Quim. Nova, Vol. 25, No.

4, 616-623, 2002 FASES ESTACIONRIAS PARA CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA EM FASE REVERSA (CLAEFR) BASEADAS EM SUPERFCIES DE XIDOS INORGNICOS FUNCIONALIZADOS

Reviso

Edivan Tonhi, Kenneth E. Collins, Isabel C. S. F. Jardim e Carol H. Collins* Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas - SP Recebido em 24/7/01; aceito em 31/10/01

STATIONARY PHASES FOR REVERSED PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (RP-HPLC) BASED ON FUNCTIONALIZED INORGANIC OXIDE SURFACES. Particles of porous silica or other solvent resistent inorganic oxides can be functionalized by aliphatic (e.g., C-8 or C-18) or other groups to give stationary phases for use in reversed phase HPLC. The functionalization can be done by bonding of individual groups to the surface of the support particles, by producing an organic polymeric film from pre-polymers, or by adsorbing/immobilizing pre-formed polymers on the surfaces. These three types of functionalization are reviewed. Keywords: HPLC; reversed phase; functionalized inorganic oxides.

INTRODUO A Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE) uma tcnica de separao que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos mtodos analticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razes para este crescimento esto relacionadas sua adaptabilidade para determinaes quantitativas com boa sensibilidade, a possibilidade de separar espcies no volteis e termicamente instveis, com destaque para a indstria farmacutica, bem como as suas aplicaes em determinaes ambientais e em muitos outros campos da cincia, como o da medicina. Dentro da CLAE, estima-se que mais de 90% dos laboratrios de anlise espalhados pelo mundo utilizam pelo menos um mtodo que aplica a modalidade de CLAE em fase reversa (FR)1. Sistemas de CLAE-FR consistem de uma fase estacionria de menor polaridade e uma fase mvel de maior polaridade, enquanto a fase normal tem as polaridades invertidas. Estas fases apresentam vrias vantagens, tais como: uso de fases mveis menos txicas e de menor custo, como metanol e gua; fases estacionrias estveis de muitos tipos diferentes; rpido equilbrio da coluna aps a mudana da fase mvel; facilidade de empregar eluio por gradiente; maior rapidez em anlises e boa reprodutibilidade dos tempos de reteno. Alm disso, so muito aplicadas separao de solutos de diferentes polaridades, massas molares e funcionalidades qumicas. O presente trabalho visa revisar as fases estacionrias de CLAEFR com destaque para os desenvolvimentos recentes. SUPORTES Por mais de 30 anos a slica tem sido o material preferido para a preparao das fases estacionrias para CLAE-FR, sendo que mecanicamente estvel altas presses, pode ser facilmente modificada, existe um vasto conhecimento de sua estrutura e suas propriedades e comercialmente disponvel em uma grande variedade de tamanho de partculas, formas e tamanhos de poros. Por outro lado, as fases baseadas em slica tendem a serem limitadas em dois aspectos importantes. Um destes aspectos est relaci-

*e-mail: chc@iqm.unicamp.br

onado no homogeneidade da sua superfcie, que apresenta diferentes tipos de grupos silanis2,3, os quais afetam a funcionalizao e, consequentemente, o mecanismo de reteno. Os silanis (SiOH) so cidos e podem interagir fortemente com vrios tipos de molculas bsicas (frmacos, bio-orgnicos, etc.) e adsorv-las. Quando a adsoro reversvel, tem-se o problema de picos largos, assimtricos e com cauda, que so difceis de serem tratados quantitativamente, alm de poderem se sobrepor ou interferirem nos picos de outros solutos que eluem com tempos de reteno similares. Muitas vezes, a adsoro pode ser irreversvel e os compostos depositados na superfcie cromatogrfica podem restringir o transporte de massa, bloquear stios de interao normal e criar stios ativos no especficos, afetando o desempenho da coluna, podendo at lev-la deteriorao irreversvel4. O segundo aspecto a instabilidade da slica e das fases estacionrias sintetizadas baseadas em slica, tanto frente a fases mveis cidas como bsicas. Os grupos silanis e siloxanos (Si-O-Si) reagem com estas fases mveis, sofrendo dissoluo, causando perda da fase estacionria e, eventualmente, colapso da estrutura do leito da coluna5,6. Este problema de instabilidade em solues de pH baixo7 ou alto8-10 muito importante em CLAE-FR, sendo que solues com pH 2,5 ou pH 9,0 so recomendadas11 para a anlise de diversos compostos contendo, em sua estrutura, grupos cidos como carboxlicos e fenlicos e bsicos como aminas e amidas, tais como os encontrados em, por exemplo, frmacos e pesticidas. Para evitar o problema de instabilidade da fase estacionria em solues cidas ou bsicas, existe a possibilidade de substituir a slica utilizada como suporte. Fases estacionrias com suportes de celulose ou polmeros de estireno-divinilbenzeno12 foram as primeiras a serem testadas, mas estas fases apresentam problemas de baixa resistncia s altas presses empregadas em CLAE. Outros suportes utilizados so os xidos inorgnicos como alumina, titnia e zircnia. A alumina13-15 tem resistncia mecnica comparvel slica e resistncia qumica maior, mas no disponvel comercialmente com tanta variedade. Uma vantagem da utilizao da alumina como suporte a sua estabilidade frente a fases mveis com pH acima de 12, podendo separar compostos bsicos sem a necessidade de utilizar reagente par-inico ou supresso inica. Entretanto, uma desvantagem do seu uso ocorre na separao de cidos carboxlicos, pois estes compostos se ligam irreversivelmente na sua superfcie. Para

