Relatório de Estágio

António Jorge Pinto Sequeira
Aluno nº 7161 da Licenciatura em Química Aplicada Ramo Biotecnologia
Pesquisa de Organismos Geneticamente

Modificados
em Alimentação Animal
Faculdade de Ciências e Tecnologia

UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA
L i s b o a
2 0 0 2
Este relatório refere-se a um estágio curricular da licenciatura
em Química Aplicada ramo Biotecnologia da Faculdade de Ciências e
Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa realizado, sob a
orientação do Dr. José Manuel Gaspar Nunes da Costa, no Serviço de
Química Alimentar e Toxicologia do Departamento de Higiene
Pública do Laboratório Nacional de Investigação Veterinária (LNIV),
com um breve período no BPL do Laboratório de Microbiologia do
Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica (IBET).
R e s u m o
O estágio efectuado foi um primeiro passo para a

implementação em rotina laboratorial de um método para o rastreio
da presença de organismos geneticamente modificados (OGM) em
alimentos para animais por PCR (polymerase chain reaction). O
trabalho experimental consistiu na adaptação às matrizes das
rações usadas na alimentação animal do método comunitário
baseado na pesquisa do promotor 35S do vírus do mosaico da
couve-flor (CaMV 35S) e do terminador NOS (nopalina sintase) do
plasmídeo Ti (tumour-inducing) da bactéria do solo Agrobacterium
tumefaciens [1], desenvolvido e testado em farinhas de milho e de
soja [2].
A g r a d e c i m e n t o s
Í n d i c e
1 Introdução.....................................................................................13
1.1 A Emergência dos OGM..........................................................13
1.2 Definições...............................................................................17
1.3 Legislação sobre OGM............................................................19
1.4 Métodos de Pesquisa de OGM.................................................23
1.4.1 Statu Quo da Normalização e Validação dos Métodos......23
1.4.2 PCR vs. ELISA....................................................................24
1.4.3 Fundamento do Método Adoptado....................................26
2 Procedimento Experimental..........................................................31
2.1 Advertências...........................................................................31
2.2 Reagentes e Equipamento......................................................32
2.3 Amostras e Padrões................................................................33
2.4 Preparação das Amostras.......................................................34
2.4.1 Moagem/Homogeneização em Stomacher.......................34
2.4.2 Pesagem...........................................................................34
2.5 Extracção/Purificação de DNA.................................................35
2.5.1 Método CTAB....................................................................35
2.6 Avaliação da Integridade e Concentração do DNA..................37
2.6.1 Electroforese do DNA Extraído.........................................37
2.6.2 Captura de Imagem dos Géis Obtidos..............................38
Coloração do Gel com Solução de Brometo de Etídeo...........38
Aquisição e Registo da Imagem Fotográfica do Gel...............38
2.6.3 Diluições...........................................................................38
2.7 Controlo da Amplificabilidade do DNA e da Inibição pela Matriz
39
2.7.1 PCR de DNA de Cloroplasto..............................................39
2.7.2 Electroforese dos Produtos de Amplificação.....................41
2.8 Pesquisa do Promotor CaMV 35S............................................43
2.8.1 PCR do Promotor CaMV 35S..............................................43
2.9 Pesquisa do Terminador NOS..................................................44
2.9.1 PCR do Terminador NOS...................................................44
3 Resultados.....................................................................................47
3.1 Avaliação da Integridade e Concentração do DNA..................47
3.2 Controlo da Amplificabilidade do DNA e da Inibição pela Matriz
49
3.3 Pesquisa do Promotor CaMV 35S............................................50
3.4 Pesquisa do Terminador NOS..................................................51
4 Discussão......................................................................................55
5 Bibliografia....................................................................................63
Introdução
1 I n t r o d u ç ã o
1.1 A Emergência dos OGM
A aplicação da biotecnologia1 à actividade agrícola (motivada

por conveniências económicas mas também ecológicas),
particularmente no que se refere à manipulação genética de
cultivares, tem lançado no mercado espécies vegetais com
propriedades alteradas, que as diferenciam das respectivas
congéneres convencionais. Assim, as novas características
introduzidas nas plantas alteradas por engenheria genética
actualmente aprovadas podem ser divididas nas seguintes
categorias [6]:
I. Melhoramento da qualidade do produto
(durabilidade, firmeza, adiamento da
senescência do fruto);
II. Resistência a pragas (insectos, nemátodos,
vírus);
III. Benefícios agronómicos (tolerância a
herbicidas).
No presente, são os benefícios para os agricultores que
dominam, no leque de produtos obtidos por engenheria genética
disponíveis no mercado (é aliás a expectativa de aumento de
rendimento e conveniência das culturas transgénicas que explicam
a sua adopção pelos agricultores), mas espera-se que uma segunda
vaga da biotecnologia agrícola (vide definição de cultivares de 2ª
geração no glossário da referência 4) se volte para a criação de
alimentos cujas vantagens para o consumidor sejam mais
evidentes, como é o caso de culturas com características
nutricionais [7] e/ou organolépticas melhoradas, com um aumento
do poder de conservação, uma redução do potencial alergénio e a
1
Definida pela OCDE como "a aplicação da ciência e tecnologia a organismos
vivos bem como a partes, produtos ou modelos deles provenientes, para alterar
material vivo ou não-vivo para a produção de conhecimento, bens e serviços" [3].
Vide também a definição apresentada nos glossários das referências 4 e 5.
13
Pesquisa de Organismos Geneticamente Modificados em Alimentação
Animal
eliminação de toxinas naturais, para além da manutenção ou

diminuição do preço dos produtos produzidos a partir delas [8, 9].
Os benefícios actuais e previstos da aplicação da engenheria
genética à actividade agrícola incluem ainda o aumento da
produtividade e do rendimento, a melhoria da qualidade das
colheitas e o uso mais racional dos factores de produção (água,
fertilizantes e fitofármacos), o desenvolvimento de culturas
resistentes à seca (o que implica um menor consumo de àgua), a
produção de combustíveis biológicos (fontes de energia renováveis),
a diminuição da produção de resíduos e de consumo de energia e,
incluisivamente, a aplicação de plantas geneticamente modificadas
(GM) na administração de vacinas ou vitaminas.
O crescimento da população mundial e evolução dos hábitos
alimentares requer da agricultura um substancial aumento de
rendimento, especialmente se se pretender não perturbar
ecossistemas virgens, como as florestas tropicais. A biotecnologia
agrícola é vista como um meio de garantir que a agricultura consiga
alimentar os 8000 milhões de pessoas estimados para 2025, dado
que a área agrícola disponível, cerca de 7% da superfície do
planeta, não pode aumentar indefinidamente. As culturas GM terão
assim de ser um importante factor a ter em conta nos futuros
estudos de sustentabilidade da agricultura [10, 11].
As vantagens da biotecnologia agrícola têm como
consequência um crescimento explosivo da área de cultivo de
espécies GM [5, 12, 13], principalmente nos EUA (que em 1999
detinham 70% do total da área de cultivo GM mundial), Argentina e
Canadá. A Europa fica muito aquém, com apenas 0,03% do total da
área de cultivo de espécies GM (vide tabela 1.1 da referência 5).
O atraso europeu fica a dever-se a preocupações de vária
ordem sobre os potenciais riscos das plantas transgénicas,
nomeadamente: a possibilidade de produção de compostos
alergénios, a transferência da resitência a antibióticos usada para
marcação genética, a ameaça para a biodiversidade e o
14
Introdução
desenvolvimento de "super ervas daninhas", por transferência da

tolerância a herbicidas. Qualquer um destes riscos potenciais é
desdramatizado, senão mesmo invalidado na referência 14. Fala-se
mesmo de "histeria em massa" e "irracionalidade quanto à questão
dos OGMs" [15]. Também os produtores e distribuidores confiam nos
anos de investigação e desenvolvimento gastos na produção de
espécies transgénicas, bem como no processo de avaliação da sua
segurança [9, 16-18]. Contudo, a preocupação dos consumidores é
alimentada pela falta de informação, pelos protestos dos grupos
ambientalistas e por numerosos estudos realizados pela
comunidade científica sobre a matéria [19-31].
Um caso paradigmático é o do artigo publicado na revista
Nature que parecia indicar que o pólen de uma variedade de milho a
quem tinha sido inserido o gene da biotoxina de Bacillus thurigiensis
(Bt)2 era prejudicial a larvas de borboletas monarca (Danaus
plexippus) [32]. O artigo gerou uma intensa polémica, exacerbando
as dúvidas sobre a segurança das culturas Bt, não isenta de
consequências legislativas (vide ponto 1.3). Porém, os próprios
autores do referido estudo concluem o artigo alertando para a
necessidade de recolher dados para avaliar os riscos da engenheria
genética enquanto tecnologia agrícola e comparar esses riscos com
os colocados pelos pesticidas e outras tácticas de controlo de
pragas. Alguns autores [33] fazem pender essa avaliação a favor
das plantas transgénicas em detrimento dos pesticidas cujos efeitos
toxicológicos e suas consequências são bem conhecidos [34]. A
referência 35 dá conta da controvérsia do caso ao reproduzir artigos
que expressam a preocupação relativa às culturas Bt [36] e outros
que a acham exagerada e sem fundamento [37].
Dada a importância do milho (Zea mays Linnaeus) [38] e dos
produtos do complexo soja (Glycine max L.) [39] na alimentação
animal – representando cerca de 30% e 17%, respectivamente, ou
2
Bacillus thurigiensis é uma bactéria do solo que produz toxinas contra insectos
(principalmente dos géneros Lepidoptera, Diptera e Coleoptera). São usadas
preparações de Bt na agricultura biológica como insecticida [5].
15
Animal
seja 47% do total das matérias-primas consumidas – o debate em

torno da utilização de OGM assume particular relevância na
indústria de alimentos compostos para animais [8, 40],
principalmente se se tomar em consideração que apenas 1% das
importações de soja são usadas para alimentação humana [5]. Esse
facto e a dependência do exterior no aprovisionamento de matérias-
primas – Portugal é deficitário em cerca de 70%, com a soja a
representar uma dependência total, sendo importada da Argentina,
Brasil e Estados Unidos – explicam o enfoque dado àquelas duas
culturas no desenvolvimento de métodos de pesquisa de OGM em
alimentos para animais.
16
Introdução
1.2 Definições
A falha de equivalência entre uma espécie geneticamente

