UNIVERSIDAD AUTNOMA DE GUERRERO

UNIDAD ACADMICA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS

CLONACIN DE UN CONTROL POSITIVO DE PCR PARA LEUCEMIAS TIPO Inv (16) o M4Eo

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QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRA EN CIENCIAS BIOMDICAS

MIGUEL NGEL RODRGUEZ BARRERA

TESIS QUE PARA OBTENER EL TITULO DE QUIMICO BIOLOGO PARASITOLOGO

P R E S E N T A N :

SALVADOR MELENDEZ ABARCA CARLOS DANIEL SANCHEZ TACUBA

DIRECTOR DE LA TESIS: Dr. Marco Antonio Leyva Vzquez

CHILPANCINGO, GRO., ABRIL DE 2007.

CLONACIN DE UN CONTROL POSITIVO DE PCR PARA LEUCEMIAS TIPO INV (16) M4Eo

DEDICATORIAS Y AGRADECIMIENTOS Quisiera agradecer principalmente a Dios por permitirme y concluir uno de mis grandes anhelos de mi vida, terminar mis estudios profesionales, a mis guas y maestros. Los de aqu y los de all. A mi padre el Sr. Mateo Snchez Calvo y a mi madre la Sra. Martha Tacuba Mosso. Porque gracias a su apoyo y consejos he llegado a realizar una de mis metas, la cual constituye la herencia ms valiosa que pudiera recibir para continuar con mi superacin y ser los mejores y estar conmigo incondicionalmente, gracias porque sin ellos y sus enseanzas no estara aqu ni sera quien soy ahora, a ellos les dedico esta tesis. A mis hermanos Josu, Emmanuel y Liliana: por ser y estar, por compartir el espacio y los momentos significativos de mi vida. A mis abuelos Telesforo Sanchez, Guadalupe Calvo y Rosa Mosso que estn orgullosos de m y a mi abuelo Moiss Tacuba (q.e.p.d.), que donde sea que se encuentre el esta feliz y orgulloso de m. A mis tos Gabriel, Jos Lus, Baltazar, Imelda, Cristina, Imelda, Eva, Marcela, Santos, Rosalba, Altagracia, Raymundo, Mario, pedro, Antonio, Leticia, Edith, que me han apoyado de forma anmica, moral, material y econmicamente durante todos estos aos. A mis primos, Oscar, Salvador, Jorge, Janeth, Ismael, Dania, Diana, Fernanda y Oswaldo por ser la mejor familia que me pudo haber tocado y ser mis hermanos. A mi novia Norma Angelica, por ser quien eres y formar parte de m, que en los buenos y malos momentos siempre me ha apoyado y ha estado conmigo en los momentos ms especiales. A mis amigos, colaboradores, profesores y compaeros de trabajo: Q.B.P. Jorge Organista , Q.B.P. Carlos Moctezuma, Q.B.P. jazmn Gmez, Q.B.P. Rene Valdovinos, Q.B.P. Marbel, MC. Mnica Saavedra y Salvador Melndez por los grandes y valiosos momentos que disfrutamos y pasamos en la realizacin y conclusin de esta tesis a todos ustedes les dedico un agradecimiento muy grande porque en los obstculos que se nos presentaban siempre encontrbamos una forma de vencerlos en especial este reconocimiento al compaero y amigo Q.B.P. Jorge Organista Nava porque juntos terminamos este proyecto de investigacin. A mi director de tesis Dr. Marco Antonio Leyva Vzquez por su confianza, apoyo y comprensin que nos tuvo en la realizacin de esta tesis. A mis sinodales la Dra. Nancy Salinas Meneses, Q.B.P. Norma Edith Martnez Hernndez, MC. Miguel ngel Rodrguez Barrera por todo el apoyo recibido durante la realizacin de esta tesis.

A la Dra. Gloria Sobern Chvez , MC. Jeiry Toribio Jimnez, MC. Marisela Aguirre Ramrez, del Instituto de Investigaciones Biomdicas de la UNAM por asesorarnos en las tcnicas de clonacin y poder realizar el proyecto de investigacin en la nueva sede del instituto de Investigaciones Biomdicas de la UNAM. Al MC. Enc Mariano Corts Malagn por habernos apoyado con la secuenciacin y al MC. Ricardo Silva Ramrez por habernos apoyado con la realizacin de este proyecto. Un reconocimiento a todo el personal del laboratorio de Biomedicina Molecular de la facultad de ciencias biomdicas de la Universidad Autnoma de Guerrero. Me resulta muy difcil poder expresar con palabras todo el agradecimiento que siento por tantas personas que han credo o creen en lo que hago. Quiero que sepan que cada una de esas personas, por mucho o poco que hayan hecho, siempre estarn presentes en mi recuerdo, y de un modo u otro siento la necesidad de agradecerles todo el apoyo que entre todos me han dado y me estn dando. Porque gracias a ellas, mi sueo es tambin el suyo, y juntos tenemos ms fuerza para poder seguir adelante. Porque ya no solo es mi sueo, sino el sueo de todos ellos. Gracias a todos!! Gracias por ayudarme a lograrlo.

CARLOS DANIEL SNCHEZ TACUBA

AGRADECIMIENTOS A DIRECTOR DE TESIS DR. MARCO ANTONIO LEYVA VAZQUEZ Por habernos apoyado en todo momento en el desarrollo de este proyecto, en las dudas que se nos presentaron, por corregirnos en nuestros errores ensendonos a seguir los mejores pasos, por su valioso conocimiento aportado a este a este proyecto, gracias por el valioso tiempo que nos dedico. A MIS SINODALES QBP. NORMA EDITH MARTINEZ HERNANDEZ M.C. NANCY SALINAS MENESES M.C. MIGUEL ANGEL RODRIGUEZ BARRERA Por todo el apoyo que nos brindaron, por ese tiempo que nos dedicaron dejando a un lado sus asuntos personales. Gracias. A la M.C. MONICA VIRGINIA SAAVEDRA HERRERA Por su gran apoyo que nos dio ya que sin su ayuda no hubiera sido posible este logro muchsimas gracias. A M.C. JEIRY TORIBIOJIMENEZ, DRA. GLORIA SOBERON CHAVEZ, M.C. MARISELA AGUIRRE RAMIREZ, al M.C. RICARDO SILVA RAMIREZ Por ese gran apoyo que nos dieron aun sin conocernos gracias. M.C. ENOC MARIANO CORTES MALAGON Por su ayuda en la realizacin de este proyecto. A MIS COMPAEROS Y AMIGOS A Carlos Daniel Snchez Tacuba, a los QBPs. Jorge Organista, Carlos Moctezuma, Yazmn Gmez y no poda faltar Rene Valdovinos Snchez y Marbel Garca Hernndez. Por que superamos muchos obstculos que se nos presentaron, por la paciencia que nos tuvimos les doy muchas gracias por ese apoyo que me brindaron y ms cuando se vea nublado el camino ellos estuvieron ah apoyndome gracias de todo corazn. A todo el personal de laboratorio de Biomedicina Molecular que estuvo apoyndonos y que no los menciono pero ellos saben que nos apoyaron muchas gracias.