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separaes com fase mvel em pH menores que 10, a alumina tem aplicao muito similar slica, entretanto, colunas de alumina apresentam menor nmero de pratos do que colunas de slica. A alumina no modificada bastante utilizada como fase normal para separao de solutos fracamente polares. Em fase reversa, a alumina pode ser utilizada tanto com ligaes covalentes de cadeias alquilas na sua superfcie ou atravs de recobrimento superficial com uma camada de polmero. Por outro lado, fases comerciais disponveis com este suporte so muito limitadas. A zirconia13,14,16-19, tanto porosa como no porosa, tambm est sendo utilizada como material de recheio ou suporte para CLAE, sendo que quimicamente estvel a pH extremos e temperaturas elevadas (maiores que 100 C), alm de possuir alta resistncia mecnica. O grande problema da utilizao da zircnia que a sua superfcie tem stios que so classificados como cidos fortes de Lewis. Estes stios cidos so promovidos por tomos de zircnio (IV) que no tm todas as suas ligaes de coordenao completas e podem interagir com bases fortes de Lewis, como fosfatos, hidrxidos, fluoretos, e outros, produzindo picos com caudas ou at mesmo favorecendo adsoro irreversvel. Para prevenir o efeito dos stios cidos sobre a superfcie da zircnia, adicionam-se bases fortes de Lewis fase mvel para competir com os grupos bsicos do soluto, ou ento pode-se modificar a sua superfcie com fluoretos ou fosfatos. A titnia14,16,20 tem as mesmas propriedades mecnicas da slica, mas possui maior estabilidade qumica. um xido metlico anftero que pode ser utilizado como trocador aninico em pH cido e trocador catinico em pH alcalino. Em sua superfcie existem os chamados grupos titanis cidos que, como a slica, tambm adsorvem compostos bsicos. Como citado anteriormente a slica ainda o xido mais utilizado como suporte em CLAE-FR e muitos estudos vm sendo feitos para tentar melhorar a sua estabilidade em pH extremos. Uma possibilidade a modificao da sua superfcie, aproveitando as suas propriedades favorveis, tais como rigidez e reprodutibilidade de tamanho de poro e de partcula. A modificao superficial da slica cromatogrfica com os xidos de magnsio21, zircnio22,23 e titnio24-26 j foi relatada com resultados promissores, aps a preparao de fases estacionrias com polmero adsorvido e imobilizado na sua superfcie. Outra possibilidade a utilizao de fases estacionrias hbridas com matriz orgnica-inorgnica. Estas fases so comercializadas pela Waters com o nome de X-Terra27,28 e so obtidas pela reao de um tetraalcoxissilano com um alquiltrialcoxissilano para formar um precursor, que ento utilizado para criar as partculas (reao 1): (RO)4Si + n(RO)3SiR + (1,5n+2) H2O SiO2(R SiO1,5)n + (3n+4)ROH

cos apolares nas suas superfcies. Existem vrias formas de se obter as camadas orgnicas apolares sobre a superfcie dos diferentes xidos. O mtodo mais comum ocorre atravs da introduo de monocamadas orgnicas via reao com reagentes apropriados, produzindo as chamadas fases quimicamente ligadas. Outros envolvem o recobrimento superficial dos xidos com polmeros orgnicos. FASES ESTACIONRIAS QUIMICAMENTE LIGADAS A modificao da superfcie da slica e dos xidos metlicos com a introduo de uma camada quimicamente ligada ao suporte tem como objetivo principal unir, em um s material, as propriedades qumicas dos grupos orgnicos com a rigidez e a estabilidade trmica e hidroltica do xido inorgnico. Existem vrios procedimentos descritos para a formao de uma camada quimicamente ligada sobre a superfcie de xidos. Dentre eles, os principais so: esterificao, clorao seguida de reao com reagente de Grignard ou composto organo-ltio, e organossilanizao. Outros dois procedimentos de menor importncia nos dias de hoje so: organossilanizao catalisada por amnia e organossilanizao em fase de vapor29,30. As reaes mais importantes so descritas nos pargrafos a seguir. A esterificao31 foi utilizada no passado para modificar a superfcie da slica e envolve a reao de um lcool com o grupo silanol superficial, como mostrado na reao 2. Si-OH + ROH Si-OR + H2O (2)

Devido a simplicidade, este mtodo foi o primeiro a ser utilizado para obter fases quimicamente ligadas. Entretanto, a ligao Si-OC muito instvel hidroliticamente e no pode ser utilizada com fases mveis aquosas ou alcolicas. Por isso, estas fases foram rapidamente abandonadas. A clorao seguida de reao com reagente de Grignard ou composto organo-ltio tambm foi empregada31 na modificao da slica e consiste de uma etapa de clorao superficial com cloreto de tionila (reao 3), seguida pela ligao da cadeia alquila atravs de um reagente de Grignard (reao 4) ou um composto organo-ltio (reao 5). Si-OH + SOCl2 Si-Cl + SO2 + HCl Si-Cl + BrMgR Si-R + MgClBr Si-Cl + LiR Si-R + LiCl (3) (4) (5)