modificada e a sua congénere que não sofreu alteração por via de
engenheria genética tem por base a existência de "modificação
genética" (que era definida na Directiva 90/220/CEE [41] como
"modificação do material genético por recurso às técnicas definidas
na Directiva 90/220/CEE" [41], onde se incluíam as técnicas de DNA
recombinante que utilizem sistemas de vectores como as já
abrangidas pela Recomendação 82/472/CEE do Conselho3 [42]), que
ocorre quando são utilizadas as técnicas referidas na parte 1 do
anexo I A da Directiva 2001/18/CE4 [43]. A alteração genética de
uma espécie manifesta-se pela presença de DNA que não está
normalmente presente no genoma da espécie em causa,
nomeadamente sequências de DNA endógeno modificadas ou de
DNA heterólogo (constituindo ambos informação genética "extra"
que pode ser pesquisada), e/ou de proteínas codificadas por esse
DNA acrescentado. No mesmo documento, define-se "organismo
geneticamente modificado" como "qualquer organismo, com
3
Documento em que se definem "trabalhos que envolvem o ADN recombinante"
como "a formação de novas combinações de materiais genéticos pela inserção de
moléculas de ácido nucleico, produzido exteriormente à célula seja por que
processo for, no interior de qualquer vírus, plasmídeo bacteriano ou sistema
vectorial, de forma a permitir a sua incorporação num organismo hospedeiro no
interior do qual não aparecem de forma natural, mas onde podem multiplicar-se
de forma contínua."
4
«Técnicas referidas no nº 2 do artigo 2º. Parte 1. As técnicas de modificação
genética referidas no nº 2, alínea a), do artigo 2º, são, nomeadamente:
1) Técnicas de recombinação de ácidos nucleicos que
envolvam a formação de novas combinações de material genético
através da inserção de moléculas de ácidos nucleicos em vírus,
plasmídeos de bactérias ou outros vectores, independentemente do
modo como sejam produzidas fora do organismo, e respectiva
incorporação num organismo hospedeiro em que não ocorrem
naturalmente mas onde poderão continuar a ser propagadas;
2) Técnicas, incluindo a micro-injecção, a macro-injecção e o
micro-encapsulamento, que envolvam a introdução directa num
organismo de material geneticamente transmissível preparado fora
desse organismo;
3) Técnicas de fusão celular (incluindo a fusão protoplástica)
ou de hibridação em que células viáveis com combinações novas de
material geneticamente transmissível sejam formadas através da
fusão de duas ou mais células através de meios ou métodos que
não ocorrem naturalmente.»
17
Animal
excepção do ser humano5, cujo material genético tenha sido

modificado de uma forma que não ocorre naturalmente por meio de
cruzamentos e/ou de recombinação natural6.".
5
Na Directiva 90/220/CEE [41] e na definição incluída no glossário da
Recomendação 97/618/CE da Comissão [44] ainda não existia a exclusão explícita
do ser humano na definição de OGM (introduzida, provavelmente, para ressalvar
os doentes tratados por terapia genética).
6
O método de transformação é maioritariamente (64%) o uso de plasmídeos
modificados de Agrobacterium tumefaciens, que actua como vector [6].
18
Introdução
1.3 Legislação sobre OGM
Em 1996 e 1997, ao abrigo da Directiva 90/220/CEE [41]

(revogada pela Directiva 2001/18/CE [43])7, que regulamenta a
libertação deliberada de OGM no ambiente, foram colocados no
mercado da União Europeia (UE) dois produtos GM: a soja Roundup
Ready® [16] e o milho Bt-176 [51, 52]. Em 1997, vinte e oito
produtos de origem vegetal geneticamente modificados foram
aprovados em todo o mundo [6]. Nesse ano, e dando voz à
preocupação expressa por alguns sectores da população
relativamente à utilização dos chamados "(alimentos) transgénicos"
na alimentação humana e animal e por forma a garantir o direito à
informação que assiste ao consumidor, a UE formulou o
Regulamento (CE) nº 258/97 [53]. Este último obriga a que os
"novos alimentos e ingredientes alimentares que contenham ou
consistam em organismos geneticamente modificados" que não
sejam substancialmente equivalentes aos respectivos organismos
tradicionais sejam rotulados como tal.
Uma vez que a comercialização no mercado comunitário dos
dois produtos anteriormente mencionados tinha sido aprovada
antes da implementação do Regulamento dos Novos Alimentos [53],
foi criado o Regulamento (CE) nº 1139/98 [54] do Conselho, para
7
Em Portugal, da transposição das Directivas 90/219/CEE [45] (acerca do uso
confinado de microrganismos geneticamente modificados) e 90/220/CEE [41]
resultou o Decreto-Lei nº 126/93, de 20 de Abril [46], que regula a utilização e
comercialização de organismos geneticamente modificados. Esse Decreto-Lei
refere-se apenas à utilização e comercialização de OGM e foi posteriormente
regulamentado pela Portaria nº 751/94, de 16 de Agosto [47], que estabelece as
regras a que devem obedecer as notificações para a libertação deliberada no
ambiente e colocação no mercado de OGM, bem como a notificação da colocação
no mercado de produtos que contenham esses organismos. O Decreto-Lei nº
126/93 [46] foi ainda alterado pelo Decreto-Lei nº 63/99, de 2 de Março [48], que
corrige algumas lacunas e obriga o notificador a pagar taxas. O Decreto-Lei nº
172/98, de 25 de Junho [49] resulta da transposição da Directiva 97/35/CE, de 18
de Junho [50], que altera o Anexo III da Directiva 90/220/CEE [41], que passou a
exigir que todos os produtos colocados no mercado que contenham OGM sejam
objecto de rotulagem. Aquele documento legislativo transpõe o Anexo, corrigindo
algumas incorrecções e acrescenta anexos que estavam em falta na Portaria nº
751/94, de 16 de Agosto, relativa à notificação da libertação deliberada no
ambiente de organismos geneticamente modificados [47].
19
Animal
colmatar o vazio legislativo relativamente à rotulagem de produtos

contendo ou consistindo naqueles dois OGM8.
Mais recentemente, o Regulamento (CE) nº 49/2000 [56]
altera aquele diploma legislativo, fixando em 1% o limite máximo
admitido para contaminações adventícias9 com OGM de géneros
alimentícios cujos produtores tenham apresentado prova da não
incorporação de OGM e da aplicação de medidas preventivas da
contaminação com OGM. O referido regulamento estabelece como
que um intervalo de tolerância para o que se pode considerar um
produto isento de OGM – acima do limiar de 1%, o alimento
supostamente GMO-free fica sujeito a rotulagem, como qualquer
produto contendo ou consistido em OGM aprovados na UE.
É com base no valor de 1% que os Serviços da Comissão
preparam legislação por forma a estipularem limiares para a
presença de semente GM em lotes de variedades convencionais.
Neste momento, a Comissão prepara Directivas que alteram os
anexos das Directivas relativas à comercialização de sementes de
forma a estabelecer modalidades baseadas nos requisitos de
rotulagem previstos na Directiva 98/95/CE do Conselho [57] para as
sementes de variedades geneticamente modificadas de espécies de
plantas agrícolas e produtos hortícolas e ainda estabelecer critérios
de pureza para a presença acidental de sementes GM em lotes de
sementes de variedades de plantas tradicionais.
No que se refere à alimentação animal, o Livro Branco sobre a
Segurança dos Alimentos [58], prevê a obrigatoriedade da
declaração de todos os ingredientes utilizados na formulação dos
alimentos compostos para animais, pelo que a respectiva rotulagem
contemplará a declaração obrigatória da incorporação de OGM. De
8
Em 1999, devido à crise das borboletas monarca e do milho Bt (vide ponto 1.1),
assistiu-se ao endurecimento da legislação concernente aos OGM mesmo pelo
Japão, país que abraçou a biotecnologia agrícola de forma quase tão efusiva
quanto os Estados Unidos e alguns países da América Latina [55].
9
A "presença adventícia" é definida como "uma presença em baixo nível,
tecnicamente inevitável e não intencional (por exemplo vestígios de produtos GM
encontrados em cargas de produtos similares convencionais resultantes da
mistura de ambos)" [4].
20
Introdução
acordo com o anexo relativo ao Plano de Acção em Matéria de

Segurança dos Alimentos do referido documento, a adopção pelo
Conselho e Parlamento Europeu de um sistema centralizado de
autorização da utilização de produtos não convencionais,
principalmente OGM e seus derivados, na alimentação animal é um
objectivo prioritário, agendado para o final de 2001. A Directiva
70/524/CEE do Conselho, de 23 de Novembro de 1970 relativamente
aos aditivos na alimentação para animais [59], com a última
redacção que lhe foi dada pela directiva 1999/20/CE do Conselho
[60], prevê um procedimento de autorização para a colocação no
mercado de aditivos nos alimentos para animais. Além deste
procedimento de autorização, os aditivos nos alimentos para
animais que contenham, consistam ou sejam produzidos a partir de
OGM deverão ser abrangidos pelo âmbito do Regulamento do
Parlamento Europeu e do Conselho relativo a alimentos
geneticamente modificados para a alimentação humana e animal,
actualmente em fase de proposta [61], no que diz respeito à
avaliação de segurança da modificação genética, enquanto que a
autorização final deverá ser concedida ao abrigo do procedimento
estabelecido na Directiva 70/524/CEE [59] (que prevê que possam
ser autorizados novos aditivos em função da evolução dos
conhecimentos científicos e técnicos). Os alimentos para animais
geneticamente modificados têm de ser rotulados de acordo com a
Directiva 90/220/CEE [41] (actualmente, 2001/18/CE [43]) que é
apenas aplicável aos OGM vivos. Assim, não existem requisitos de
rotulagem para alimentos para animais produzidos a partir de OGM
mas que já não contenham OGM. Além disso, até à segunda revisão
da Directiva 90/220/CEE [41], não era obrigatória a rotulagem
indicando a presença de OGM, pelo que, actualmente, quatro
autorizações de OGM para utilização em alimentos para animais não
exigem rotulagem obrigatória enquanto que outras quatro exigem
essa rotulagem.
21
Animal
Um sistema adequado de rotulagem de alimentos

geneticamente modificados para a alimentação humana e animal é
encarado como um dos aspectos principais no sentido de garantir
uma maior aceitação da aplicação da tecnologia genética no sector
agro-alimentar. O Eurobarómetro 2000 [62] e vários outros estudos
efectuados por toda a Europa [63] (a referência 64 analisa os dados
do Eurobarómetro de 1996 e compara-os com o de 1993 e de 1991)
revelam que os consumidores exigem uma rotulagem mais clara
indicando se os produtos consistem em, contêm ou foram
produzidos a partir de organismos geneticamente modificados no
sentido de poderem efectuar uma selecção individual10.
10
A forma como os inquéritos são levados a cabo e as conclusões que deles se
retiram têm, no entanto, sido postas em causa por autores envolvidos no
processo de sondagem de opinião dos consumidores acerca da utilização da
biotecnologia na alimentação [65].
22
Introdução
1.4 Métodos de Pesquisa de OGM
De modo a satisfazer os requisitos de rotulagem, é imperativo

o desenvolvimento, validação e aplicação sistemática de métodos
de controlo das sementes e alimentos que circulam no mercado
europeu. Esses métodos passam pelo rastreio da presença de OGM
de forma genérica nas sementes, matérias-primas e alimentos
processados bem como pela quantificação do teor de cada OGM
aprovado na UE, nas amostras que tenham dado resultado positivo
no diagnóstico inicial (para determinar se esse teor está ou não
acima do limiar máximo de 1%, fixado para os casos de
contaminações adventícias com OGM de produtos que
alegadamente não foram produzidos com recurso a OGM).
1.4.1 Statu Quo da Normalização e Validação dos Métodos
Na UE, um número crescente de laboratórios de controlo de

alimentos e de controlo de sementes estão a adoptar a tecnologia
de PCR como técnica de rotina. Contudo, a normalização e validação
internacional de métodos para detecção de OGM por protocolos
harmonizados estão ainda nas suas fases iniciais.
Organismos de normalização como o CEN (Comité Européen
de Normalisation, Bruxelas, Bélgica) e a AFNOR (Association
Française de Normalisation, Paris, França) já iniciaram actividades
nesta área, existindo alguns documentos preliminares no que diz
respeito a amostragem e detecção de OGM. Também já foram
realizados ensaios interlaboratoriais para validação de métodos de
detecção de DNA para o rastreio de diferentes OGM em géneros
alimentícios, organizados por entidades como o Joint Research
Centre (JRC) da UE (Ispra, Itália) [66, 67], o DMIF-GEN (Development
of Methods to Identify Foods produced by means of Genetic
Engineering) project [68], e o BgVV (Bundesinstitut für
gesundheitlichen Verbrauncherschutz und Veterinärmedizin, Berlim,
Alemanha) [69]. De igual forma, métodos de análise quantitativa já
foram testados, embora mais estudos de validação sejam
23
Animal
necessários, tendo em conta os resultados obtidos. De facto, urge