AGRADECIMIENTOS A DIOS Por permitirme seguir con vida y salud, por mantener a mi familia unida en las buenas y las malas por todos esos momentos maravillosos que nos ha permitido vivir juntos. Gracias A MI MADRE FRANCISCA ABARCA GARCIA Le doy las gracias a mi mama por todo el apoyo, por sus consejos y cario que me a brindado incondicionalmente, por esos sacrificios que hizo por mi y que nunca se lo podr pagar ni con la riqueza mas grande del mundo, te Amo mama.

A MIS HERMANOS A Ma. Isabel, a Jos Manuel y a Pablo Melndez Abarca por todo el apoyo que me dieron por que juntos vivimos momentos difciles pero tambin maravillosos y que supimos salir adelante juntos les doy las gracias los quiero mucho.

A Teresita de Jess Ortiz Cristino por apoyarme en todo momento, por esa paciencia y por todo el cario que me ha brindado, Gracias.

SALVADOR MELNDEZ ABARCA

INDICE

Pgina INDICE DE FIGURAS INDICE DE TABLAS LISTA DE ABREVIATURAS INTRODUCCIN MARCO TERICO MATERIALES Y MTODOS RESULTADOS Y DISCUSION CONCLUSION REFERENCIAS ANEXOS I II III 1 3 16 18 24 25 29

INDICE DE FIGURAS

Pgina Fig. 1 Cromosoma 16 normal y su inversin Fig. 2 Genes quimricos por la inversin 16 Fig. 3 Componentes bsicos de un vector de clonacin Fig. 4 Vector pUC18/pUC19 Fig. 5 Producto de PCR de la Inv16
Fig. 6 Vector de clonacin pUC19 Fig. 7 Plsmido recombinante pUC19 CBF/MYH11 Fig. 8 Colonias con inserto y sin inserto Fig. 9 Producto de PCR del DNA plasmdico Fig. 10 Digestin del plsmido recombinante y no recombinante Fig.11 Serie de diluciones del producto de PCR de la Inv 16

7 8 13 14 18 19 19 20 20 21 23

NDICE DE TABLAS

Pgina Tabla 1 Clasificacin de las leucemia aguda mieloblstica (LAM) y sus asociaciones genticas segn el Franco-Americano- Britnico (FAB) Tabla 2 Anlisis de secuencia en el programa Blast Tabla 3 VecScreen Tabla 4 Clustal W (1.83) 6 22 22 23

ii

LISTA DE ABREVIATURAS

LAM FAB A-M4Eo MO PAS Inv t MYH11 CBFB LAL cDNA RC MDR DNA 2-m IPTG ORF MPO HTLV-I HTLV-2 LA FISH RT-PCR

Leucemia Mieloide Aguda. Franco Americano Britnico. Leucemia Aguda mielomonoctica con Eosinofilia Medula sea. Tincin Argentina de Plata. Inversin. Translocacin. Cadena pesada de miosina del msculo liso Factor de unin central subunidad Leucemia Aguda Linfoblstica cido desoxirribonucleico complementario. Remisin Completa Resistencia a multidrogas Elemento Multicopia Extracromosmico. Isopropil-b-D-Tiogalactsido Marco Abierto de Lectura Mieloperoxidasa. Virus linftropico de linfocitos T Humano tipo 1 Virus linftropico de linfocitos T Humano tipo 2. Leucemia Aguda. Hibridacin In Situ con Fluorescencia Trascripcin Inversa Seguida de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa

iii

INTRODUCCIN

La leucemia aguda mieloblstica (LAM) es una enfermedad que se origina como resultado de la expansin clonal de una sola clula hematopoytica inmadura la cual ha sufrido una transformacin molecular en la expresin de algunos genes.1 En las ltimas dcadas, la incidencia de LAM se ha incrementado considerablemente en pases desarrollados y en algunos pases en va de desarrollo. En Mxico, la falta de estudios epidemiolgicos ha propiciado a que no se tenga un seguimiento de casos nuevos, sin embargo existe evidencia de que el nmero de pacientes con esta enfermedad se ha incrementado en forma significativa. Tan solo en 1998 se reportaron ms de 600 casos nuevos.2 Debido a que estas neoplasias tienen una gran variedad de subtipos lo cual hace muy difcil su diagnstico, se han implementado una secuencia de tcnicas, partiendo de un examen hematolgico seguido de un inmunolgico y finalmente de un citogentico que actualmente son de gran ayuda, ya que han permitido hacer un mejor diagnstico y dar una terapia adecuada; as la citogentica o los mtodos genticos moleculares se han vuelto una parte esencial en el diagnostico rutinario de pacientes con LAM. Entre las tcnicas que actualmente se han estado utilizando es la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) que hace posible conocer el subtipo biolgicamente definido de LAM. Las Leucemias Agudas Mieloides (LAM) son un tipo de cncer que afecta a la poblacin en general, presentndose con mayor frecuencia en los adultos. Por esta razn se han llevado acabo estudios con tcnicas moleculares y citogenticas que han revelado la existencia de una gran variedad de LAM. La M4Eo es uno de los subtipos originado por la inversin del cromosoma 16 encontrndose con una frecuencia entre el 10-12% de todas las LAM. Una de las tcnicas que en la actualidad se han utilizado para el diagnstico de esta alteracin cromosmica es la RT-PCR que ha utilizado como control positivo muestras de pacientes que presentan esta inversin cromosomal. Debido a que no siempre es posible contar con estos controles es necesario implementar tcnicas que permitan generar un control positivo para tenerlo disponible. En la actualidad las leucemias agudas mieloides son las neoplasias hematolgicas que hoy en da van en aumento, debido a que no se presenta un cuadro clnico patognomnico lo que genera un diagnstico confuso con otras enfermedades, por lo que un examen fsico y un estudio hematolgico de rutina (biometra hemtica) no es suficiente para su correcto diagnstico y un tratamiento adecuado, debido a que cada subtipo de LAM requiere de un tratamiento especifico. Por esta razn se han implementado tcnicas ms eficientes como la citogentica y las moleculares (RT-PCR) que han permitido detectar alteraciones a nivel cromosomal

teniendo as un mnimo grado de error para establecer una apropiada identificacin del fenotipo y genotipo leucmico. Debido a la falta de controles positivos disponibles, para la identificacin rpida y fcil, adems con una mayor sensibilidad para la deteccin de la leucemia Inv (16) correspondiente al subtipo M4 variedad M4Eo de las LAM, este proyecto pretendi clonar controles positivos de PCR que van a ser utilizados para establecer el diagnstico de sta leucemia. Por lo anterior al obtener estos controles se obtendrn los siguientes beneficios: tener un control en cantidades suficientes y a bajo costo, contar con el control positivo disponible como un estndar que pueda utilizarse en el momento que sea requerido sin la necesidad de buscar una muestra de un paciente positivo que pueda servir como control, y con esto dar un diagnstico para que pueda ser tratada oportunamente y con ello disminuir costo e incrementando la esperanza de vida con una remisin completa.