(1)

Como resultado final obtem-se uma partcula contendo unidades inorgnicas (SiO2) e orgnicas (RSiO1,5), com o grupo alquila (R) incorporado na matriz. O uso de diferentes grupos alquilas, assim como diferentes propores dos materiais de partida, foram investigados e o material com as melhores propriedades foi aquele com composio SiO2(CH3SiO1,5)0,5 27. As fases estacionrias quimicamente ligadas obtidas dos materiais hbridos, so mais estveis que as fases quimicamente ligadas convencionais e tambm apresentam um menor nmero de grupos silanis, devido ao maior recobrimento superficial pelos grupos alquilas. FASES REVERSAS Como as fases estacionrias para utilizao como fase reversa devem apresentar carcter apolar e a superfcie dos xidos utilizados como suporte so polares, deve-se ento introduzir grupos orgni-

A ligao Si-C tem maior estabilidade que as ligaes Si-O-SiR, formada na reao de organossilanizao (descrita a seguir), entretanto o uso do reagente de Grignard ou o composto organo-ltio na sntese torna este procedimento economicamente invivel e tambm foi abandonado rapidamente. A organossilanizao em condies anidras o mtodo mais utilizado atualmente para a modificao da superfcie da slica e dos xidos metlicos 17,29, 31-35. Primeiramente, necessrio ativar os grupos hidroxilas da superfcie do xido atravs de aquecimento, removendo as molculas de gua ligadas superfcie do xido por pontes de hidrognio. Em seguida promove-se a reao entre um organossilano monofuncional e os grupos hidroxilas superficiais, como mostrado na reao 6, onde M pode ser Si, Al, Ti ou Zr. O agente silanizante representado por XSiR2R, onde X representa o grupo funcional reativo que usualmente um cloreto ou um grupo alcxido (etoxi ou metoxi), R pode ser uma cadeia aliftica ou uma cadeia aliftica com grupos polares terminais, que se deseja introduzir no suporte e R geralmente um grupo metila. Em fase reversa R

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representa as cadeias C-8 e C-18, que so as mais utilizadas, sendo que cadeias de C-2 a C-30 so tambm encontradas36. Em fase normal, utiliza-se geralmente grupos terminais ciano ou amino ligados a uma cadeia aliftica. As fases assim produzidas so comumente chamadas fases tipo escova 37 ou fases monomricas38. M-OH + XSiR2R M-O-SiR2R + HX (6)

Reao similar, em condies anidras, tambm pode ser obtida utilizando reagentes difuncionais e trifuncionais, representados por X2SiRR e X3SiR, respectivamente, mas, neste caso, as condies da reao devem ser muito bem controladas, evitando principalmente a presena de gua, que pode hidrolisar o agente silanizante, ocorrendo reaes de condensao ou entrecruzamento entre os reagentes silanizantes. A reao pode acontecer entre um ou dois grupos hidroxilas do suporte, como mostrado nas reaes 7 e 8. Em uma etapa final, os grupos X residuais so hidrolizados, produzindo outros grupos Si-OH. M-OH + X3SiR M-O-SiX2R + HX (7)

(8)

O grande problema das reaes 6, 7 e 8 que no se consegue reagir todos os grupos hidroxilas superficiais, devido aos impedimentos estricos. Para resolver este problema e eliminar os grupos hidroxilas residuais promove-se mais uma reao posterior de silanizao com um reagente organossilano com cadeias laterais pequenas como o clorotrimetilsilano. Este procedimento chamado de capeamento39,40. Com o capeamento, consegue-se reduzir substancialmente o nmero de silanis residuais, mas no totalmente. Apesar dos inconvenientes, as colunas obtidas com estas fases apresentam alta eficincia. Outra forma de melhorar a estabilidade das fases estacionrias quimicamente ligadas utilizar as chamadas fases estacionrias estericamente protegidas7,41. Neste tipo de fase estacionria o reagente organossilano, alm de possuir a cadeia alquila lateral que se deseja introduzir na fase estacionria, tambm tem dois grupos alquilas volumosos como o isobutil, que promovem a proteo dos grupos silanis (Figura 1). Neste caso obtem-se um menor recobrimento do