definir alguns parâmetros de validação, como a especificidade e a
sensibilidade, que dariam informação sobre a precisão dos métodos
utilizados e que permitiriam a sua consequente certificação.
Incluído nos esforços desenvolvidos a nível comunitário para a
validação de métodos para a monitorização de OGM, o Joint
Research Center promoveu ainda um ensaio interlaboratorial para a
validação de um ensaio imuno-enzimático com vista à detecção de
soja GM [70], em que o LNIV foi participante.
1.4.2 PCR vs. ELISA
As metodologias que permitem distinguir espécies

geneticamente modificadas das que não o foram assentam na
pesquisa de fragmentos de DNA estranho ao organismo testado –
sequências que regulam a expressão do(s) transgene(s) (como
promotores e terminadores), fragmentos do próprio transgene e de
genes que servem como marcadores11, durante o processo de
construção genética [74, 75]– ou da produção de proteínas que não
são típicas da espécie.
Para a procura de DNA exógeno pode recorrer-se à
amplificação, por PCR [76, 77], de fragmentos de elementos
genéticos reguladores, presentes na quase totalidade dos OGM
actualmente aprovados na UE (vide tabela 19 da referência 6), para
11
Geralmente genes de resistência a antibióticos. A utilização de tais marcadores
tem levantado preocupação sobre a possibilidade de a resistência a antibióticos
ser transferida para estirpes sensíveis, aquando da libertação dos OGM no
ambiente (a presença do gene blaTEM-1 – que codifica para uma β-lactamase – no
genoma cromossómico do milho da Novartis desencadeou debates na UE sobre os
riscos para a saúde humana da possível transferência desse gene para a
microflora intestinal, como consequência do seu uso na alimentação animal ou
humana), apesar de tal possibilidade ser ínfima (a frequência de transferência de
genes marcadores de resistência a antibióticos é de 10-13 a 10-18). A avaliação dos
riscos do uso dos genes de resistência a antibióticos é feita durante o processo de
aprovação da libertação de OGM no ambiente, de acordo com o procedimento
estipulado no Anexo II da Directiva 90/220/CEE [41]. A presença de genes de
resistência a antibióticos em plantas transgénicas tem reforçado, desde finais de
1996, a fraca aceitação dos OGM pela opinião pública e levou a que, em 1999, a
utilização de tais genes como marcadores em plantas para consumo humano ou
animal fosse banida na Europa [71]. A preocupação com o uso de genes de
resistência a antibióticos veio fomentar a investigação sobre eliminação de
marcadores moleculares em espécies GM [72, 73].
24
Introdução
um rastreio inicial da presença de OGM, seguida da detecção

específica de genes inseridos, característicos de determinados OGM,
por amplificação de fragmentos desses mesmos genes12.
A presença de proteínas codificadas por genes acrescentados
artificialmente ao genoma de um dado organismo pode ser revelada
através de ensaios imuno-enzimáticos (ELISA13), envolvendo
anticorpos específicos contra essas proteínas [76].
Existem kits comerciais fundamentados em cada uma das
técnicas mencionadas, que permitem averiguar de forma fácil e
rápida se a amostra contém OGM específicos – como o GMO √ Soya
Kit da SDI, um teste por ELISA específico para a proteína CP4
enolpiruvilxiquimato-3-fosfatosintase (EPSPS) da Monsanto em soja
Roundup Ready®, validado no ensaio interlaboratorial
anteriormente referido [70] – ou se incorpora ou consite numa ou
mais espécies que sofreram modificação genética – caso do Allin
1.0, sistema de PCR usado para pesquisar a presença de milho e
soja e, simultaneamente, do promotor de CaMV.
A pesquisa de DNA exógeno tem vantagem sobre a de
proteínas estranhas:
– por ter um limite de detecção mais baixo (0,01% –
100 mg de soja GM por kg dá resultado positivo),
– por ser mais específica – os ensaios imunológicos
podem produzir reacção com diferentes proteínas
de espécies aparentadas, ao passo que é possível
seleccionar sequências de DNA específicas de
dada espécie [78],
– por o DNA ser menos sensível ao tratamento
térmico a que alguns alimentos são sujeitos
durante o seu processamento do que as proteínas,
que facilmente se desnaturam a alta temperatura,
12
Esta segunda fase é desnecessária se apenas fôr pretendido determinar se
dado alimento contém ou não OGM, não sendo requerida uma identificação dos
OGM eventualmente presentes na amostra.
13
Enzime-linked immunosorbent assay.
25
Animal
– porque permite obter resultados positivos mesmo

quando há produção da proteína estranha
especificamente em tecidos menos ou de todo
utilizados na produção de alimentos e
– porque permite a detecção de genes não
traduzidos em proteínas14.
1.4.3 Fundamento do Método Adoptado
Pelos motivos apontados, a detecção de organismos

geneticamente modificados, no âmbito do estágio realizado, foi feita
por PCR, utilizando como sequências reguladoras universais a
amplificar o promotor CaMV 35S15 e o terminador NOS (a pesquisa
destas duas sequências em conjunto permitia detectar 26 ou 27 das
28 cultivares GM que se encontravam aprovadas em 1997, segundo
dados desse ano [6]), seguindo o método oficial europeu
desenvolvido pelo JRC para a pesquisa de OGM em alimentos [1]:
O DNA é extraído da amostra, sendo o rendimento da
extracção e a integridade do DNA controlados por
electroforese em gel de agarose. As sequências de DNA alvo
específicas dos elementos genéticos pesquisados são
amplificadas por PCR através do uso dos oligonucleotídeos
14
Como no caso do tomate Flavr Savr™ da Calgene, em que se recorre à
antisense RNA technology: ao ser transcrito, o gene introduzido hibrida com o
mRNA que codifica para uma enzima envolvida no processo de senescência (a PG,
poligalacturanase, que degrada a pectina, um dos principais componentes da
parede celular do fruto), impedindo-o de ser traduzido, o que reduz para 10% do
normal a produção da enzima, aumentando o tempo de conservação do tomate e
proporcionando aos consumidores o sabor de um tomate colhido maduro [79] (a
maioria dos tomates convencionais são colhidos verdes para facilitar o seu
transporte e são amadurecidos artificialmente, recorrendo a etileno para lhes
conferir a cor vermelha [6]). Neste caso, o objectivo é a produção de um RNA
complementar à cadeia sense (daí o nome "tecnologia antisense"), não havendo
produção de proteína transgénica [80, 81]. O OGM discutido foi o primeiro
alimento GM a ser posto no mercado e a segunda aprovação da FDA (U.S. Food
and Drug Administration) para um produto biotecnológico usado na alimentação
(a primeira foi para a quimosina – um agente de coagulação do leite –, para a
produção de queijo) [82]. Um método para a sua detecção por PCR é descrito na
referência 83.
15
O efeito da duplicação deste elemento genético na activação de genes de
plantas e as sequências necessárias para a sua activação são discutidos nas
referências 84 e 85, respectivamente.
26
Introdução
iniciadores e condições de reacção adequados (vide pontos

2.8 e 2.9). Os produtos de PCR são então separados por
electroforese em gel de agarose, controlando-se a presença
dos fragmentos de amplificação esperados pela comparação
da mobilidade electroforética das bandas obtidas com a das
bandas de um padrão de peso molecular.
27
28
29
30
Procedimento Experimental
2 P r o c e d i m e n t o E x p e r i m e n t a l
2.1 Advertências
No sentido de minorar os riscos de contaminação cruzada entre

amostras, todo o material e reagentes usados são estéreis e o
trabalho é executado sob condições de esterilidade; sempre que
ácidos nucleícos estejam envolvidos, são usadas pipetas resistentes
a aerossóis (com filtro); a extracção de DNA dos padrões de soja e
milho GM que servirão de controlos negativos é efectuada num dia
anterior ao da extracção do DNA controlo positivo; a extracção de
DNA, a amplificação por PCR e a análise dos resultados por
electroforese são levadas a cabo em salas diferentes; cada uma
dessas salas tem o seu próprio material e reagentes, que não são
trocados entre salas; é usada uma outra bata para a preparação das
mastermixes, na sala de PCR.
Outras precauções a tomar relacionadas, nomeadamente, com o
manuseamento de alguns reagentes ou com a execução de
determinados métodos podem ser consultadas no protocolo original
[1].
31
Animal
2.2 Reagentes e Equipamento
Apesar de se terem introduzido algumas modificações ao

protocolo apresentado na referência 1, os reagentes empregues nas
diversas etapas deste trabalho são os referidos nessa fonte
bibliográfica (vide páginas 5 a 9 da referência 1).
Uma lista do equipamento necessário às diversas etapas do
trabalho pode igualmente ser encontrada na referência 1. As marcas
e modelos de alguns dos aparelhos usados são referidos no
presente texto, quando pertinente.
32
2.3 Amostras e Padrões16
Os resultados apresentados e discutidos adiante referem-se

ao seguinte conjunto de amostras e padrões:
-Uma amostra de ração para frangos, que deu
entrada no Departamento de Higiene Pública do
LNIV com o número 7566 (este número será usado
doravante para referir esta amostra);
-Uma amostra de ração para novilhos de engorda,
que deu entrada no Departamento de Higiene
Pública do LNIV com o número 8144 (este número
será usado doravante para referir esta amostra);
-Uma amostra de milho em grão supostamente
não GM (esta amostra serviu de controlo negativo
para a presença de milho GM no lote de amostras
considerado, substituindo o padrão de milho Bt-
176 a 0%, habitualmente usado para o efeito);
-Um padrão de milho Bt-176 a 2% (usado como
controlo positivo para a presença de milho GM nas
amostras);
-Um padrão de soja Roundup Ready® a 0% (usado
como controlo negativo para a presença de soja
GM nas amostras);
-Um padrão de soja Roundup Ready® a 2% (usado
como controlo positivo para a presença de soja
GM nas amostras).
16
Os padrões de milho Bt-176 e de soja Roundup Ready®, material de referência
certificado, são comercializados pela Fluka. Os padrões de soja Roundup Ready®
a 0 e 2% usados nas sessões laboratoriais a que este relatório se refere eram
material remanescente do ensaio interlaboratorial para validação de um ensaio
imunológico para a detecção e quantificação de soja GM em alimentos em que o
LNIV participou [70], produzido pelo IRMM (Institute for Reference Materials and
Measurments, Geel, Bélgica).
33
Animal
2.4 Preparação das Amostras
2.4.1 Moagem/Homogeneização em Stomacher
As amostras de alimentos compostos para animais (sob a

forma de granulado) foram trituradas e homogeneizadas num
stomacher17 (Stomacher 400 da Seward): foram adicionados 60 ml
de água estéril a 30 g de amostra num saco de plástico estéril
próprio para stomacher que foi levado ao aparelho até se obter uma
suspenção homogénea (cerca de 1,5 min., à velocidade normal). A
amostra de milho foi moída num almofariz estéril18 e com azoto
líquido. Os padrões de soja e milho geneticamente modificados
usados como controlos positivos e negativos vêm sob a forma de
um pó homogéneo, não necessitando, portanto, de qualquer
tratamento preliminar.
2.4.2 Pesagem
As massas referidas de seguida são as requeridas para o