MARCO TERICO

LEUCEMIAS AGUDAS MIELOBLASTICAS (LMA) Definicin Es una neoplasia hematolgica caracterizada por un incremento en el nmero de clulas mieloides en la medula sea, acompaado de un bloqueo en su maduracin. Estas leucemias se asocian con un gran nmero de anormalidades cromosmicas en bandas que contienen proto-oncogenes.1,3,4 La mayora de las neoplasias son inducidas por agentes medioambientales que causan mutaciones en protooncogenes (transformndolos en oncogenes activos), en genes supresores de tumor (antioncogenes) o incluso en genes involucrados en la reparacin del DNA, producindose as la transformacin y proliferacin clonal de progenitores inmaduros con fallo en la capacidad de diferenciarse, que se desplazan e inhiben el crecimiento de la hematopoyesis normal.4,5,6 Origen clonal de las leucemias agudas mieloides Es bien sabido que la leucemia aguda mieloide (LAM) es una enfermedad que se origina como resultado de la expansin clonal de una sola clula hematopoytica inmadura, la cual ha sufrido una transformacin molecular (alteraciones en la expresin de ciertos genes).1 Un primer modelo propuesto a este respecto, y que por mucho tiempo fue considerado como la visin general sobre el origen de LAM, es que esta puede surgir en distintas poblaciones de clulas hematopoyticas. El estadio de maduracin y el grado de compromiso de dichas poblaciones hacia un linaje especifico, es lo que determina que la patologa tenga manifestaciones particulares y que clnicamente sea clasificada dentro de las ocho categoras (M0-M7), propuestas por el Grupo Cooperativo FrancoAmericano-Britnico (FAB). 1 Un segundo modelo ha sido propuesto ms recientemente, el cual planea la posibilidad de que, en todos los casos (M0-M7), la LAM se origina en una misma poblacin de clulas hematopoyticas primitivas; sin embargo dependiendo de la naturaleza de las alteraciones genticas que se presente, la clona leucmica seguir un cierto patrn de comportamiento biolgico y este, determinar sus caractersticas clnicas.1 Frecuencia de las LAM La leucemia representa el 2.5 % en la incidencia de todos los canceres, 7 en Mxico, el cncer ha pasado a ocupar junto con las enfermedades cardiovasculares el primer lugar como causa de muerte en la poblacin.4 Durante las ltimas dcadas, la incidencia de LAM se ha incrementado considerablemente en los pases desarrollados y en algunos pases en vas de 3

desarrollo.1 La incidencia LAM es mayor en los caucsicos que en la gente de color; aumentando drsticamente entre 1920 y 1960 y permaneci estable hasta los principios de los 70s; desde 1973 ha tendido a la disminucin.7 La mayor parte de las leucemias agudas infantiles de tipo linfoide en tanto, que las que se producen en adultos son de origen mieloide.8 La LAM en el adulto representa el 1.2 % de todos los casos de cncer en la mayora de los pases occidentales. Esta patologa relativamente rara, se presenta alrededor de 2.5 pacientes por 100,000 habitantes/ao en Estados Unidos. La LAM afecta a personas mayores, a una edad media de diagnostico de 65 aos,5 esto se demuestra al comparar su incidencia de casi 4 casos por 100,000 habitantes contra los 29 casos de cncer de pulmn por 100,000 habitantes, los 42 canceres de prstata por 100, 000 hombres y los 62 canceres de mama por 100,000 mujeres. Su frecuencia aumenta con la edad y comprende el 80 % de las leucemias agudas en adultos y del 15-20 % en nios.7 Caractersticas citolgicas Los mieloblastos son clulas de 15-25 micrmetros con relacin ncleo/ citoplasma elevada. El ncleo es de cromatina laxa con uno o ms nuclolos que con frecuencia son grandes. El citoplasma suele ser hialino o basfilo dbil. Los blastos mieoloides pueden presentar formaciones con aspecto de palillo que corresponden a anomalas en la distribucin de la granulacin; estos se denominan bastones de Auer, se tien con mieloperxidasa (MPO) son propios de leucemias mieloblsticas y se observa en el 33% de las mismas.6 Adems de la positividad citoplsmica para la MPO, los blastos de origen monocitario presentan positividad difusa que se vuelve negativa con el fluoruro sdico para las esteras inespecficas (naftol-AS-D- acetatoesterasa, alfanaftilbutirato-esterasa).3, 6 FACTORES DE RIESGO Resulta de inters conocer los factores de importancia pronostica con objeto de disear esquemas teraputicos que permitan mejorar los resultados obtenidos con la terapia convencional. Los factores de riesgo en LAM que tienen importancia de indudable valor pronstico son: 8 Edad del paciente Los pacientes mayores de 60 aos tienen tan solo un 50% de posibilidades de conseguir una remisin completa (RC) debido a: 1) frecuente asociacin con otros padecimientos metablicos o degenerativos (diabetes mellitus, hipertensin arterial, insuficiencia cardiaca, renal o heptica). 2) mayor toxicidad medicamentosa. 3) asociacin a hemopatas previas que son ms comunes despus de los 50 aos. 4) mayor inmunosupresin.3, 8

 Aparicin de LAM despus de otras hemopatas o neoplasias. Estos pacientes son refractarios a la quimioterapia y los pocos que consiguen la remisin, tienen una pobre sobrevivencia, el tratamiento de ellos, debe de ser agresivo (dosis altas de citotxicos, transplantes de medula sea y citocinas).8 Alteraciones citogenticas y moleculares En la LAM ms del 75% de los enfermos presentan anormalidades citogenticas. Pueden existir anomalas en el nmero de cromosomas (hipodiploidias, hiperdiploidias y seudodiploidias) alteraciones estructurares del tipo de las traslocaciones (t), delesiones (del) o inversiones (inv). Las ms comunes son: t (8;21), t (15;17), inv (16), del (16q-).8 Las alteraciones moleculares que han mostrado importancia pronostica son: a) Resistencia a multidrogas (MDR) relacionada con el codn 170 KD y que ocasiona anormalidad en la bomba de flujo en la membrana celular y limita la concentracin de algunos medicamentos (antraciclina, vincristina y etopsido). b) Expresin del oncogen bcl-2 manifestado por la protena bcl-2 de origen mitocondrial y que interviene en la muerte celular programada. c) Expresin del gen para nterleucina 1.3, 8 Otros factores de riesgo Otros factores de riesgo identificados como predisponentes son haber estado expuesto de manera accidental a radiaciones, los sobrevivientes de bombas atmicas, la exposicin a benceno y a sus derivados, los fumadores de cigarrillos, la susceptibilidad gentica, leucocitosis, sexo, raza y as como tambin se ha relacionado con algunos retrovirus: Virus Linftropico de Linfocitos T Humano tipo 1 y 2 (HTLV-1 y HTLV-2) que pueden inducir al desarrollo de LAM en humanos.3, 8, 9 MANIFESTACIONES CLNICAS La LAM se manifiesta con signos y sntomas relacionados con la alteracin de la hematopoyesis (infeccin, hemorragia y problemas en la capacidad del transporte de oxgeno). Los signos y sntomas corrientes en las LA (ya sea mieloblstica o linfoblstica) son dolor seo, cansancio, fatiga, acortamiento de la respiracin, mialgias y sangrado de encas, la infiltracin leucmica de varios tejidos incluso el hgado (linfadenopata) y el sistema nervioso central, pueden producir una variedad de otros sntomas. La hiperleucocitosis puede llevar a los sntomas de leucocitosis, disfuncin ocular y trastornos cerebrovasculares o sangrado. Puede haber tambin anormalidades metablicas (hiperuricemia e hipocalcemia) aunque estos raramente se encuentran presentes.3 En la LAM los datos de laboratorio incluyen un hemograma completo que presenta anemia, trombocitopenia, leucocitosis o neutropenia, coagulopata parecida a la intravascular diseminada y que se manifiesta con bajo fibringeno y elevacin del tiempo de tromboplstina parcial activado. En el exmen de sangre perifrica se observan mieloblastos con bastones de Auer.5