suporte devido a limitao estrica durante a reao de silanizao, exibindo assim menor reteno dos solutos quando comparado com as fases estericamente no protegidas com mesma cadeia alquila lateral. Por outro lado, os silanis so bem menos disponveis para interagir com os solutos presentes na fase mvel, no necessitando reao de capeamento para obter uma fase estacionria capaz de separar os compostos bsicos sem cauda. Dentre as vrias estruturas mostradas na literatura de fases estacionrias quimicamente ligadas, vm se destacando aquelas provenientes de reagentes silanizantes contendo grupos polares inseridos no meio das cadeias alquilas, por exemplo, um reagente como XSiR2(CH2)3Y(C8H17) ou XSiR2(CH2)3Y(C18H37), sendo que Y representa grupos de amida, uria, carbamato ou amina42-46. Estas fases exibem diferentes seletividades para analitos polares, so estveis e reprodutveis em fases mveis altamente aquosas e promovem picos bastante simtricos para compostos bsicos47. Uma vantagem da utilizao destas fases, em comparao com as fases que possuem somente cadeias alquilas, est relacionada com a necessidade de menor concentrao de modificador orgnico na fase mvel. Com a presena do grupo polar na fase estacionria e dependendo do soluto que se deseja separar e das condies da fase mvel, o mecanismo de reteno pode ocorrer por partio, troca-inica ou ainda interaes dipolo-dipolo45,48. O grande problema destas fases est relacionado com a sua baixa estabilidade em pH extremos, quando comparada com as fases que possuem somente cadeias alquilas longas. Para resolver este problema Kirkland e colaboradores desenvolveram uma fase estacionria com grupos carbamatos no meio da cadeia alquila e ainda estericamente protegidas com grupos isopropilas, como mostrado na Figura 244.

Figura 2. Estrutura da fase estacionria diisopropil-alquil-amida44

Figura 1. Fases estacionrias quimicamente ligadas: a) estericamente protegida por grupo volumoso e b) no protegida

Fases estacionrias com cadeias alquilas quimicamente ligadas a zircnia (ZrO2)13,14,16-19, titnia (TiO2)14,16,49-52 e alumina (Al2O3)13,14,15 tambm j foram preparadas e testadas. Os seus desempenhos so somente razoveis, devido a problemas de reprodutibilidade na produo das partculas do suporte e no rendimento da reao de derivatizao. A estabilidade hidroltica da ligao Si-O-M das fases quimicamente ligadas, em relao hidrlise, diminui na seguinte sequncia de M: Si >> Ti ~ Zr >> Al. Devido a isso, o mtodo mais promissor de modificar a superfcie de alumina, titnia e zircnia o recobrimento com um polmero53. A reao de organossilanizao na superfcie do xido tambm pode ser feita na presena de gua29, utilizando reagentes silanizantes difuncionais ou trifuncionais. Neste caso, ocorre inicialmente uma prhidrlise do agente silanizante (reao 9), formando grupos silanis, os quais posteriormente reagem com os grupos silanis da molcula

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vizinha e tambm com os grupos hidroxilas da superfcie do suporte (reao 10). Nesta reao se estabelecem as ligaes do tipo siloxano (Si-O-Si) com a eliminao de gua (condensao). Assim, o processo constitudo de reaes do reagente silanizante em todas as direes, formando uma rede tridimensional sobre a superfcie da slica. Este tipo de fase estacionria quimicamente ligada frequentemente chamada fase polimrica38. Alm de serem mais espessas, as fases obtidas com este tipo de reao apresentam maior estabilidade hidroltica em comparao com as fases produzidas na reao 6. X3SiR + 3H2O RSi(OH)3 + 3HX (9)

fases monomricas. Segundo, a polimerizao usa a gua intrinsecamente adsorvida na superfcie da slica. A quantidade de gua utilizada neste mtodo muito menor e pode ser controlada reprodutivelmente56. Como no h gua em soluo, o entrecruzamento ocorre somente quando os reagentes entram em contato com a superfcie do suporte. Assim, estas fases estacionrias mostraram alta estabilidade hidroltica e baixa atividade dos grupos silanis superficiais57. Para evitar limitaes estricas durante a reao, promoveu-se o entrecruzamento horizontal com uma mistura de organossilanos trifuncionais com cadeias alifticas C1 e C1858 como mostrado na Figura 3. A mistura promoveu uma barreira slida imediatamente sobre a superfcie da slica. A distribuio do grupo C-18 sobre a superfcie controlada pelos grupos C-1, que atuam como espaadores, proporcionando melhor interao dispersiva entre as longas cadeias alifticas e o soluto. A monocamada orientada tambm promove uma barreira entre a fase mvel e a superfcie da slica, impedindo a troca de prtons entre os silanis residuais e a fase mvel e consequentemente reduzindo a formao de cargas superficiais. Estas fases foram submetidas a testes de estabilidade e se mostraram bastante resistentes tanto fases mveis cidas como bsicas. A concentrao dos grupos octadecil (C-18) pode ser ajustada variando a proporo dos reagentes organossilanos C-1 e C-18.

(10) O maior problema encontrado neste processo a dificuldade de se controlar a reao de entrecruzamento e a espessura da camada resultante, tornando o processo pouco reprodutvel, sendo raramente formada uma camada uniforme sobre o suporte. Um trabalho recente mostrou a preparao de uma fase reversa para CLAE, utilizando a reao de organossilanizao na presena de gua, constituda de polissiloxanos com cadeias alifticas variadas (C-28 a C-42) sobre a superfcie de slica para a utilizao na separao de carotenides54. Um novo conceito para a obteno de monocamadas sobre partculas de slica foi criado por Wirth e Fatunmbi55 nos ltimos anos. O mtodo baseado na reao de silanos trifuncionais restrita superfcie do suporte. O motivo do entrecruzamento restrito direo horizontal est relacionado com a presena de gua somente adsorvida na superfcie do suporte durante a reao de organossilanizao. Durante a reao, os reagentes trifuncionais so ligados um ao lado do outro e tambm superfcie da slica, formando um filme ordenado e denso, denominado monocamada auto-organizada (self-assembled monolayer), como mostrado na reao 11, onde R um grupo pequeno, como o metil e R um grupo maior como C-8 ou C-18.