método CTAB modificado utilizado.
Foram pesados 1 g de cada amostra homogeneizada para
tubos cónicos de 50 ml com saia estéreis. No caso dos padrões de
soja e milho GM, um décimo dessa quantidade é suficiente para se
obter DNA amplificável (i.e., com concentração superior a 10 µg/µl –
vide ponto 2.6.3), pelo que foram pesados 100 mg de cada padrão
para tubos de microcentrífuga de 2 ml (tipo Eppendorf) estéreis.
17
A escolha do dispositivo de redução do tamanho de partículas depende da
natureza da amostra: no protocolo do Wizard® Magnetic DNA Purification System
for Food da Promega [86] recomenda-se o uso de um moinho para café caseiro ou
outros moinhos, como o Mixer Mill MM 200 (Retsch / Brinkmann), para um maior
número de amostras. Alerta-se ainda para ter o cuidado de lavar cuidadosamente
o moinho com detergente e álcool entre cada amostra para evitar contaminação
cruzada.
18
A sua esterilização é feita por calor seco a 170ºC durante 2 h.
34
2.5 Extracção/Purificação de DNA
2.5.1 Método CTAB19
Adicionaram-se 500 µl de tampão de extracção CTAB aos

padrões de soja e milho GM e 5000 µl do mesmo tampão às
amostras de rações e milho. Quer as amostras, quer os padrões de
soja e milho foram incubados durante 30 minutos a 65ºC, com
agitação.
Foram pipetadas duas alíquotas de 500 µl de cada amostra de
rações e de milho (com a ponta da micropipeta cortada para que
não entupisse com partículas em suspensão) para tubos de
Eppendorf de 2 ml. Os tubos de microcentrífuga contendo os
padrões bem como os contendo as amostras e respectivos
duplicados foram centrifugados durante 10 minutos a 16000×g,
sendo o sobrenadante transferido para um novo tubo de reacção.
Foram adicionados 200 µl de clorofórmio e agitou-se durante
30 segundos.
Centrifugou-se a mistura durante 10 minutos a 12000×g, até
completa separação de fases e transferiu-se o sobrenadante (fase
aquosa) para um novo tubo de reacção.
Foram adicionados 2 volumes de solução CTAB de precipitação
e agitou-se bem.
As amostras e padrões foram então incubados durante 60
minutos, à temperatura ambiente.
Centrifugou-se durante 10 minutos a 14500×g e rejeitou-se o
sobrenadante.
O precipitado foi dissolvido em 350 µl de NaCl.
Adicionaram-se 350 µl de clorofórmio e misturou-se durante
30 s.
19
O método CTAB descrito é uma alteração ao protocolo apresentado na
referência 1. Difere na medida em que os tempos de incubação e as
centrifugações são mais prolongados.
35
Animal
Centrifugou-se a mistura durante 10 min. a 12000×g, até

completa separação de fases e transferiu-se o sobrenadante (fase
aquosa) para um novo tubo de reacção.
Adicionou-se 0,8 do volume transferido em isopropanol,
misturou-se e incubou-se durante 30 min. a 4ºC.
Centrifugou-se durante 30 min. a 15000×g e rejeitou-se o
sobrenadante.
Adicionaram-se 500 µl de etanol a 70% (V/V) e misturou-se.
Centrifugou-se durante 15 min. a 15000×g.
Decantou-se o sobrenadante, descartando-o cuidadosamente.
Secou-se o DNA e ressuspendeu-se em 50 µl de água estéril.
Para cada amostra de milho e de alimentos compostos para
animais, juntou-se, num mesmo tubo de 500 µl, o DNA extraído em
cada um dos respectivos duplicados.
O DNA extraído foi conservado a 4ºC (entre 2 e 8ºC) até ser
usado (no dia seguinte20).
O processo de extracção/purificação de DNA descrito foi
igualmente aplicado a um tubo vazio, que serviu como controlo da
extracção (para despistar possíveis contaminações durante o
processo).
20
Guardar a -20ºC, no caso de armazenamentos mais prolongados.
36
2.6 Avaliação da Integridade e Concentração do DNA
2.6.1 Electroforese do DNA Extraído
O objectivo desta operação é a avaliação da pureza e

dimensão dos fragmentos do DNA extraído – estimando o peso
molecular das bandas obtidas por comparação da sua mobilidade
electroforética com a das diferentes bandas de um padrão de peso
molecular – e a estimativa da concentração de cada amostra, por
comparação da fluorescência das suas bandas (vide ponto seguinte)
com a de padrões de DNA de concentrações conhecidas.
Foram adicionadas alíquotas de 10 µl de cada amostra, de
cada padrão e do controlo de extracção, previamente agitados e
centrifugados por cerca de 10 s, a 4 µl de tampão de arrastamento
(xileno cianol e ficol 400 – vide referência 1) em tubos de 50 µl,
homogeneizando-se e centrifugando-se durante cerca de 10 s antes
de depositar cada solução no gel.
A migração electroforética foi efectuada num mini gel de
agarose21 a 1,5% em tampão TBE 1× sob um campo eléctrico
aplicado de 5 V/cm ( que corresponde a uma corrida a uma
diferença de potencial de 70 V durante uma hora, no caso da tina de
reduzidas dimensões utilizada). O padrão de peso molecular usado
foi o 100 bp DNA Ladder (da Promega) 22. Como padrões de
concentração do DNA, recorreu-se a diluições de 10, 25, 50, 100 e
200 µg/µl de λ DNA (Non-Methylated) da Amersham Pharmacia.
21
Preparação do gel: pesar a quantidade apropriada de agarose, juntar o volume
de tampão necessário e levar ao forno de microondas até fundir completamente;
agitar sempre até atingir a temperatura de 50ºC, deitar a solução no tabuleiro,
colocar os pentes e esperar 30 min. para que o gel polimerize, retirando então os
pentes com cuidado (para não partir os poços).
22
Composição da solução de padrão de peso molecular depositada: 16 µl de água
estéril desionizada, 4 µl de tampão de arrastamento e 4 µl de 100 bp DNA ladder.
A solução resultante é conservada a 4ºC.
37
Animal
2.6.2 Captura de Imagem dos Géis Obtidos
A visualização das bandas foi feita através da fluorescência,

sob radiação ultravioleta (312 nm), do brometo de etídeo
incorporado:
• Coloração do Gel com Solução de Brometo de

Etídeo
Após a corrida, o gel foi imerso numa

solução a 10 µg/ml de brometo de etídeo (EtBr)
durante cerca de 15 minutos.
• Aquisição e Registo da Imagem Fotográfica do

Gel
O gel corado com EtBr foi fotografado num

sistema de Imagem Eagle Eye II da Stratagene,
sob radiação ultravioleta para induzir a
fluorescência do EtBr intercalado nas bases do
DNA. A imagem devidamente tratada para
evidenciar as bandas foi impressa e arquivada em
suporte informático (disquete de 3½'').
2.6.3 Diluições
Para ser amplificado, a concentração do DNA deve situar-se

entre 10 µg/µl e 50 µg/µl. Nos casos em que a concentração estava
acima daquele valor máximo, efectuaram-se diluições com água
desionizada estéril (para um volume final de 40 µl) para que a
concentração de DNA das amostras ficásse dentro do intervalo
indicado.
38
2.7 Controlo da Amplificabilidade do DNA e da Inibição pela

Matriz
Antes de se proceder à reacção de PCR que conduz à detecção

dos elementos genéticos a pesquisar, é necessário avaliar se o DNA
extraído é amplificável e se a matriz da amostra contém produtos
inibidores da reacção de amplificação. O teste da amplificabilidade é
feito recorrendo a uma PCR de fragmentos de DNA universais de
plantas (que, portanto, se sabe estarem presentes nas amostras
analisadas) como DNA de cloroplasto ou de fragmentos de genes de
proteínas específicas como a lecitina (para amostras contendo soja)
ou a invertase [87] (para amostras contendo ou consistindo em
milho). Para investigar a presença de inibidores da PCR na matriz
das amostras, efectuam-se, em paralelo, duplicados de cada
amostra e padrão a que se adicionou DNA controlo, amplificável
com o programa de amplificação e concentrações usadas.
2.7.1 PCR23 de DNA de Cloroplasto
Nas amostras cujos resultados são apresentados e discutidos,

o controlo da amplificabilidade e da inibição da matriz é feito por
amplificação de um fragmento não codificante universal de DNA de
cloroplasto (cpDNA) [88]. As sequências do par de oligonucleotídeos
iniciadores usado são:
 c – 5'-GCA AAT CGG TAG ACG CTA CG-3'
 d – 5'-GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC-3'.
Aqueles primers geram fragmentos de amplificação entre 500
a 600 bp, dependendo da espécie vegetal cujo DNA foi submetido a
amplificação: obtem-se um fragmento de amplificação de cerca 600
bp em amostras contendo soja; a presença de milho é revelada pelo
aparecimento de um fragmento de amplificação com menos de 200
bp e de outro com pouco mais de 500 bp.
23
As diversas PCR constantes no procedimento experimental foram realizadas
num termociclador Trio da Biometra, pelo que os programas de amplificação
mencionados são referentes a este aparelho.
39
Animal
Quando não há amplificação com aquele par de

oligonucleotídeos iniciadores, tentam-se as PCR de lecitina e
invertase, que geram produtos de amplificação mais curtos24, o que
pode permitir a obtenção de resultados positivos quando a
degradação do DNA da amostra impossibilita obter amplicons com a
dimensão dos que resultam da PCR de cpDNA.
O programa de amplificação usado com os oligonucleotídeos
iniciadores c e d consiste num passo de desnaturação inicial com a
duração de 3 min. e 3 s a 98ºC, seguido de 35 ciclos de amplificação
– em que cada um compreende um passo de desnaturação de 1
min. a 94ºC, a desnaturação dos primers, operação com a duração
de 1 min. à temperatura de 54ºC e a fase de elongação, levada a
cabo a 72ºC25, durante 2 min – a que se segue uma elongação final
de 3 min. a 72ºC, terminando com um arrefecimento opcional a 4ºC
(duração de 0 min. na programação do aparelho), para o caso de as
amostras terem de pemanecer no aparelho durante algum tempo
(ou mesmo de um dia para o outro).
O DNA controlo usado para testar a presença de inibidores da
PCR na matriz das amostras foi extraído de milho Bt-176 a 5%.
A composição, por cada tubo de reacção, da mastermix para
amplificação de cpDNA com o par de oligonucleotídeos iniciadores e
o programa de amplificação descritos é a seguinte: 26 µl de H2O;
5,25 µl de tampão de PCR 10×; 5,25 µl de MgCl2 a 25 mM; 5,25 µl de
BSA a 20 µg/ml; 2,6 µl de uma solução equimolar dos 4 dNTPs a 4
mM; 1,3 µl de soluções de cada um dos oligonucleotídeos iniciadores
ambas a 10 pmol/µl; 0,25 µl de Taq DNA Polymerase. A quantidade
24
Oligonucleotídeos iniciadores para lecitina, que geram um fragmento de
amplificação de 118 bp: IVR-1-F – 5'-CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC C-3',
IVR-1-R – 5'-GGA GCC CGT GTA GAG CAT GAC GAT C-3'. Oligonucleotídeos
iniciadores para invertase, que geram um fragmento de amplificação de 226 bp:
IVR-1-F – 5'-CCG CTG TAT CAC AAG GGC TGG TAC C-3', IVR-1-R – 5'-GGA GCC CGT
GTA GAG CAT GAC GAT C-3'.
25
Que é a temperatura óptima da polimerase do DNA termoresistente da bactéria
hipertermófila Thermus aquaticus – a Taq Polymerase [76], usada na maioria das
PCR efectuadas em todo o mundo [89].
40
de DNA adicionada por tubo foi de 7 µl26. Aos duplicados de cada