CLASIFICACIN DE LA LEUCEMIA AGUDA MIELOIDE SEGN EL FRANCOAMERICANO- BRITNICO (FAB). La necesidad de una clasificacin radica en la posibilidad de seleccionar pacientes para un tratamiento mas adecuado. Segn el FAB esta clasificacin se basa en caractersticas morfolgicas y citoqumicas, teniendo en cuenta el nivel de maduracin en el que se encuentran los blastos y la participacin de las diferentes lneas celulares.6, Esta distincin es basada en la morfologa y la apariencia a su exposicin y su reactividad con las reacciones histoqumicas, incluida la mieloperxidasa (MPO), el negro Sudn, naftol-AS-D- acetatoesterasa, y alfanaftil-butirato-esterasa (Tabla 1). 3, 5, 6 LEUCEMIA AGUDA M4Eo La LAM clasificacin M4Eo de la FAB corresponde al subtipo M4Eo de la leucemia mielomonoctica. Aparte de los blastos y promonocitos hay muchos eosinfilos anormales, algunos con granulaciones basfilas gruesas.8 La LAM-M4Eo se ha asociado frecuentemente con los siguientes rearreglos cromosmicos: la inversin pericntrica del cromosoma 16 {inv(16) (p13q22)} y la translocacin t(16;16) (p13;q22).12
TABLA 1. CLASIFICACIN DE LAS LAM Y SUS ASOCIACIONES GENTICAS SEGN EL FAB3
TRANSLOCACIONES ASOCIADAS Y REARREGLOS GENTICOS % DE CASOS

10, 11

SUBTIPOS FAB

NOMBRE COMN (% DE CASOS) MPO

RESULTADO DE LA TINCIN

GENES

NEGRO SUDAN

ENTERASAS NO ESPECIFICAS

M0 M1 M2

LAM con mnima diferenciacin (3%) LAM sin maduracin (15-20%) LAM con maduracin (25-30%) LA promielocitica (5-10%)

+ +

+ +

* -

Inv (3q26), y t(3,3) (1 %)

EV11

t (8;21) (40%) t (6;9) (1%) t(15;17) (98%), t(11;17) (1%), t(5;17) (1%) 11q23 (20%), inv(3q26), t(3;3) (3%), t(6;9) (1%)

AML1-ETO, DEK-CAN PML-RAR , PLZFRAR , NPM RAR

M3

MLL, LA + + + DEK-CAN, EVI1 mielomonoctica (20%) LAM con eosinfilos inv(16), t(16;16) M4 Eo + + + CBF-MYH11 anormales (80%) (5-10%) LA monocitica M5 + 11q23 (20%), (2-9%) MLL, t(8;16) (2%) MOZ-CBP LA mieloeritroide M6 + + (3-5%) LA M7 + t(1;22) (5%) Desconocido megacariocitica * Clulas que son positivas al antigeno mieloide (CD13 y CD33) Clulas que son positivas a alfa-naftilacetato y glucoproteinas de las plaquetas IIb/ IIIa o factor VIII relacionado con el antigeno y negativo a naftilbutirato. M4

Es una variedad bien definida, relacionada con anomalas cromosmicas a nivel del cromosoma 16 y con presencia de eosinofilia en MO. Representa el 12% de las M4 y el 4% de las leucemias mieloblsticas, su importancia radica en que tiene un pronstico favorable. Los eosinofilos medulares son atpicos con granulacin preeosinfila y eosinfilia a la vez en todos los estadios de maduracin y a diferencia de los normales presentan positividad para el PAS y cloroacetatoesterasa.6 Genes CBF-MYH11 asociados a LA M4Eo La LAM-M4Eo se ha asociado a rearreglos cromosmicos: tales como la inversin pericntrica del cromosoma 16 {inv (16) (p13q22)} y la traslocacin t(16;16) (p13;q22). Tales rearreglos producen la fusin de los genes CBF (factor central de unin a la subunidad) y MYH11 (Cadena Pesada de miosina del msculo liso) representada como CBF/MYH11 (Fig. 1)12, 13, 14, 15, 16

Figura 1. A) Cromosoma 16 normal B) Inversin del cromosoma 16

La funcin putativa del gen humano CBF puede derivarse de su homlogo murino CBF (o PEBP2) ya que los genes tienen un 98 % de homologa a nivel proteico. Este gen codifica para al menos dos isoformas de la unidad del factor de transcripcin heterodimrico CBF que es un heterodmero que consta de dos subunidades y , que se une a los aumentadores de varios virus que provocan leucemia murina, y de manera similar a los aumentadores de los genes que codifican para los receptores de las clulas T.12, 14, 17 CBF debe ser crucial para el control de la divisin y diferenciacin celular del linaje mieloide puesto que la expresin de cualquiera de las subunidades como una protena de fusin se asocia con el bloqueo de la diferenciacin y la expansin descontrolada de clulas leucmicas. Recientemente se ha demostrado que CBF que regula la expresin de dos genes especficos para la estirpe mieloide, mieloperxidasa y elastasa neutrfila.12 El gen quimrico CBF/MYH11, en la mayora de los casos, provoca la remocin de los ltimos 17 aminocidos de la protena CBF y modifica la funcin biolgica de esta, como reguladora de la expresin de ciertos genes relacionndose este evento a la presencia de leucemia.12, 15 Se han detectado cuatro puntos de fractura diferentes en el gen MYH11 (A, B, C, D) que se unen al mismo punto de fractura de CBF (en posicin 495). Todos los puntos de fractura dentro del gen MYH11 se localizan dentro de una regin denominada cola 7

conservada, hecho que se ha tratado de relacionar con la dominancia de la protena quimrica, (Figura 2)14

Figura 2. Se esquematizan en una forma lineal los cuatro genes que se encuentran con mayor frecuencia: A, B; C, D, las flechas sealan el punto de fusin entre genes CBF y MYH11, indicando el numero de bases del cDNA involucrados.

Inversin del cromosoma 16 (Inv 16) (p13q22) Las inversiones se refieren a la rotacin de 180 de un segmento del cromosoma, as en la inv (16) (p13q22) indica la rotacin de 180 del segmento contenido entre el brazo corto, regin 1, banda 3, y el brazo largo, regin 2, banda 2 del cromosoma 16, como esta rotacin esta constituida por segmentos de los brazos corto y largo del cromosoma 16, se deduce que es pericntrica (alrededor del centrmero). A nivel citogentico, esta yuxtaposicin se presenta mas comnmente en la Inv16 que a la t(16:16)(p13:q22) (Fig. 4)10,12, 14, 15, 16, 18 Por lo tanto la Inv16 produce dos genes de fusin 5-CBFB/MYH11-3 en 16p y 5MYH11/CBFB-3 en 16q, estudios realizados han sugerido que el gen que da origen a una leucomogenesis es la del brazo p 5CBFB/MYH11-3, y no el gen de brazo q 5MYH11/CBFB-3, ya que el brazo p tiene una delesin proximal al p-ibc (punto de ruptura de la inversin del brazo p.13 La Inv16 es una de las alteraciones cromosmicas mas frecuentemente encontradas en las LAM ocurriendo en un 10-12 % de todos los casos de LAM de adolescentes y adultos jvenes especialmente en la leucemia mielonomoctica aguda con aumento de precursores eosinofilos en la medula sea LAM 4 con eosinofilia del FAB.6, 20 TCNICAS DIAGNSTICAS PARA LAM Las tcnicas diagnsticas en primer lugar permiten hacer una distincin entre las leucemias agudas de otras enfermedades neoplsicas. En segundo se utiliza para diferenciar una LAM de una leucemia aguda linfoblstica (LAL). As como tambin para poder clasificarlas dentro de las categoras que permitan definir un tratamiento apropiado.11