Figura 3. Representao esquemtica da fase estacionria obtida pela polimerizao horizontal de uma mistura de organossilanos com cadeias alifticas C-1 e C-1858

(11) Este entrecruzamento horizontal difere do entrecruzamento por organossilanizao convencional em dois aspectos: primeiro, a monocamada obtida de uma mistura de reagentes triclorofuncionais, que leva a uma monocamada contendo uma pequena quantidade dos grupos maiores, promovendo uma seletividade parecida com a das

No incio a maior dificuldade encontrada com este tipo de fase estacionria estava relacionada com a reprodutibilidade de sua obteno. Isto foi resolvido pelo controle da umidade da superfcie da slica antes de iniciar a reao57. Estas fases j foram bastante caracterizadas por mtodos fsicos e qumicos nos ltimos anos, no restando nenhuma dvida da formao desta estrutura de monocamada auto-organizada. Outro mtodo, denominado recobrimento com hidreto intermedirio, produz uma monocamada superficial de polissiloxanos com cadeias laterais alquilas em duas etapas. Primeiramente uma monocamada superficial de polissiloxano com grupamentos hidretos (Si-H) produzida pela silanizao da superfcie do xido inorgnico com o produto de hidrlise do trietoxissilano (TES) (reao 12). Logo aps, hidrocarbonetos terminalmente insaturados, como o 1-octadeceno, so ligados ao polissiloxano na presena de um catalisador apropriado (reao 13). Apesar da complexidade, este mtodo produz um recobrimento de alta densidade de cadeias alquilas sobre o suporte, devido a pequena limitao estrica durante a reao de introduo destas cadeias sobre a superfcie. Com a ligao Si-C embutida, este recobrimento tambm proporciona uma alta estabilidade hidroltica destas fases 59.

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(12)

(13) A formao da monocamada com hidretos (Si-H) sobre a superfcie dos xidos modificada com o TES influenciada pela razo TES/OHsuperficial. Quando esta razo for maior que 1 pode ocorrer uma maior polimerizao do TES sobre a superfcie, proporcionando o aparecimento de camadas mais espessas que podem interferir na eficincia cromatogrfica60. FASES ESTACIONRIAS COM POLMEROS ADSORVIDOS E IMOBILIZADOS SOBRE O SUPORTE Nas ltimas dcadas, recobrimentos de suportes xidos com polmeros tm se tornado um mtodo de grande importncia na preparao de fases estacionrias para CLAE-FR. Levando em considerao o desenvolvimento de fases estacionrias com camadas muito finas de polmeros (monocamadas), bvio que a diferena na velocidade de transferncia de massa dos solutos nas fases modernas com polmeros e nas quimicamente ligadas esto ficando cada vez mais desprezveis. A preparao destas fases estacionrias foi to bem sucedida que atualmente inmeras delas esto sendo comercializadas. O objetivo de produzir fases com polmeros recobertos sobre um suporte combinar a resistncia mecnica da matriz inorgnica com a seletividade e inrcia qumica dos polmeros orgnicos. As principais vantagens das fases com polmeros sobre as quimicamente ligadas so: maior recobrimento dos stios ativos do suporte e a possibilidade de maior seletividade da fase estacionria pela escolha do polmero apropriado. A seletividade influenciada pela natureza e quantidade de grupos funcionais nas cadeias dos polmeros, pela espessura do filme polimrico e pela rea superficial e estrutura de poros do suporte. A imensa variedade de polmeros orgnicos disponveis possibilita preparar fases com uma grande faixa de seletividade. A imobilizao de polmeros sobre um suporte poroso um processo complexo, influenciado pela contribuio dos diferentes tipos de interaes entre o suporte e o polmero, entre as molculas adjacentes na superfcie do suporte e, tambm, pela solubilidade do polmero nas fases mveis. No s as propriedades cromatogrficas do compsito polmero-suporte mas tambm o processo de imobilizao do polmero so influenciados pelas propriedades do suporte. Portanto, a escolha do suporte com propriedades adequadas de fundamental importncia na preparao das fases com polmeros. Existem vrios tipos de recobrimentos. Um dos mais comuns usados em cromatografia consiste da adsoro fsica de um polmero previamente sintetizado, com composio qumica bem definida, sobre o suporte. Alternativamente, o polmero tambm pode ser introduzido pela polimerizao de monmeros in situ61. Pode ocorrer um processo posterior de imobilizao por reticulao (ligaes cruzadas), induzidas por perxido62-66, tratamento trmico63,67,68, radiao ionizante-g 61,62,69 e outras, ou ainda promover a ligao covalente