amostra e padrão foram ainda acrescentados 2 µl do DNA controlo.
Preparou-se igualmente um controlo da mastermix, substituindo o
DNA molde por água estéril desionizada, o qual foi submetido à
reacção de amplificação juntamente com os outros tubos. Em todos
os casos, adicionou-se o DNA (e o DNA controlo, nos duplicados para
controlo da inibição pela matriz) ou a água (no caso do controlo da
mastermix) a uma alíquota de 45 µl de mastermix num tubo de 0,2
ml, agitando-se a mistura e centrifugando-se brevemente antes de
colocar o tubo no termociclador que, sendo um modelo com tampa
aquecida, permitiu prescindir da adição de óleo mineral à mistura
reaccional.
O controlo da extracção, obtido como indicado no ponto 2.5.1,
e o seu duplicado a que se adicionou o DNA de milho Bt-176 a 5%
sofreram o mesmo processo de amplificação que as amostras, os
padrões, os respectivos duplicados e o controlo da mastermix.
2.7.2 Electroforese dos Produtos de Amplificação27
A electroforese dos fragmentos amplificados pela PCR de

cloroplasto foi efectuada num gel de agarose a 2% em tampão TBE
1× (preparado como descrito na nota de rodapé do ponto 2.6.1),
adicionando-se 16 µl de tampão de arrastamento à totalidade de
cada um dos produtos de amplificação obtidos no passo anterior (18
µl, no caso dos tubos que continham DNA controlo). No sentido de
melhorar a visualização das bandas no gel (vide nota de rodapé do
ponto anterior), foi aplicado um volume maior que os habituais 14 µl
26
A quantidade normalmente utilizada é de 5 µl mas, com esse volume, obteve-se
uma má visualização das bandas no gel subsequente (dados não apresentados)
pelo que a reacção foi repetida, com esta alteração.
27
Alternativamente à separação dos fragmentos de amplificação por electroforese
e da sua visualização através da fluorescência do EtBr incorporado, alguns
autores propoem a separação e quantificação de misturas de DNA por
cromatografia líquida [90-92]. Esse método permite a separação bem com a
quantificação dos fragmentos de DNA de forma mais rápida que os métodos
electroforéticos (o que é vantajoso sobretudo na fase de optimização das
condições de amplificação por PCR) e possibilita uma fácil recuperação e posterior
purificação dos produtos de interesse.
41
Animal
de cada solução resultante (cerca de 25 a 30 µl), utilizando-se para

isso um gel com pentes mais largos. O gel (de 200 ml coberto com
cerca de 2 l de tampão TBE 1×) foi deixado a correr durante 2 h, sob
uma diferença de potencial de 125 V (campo eléctrico aplicado de 5
V/cm). Como padrão de peso molecular foi, de novo, empregue a
solução de 100 bp DNA Ladder, cuja composição é indicada na nota
de rodapé do ponto 2.6.1.
Esta parte do protocolo experimental foi realizada segundo o

procedimento descrito no ponto 2.6.2.
42
2.8 Pesquisa do Promotor CaMV 35S
2.8.1 PCR do Promotor CaMV 35S
A presença do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor

– CaMV (cauliflower mosaic virus) – é revelada pela amplificação de
um fragmento de 195 bp da sua sequência, usando o par de
oligonucleotídeos iniciadores 35S-1, 35S-2 [1].
O programa de amplificação para este elemento genético é
apresentado na referência 1.
A composição da mastermix, por cada tubo de reacção, é a
que se segue: 26 µl de H2O; 5,25 µl de tampão de PCR 10×; 5,25 µl
de MgCl2 a 25 mM; 5,25 µl de BSA a 20 µg/ml; 2,6 µl de uma solução
equimolar dos 4 dNTPs a 4 mM; 1,3 µl de cada solução de
oligonucleotídeo iniciador, ambas a 20 µM; 0,25 µl de Taq DNA
Polymerase (AmpliTaq Gold® DNA Polymerase da Applied
Biosystems). A quantidade de DNA – ou água, para preparar o
controlo da extracção – a adicionar é de 5 µl28. A mistura reaccional
foi preparada como descrito para a reacção de amplificação anterior
(vide em 3.6.1).
2.8.2 Electroforese dos Produtos de Amplificação
A separação dos fragmentos de amplificação obtidos na PCR

da sequência alvo foi efectuada como descrito para a electroforese
dos produtos de amplificação da PCR de cpDNA (vide ponto 2.7.2).

28
À semelhança do que aconteceu na PCR anterior, também a aqui a quantidade
inicial de DNA molde teve de ser aumentada para 7 µl, pelo mesmo motivo.
43
Animal
2.9 Pesquisa do Terminador NOS
2.9.1 PCR do Terminador NOS
A existência do terminador NOS (da sintase de nopalina) no

DNA da amostra é detectada pela amplificação de um fragmento de
180 bp desse elemento genético, utilizando o par de
oligonucleotídeos iniciadores NOS-1, NOS-3 [1].
A pesquisa deste elemento genético regulador partilha o
mesmo programa de amplificação que o promotor CaMV 35S (vide
referência 1).
A mastermix para a pesquisa da sequência de interesse difere
apenas no par de oligonucleotídeos iniciadores adicionado (vide
preparação da mastermix para a PCR anterior). A mistura reaccional
foi preparada como descrito para a reacção de amplificação de um
fragmento do promotor 35S (vide ponto 2.8.1).
2.9.2 Electroforese dos Produtos de Amplificação
A separação dos produtos de amplificação obtidos na PCR da

sequência pesquisada foi levada a cabo como descrito para a
electroforese dos produtos de amplificação da PCR de cpDNA (vide
ponto 2.7.2).

44
45
46
Resultados
3 R e s u l t a d o s
A interpretação e arquivo dos dados obtidos ao longo do

processo que se acabou de descrever é feito através das imagens
fotográficas dos géis de agarose que resultaram das diversas
electroforeses realizadas ao longo do procedimento experimental.
Assim, apresentar-se-ão nas figuras que se seguem os diversos géis
referentes ao conjunto de amostras considerado.
3.1 Avaliação da Integridade e Concentração do DNA
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5
8 6
Figura 1 – Imagem Figura 2 – Imagem

fotográfica do gel da fotográfica do gel da
electroforese do DNA extraído. electroforese das
Poço 1, padrão de peso diferentes diluições do
molecular (100 bp DNA padrão de
Ladder); poço 2, controlo da concentração (λ DNA).
extracção; poço 3, soja
Poço 1, padrão de
Roundup Ready® a 0%; poço
peso molecular (100
4, soja Roundup Ready® a
bp DNA Ladder); poço
2%; poço 5, milho comercial;
2, padrão de
poço 6, ração nº 8144; poço 7,
concentração a 10 µg/
ração nº 7566; poço 8, padrão
de peso molecular (100 bp µl; poço 3, padrão de
DNA Ladder). concentração a 25 µg/
µl; poço 4, padrão de
concentração a 50 µg/
µl; poço 5, padrão de
concentração a 100 µ
g/µl; poço 6, padrão de
Como se pode observar por comparação concentração a 200 µ
com os padrões de concentração da Figura 2, todas as amostras e
padrões, à excepção do padrão de soja Roundup Ready® a 0% e da
amostra de milho comercial não transgénico, tinham concentrações
em DNA abaixo de 10 µg/µl – o limite mínimo aconselhado para
47
Animal
garantir amplificabilidade (vide ponto 2.6.3) – apesar disso, essas

amostras de DNA foram submetidas ao teste de amplificabilidade
por PCR de cloroplasto, já que se supunha que seriam, ainda assim,
amplificáveis. Pelo contrário, o DNA extraído do padrão de soja
Roundup Ready® a 0% e da amostra de milho em grão (poços 3 e 5
da Figura 1, respectivamente) teve de ser diluído, como indicado em
2.6.3, de 1:5, no primeiro caso e de 1:2 na amostra de milho, antes
de lhes ser aplicado o teste de amplificabilidade. Verifica-se ainda
que o controlo da extracção se apresentava isento de DNA, como
era suposto.
Acrescentou-se, nos passos seguintes do procedimento
experimental, uma amostra de DNA de milho Bt-176 a 2% para
comparação com a amostra comercial de milho, que estava a ser
usada como controlo negativo para a presença de milho GM.
48
Resultados
3.2 Controlo da Amplificabilidade do DNA e da Inibição pela

Matriz29
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
16
Figura 3 – Imagem fotográfica do gel de agarose da

electroforese dos produtos de PCR de DNA de cloroplasto obtidos Na
no ponto 2.7.1. do procedimento experimental. Poço 1, padrão de
peso molecular (100 bp DNA Ladder); poço 2, ração nº 7566;
poço 3, ração nº 7566 + controlo; poço 4, ração nº 8144; poço 5,
ração nº 8144 + controlo; poço 6, milho comercial; poço 7, milho
comercial + controlo; poço 8, milho Bt-176 a 2%; poço 9, milho
Bt-176 a 2% + controlo; poço 10, soja Roundup Ready® a 0%;
poço 11, soja Roundup Ready® a 0% + controlo; poço 12, soja
Roundup Ready® a 2%; poço 13, soja Roundup Ready® a 2% +
controlo; poço 14, controlo da mastermix; poço 15, controlo da
mastermix + controlo; poço 16, padrão de peso molecular (100
bp DNA Ladder).
figura acima, verificou-se que mesmo as amostras com uma
concentração de DNA tão baixa que eram praticamente não
detectáveis na Figura 1 eram de facto amplificáveis. Observa-se
igualmente que houve uma certa inibição da PCR nos duplicados a
que se adicionou DNA controlo, por excesso de DNA.
Os resultados obtidos nesta parte do procedimento
experimental permitiram assegurar o prosseguimento da pesquisa
pretendida para todas as amostras do lote considerado.
29
O gel apresentado é uma repetição do gel original em que se depositou um
volume superior de amostra (vide nota de rodapé do ponto 3.6.1) e se omitiu o
controlo da extracção, que se tinha revelado limpo de DNA no primeiro gel
efectuado (dados não apresentados).
49
Animal
3.3 Pesquisa do Promotor CaMV 35S
1 2 3 4 5 6 7 8
9

electroforese dos produtos de PCR do promotor 35S
obtidos no ponto 2.8.1. do procedimento experimental.
Poço 1, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder);
poço 2, ração nº 7566; poço 3, ração nº 8144; poço 4,
milho comercial; poço 5, milho Bt-176 a 2%; poço 6, soja
Roundup Ready® a 0%; poço 7, soja Roundup Ready® a
2%; poço 8, controlo da mastermix; poço 9, padrão de
peso molecular (100 bp DNA Ladder).
50
Resultados
3.4 Pesquisa do Terminador NOS
1 2 3 4 5 6 7 8
9

electroforese dos produtos de PCR do promotor 35S
obtidos no ponto 2.9.1. do procedimento experimental.
Poço 1, padrão de peso molecular (100 bp DNA Ladder);
poço 2, ração nº 7566; poço 3, ração nº 8144; poço 4,
milho comercial; poço 5, milho Bt-176 a 2%; poço 6, soja
Roundup Ready® a 0%; poço 7, soja Roundup Ready® a
2%; poço 8, controlo da mastermix; poço 9, padrão de
peso molecular (100 bp DNA Ladder).
51
52
53
54
Discussão
4 D i s c u s s ã o
Os resultados apresentados na secção anterior permitem