 Citometra de flujo El uso de citometra de flujo en el laboratorio clnico ha aumentado sustancialmente en la ltima dcada. Esto se atribuye en parte al desarrollo de instrumentos ms pequeos, uso fcil, de menor costo y el aumento continuo de nuevos casos.21 Tambin es utilizada para immunofenotipificar una variedad de especimenes, incluyendo sangre entera, mdula, los sueros lquidos de las cavidades, el lquido cefalorraqudeo, la orina, y los tejidos finos slidos. Las caractersticas que pueden ser medidas incluyen tamao de clula, complejidad citoplsmica, el contenido del DNA o del RNA y las protenas intracelulares.20 Esta tcnica suele efectuarse tiendo las clulas con sondas fluorescentes especficas para la molcula a estudiar y midiendo la cantidad de fluorescencia que emita las clulas. El fundamento de la tcnica es la deflexin diferencial de las clulas con campos electromagnticos, cuya potencia y direccin varan en funcin de la intensidad mediada en la seal fluorescente.22 a) La determinacin citomtrica de flujo permite:23 b) confirmar el diagnstico. c) Establecer el diagnstico cuando no es posible tener un juicio claro con base en la morfologa o los patrones de tincin citoqumica. d) Identificar perfiles de antgeno aberrantes que puedan ayudar a detectar el retorno de la leucemia durante una remisin. e) Mejorar la prediccin del curso de la enfermedad. Citogentica y gentica molecular como evaluacin diagnstica. El anlisis citogentico y molecular es en la actualidad una parte esencial y rutinaria de la evaluacin diagnostica inicial de los pacientes con LAM, permitiendo determinar aspectos importantes sobre la clasificacin y el pronostico de la enfermedad.6, 24 El anlisis citogentico de las clulas tumorales ha revelado la presencia de alteraciones cromosmicas clnales en mas 30, 000 neoplasias humanas hoy sabemos que la presencia de determinadas alteraciones cromosmicas aportan informacin importante con valor diagnostico y pronostico en neoplasias hematolgicas y tumores slidos.22, 25 La combinacin de la citogentica convencional, hibridacin in situ con fluorescencia (FISH por sus siglas en ingls) y el anlisis molecular (RT-PCR) permiten:25 a) Una aproximacin diagnstica. b) La clasificacin de las neoplasias en subgrupos con distinto valor pronstico.

c) La monitorizacin del efecto del tratamiento. La citogentica tiene una participacin muy importante dentro de la constante evolucin de la tecnologa, lo cual esta permitiendo construir las bases para que en un futuro no muy lejano, tener la capacidad de controlar y prevenir las neoplasias hematolgicas.26 Hibridacin in situ con fluorescencia (FISH) Despus de la localizacin de genes por hibridacin in situ con marcaje radioactivo (isotpico), se logr posteriormente un marcaje con fluorescencia (no isotpico) que ofreci mayor rapidez, resolucin y sensibilidad al compararlo con el primero ya que este traa como consecuencia un dao en el personal que realizaba la tcnica y de esta forma naci FISH, que puede ser definida como la localizacin morfolgica de secuencias genticas.26 La tcnica de Hibridacin in situ con fluorescencia se basa en la hibridacin de una sonda de ADN marcada con una marcador fluorescente sobre su secuencia complementaria del genoma, bien en la metafase cromosmica o en el ncleo en la interfase.25 Su propsito es determinar la presencia o ausencia de regiones especificas de DNA o RNA, y su localizacin particular en una clula o en un sitio cromosmico.26 Algunas de las ventaja son su alta sensibilidad, especificidad y la rapidez de los ensayos que han hecho de esta tcnica una importante estrategia diagnostica con numerosas aplicaciones.25 Transcriptasa reversa seguida de la reaccin de la polimerasa (RT-PCR). El gen quimrico CBF-MYH11 puede detectarse por medio de la tcnica de trascripcin reversa acoplada a la reaccin en cadena de la polimerasa.16 La transcriptasa reversa seguida de la reaccin de la polimerasa (RT-PCR) consiste en sintetizar DNA complementario (cDNA) a partir del RNA total extrado de leucocitos, obtenidos de sangre perifrica o aspiracin medular, es importante partir del RNA celular, ya que de esa manera se obtiene un cDNA libre de intrones utilizando una transcriptasa reversa, lo que permite la obtencin de fragmentos de menor tamao al amplificar y una mayor especificidad del oligonucleotido por su sitio de homologa.27 Algunas de las ventajas de usar RT-PCR son:14 a) Alta sensibilidad (1 en 104 clulas). b) Gran especificidad. c) Utilidad en el seguimiento del paciente por la deteccin de la enfermedad mnima residual.

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d) Permite diferenciar los cuatro tipos de gen quimricos segn su punto de fractura. Adems los resultados se obtienen ms rpido y con un menor porcentaje de error que con otros mtodos. CLONACIN MOLECULAR El rpido surgimiento de la biologa molecular, y sus avances durante los ltimos 30 aos, ha propiciado el desarrollo de muchas tcnicas nuevas para analizar la funcin del genoma, y tratar de entender los mecanismos de regulacin de la expresin gentica que existen en los organismos procariontes y eucariontes.27 As estas nuevas tcnicas han permitido separar regiones determinadas del DNA, obtener cantidades ilimitadas de esos fragmentos y determinar incluso la secuencia de esos nucletidos, estos adelantos tcnicos forman parte de la tecnologa del DNA recombinante, constituida por una mezcla de tcnicas, algunas de las cuales son nuevas, pero otras son adaptaciones de procesos naturales de la gentica microbiana.28 Definicin. Clonacin molecular es la manipulacin dirigida del material gentico por recombinacin del DNA in vitro, y su multiplicacin dentro de una clula hospedera donde se sintetizan copias idnticas.29 Con las tcnicas de clonacin se puede cortar el DNA, aislar un solo fragmento incluyendo uno o varios genes y multiplicarlo en una clula bacteriana.27 La finalidad de la clonacin molecular es aislar gran cantidad de genes especficos, en forma pura.28

Fuentes de DNA29

Por lo general se utilizan cuatro mtodos para la obtencin de DNA. a) La digestin por enzimas de restriccin: Es el ms utilizado por su simplicidad y su capacidad de producir poblaciones de fragmentos con tamaos homogneos que pueden separarse por electroforesis. b) El rompimiento mecnico del DNA: Es particularmente til para la generacin de fragmentos heterogneos con secuencias azarosas en sus extremos, de longitud variable. Los fragmentos largos de ms de 10000 pb pueden obtenerse de esta forma. c) La sntesis enzimtica del DNA: Puede llevarse en dos formas: mediante el copiado enzimtico de una molcula de RNAm para producir una copia del DNA complementario (DNAc), o mediante la PCR. d) La sntesis qumica del DNA: Permite la construccin de oligonucletidos de cadena sencilla con una secuencia de bases definida que no necesariamente existen en la naturaleza. Este mtodo es importantsimo para varios aspectos de la investigacin de biologa molecular, ya que se demostr que genes sintticos son funcionales in vivo y son moldes apropiados para la sntesis de protenas. 11

