el anlisis, pero a costa de que el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio de sedimentacin aumenta considerablemente). Tiempo aproximado del experimento: 15-24 h (80 L). Muestras lbiles: se pueden reducir estos tiempos usando procedimientos experimentales especficos.

Muestras Al ser una tcnica no destructiva, las muestras se pueden recuperar despus de cada anlisis. Cul es el grado posible de toxicidad/contaminacin de las muestras? Las muestras han de ser lo ms puras que sea posible y estar bien equilibradas en el tampn de trabajo. Diagnstico previo de pureza: Aparece la protena como una o como varias bandas en electroforesis en presencia de SDS? Diagnstico de homogeneidad (de tamao) de la muestra: Eluye la protena en cromatografa de filtracin en gel como uno o como varios picos? Cul es el espectro UV-VIS (200-350 nm) de la muestra? Cul es la composicin de aminocidos de la protena? Esta informacin es necesaria para calcular el volumen especfico parcial de la protena/ADN. Centrifugar las muestras en una centrfuga de mesa a 13.000 rpm durante unos 5-10 minutos. Medir la absorbancia de la muestra antes y despus de la centrifugacin. Disminuye la absorbancia despus de centrifugar? Una disminucin apreciable de la absorbancia indicara que la muestra est agregando en esas condiciones y habra que buscar otras condiciones (temperatura, composicin del tampn, etc.) para hacer el experimento. Los anlisis se suelen realizar a temperaturas de +4 a +37C. Cul es la temperatura a la que se debe realizar el experimento? Son las muestras estables / lbiles (condiciones de temperatura, pH, etc.)?

Tampones Es necesario poner en cada celda de medida, adems de la muestra, una alcuota del tampn en el que va disuelta la muestra, que se usa como referencia. Cuando sea posible, este tampn provendr del ltimo paso de dilisis de nuestra

muestra. Posee el tampn de referencia la misma composicin que el correspondiente en el que est disuelta la muestra? Existen sustancias en los tampones habitualmente empleados que absorben en el UV (nucletidos, algunos agentes reductores, como mercaptoetanol y DTE, detergentes, etc.) y pueden interferir en las medidas de centrifugacin, por lo que, si es posible, se recomienda no emplearlos. Este problema no existe en experimentos de velocidad de sedimentacin por interferencia con el modelo XLI. Qu componentes lleva el tampn que contiene la muestra? Otras sustancias (como por ejemplo el glicerol, la urea y el cloruro de guanidinio) pueden interaccionar con las protenas alterando su volumen especfico parcial. Aunque es posible trabajar en presencia de estas sustancias, esto dificulta el anlisis experimental, por lo que se recomienda eliminarlas, si es posible, previamente. Por otro lado, el cloruro de guanidinio y sustancias similares pueden daar las celdas de medida. Lleva el tampn de muestra alguna de estas sustancias? Dado que las ventanas de medida de las celdas de la centrfuga son de cuarzo (o zafiro) y las piezas centrales de las mismas son de ciertos tipos de plsticos (Epon-charcoal, aluminio-Epon) los tampones NO podrn contener sustancias que afecten a los mencionados materiales (cidos y bases fuertes, algunos disolventes y detergentes, etc.). Cul es la composicin completa del tampn de muestra?