descobrir se o promotor CaMV 35S e/ou o terminador NOS estão
presentes em cada uma das amostras analisadas e, dado que esses
elementos genéticos são largamente utilizados em biotecnologia
agrícola, inferir sobre a presença de OGM nas amostras em que se
detectaram fragmentos de amplificação nas PCR dos pontos 2.8.1
e/ou 2.9.1. No entanto, a análise dos resultados tem de ser
cautelosa já que a presença quer de um, quer do outro fragmento
pesquisado numa dada amostra não significa necessariamente que
esta contenha OGM [1]:
-podem obter-se falsos positivos baseados na
presença do promotor CaMV 35S uma vez que o
vírus do mosaico da couve-flor de onde é derivado
infecta crucíferas (sendo mínimo o risco de
infecção de outras famílias com CaMV) [93], razão
pela qual a análise de resultados positivos
referentes a amostras contendo plantas da família
Cruciferae deve ser feita com cuidado;
-o terminador NOS, sendo de origem bacteriana,
pode ser incorporado em alimentos através do
solo, pelo que têm de ser tomadas precauções na
análise de raízes.
A detecção do terminador NOS é menos sensível que a do
promotor 35S, o que tem como consequência um número
ligeiramente superior de falsos negativos [2]. Por outro lado, o facto
de esse elemento genético não estar presente no milho Bt-176 [6]
(uma das quatro variedades de milho actualmente autorizadas na
UE [94]) pode permitir, nalguns casos, a sua identificação preliminar
numa amostra30, antes de se realizarem testes específicos por
30
Se uma amostra composta exclusivamente por milho (a PCR de cpDNA tem um
papel preponderante na confirmação da composição das amostras, como se pode
constatar na discussão dos respectivos resultados) der resultado positivo para o
promotor 35S mas não contiver indicação da existência do terminador NOS, pode
55
Animal
exemplo para a presença da versão sintética truncada do gene cry

IA(b), que codifica para a δ-edotoxina de Bacillus thuringiensis
subsp. kurstaki [95] presente naquela cultura vegetal GM.
Um resultado positivo nas pesquisas em análise limita-se a
dar algum fundamento a uma suspeita da presença de OGM, que
poderá, como se referiu na introdução, ser confirmada através de
testes para a presença de genes específicos de determinados OGM.
O gel do DNA extraído (Figura 1) mostra, que embora a
dimensão da maioria dos fragmentos se encontre abaixo dos 300
bp, existe uma quantidade significativa do DNA das amostras que
tem uma dimensão na ordem desse valor e mesmo acima, o que,
em princípio, permite assegurar a amplificação dos fragmentos dos
dois elementos genéticos reguladores pesquisados (cuja dimensão
se situa abaixo de 200 bp), dependendo da concentração do DNA
nas amostras. Relativamente a esse aspecto, a concentração da
maioria das amostras era de facto inferior ao limite mínimo
recomendado – 10 µg/µl (vide ponto 2.6.3) – mas este facto não
invalidou o teste da amplificabilidade subsequente, como se pode
comprovar na Figura 3.
Da análise das bandas obtidas no gel da Figura 3 (a
interpretação das bandas resultantes da PCR de cpDNA foi discutida
no ponto 2.7.1) depreende-se que a ração para frangos com o nº
7566 contém milho, o mesmo acontecendo com a outra ração
analisada (ração para novilhos de engorda com o nº 8144), que
também contém soja, bem como outra(s) planta(s) forrageira(s)
(talvez trigo).
Os resultados obtidos em 2.8.2 (vide Figura 4) permitem
concluir que ambas as amostras de rações analisadas continham o
fragmento de 195 bp do promotor 35S do vírus do mosaico da
couve-flor, enquanto que a amostra de milho em grão revelou estar
isenta desse elemento genético, como era esperado (recorde-se que
apostar-se fortemente na identificação da amostra em causa como sendo de

milho Bt-176.
56
Discussão
se sabia à partida que o milho analisado não era GM – vide ponto

2.3). Os padrões tiveram o comportamento que era suposto: tanto o
padrão de milho Bt-176 a 2% como o de soja Roundup Ready® a 2%
apresentaram uma banda perto dos 200 bp, ao passo que quer a
amostra de milho, quer o padrão de soja Roundup Ready® a 0%
deram resultado negativo nesta pesquisa.
Na pesquisa do terminador NOS, cujos resultados são
apresentados na Figura 5, ambas as rações deram resultado positivo
e a amostra de milho comercial não acusou a banda de 180 bp, o
que está de acordo com a informação de que se dispunha sobre
essa amostra (vide ponto 2.3). Da análise dos padrões obteve-se um
resultado coerente com a sua natureza: os padrões negativos de
espécies transgénicas não evidenciaram o elemento genético
pesquisado, o mesmo acontecendo com o padrão de milho Bt-176 a
2% – uma vez que este tipo de milho não contém o terminador NOS
–, pelo que, de entre os padrões, só o de soja Roundup Ready® a
2% originou a banda característica da amplificação efectuada.
Em suma, os resultados obtidos mostram que ambas as
rações analisadas podem conter OGM31, ao passo que o milho
testado não é, de facto, transgénico (salvo se tiver sido
geneticamente modificado recorrendo a outros elementos genéticos
reguladores que não os pesquisados – se esse fosse o caso, o milho
em questão seria um OGM não aprovado na UE, já que as quatro
variedades de milho GM aprovadas32 contêm, pelo menos, o
promotor CaMV 35S [6]).
A confirmação da indentificação dos fragmentos de DNA
amplificados com a sequência de DNA alvo em cada pesquisa
31
Facto que não é surpreendente, dada a dependência portuguesa de soja, que o
nosso país importa da Argentina, Brasil e Estados Unidos [8], sabendo-se que os
Estados Unidos da América e a Argentina são os países onde a percentagem de
cultivo de variedades GM daquela cultura é mais significativa e que, apesar de o
Brasil não autorizar a plantação de culturas GM, inúmeros relatórios mencionam
que, em 1999, pelo menos 10% da soja brasileira era GM (as sementes são
importadas de forma fraudulenta da Argentina) [5, 15].
32
O milho Bt-176 da Ciba-Geigy, o milho T25 da AgrEvo, o milho MON 810
(YieldGard®) da Monsanto [17] e o milho Bt-11 da Novartis, segundo dados de
Maio de 2000 [94].
57
Animal
poderia ter sido feita por uma análise de restrição (digestão dos
produtos de amplificação com endonucleases apropriadas e
obtenção consequente de dois ou mais fragmentos de tamanhos
conhecidos), como proposto na referência 1, por Southern Blot
(recorrendo a sondas de DNA específicas para sequências contidas
em cada um dos fragmentos amplificados) [96-98] ou ainda (para
uma identificação inequívoca) por sequênciação dos fragmentos
obtidos [98]. No entanto, os métodos de confirmação prolongam o
tempo de análise e aumentam o seu custo – factores a ter em conta
em exames de rotina – e tornam-se prescindíveis assim que se
estabeleça a robustez e fiabilidade do método empregue, com
determinado tipo de matrizes.
Os fragmentos de amplificação de ambos os elementos
genéticos pesquisados resultantes da aplicação dos
oligonucleotídeos iniciadores usados neste trabalho rondam os 200
bp mas, no caso de alimentos processados (nomeadamente nos
produtos expandidos), submetidos a um tratamento térmico33
agressivo que degrade os ácidos nucleícos [96], visto a quantidade
e o tamanho médio do DNA presente na amostra ser inferior
(nalguns alimentos, como os óleos ou o chocolate, pode ter-se
apenas quantidades residuais de DNA, para além da presença de
produtos que inibem a PCR), pode ser necessário utilizar-se
oligonucleotídeos iniciadores que giram fragmentos de amplificação
mais curtos34. Em alernativa ou juntamente com a diminiução dos
fragmentos de amplificação, pode recorrer-se a métodos de
extracção de DNA que dêem maior rendimento, como o CTAB, em
detrimento de kits comerciais (como o Wizard® da Promega [99,
78]), que permitem obter DNA de melhor qualidade para a PCR
33
As forças de corte usadas no processamento das matérias-primas e o pH
(sobretudo àcido) são também responsáveis por uma clivagem aleatória do DNA,
reduzindo o tamanho médio dos fragmentos de DNA presentes na amostra.
34
Sequências (3' 5') dos primers para amplificação do promotor CaMV 35S
(amplicon de 123 bp) e do terminador NOS (amplicon de 118 bp) em alimentos
processados:
p35S-cf3 – CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG e p35S-cr4 – TCC TCT CCA AAT GAA
ATG AAC TTC C; HANOS 118-f – GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAT GGG e HANOS
118-r – GAC ACC GCG CGC GAT AAT TTA TCC.
58
Discussão
subsequente mas com um rendimento muito inferior [100], e/ou

fazer mais que uma extracção por amostra e juntar o DNA obtido
em cada uma. Uma outra hipótese para a amplificação de amostras
com DNA muito degradado e que pode ser usada em conjunto com
as acima referidas é o recurso à tecnica de nested PCR [75, 101,
102].
Como apreciação final, pode afirmar-se que o método validado
a nível comunitário para a detecção de OGM em alimentos [1]
revelou ser aplicável a amostras de alimentos para animais,
nomeadamente à matriz particular dos alimentos compostos para
animais35, o que o torna numa ferramenta valiosa para pôr em
prática a legislação vigente e futura sobre comercialização e
rotulagem de OGM destinados ao consumo animal no mercado único
europeu.
35
Os resultados da aplicação do método discutido tinham já sido apresentados
oralmente no 5º Encontro de Química de Alimentos, realizado entre 8 e 11 de
Maio de 2001 na Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Católica
Portuguesa, tendo sido publicada no respectivo livro de actas a comunicação
"Nunes da Costa, J.M. & Sequeira, A.J. Detecção de Organismos Geneticamente
Modificados em Alimentos para Animais por PCR".
59
60
61
62
Bibliografia
5 B i b l i o g r a f i a
[1]DG JRC, Environment Institute, Consumer Protection & Food Unit.