 Enzimas de restriccin La capacidad para clonar cualquier gen o secuencia de DNA de inters, depende en gran medida, de un tipo especial de enzimas denominadas enzimas de restriccin o endonucleasas de restriccin que fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans.28 Estas son enzimas sumamente especficas que catalizan la hidrlisis de los enlaces fosfodister de los cidos nuclicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares especficos, creando de esta manera una serie de fragmentos. La funcin de las enzimas de restriccin es la de proteger al organismo de DNA extrao. Cuando una porcin de DNA forneo ingresa a la clula, las enzimas de restriccin se encargan de degradarlo cortndolo en pequeos fragmentos, siempre y cuando ste no est modificado.30 Actualmente se conocen unas 200 enzimas de restriccin, las cuales se nombran de acuerdo al organismo del cual se extraen, como por ejemplo EcoRI y EcoRII, que se extraen de Escherichia coli o HaeIII que se extrae de Haemophilus aegyptius. Las enzimas de restriccin trabajan nicamente sobre secuencias especficas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restriccin y producen dos tipos de corte: (1) corte con extremos cohesivos y (2) corte con extremos romos. Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeas secuencias de bases sin aparear en cada lado, siendo stas complementarias entre s, mientras que los extremos romos son aquellos en los que no queda una porcin lineal en ninguno de los lados. De acuerdo a la especificidad de las enzimas de restriccin, se conocen tres tipos:30 a) Las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restriccin, a una distancia que vara aleatoriamente entre 100 y 1000 nucletidos del sitio de reconocimiento, y por ello no se suelen emplear para DNA recombinante.27 b) Las enzimas de tipo II reconocen y cortan en la secuencia especfica, y son las ms empleadas en este tipo de protocolos por su alta precisin. Estas enzimas reconocen secuencias palindrmicas en el DNA.27, 29 c) Las enzimas de tipo III son similares a las de tipo II en cuanto a la precisin del lugar de corte, pero se diferencian de stas en que slo cortan entre nucletidos del mismo tipo, por ejemplo entre dos adeninas.30 Vectores de clonacin Un vector es una molcula de ADN que acarrear al fragmento de inters y permitir su amplificacin. Los vectores de clonacin ms utilizados derivan del genoma viral o de plsmidos bacterianos.

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Un vector de clonacin tiene tres componentes esenciales, un origen de replicacin, un gen marcador fcilmente seleccionable y al menos un sitio nico de restriccin. (Figura 28 3): Los vectores de clonacin de ltima generacin son muy prcticos y sencillos de manejar. Incluyen un sitio mltiple de clonacin o sitio de restriccin mltiple (polylinker), que es un segmento corto de DNA con muchos sitios de restriccin diferentes, cada uno de ellos nico para el vector. Este sitio suele formar parte del marco de lectura abierto (ORF) de un gen responsable de alguna caracterstica fenotpica, por lo que resulta sencillo confirmar si tras la restriccin y ligado se ha insertado efectivamente un fragmento de DNA, ya que la inclusin de este interrumpe la secuencia del vector, lo cual redunda en la prdida de funcionalidad del gen mediante inactivacin por insercin.28 Actualmente, se usan diferentes tipos de vectores para la produccin de DNA recombinante, los principales son los plsmidos, los bacterifagos, los csmidos, vectores transbordadores, cromosomas artificiales, entre otros.30

Fig. 4 Componentes bsicos de un vector

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 Sistemas de clonacin en procariontes Plsmidos Son molculas de DNA bicatenario de carcter extracromosmico y tienen la capacidad de replicarse autnomamente, adems de transportar los genes de inters para el investigador, los plsmidos transportan otros genes que le confieren propiedades importantes al hospedador, como es la resistencia a ciertos antibiticos.30, 32 Puc18 y pUC19 Son pequeos plsmidos, idnticos excepto que contienen los sitios mltiples de clonacin (MCS) dispuestos en orientaciones opuestas, estos plsmidos (pUC18/19) contienen todas las caractersticas de un plsmido (Fig. 4). Los plsmidos de tipo pUC contienen un segmento derivado del opern lactosa de E. coli, este segmento codifica el represor, el promotor, el operador y los primeros 146 aminocidos del gen lacZ (el pptido alfa). La sntesis de -galactosidasa por este fragmento puede ser inducido por la IPTG (isopropil-b-D-tiogalactsido).34

Fig.4 Vector Puc 19

Sistemas de clonacin en eucariontes Levaduras Es quizs el sistema de clonacin ms sencillo, crece en grandes cantidades y puede modificar protenas por glucosilacin. Tienen un genoma pequeo y presentan un elemento multicopia extracromosmico llamado DNA2~m, anlogo al plsmido bacteriano que puede usarse como vector de clonacin. En levaduras se han utilizado dos tipos de marcadores de seleccin los de complementacin gentica, como LEU2, URA3 y los de resistencia a antibiticos como neomicina y cloramfenicol.27

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 Escherichia coli como clula hospedera El primer hospedero empleado para clonacin de DNA y el ms usado en la actualidad es E. coli. Esta bacteria, es posiblemente la mejor conocida por los cientficos y se tiene gran cantidad de informacin sobre su genoma y sus caractersticas fisiolgicas. La cepa K12 de E. coli constituye un hospedero bastante bueno, para cumplir las condiciones anteriormente mencionadas. Sin embargo, E. coli en su forma nativa produce una retencin de protenas en el periplasma, haciendo difcil su aislamiento. Otra ventaja de E. coli es que puede aceptar una amplia gama de vectores, como los plsmidos, los bacterifagos y los csmidos, entre otros. Adems se ha usado para la produccin de muchas sustancias de inters mdico, como protenas y vitaminas, mediante la insercin de los genes que las codifican. Un ejemplo de esto, es la produccin de grandes cantidades de insulina en cultivos de E. coli transgnica, cuyos productos estn destinados a los enfermos de diabetes.30 Si bien E. coli es un buen hospedero para muchos propsitos de ingeniera gentica y DNA recombinante, tiene la desventaja de carecer de ncleo y otros organelos, y al ser un organismo procaritico, es posible que no exprese correctamente protenas introducidas de origen eucaritico, por ello se ha visto la alternativa de emplear hospederos eucariticos.30