entre o polmero e o suporte, produzindo uma monocamada ancorada61. Neste ltimo caso, o polmero deve apresentar grupos funcionais especficos ou reativos para se ligar ao suporte. Entre os polmeros j utilizados esto o poli(etileno)70-71, o poli(butadieno) 13,63,72-81, o poli(estireno)82,83, o poli(dimetilsiloxano)66, o poli(metiloctilsiloxano) 61-63,67,69,84 e o poli(metiloctadecilsiloxano)62,63. Tambm so utilizados politeres, polissacardeos, poliaminas, polinucleotdeos, poliamidas e protenas. Dentre os suportes utilizados na preparao de fases estacionrias com polmeros esto a slica13,62,64,70-73,84-91, a zircnia 13,17,70,71,76-83,92,93, a titnia81 e a alumina14,64,66,74,75,92. A forma mais simples de preparar o compsito suporte-polmero pela deposio de uma camada polimrica sobre a superfcie do suporte, sem promover a reticulao entre as cadeias do polmero e tambm sem a ligao qumica entre o polmero e o suporte. Neste caso ocorre uma contribuio de um ou mais tipos de interaes como dipolo-dipolo, ligaes de hidrognio e interaes eletrostticas entre as cadeias do polmero e o suporte. A insolubilidade do polmero na fase mvel tambm importante neste tipo de fase. Duas formas, bem diferentes, so as mais utilizadas para colocar o polmero sobre o suporte. Na primeira, mistura-se o polmero em soluo com o suporte e posteriormente evapora-se o solvente e, na segunda, promove-se a polimerizao in situ de monmeros sobre o suporte. A espessura do recobrimento nos dois casos pode ser controlada pela quantidade de polmero ou monmero no processo de deposio. Mao e Fung66 obtiveram uma fase reversa para CLAE pela copolimerizao in situ de cido maleico e 1-octadeceno sobre a supefcie de alumina. O copolmero foi reticulado com 1,4divinilbenzeno. A interao do cido carboxlico sobre a superfcie da alumina muito forte, ocorrendo um ancoramento do filme polimrico pela formao de duas pontes de hidrognio fortes com a superfcie para cada grupo carboxlico do polmero. A monocamada resultante propiciou estabilidade qumica fase estacionria tanto em meio cido como bsico. Li et al.94 estudaram os fatores que influenciam a deposio de polibutadieno (PBD) sobre zircnia porosa. Eles utilizaram perxido de dicumila como agente de reticulao do polmero. Foi mostrado que o processo de deposio do polmero influenciado pela velocidade de evaporao do solvente da soluo, pela afinidade do polmero pela superfcie do suporte e pela interao polmerosolvente. Em outro estudo95 comparou-se a adsoro do PBD, tambm reticulado com perxido de dicumila sobre slica, alumina ou zircnia, e concluiu-se que estas fases apresentam comportamentos cromatogrficos similares, embora a fase baseada em zircnia apresente stios cidos fortes de Lewis que no so protegidos pelo recobrimento. Fases estacionrias para a separao de ismeros foram obtidas pela adsoro de polivinilamina96,97 ou o copolmero de vinilamina/ lcool vinlico98, reticulados sobre slica. Aps a reticulao foram introduzidas ciclodextrinas quimicamente ligadas s cadeias do polmero para promoverem a separao dos ismeros geomtricos. Recentes trabalhos em nosso Laboratrio de Pesquisas em Cromatografia Lquida (LABCROM) utilizaram lquidos polimricos, tais como o poli(metiloctilsiloxano) (PMOS) ou o poli(metiloctadecilsiloxano) (PMODS), que se encontram adsorvidos, isto , depositados, dentro dos poros da slica cromatogrfica nua. As fases estacionrias preparadas utilizando este mtodo apresentaram propriedades cromatogrficas similares s colunas comerciais recheadas com fases estacionrias contendo os mesmos grupos alquilas 85-89. Entre os resultados interessantes obtidos nesta pesquisa, um estudo da distribuio do PMOS lquido nos poros, quando os poros no esto cheios, indicou que ela no uniforme; o lquido encon-

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Fases Estacionrias para Cromatografia Lquida de Alta Eficincia em Fase Reversa (CLAEFR)