Screening method for the identification of genetically modified
organisms (GMO) in food: Detection of the CAMV 35S promoter
and NOS terminator by means of polymerase chain reaction
(PCR).
[2]Lipp, M., Brodman, P. Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. 1999.
IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically
modified soy beans and maize in dried powder. J. AOAC Int. 82:
923-928.
[3]Organisation for Economic Co-operation and Development.
01/06/2001 Biotech Statistics Progress.
http://www.oecd.org/doc/M00003000/M00003698.doc.
[4]COM (2001) 454 final Communication from the commission
Towards a Strategic Vision of Sciences and Biotechnology:
Consultation Document.
http://europa.eu.int/eur-
lex/com/cnc/2001/com2001_0454en01.pdf.
[5]Directorate-General for Agriculture. Economic Impacts of
Genetically Modified Crops in the Agri-Food Sector.
http://europa.eu.int/comm/agriculture/publi/gmo/gmo.pdf.
[6]Hemmer, W. 1997. Foods derived from genetically modified
organisms and detection methods. BATS-Report, Agency for
Biosafety research And Assessment of Technology Impacts of the
Suiss Priority Programme Biotechnology of the Swiss National
Science Foundation, Clarastr. 13, CH-4058 Basel. 2/97.
[7]Molving, L., Tabe, L.M., Eggum, B.O., Moore, A.E. Craig, S.,
Spencer, D. and Higgins, T.J.V. 1997. Enhanced methionine levels
and increased nutritive value of seeds of transgenic lupins
(Lupinus angustifolius L.) expressing a sunflower seed albumin
gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8393-8398.
63
Animal
[8]Piçarra, J. 2000. Organismos Geneticamente Modificados: Uma

Perspectiva da Indústria de Alimentos Compostos para Animais.
Alimentação Animal 36:4-6.
[9]Zak, J.R. 2000. Comentário sobre Biotecnologia dos Produtores de
Soja dos EUA. Alimentação Animal 36: 12-23.
[10]Rasmussen, P.E., Goulding, K.W.T., Brown, J.R., Grace, P.R.,
Janzen, H.H. and Körschens, M. 1998. Long-Term Agroecosystem
Experiments: Assessing Agricultural Sustainability and Global
Change. Science 282: 893-896.
[11]Stone, R. 1994. Large Plots Are Next Test For Transgenic Plants.
Science 266: 1472-1473.
[12]International Service for the Acquisition of Agri-biotech
Applications. 2001. Global GM Crop Area Continues to Grow –
Likely to Reach 50 Million Hectares, or 125 Million Acres, in 2001.
www.isaaa.org/press%20release/Global%20GMO%20Area.htm.
[13]EuropaBio. 2001. GMO Fact Sheet.
www.europabio.org/upload/articles/article_90.pdf.
[14]Rosa, J.J.S. 2000. OGM's, Agricultura e Progresso. Alimentação
Animal 36: 10-11.
[15]Green, D. 2000. OGMs Como Evitar uma Crise. Alimentação
Animal 36: 24-25.
[16]Monsanto. Caderno Técnico nº 1: Avaliação da Segurança da
Soja Roundup Ready® (Evento 40-3-2).
[17]YeldGard Maiz protegido contra taladros – Monsanto. Caderno
Técnico nº 2: Segurança do Milho MON 810 (YiedGard®),
Geneticamente Protegido contra as Brocas.
[18]Daniell, H., Datta, R., Varma, S., Gray, S. and Lee, S.
Containment of herbicide resistance through genetic engineering
of the chloroplast genome. Nature Biotechnology 16: 345-348.
[19]Bergelsin, J., Purrington, C.B. and Wichmann, G. 1998.
Promiscuity in transgenic plants. Nature 395: 25.
[20]Stewart, C.N., Prakash, C.S. 1998. Chloroplast-transgenic plants
are not a gene flow panacea. Nature Biotechnology 16: 401.
64
Bibliografia
[21]Anthony, R.G., Waldin, T.R., Ray, J.A., Bright, S.W.J. and Hussey,
P.J. 1998. Herbicide resistence caused by spontaneous mutation
of the cytoskeletal protein tubulin. Nature 393: 260-263.
[22]Altieri, M. 1998. The Environmental Risks of Transgenic Crops:
an Agroecological Assessment. Ecological Impacts.
[23]Lehrer, S.B., Horner, W.E. and Reese, G. 1996. Why are some
proteins allergenic? Implications for biotechnology. Crit Rev Food
Sci Nutr 36 (6): 553-564.
[24]Cookson, C. The Nature of Things: The huge unstoppable
experiment. Finacial Times November 8, 1997.
[25]Palukaitis, P. and Roossinck, M.J. 1996. Spontaneous change of a
benign satellite RNA of cucumber mosaic virus to a pathogenic
variant. Nature Biotechnology 14: 1264-1268.
[26]Timmons, A.M., Charters, Y.M., Crawford, J.W., Burn, D., Scott,
S.E., Dubbels, S.J., Wilson, N.J., Robertson, A., O'Brien, E.T.,
Squire, G.R. and Wilkinson, M.J. 1996. Risks from transgenic
crops. Nature 380: 487.
[27]Mikkelsen, T.R., Andersen, B. and Jrgensen, R.B. The risk of
crop transgene spread. Nature 380: 31.
[28]Tabashnik, B.E., Liu, Y., Finson, N., Masson, L. and Heckel, D.G.
1997. One gene in diamondback moth confers resistence to four
Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1640-
1644.
[29]Falk, B.W. and Bruening, G. 1994. Will Transgenic Crops
Generate New Viruses and New Diseases? Science 263: 1395-
1396.
[30]Kareiva, P. Transgenic plants on trial. Nature 363: 580-581.
[31]Crawley, M.J., Hails, R.S., Rees, M., Kohn, D. and Buston, J.
Ecology of transgenic oilseed rape in natural habitats. Nature
363: 620-623.
[32]Losey, J.E., Rayor, L.S. and Carter, M.E. 1999. Transgenic pollen
harms monarch larvae. Nature 399: 214.
65
Animal
[33]Estruch, J.J., Carozzi, N.B., Desai, N., Duck, N.B., Warren, G.W.
and Koziel, M.G. 1997. Transgenic plants: An emerging approach
to pest control. Nature Biotechnology 15: 137-141.
[34]Marrs, T.C. Toxicology of Pesticides. General & Applied
Toxicology Edited by Ballantyne, B., Marrs, M. and Turner, P.
Volume 2. Stockton Press. 1994.
[35]http://www.biotech-info.net/butterflies_btcorn.html.
[36]Monarch Butterflies and Toxic Pollen.
www.ucsusa.org/agriculture/monarch.html.
[37]Pimentel, D. S. and Raven, P.H. 2000. Bt Corn Pollen Impacts on
Nontarget Lepidoptera: Assessment of Effects in Nature. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 97 (15):8198-8199.
[38]http://www.aphis.usda.gov/biotech/corn.html.
[39]http://www.aphis.usda.gov/biotech/soybean.html.
[40]Piçarra, J. 1999. Organismos Geneticamente Modificados: Uma
Perspectiva da Indústria. Alimentação Animal 32: 6-7.
[41]Directiva 90/220/CEE do Conselho de 23 de Abril de 1990
relativa à libertação deliberada no ambiente de organismos
geneticamente modificados. Jornal Oficial das Comunidades
Europeias das Comunidades Europeias L 117, 08/05/90, p.0015-
0027.
[42]Recomendação 82/472/CEE do Conselho, de 30 de Junho de
1982, relativa ao registo dos trabalhos respeitantes ao ácido
desoxiribonucleico (ADN) recombinante. Jornal Oficial das
Comunidades Europeias L 213, 21/07/1982 p. 0015-0016.
[43]Directiva 2001/18/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, de
12 de Março de 2001, relativa à libertação deliberada no
ambiente de organismos geneticamente modificados e que
revoga a Directiva 90/220/CEE do Conselho. Jornal Oficial das
Comunidades Europeias L 106, 17/04/2001, p. 0001-0039.
[44]Recomendação 97/618/CE da Comissão, de 29 de Julho de 1997,
relativamente aos aspectos científicos, à apresentação dos
pedidos de colocação no mercado de novos alimentos e
66
Bibliografia
ingredientes alimentares e à elaboração dos relatórios de

avaliação preliminar nos termos do Regulamento (CE) nº 258/97
do Parlamento Europeu e do Conselho.
[45]Directiva 90/219/CEE do Conselho, de 23 de Abril de 1990,
relativa à utilização confinada de microrganismos geneticamente
modificados. Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 117,
08/05/1990, p. 0001 – 0014.
[46]Decreto-Lei nº 126/93, de 20 de Abril. Diário da República
Número 92 Série I-A.
[47]Portaria nº 751/94, de 16 de Agosto. Diário da República
Número 188/94 Série I-B.
[48]Decreto-Lei nº 63/99, de 2 de Março. Diário da República
Número 51/99 Série I-A.
[49]Decreto-Lei nº 172/98, de 25 de Junho. Diário da República
Número 144/98 Série I-A.
[50]Directiva 97/35/CE da Comissão de 18 de Junho de 1997 que
adapta pela segunda vez ao progresso técnico a directiva
90/220/CEE do conselho relativa à libertação deliberada no
ambiente de organismos geneticamente modificados. Jornal
Oficial das Comunidades Europeias L 169, 27/06/1997 p. 0072-
0073.
[51]Decisão 96/281/CE da Comissão de 3 de Abril 1996 relativa à
colocação no mercado de soja (Glycine max L.) geneticamente
modificada com maior tolerância ao herbicida glifosato, nos
termos da Directiva 90/220/CEE do Conselho. Jornal Oficial das
[52]Decisão 97/98/CE da Comissão de 23 de Janeiro 1997 relativa à
colocação no mercado de milho (Zea mays L.) geneticamente
modificado com propriedades insecticidas conferidas pelo gene
da Bt-endotoxina juntamente com uma maior tolerância ao
herbicida glufosinato-amónio, ao abrigo da Directiva 90/220/CEE
do Conselho. Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 031,
01/02/1997, p. 0069-0070.
67
Animal
[53]Regulamento (CE) Nº 258/97 do Parlamento Europeu e do

Conselho de 27 de Janeiro de 1997 relativo a novos alimentos e
ingredientes alimentares. Jornal Oficial das Comunidades
Europeias L 043, 14/02/97 p. 0001-0007.
[54]Regulamento (CE) Nº 1139/98 do Conselho, de 26 de Maio de
1998, relativo à menção obrigatória, na rotulagem de
determinados géneros alimentícios produzidos a partir de
organismos geneticamente modificados, de outras informações
para além das previstas na Directiva 79/112/CEE. Jornal Oficial
das Comunidades Europeias L 159, p. 0004-0007.
[55]Saegusa, A. 1999. Japan tightens rules on GM crops to protect
the environment. Nature 399: 719.
[56]Regulamento (CE) Nº 49/2000 da Comissão de 10 de Janeiro de
2000 que altera o Regulamento (CE) Nº 1139/98 do Conselho
relativo à menção obrigatória, na rotulagem de determinados
géneros alimentícios produzidos a partir de organismos
geneticamente modificados, de outras informações para além
das previstas na Directiva 79/112/CEE. Jornal Oficial das
[57]Directiva 98/95/CE do Conselho de 14 de Dezembro de 1998
que altera, no que diz respeito à consolidação do mercado
interno, às variedades de plantas geneticamente modificadas e
aos recursos genéticos, as Directivas 66/400/CEE, 66/402/CEE,
66/403/CEE, 69/208/CEE, 70/457/CEE e 70/458/CEE relativas à
comercialização de sementes de beterraba, sementes de plantas
forrageiras, sementes de cereais, batatas de sementes,
sementes de plantas oleaginosas e de fibras e sementes de
produtos hortícolas a ao catálogo comum das variedades de
plantas agrícolas. Jornal Oficial das Comunidades Europeias L
025, 01/02/1999 p. 0001-0026.
[58]Livro Branco sobre Segurança dos Alimentos, Anexo relativo ao
Plano de Acção em matéria de Segurança dos Alimentos.
68
Bibliografia
Comissão das Comunidades Europeias (1999) 719 final. Ed.