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MATERIALES Y METODOS

Retrotranscripcin: en esta reaccin se utiliz un volumen de 20 L para 1 ng de RNA 1-500 ng de mRNA, en un tubo Eppendorf libre de nucleasas se le aadi: oligo (dT) (500L/ml) o 50-250 ng de random primers o 1L de dos primers especficos de genes (GSP), 1 ng a 5 g de RNA total o 1-500 ng de mRNA, 1 L dNTP mezclado (por cada 10 nM) y 12 L de agua destilada, enseguida se calent la mezcla a 65C por 5 minutos y rpidamente se enfri en hielo. Se colect el contenido del tubo por centrifugacin breve y agreg: 4L de 5X RT- buffer, 2L de DTT a 0.1M, 1 L de RNasa Out (40 unidades/L). Posteriormente se mezcl el contenido con cuidado, se agreg 1 L (200 unidades) de Superscript RT II y mezcl por pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Si se usa menos de 1 ng de RNA se reduce la cantidad de Superscript RT a 0.25 L (50 unidades), agregar agua destilada y esterilizada a 20L como volumen final con una concentracin final de 1X enseguida incubar a 42C por 50 minutos y finalmente inactivar la reaccin por calentamiento a 70C por 10 minutos.36 (ANEXO 1) Amplificacin del cDNA de la Inv (16): la amplificacin se llev a cabo en el termociclador (Master epgradient eppendorf ) por medio de la tcnica de PCR (ANEXO 4)37, la mezcla de reaccin contuvo 5 l de 10XPCR Buffer, 10 l de cDNA, 5 l de 4mM iniciadores correspondientes (ANEXO 2)37, 0.2 l de Taq DNA polimerasa y agua Mili-Q estril con un volumen final de 50L con una concentracin de 1X. Para llevar a cabo la PCR en el termociclador se utiliz un pre-ciclo de 1 min a 95C, 40 ciclos de (15 seg a 94C, 20 seg a 66C, 20 seg a 72C) y un post-ciclo de 2 min a 72C. Despus de esto se realiz una electroforesis en agarosa al 2.5%. ver (ANEXO 3)39.Posterior a ello se tiene que purificar el producto de PCR (ANEXO 4). Digestin y desfoforilacin: se emple la enzima SmaI, que corta en el sitio de clonacin mltiple del pUC19, y que reconoce la secuencia de 5CCCGGG3', 3'GGGCCC5, ocasionando un corte de extremos romos, se realiz a una temperatura de 30C durante 2 horas (ANEXO 5). Posterior a ello se realiz la desfosforilacin, esto para eliminar los grupos fosfatos de los extremos 5`, utilizando la enzima fosfatasa alcalina intestinal bovina. Esto se llev a cabo a una temperatura de 37C durante 1 hora en un termociclador (Thermomixer R Eppendorf) (ANEXO 6), se purific en columna QIAGEN (ANEXO 7). Se cuantific en un Biofotmetro (Ultroespec 2100 pro). Ligacin del producto de PCR: la ligacin del producto de PCR de la Inv 16 con pUC19 desfosforilado y cuantificado se llev a cabo utilizando la enzima T4 DNA ligasa (Invitrogen), donde se incubo a una temperatura de 14C de 16-24hrs. (ANEXO 8). Transformacin: una vez obtenido el plsmido con DNA recombinante se transform E. coli DH5 y TOP-10, en un tubo Eppendorf de 1.7 ml se colocaron 200l de clulas competentes (ANEXO 9), ms 50 a 100 ng de pUC19 recombinante, En otro tubo Eppendorf de 1.7 ml se coloc 200l de clulas competentes (control negativo) e incub ambos tubos en hielo durante 30 min , se di un choque trmico por 5 minutos a 43C, y choque fri en hielo por 5 min, adicionando 900 l de caldo 2xyt LB, se 16

expres incubando en un bao metablico de 1 a 2 hrs a 37C con agitacin leve(ANEXO 10). Seleccin de clonas: Una vez transformadas la clulas se plaquearon de la siguiente manera: 100L de clulas competentes en una placa de 2xyt sin antibitico ms X-Gal (40 mg/L), 100L de clulas competentes en una placa de 2xyt LB con ampicilina (200 mg/L) mas X-Gal, 200L de clulas competentes ms ligacin en una placa de 2xyt con ampicilina mas X-Gal, 100L de clulas competentes ms plsmido sin inserto en una placa con ampicilina, esto se hizo mediante un dispersador haciendo rotaciones de la placa, aproximadamente 100 veces, una vez hecho esto las placas se incubaron a 37C durante 24 hrs. (ANEXO 11). Extraccin del DNA plsmidico: para la extraccin del DNA plasmdico se inocul 2 ml de medio (LB 2xyt) conteniendo un antibitico apropiado (ampicilina) con una colonia de la bacteria transformada. (ANEXO 12). Comparacin del DNA plasmdico: Una vez obtenido el DNA plsmidico a ste se le realiz una segunda PCR para amplificar el inserto de la Inv-16, y esto se tuvo que comparar con un control positivo y un control negativo, realizando la electroforesis en gel de agarosa al 1% y 2.5%, confirmndolo mediante la secuenciacin del inserto clonado.

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RESULTADOS Y DISCUSIN El producto de PCR fue obtenido mediante la utilizacin de la tcnica de RT-PCR utilizando los oligonucletidos MYa y CBF5 que son especficos para la amplificacin del gen quimrico 5-CBFb/MYH11-3 Los iniciadores se emplean de la siguiente manera: mRNA blanco AB B,C,D CBF ( control interno) Oligo 1 MYa 3CBF 5` Oligo 2 CBF 5` 4CBF 3

123 pb

Figura 5. Gel de agarosa al 2.5 % del producto de PCR de la Inv 16 en, Carril 1: Mp 123 pb, carril 2: Deteccin de arreglo B, C y D, carril 3: Deteccin de arreglo tipo A y B, carril 4: Control positivo para arreglo tipo A, carril 5: control interno CBF.

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Figura 6. Vector de clonacin (pUC19) en un gel de agarosa al 1%, Carril 1: Mp fago, carril 2: plsmido cortado con la enzima Sma I (lineal), carril 3: plasmido sin digerir (circular).

El gen quimrico 5-CBFb/MYH11-3 fue ligado al plsmido pUC-19 (el cual se desfosforil previamente con la enzima fosfatasa alcalina intestinal bovina) a este se le denomino pUC19-CBFb/MYH11. Posteriormente fue transformada la cepa de Escherichia coli Top 10 F.

Figura 7. Plsmido recombinante pUC19-CBFb/MYH11 realizado en el programa Vector NTI v. 10. Utilizando la secuencia del gen quimrico CBFb/MYH11 de la base de datos de GenBank (color verde).

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La cepa transformada se cultiv en medio 2xyt con ampicilina y x-gal a una concentracin de 200 mg/mL y 40 mg/mL respectivamente.

Panel A

Panel B

Figura 8. Panel A: Colonias con inserto (color blanco) y sin inserto (color azul). Panel B: resiembra de colonias blancas seleccionadas para comprobar que contenan el inserto.

A las colonias seleccionadas se les extrajo el plsmido recombinante mediante una lisis alcalina, mediante una PCR con los oligonucletidos especficos que detectan al gen quimrico, obtenindose as un producto de PCR de 227 pb de pUC19-CBFb/MYH11.

Figura 9. Productos de PCR del DNA plasmdico en un gel de agarosa al 1%. Carril 1: Marcador de peso molecular de 1Kb. Carriles 2-8: en la parte superior se observa el plsmido recombinante con un tamao de 2913 pb, en la parte inferior el producto de 227 pb que corresponde a la Inv 16.

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Con el fin de comprobar que el inserto estaba presente se le realiz una restriccin a pUC19 y al plsmido recombinante (pUC19-CBFb/MYH11) con la enzima EcoRI, obteniendo as un pUC19 lineal con un tamao de 2686 pb y un plsmido recombinante con un tamao de 2913 pb.