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tra-se preferencialmente distribudo em gotas ou plugs86. Esta distribuio explicada como resultado do fenmeno de instabilidade de Raleigh no qual energeticamente desfavorvel para um lquido atingir uma configurao em uma grande rea, tal como uma camada fina depositada na superfcie dos poros da slica, quando existe a opo da formao de plugs86. Quando uma certa quantidade do PMOS sorvida nos poros da slica como plugs e, depois de um certo perodo de repouso, as partculas de slica contendo este lquido so submetidas a uma extrao com um solvente forte, tal como CH2Cl2, somente uma poro do polmero extrada, a restante est seguramente fixa nos poros85,99. Desde que o polmero livre muito solvel neste solvente, os resultados indicam que uma poro do polmero torna-se firmemente adsorvida, isto , auto-imobilizada, com fortes atraes superfcie do suporte, de uma maneira til para fins cromatogrficos99. A adsoro ocorre em muitos pontos de contato entre a superfcie da slica e a molcula longa (linear) do polissiloxano100. Isto leva a um novo modelo desta fase estacionria com o polmero adsorvido, onde o esqueleto de siloxano est espalhado dentro dos poros, acima da superfcie da slica, com os grupos octil estendidos para o centro do poro90. Sendo assim, a estrutura da fase estacionria de PMOS adsorvido formalmente similar estrutura das fases estacionrias convencionais quimicamente ligadas, com os grupos octil estendidos para o centro do poro. Por outro lado, a estrutura da monocamada da fase estacionria quimicamente ligada tem um aspecto diferente desta estrutura, ou seja, a distribuio dos grupos alquilas de baixo grau de organizao na superfcie, sendo que a reao de derivatizao tem um rendimento que implica em reao com, no mximo, 30 a 45% dos grupos silanis disponveis101, dando um carter no regular superfcie da slica amorfa derivatizada. No caso do espalhamento das molculas longas de PMOS (ou outro polmero com estrutura linear), os grupos alquil esto localizados, com regularidade, na cadeia do siloxano e existe um alto grau de organizao inerente no sentido compacto ao longo do esqueleto da molcula. Isto deve ser refletido em propriedades fsicas e cromatogrficas diferentes, potencialmente favorveis, para o caso das fases preparadas com polissiloxanos. Outros trabalhos realizados no LABCROM envolvem a utilizao de slicas com suas superfcies modificadas. Slica, aps a reao com tetrabutxido de zircnio, resulta em slica zirconizada (SiO-ZrOx)22,23, enquanto a reao de slica com tetrabutxido de titnio ou tetracloreto de titnio produz slica titanizada (Si-O-TiOx)24-26. Estes dois novos suportes foram recobertos com PMOS pelo mtodo de evaporao do solvente. Os resultados indicam que a adsoro encontrada com a slica nua, isto , a atrao forte entre o polmero e a superfcie99, no obtida com os suportes de slica modificada com zircnio ou titnia e o lquido polimrico se arrasta lentamente com a passagem da fase mvel. Por outro lado, a imobilizao por radiao gama22-26, mostrou-se muito efetiva com os suportes de slica com superfcies modificadas. Testes de estabilidade destas fases estacionrias, feitos pela passagem de volumes controlados de fase mvel, indicam que as fases estacionrias com PMOS imobilizado por radiao gama sobre a superfcie da slica zirconizada23 ou a slica titanizada25 apresentam estabilidade cromatogrfica igual ou melhor que as fases comerciais quimicamente ligadas. Um resultado significativo obtido com estas fases estacionrias preparadas com as slicas modificadas, com uma camada de PMOS imobilizada sobre as suas superfcies, a sua estabilidade frente s fases mveis de pH elevado. Utilizando o desempenho cromatogrfico como ferramenta de avaliao, no foi observado comportamento que indicasse degradao da slica derivatizada com a passagem de volumes significativos de fases mveis bsicas. Isto sugere que uma aplicao destas fases estacionrias seria na separao de compostos bsicos utilizando fases mveis de pH elevado23,25.

Outra forma de melhorar a estabilidade da fase estacionria promovendo o ancoramento (ligao qumica) do polmero sobre o suporte. A ligao qumica entre o recobrimento polimrico e o suporte pode ocorrer de duas formas diferentes. Na primeira, uma reao de ligao induzida aps a deposio do polmero sobre o suporte102,103. Neste caso deve haver grupos reativos especficos no polmero e no suporte para ocorrer a ligao covalente, caso isso no ocorra, deve-se introduz-los. Na segunda, a ligao ocorre no momento da polimerizao de monmeros sobre o suporte. Um exemplo deste procedimento a reao de organossilanizao na presena de gua, descrita previamente55-57. So poucas as fases com polmeros quimicamente ligados ao suporte mostradas na literatura. Duas delas foram preparadas para utilizao como fase reversa e foram obtidas pelo recobrimento de slica com copolmeros baseados em vinilmetildietoxissilano102,103. Os copolmeros foram ligados superfcie da slica atravs de ligaes covalentes entre os grupos silanis da slica e o grupo etoxisilil dos copolmeros. Novas fases reversas para CLAE tambm esto sendo desenvolvidas baseadas no recobrimento da superfcie da slica com lquidos cristalinos de baixa ou de alta massa molar. Lquidos cristalinos representam um estado da matria intermedirio entre um slido cristalino e um lquido isotrpico. A imobilizao destes lquidos cristalinos sobre o suporte pode ser feita de vrias formas, dependendo dos grupos funcionais presentes nestes compostos. A imobilizao mais frequente feita pela ligao qumica do suporte com um reagente clorossilano modificado com o lquido cristalino, promovendo uma monocamada104. O mtodo de hidreto intermedirio tambm muito utilizado para a imobilizao dos lquidos cristalinos de baixa ou de alta massa molar105. Delaurent e colaboradores106 produziram e caracterizaram uma fase estacionria constituda de cloroformato colestrico quimicamente ligado a aminopropil slica atravs de uma ligao carbamato. Esta fase se mostrou bastante eficiente na separao de hidrocarbonetos aromticos e tambm apresentou seletividade diferente das fases monomricas C-18 convencionais. Mais recentemente um trabalho mostrou a configurao de quatro fases estacionrias diferentes com o mesmo lquido cristalino104. As duas primeiras fases foram obtidas pela ligao qumica do lquido cristalino longitudinalmente e lateralmente superfcie da slica (Figura 4). Nas outras duas, o lquido cristalino foi ligado longitudinalmente e lateralmente a um polissiloxano (Figura 5) que posteriormente foi depositado sobre a superfcie da slica pelo mtodo de evaporao do solvente. Foi mostrado que a seletividade destas fases estacionrias so altamente dependentes da forma do lquido cristalino. Entre as fases estudadas, aquelas com o lquido cristalino fixado lateralmente ao polissiloxano apresentaram o melhor desempenho cromatogrfico na separao de hidrocarbonetos aromticos. Um novo conceito de obteno de fases estacionrias baseadas na combinao da tcnica de adsoro polimrica sobre um suporte com o conceito de mistura funcional foi proposta por Kanda e colaboradores107,108. Estas fases so constitudas de grupos hidroflicos intercalados com grupos hidrofbicos presos a uma mesma monocamada de polmero depositada sobre a superfcie da slica. Estas fases foram preparadas com o objetivo de serem utilizadas na anlise direta de fludos biolgicos. Para a preparao destas fases, primeiro deposita-se uma monocamada de polissiloxano atravs de reao de grupos hidretos (Si-H) sobre a superfcie do suporte e, posteriormente, introduz-se os grupos hidrofbicos (metil, fenil e octadecil) e hidroflicos (polioxietileno) na cadeia polimrica atravs de reao com um alqueno terminal, com auxlio de um catalizador apropriado (reao 14).