12.1.2000, Bruxelas.
[59]Directiva 70/524/CEE do Conselho, de 23 de Novembro de 1970
relativamente aos aditivos na alimentação para animais. Jornal
Oficial das Comunidades Europeias L 270, 14/12/1970, p. 0001-
0017.
[60]Directiva 1999/20/CE do Conselho de 22 de Março de 1999 que
altera as Directivas 70/524/CEE relativa aos aditivos na
alimentação para animais, 82/471/CEE relativa a certos produtos
utilizados na alimentação dos animais, 95/53/CE que fixa os
princípios relativos à organização dos controlos oficiais no
domínio da alimentação animal e 95/69/CE que estabelece as
condições e regras aplicáveis à aprovação e ao registo de certos
estabelecimentos e intermediários no sector da alimentação
animal. Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 080,
25/03/1999, p. 0020-0021.
[61]Proposta de Regulamento 2001/0173 do Parlamento Europeu e
do Conselho relativo a alimentos geneticamente modificados
para a alimentação humana e animal. Comissão das
Comunidaddes Europeias, 25/07/2001.
[62]Eurobarometer 52.1 The Europeans and Biotechnology.
http://europa.eu.int/comm/research/pdf/eurobarometer-en.pdf.
[63]Silva, M. 2000. Transgénicos em Portugal: Há Vantagens?.
Alimentação Animal 36: 8-9.
[64]Europe ambivalent on biotechnology (1997). Nature 387 845-
847.
[65]Hoban, T.J. 2000. A Biotecnologia no Novo Milénio. Alimentação
Animal 36: 30-32.
[66]Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den
Eede, G. and Anklam, E. 2000. Validation of method based on
polymerase chain reaction for the detection of genetically
modified organisms in various processed foodstuffs. Eur. Food
Res. Techol., in press.
69
Animal
[67]Van den Eede, G., Lipp, M., Eyquem, F. and Anklam, E. 2000.
Validation of an analytical method for the detection of GMO-
derived DNA in processed foodstuffs. EUR 19677 EN (2000).
[68]DMIF-GEN Final Project. 1999. DMIF-GEN Project: development of
methods to identify foods produced by means of genetic
engineering. EU-Project SMT4-CT96-2072, Final report 12/1999.
http://food.ethz.ch/dmif-gen/.
[69]EU Tender Project. 2000. Development of qualitative as well as
quantitative detection methods to identify a genetic modification
in soybean and maize products. Report of the EU tender No
XXIV/98/A3/001 (2000).
[70]Lipp, M. and Anklam, E. 2000. Validation of an Immunoassay for
Detection and Quantification of a Genetically Modified Soybean in
Food and Food Fractions Using Reference Materials:
Interlaboratory Study. Journal of AOAC International 83 (4): 919-
927.
[71]http://biosafety.ihe.be/ARGMO/GMO_Plants.html.
[72]Yoder, J. I., Goldsbrough, A. P. 1994. Transfomation Systems for
Generating Marker-Free Transgenic Plants. Bio/Technology 12:
263-267.
[73]Sanchis, V., Agaisse, H., Chaufaux, J., Lereclus, D. 1997. A
Recombinase-Mediated System for Elimination of Antibiotic
Resistance Gene Markers from Genetically Engineered Bacillus
thuringiensis Strains. Applied and Environmental Microbiology.
63: 779-784.
[74]MacCormick, C.A., Griffin, H.G., Underwood, H.M. and Gasson,
M.J. 1998. Common DNA sequences with potencial for detection
of genetically manipulated organisms in food. Journal of Applied
Microbiology 84: 969-980.
[75]http://www.eurofins.com.
[76]Stryer, L. Biochemistry, 4th ed. W. H. Freeman and Company,
New York, 1995.
70
Bibliografia
[77]Lodish, L., Baltimore, D., Berk, A., Zipursky, S. L., Matsudaira, P.,
Darnell, J. Molecular Cell Biology, 3rd ed., Scientific American
Books, New York, 1997.
[78]Meyer, R., Candrian, U. and Lüthy, J. 1994. Detection of Pork in
Heated Meat Products by the Polymerase Chain Reaction. Journal
of AOAC International 77:617-622.
[79]http://people.ne.mediaone.net/jkimball/BiologyPages/A/Antisens
eRNA.html.
[80]Rensberg, B. 93/01/04. Technique May Fight Disease by
Reversing Instructions to Cells. The Washington Post, Science –
Genetic Engineering.
[81]Weintraub, H. 1990. Antisense RNA and DNA. Scientific
American January: 34-40.
[82]http://www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00482.html.
[83]Meyer, R. 1995. Detection of genetically engineered plants by
polymerase chain reaction (PCR) using the FLAVR SAVR tomato
as an example. Z Lebensm Unters Forsch 201 (6): 583-586.
[84]Kay, R., Chan, A., Daly, M., McPherson, J. 1987. Duplication of
CaMV 35S Promotor Sequences creates a Strong Enhancer for
Plant Genes. Science 236:1299-1309.
[85]Odell, J.T., Nagy, F. and Chua, N. 1985. Identification of DNA
sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus
35S promoter. Nature 313:810-812.
[86]Promega. Wizard® Magnetic DNA Purification System for Food.
Technical Bulletin No. 284.
http://www.promega.com/tbs/tb284/tb284.pdf
[87]Xu, J., Pemberton, G.H., Almira, E., McCarty, D.R. and Koch, K.E.
1995. The Ivr 1 Gene for Invertase in Maize. Plant Physiol. 108:
1293-1294.
[88]Taberlet, P., Gielly, L., Panton, G. and Bouvet, J. 1991. Universal
primers for amplification of three non coding regions of
chloroplast DNA. Plant Molecular Biology 17: 1105-1109.
71
Animal
[89]PhorTech International. 2000. 1999/2000 U.S. DNA Amplification

Survey. 1999/2000 MSPPSA series.
[90]Katz, E.D., Haff, L.A. and Eksteen, R. 1990. Rapid separation,
quantitation and purification of products of polymerase chain
reaction by liquid chromatography. Journal of Chromatography
512: 433-444.
[91]Kato, Y., Yamasaki, Y., Onaka, A., Kitamura, T., Hashimoto, T.,
Murotsu, T., Fukushige, S. and Matsubara, K. 1989. Separation of
DNA restriction fragments by high-performance ion-exchange
chromatography on a non-porous ion exchanger. Journal of
Chromatography 478: 264-268.
[92]Kato, Y., Kitamura, T., Mitsui, A., Yamasaki, Y., Hashimoto, T.,
Murotsu, T., Fukushige, S. and Matsubara, K. Separation of
oligonucleotides by high-performance ion-exchange
chromatography on a non-porous ion exchanger. Journal of
Chromatography 447: 212-220.
[93]http://image.fs.uidaho.edu/vide/descr184.htm.
[94]Facts on GMOs in the EU.
http://europa.eu.int/comm/dgs/health-
consumer/library/press/press63_en.pdf.
[95]Aronson, A.I. Insecticidal Toxins. Bacillus subtilis and Other
Gram-Positive Bacteria. (1993). Ed. Soneshein, A.L., Hoch, J.A.
and Losick, R. A.S.M. Washington, D.C.
[96]Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. 1998. Detection of the genetic
modifications in heat-treated products of Bt maize by polymerase
chain reaction. Z Lebensm Unters Forsh A. 206: 203-207.
[97]Vollenhofer, S., Burg, K., Schmidt, J. and Kroath, H. 1999.
Genetically Modified Organisms in Food – Screening and Specific
Detection by Polymerase Chain Reaction. J. Agric. Food Chem.
47: 5038-5043.
[98]Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. and Engel, K. 1997. Detection
of genetically modified insect-resistant Bt maize by means of
72
Bibliografia
polymerase chain reaction. Z Lebensm Unters Forsch A 205: 442-

445.
[99]Promega Corporation 1999. Wizard® Plus Minipreps DNA
Purification Systems. Technical Bulletin No. 117.
[100]Zimmermann, A., Lüthy, J. and Pauli, U. 1998. Quantitative and
qualitative evaluation of nine different extraction methods for
nucleic acids on soya bean food samples. Z. Lebensm Unters
Forsch A 207:81-90.
[101]Van Hoef, A. M. A., Kok, E. J., Bouw, E., Kuiper, H. A. and Keijer,
J. 1998. Development and Application of a selective detection
method for genetically modified soy and soy-derived products.
Food Additives and Contaminants 15 (7): 767-774.
[102]Meyer, M., Chardonnens, F., Hübner, P. and Lüthy, J. 1996.
Polymerase chain reaction (PCR) in the quality and safety
assurance of food: detection of soya in processed meat products.
Z Lebensm Unters Forsh 203: 339-344.
73

Relatório de Estágio

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António Jorge Pinto Sequeira

Aluno nº 7161 da Licenciatura em Química Aplicada Ramo Biotecnologia

Pesquisa de Organismos Geneticamente

Faculdade de Ciências e Tecnologia

O estágio efectuado foi um primeiro passo para a

1.1 A Emergência dos OGM

A aplicação da biotecnologia1 à actividade agrícola (motivada

eliminação de toxinas naturais, para além da manutenção ou

desenvolvimento de "super ervas daninhas", por transferência da

seja 47% do total das matérias-primas consumidas – o debate em

A falha de equivalência entre uma espécie geneticamente

excepção do ser humano5, cujo material genético tenha sido

1.3 Legislação sobre OGM

Em 1996 e 1997, ao abrigo da Directiva 90/220/CEE [41]

colmatar o vazio legislativo relativamente à rotulagem de produtos

acordo com o anexo relativo ao Plano de Acção em Matéria de

Um sistema adequado de rotulagem de alimentos

1.4 Métodos de Pesquisa de OGM

De modo a satisfazer os requisitos de rotulagem, é imperativo

1.4.1 Statu Quo da Normalização e Validação dos Métodos

Na UE, um número crescente de laboratórios de controlo de

necessários, tendo em conta os resultados obtidos. De facto, urge

1.4.2 PCR vs. ELISA

As metodologias que permitem distinguir espécies

um rastreio inicial da presença de OGM, seguida da detecção

– porque permite obter resultados positivos mesmo

1.4.3 Fundamento do Método Adoptado

Pelos motivos apontados, a detecção de organismos

iniciadores e condições de reacção adequados (vide pontos

No sentido de minorar os riscos de contaminação cruzada entre

2.2 Reagentes e Equipamento

Apesar de se terem introduzido algumas modificações ao

2.3 Amostras e Padrões16

Os resultados apresentados e discutidos adiante referem-se

2.4 Preparação das Amostras

2.4.1 Moagem/Homogeneização em Stomacher

As amostras de alimentos compostos para animais (sob a

As massas referidas de seguida são as requeridas para o

2.5 Extracção/Purificação de DNA

2.5.1 Método CTAB19

Adicionaram-se 500 µl de tampão de extracção CTAB aos

Centrifugou-se a mistura durante 10 min. a 12000×g, até

2.6 Avaliação da Integridade e Concentração do DNA

2.6.1 Electroforese do DNA Extraído

O objectivo desta operação é a avaliação da pureza e

2.6.2 Captura de Imagem dos Géis Obtidos

A visualização das bandas foi feita através da fluorescência,

• Coloração do Gel com Solução de Brometo de

Após a corrida, o gel foi imerso numa

• Aquisição e Registo da Imagem Fotográfica do

O gel corado com EtBr foi fotografado num

Para ser amplificado, a concentração do DNA deve situar-se

2.7 Controlo da Amplificabilidade do DNA e da Inibição pela

Antes de se proceder à reacção de PCR que conduz à detecção

2.7.1 PCR23 de DNA de Cloroplasto

Nas amostras cujos resultados são apresentados e discutidos,

Quando não há amplificação com aquele par de

de DNA adicionada por tubo foi de 7 µl26. Aos duplicados de cada

2.7.2 Electroforese dos Produtos de Amplificação27

A electroforese dos fragmentos amplificados pela PCR de

de cada solução resultante (cerca de 25 a 30 µl), utilizando-se para

2.7.3 Captura de Imagem dos Géis Obtidos

Esta parte do protocolo experimental foi realizada segundo o

2.8 Pesquisa do Promotor CaMV 35S