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Tonhi et al.

Quim. Nova

parao com um leito de partculas convencionais. Por apresentarem uma estrutura com muitos macroporos, estes monolitos permitem alta permeabilidade da fase mvel, podendo serem utilizados com altas vazes de fase mvel sem atingir altas presses, enquanto nos mesoporos ocorrem as separaes. As colunas obtidas com estas fases no necessitam de filtros nas extremidades, eliminando assim, o espalhamento da banda proveniente deste acessrio da coluna. A primeira coluna comercial contendo fase estacionria monoltica baseada em slica foi a Chromolith, da Merck, contendo grupos C18 quimicamente ligado nos mesoporos do monolito de silica dentro da coluna. Estas fases esto sendo pesquisadas principalmente para a chamada cromatografia rpida, mas tambm apresentam vantagens para a eletrocromatografia capilar e m-CLAE 109-111. CONCLUSES
Figura 4. Lquido cristalino ligado longitudinalmente e lateralmente superfcie da slica

Figura 5. Lquido cristalino ligado longitudinalmente e lateralmente ao polissiloxano

(14)

Trs exemplos destas fases estacionrias so mostrados na Figura 6108, onde o grupo hidroflico para todas o polioxietileno e os grupos hidrofbicos so o metil, octil e fenil.

Neste trabalho foi descrito um grande nmero de fases com as mais diversas estruturas. No existe fase estacionria ideal, todas apresentam as suas vantagens e desvantagens. De um modo geral, as fases estacionrias quimicamente ligadas do tipo monomricas produzem colunas com maior eficincia, sendo que so monocamadas verdadeiras. As fases quimicamente ligadas do tipo polimricas promovem colunas mais estveis s condies variadas de fases mveis e com maiores seletividades, pois promovem um melhor recobrimento dos suportes. A fase estacionria ideal aquela que une a mnima espessura do recobrimento com a mxima proteo superficial do suporte. As fases que mais se aproximam deste ideal so aquelas obtidas pelo processo de entrecruzamento horizontal e pelo mtodo de hidreto intermedirio, bem como as produzidas pela adsoro/imobilizao de polmeros pr-formados sobre os diferentes xidos inorgnicos. A slica ainda o xido mais utilizado como suporte para os mais diversos tipos de recobrimentos. Nos recobrimentos obtidos por ligao qumica, isto est relacionado com a maior estabilidade hidroltica das ligaes dos tipos Si-O-Si ou Si-C com o suporte de slica. Mas, para o recobrimento com polmeros pr-formados ou preparados in situ, a slica s prevalece pela sua grande variedade comercial, pois a slica metalizada e os demais xidos apresentam propriedades fsico-qumicas at mais apropriadas que a slica para este fim. Avanos futuros de monocamadas sobre xidos para utilizao como fase estacionria em cromatografia lquida podero aparecer de novas fases que apresentem polmeros pr-formados, imobilizados na superfcie do suporte. Esta previso baseada na grande variedade de polmeros disponveis, que podero fornecer fases com variadas seletividades, diferentes processos de imobilizao, estruturas qumicas diversas (hidrofbicas, hidroflicas, carregadas, etc.), propriedades mecnicas adequadas e outras. As fases monolticas tambm so bastante promissoras e podem vir a substituir os recheios cromatogrficos convencionais constitudos de pequenas partculas, especialmente para a CLAE-FR em colunas microbore ou capilar, bem como na eletrocromatografia capilar. REFERNCIAS

Figura 6. Representao esquemtica de trs fases estacionrias obtidas pela deposio de um polmero com mistura funcional108

FASES ESTACIONRIAS MONOLTICAS Fases estacionrias baseadas em slica monoltica ou monolitos de polmeros esto sendo muito estudadas atualmente e so de grande interesse em CLAE. As colunas monolticas diferem dos materiais convencionais de enchimento, sendo que so uma nica estrutura porosa com macroporos e mesoporos em um nico slido, em com-

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Fases Estacionrias para Cromatografia Lquida de Alta Eficincia em Fase Reversa (CLAEFR)

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