Marcador DNA digerido con Hind III

Plsmido recombinante 2913 pb

Plsmido 2683 pb

4000 pb 3000 pb 2000 pb

Figura 10. Digestin del plsmido recombinante (pUC19-CBFb/MYH11) y no recombinante en un gel de agarosa al 1%. Carril 1: Marcador de peso molecular, Carriles 3 y 4: plsmido recombinante, Carril 5 y 6 se muestra al plsmido sin el inserto

As mismo se realiz en el secuenciador (ABI PRISM 310 GENETIC ANALYZER) la secuenciacin del producto de PCR a partir del plsmido recombinante obteniendo as un producto de 227 pares de bases. CTGGATGGTATGGGCTGTCTGGAGTTTGATGATGAGCGACCCACAGGAGGAGCTTTAGCACCACA GGCCTTTGAAGAGGCTCGCGAGAAGGACACGCGAATTTGAAGACACAGACAGGTCTCATCGGGAG GAAATGGAGGTCCGAGAGTTTCACAGCTGCTGGTCCATGAGCTGGAGAAGTCCAAGCGGGCCCTG GAGACCCAGATGGAGGAGATGAAGACGCAGCT Posterior a ello se realiz un Blast para comprobar si la secuencia obtenida correspondi a la secuencia que se encuentra en la base de datos Genbank. La siguiente tabla muestra el porcentaje de similitud.

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Tabla 2. Max score: muestra el nmero de alineamientos de nuestra secuencia. Total Store: muestra el nmero de alineamientos de nuestra secuencia. E value: ndice de error. Max ident: demuestra la identidad de nuestra secuencia con las dems o con las que se encuentran en la base de datos Genbank con un parecido del 100%. Links: se refiere a otras referencias las cuales se pueden consultar.

La secuencia obtenida se analiz en el programa VecScreen para corroborar si la secuencia no presentaba contaminacin o contena restos del plsmido y el resultado que se obtuvo de este anlisis es que dicha secuencia no presento contaminacin. Tabla 3.

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Por otro lado al comparar la secuencia obtenida por el secuenciador y aquella que se encuentra en la base de datos se obtuvo una homologia de mas del 95% esto se realiz en el programa CLUSTAL W (1.83). Tabla 4.

Se llevaron a cabo una serie de diluciones del DNA plsmidico para determinar la sensibilidad de PCR que amplific el gen quimrico 5-CBFb/MYH11-3. Estas diluciones fueron de 10 g, 5 g, 1g, 1ng, 1pg y 1fg de DNA plsmidico recombinante. Donde se obtuvo la amplificacin en 10 g a 1 pg.

Figura 11. Serie de concentraciones del producto de PCR de la Inv 16 en un gel de agarosa al 2.5%. Carril 1: marcador de peso molecular de 123 pb, carril 2: producto de PCR de la dilucin de 10 g, carril 3: 5 g, carril 4: 1g, carril 5: 1ng, carril 6: 1pg, carril 7: 1 fg.

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CONCLUSIN

Se clon un control positivo para PCR de la inv-16, que forma un transcrito quimrico denominado, CBFb/MYH11 esto se hizo utilizando la cepa de Escherichia coli Top 10 F. La clonacin del control positivo para PCR de la inversin 16 ser utilizado para el diagnstico de leucemia aguda mieloide y permitir al Laboratorio de Biomedicina Molecular disponer del DNA para ser utilizado como control positivo y as se brindar calidad en el diagnstico de la leucemia aguda mieloblstica, tipo Inv 16 o M4Eo. La tcnica de PCR para la deteccin del gen quimrico es sensible y altamente especifica, ya que se obtuvo una amplificacion de este mismo hasta una concentracin de 1 pg de DNA. Se secuenci el producto de PCR de la Inv 16 y se comprob que la secuencia se encuentra en la base de datos GenBank.

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REFERENCIAS

1. Montesinos J J, Mayani H. Nuevos Conceptos en la Biologa de la Leucemia Mieloide Aguda. Gac Md Mx 2002; 138: (1).67-75. 2. Registro Histopatolgico de neoplasias en Mxico. Direccin General de Epidemiologa, Secretaria de salud. 1998. 3. Lwenberg B M D, Downing James R M D, Buurnett A M D, Acute Mieloid Leukemia, N Engl J. Med 1999; 341: (14).1051-1062. 4. Gariglio P, Rangel L M, Garcia. II. Biologa Molecular de la Leucemia Aguda Mieloblstica (LAM). Gac Md Mx 2001; 137: (1).33-36 5. Sala M L, Blanco B, Prez M, Hematologa Clnica, Mxico: Farmacia Hospitalaria, 2002; (3).1031-1076. 6. Bonet-Monforte J A, Martnez Climent I, Marugan de la Concha. Leucemias Agudas Mieloblsticas. Medicine; Valencia 2001; 8: (54) 2881-2889. 7. Labardini-Martnez J R, Leucemia Aguda Mieloblstica. De la Biologa Molecular al Tratamiento, Gac Md Mx. 2001; 137: (1)31-32. 8. Ruiz-Argelles J G, San Miguel J. Actualizacin de Leucemias. 1a Ed. Mxico DF. Mdica Americana, 1996; 31-46. 9. Handin R I, Stossel T P, Lux S E. Acute Myelogenous Leukaemia. Blood, Principles and Practice of Hematology. J. B. Lippincott Company: U.S.A. 2002. 10. Velzquez-Gonzlez A, cruz A, Cerezo R M. III. Alteraciones Citogenticas en Leucemia Aguda Mieloblstica. Significado Clnico. Gac Md Mx. 2001; 137 (1).37-42. 11. Mckenna W R. Multifaceted Approach to the Diagnosis and Classification of Acute Leukemias. Clinical Chemistry 2000; 46: (8). 1252 -1259. 12. Poirel H, Radford-Weiss I, Rack K, Troussard X, Veil A, Valensi F, et al. Detection of the Chromosome 16 CBF beta-MYH11 Fusion Transcript in Myelomonocytic Leukemias. Blood, 1995; 85: (5). 1313-22. 13. Marlton P, Claxton D F, Liu P, Estey EH, Beran M, LeBeau M, Testa JR, Collins F S, Rowley J D, Siciliano M J. Molecular Characterization of 16p Deletions Associated with Inversion 16 Defines the Critical Fusion for Leukemogenesis. Blood, 1995; 85: (3):772-9. 14. Claxton D F, Liu P, Hsu H B, Marlton P, Hester J, Collins F, Deisseroth A B, Rowley J D, Siciliano M J. Detection of Fusion Transcripts Generated by the 25

Inversion 16 Chromosome in Acute Myelogenous Leukemia. Blood, 1994; 83:(7) 1750-6. 15. Wessels J W, Mollevanger P, Dauwerse J G, Cluitmans F H, Breuning M H, Beverstock G C. Two Distinct Loci on the Short Arm of Chromosome 16 are Involved in Myeloid Leukemia. Blood. 1991; 77:(7) 1555-9. 16. Merchant S H, Haines S, Hall B, Hozier J, Viswanatha D S. Fluorescence in Situ Hybridization Identifies Cryptic t(16;16)(p13;q22) Masked by del(16)(q22) in a Case of AML-M4 Eo. J Mol Diagn. 2004; 6: 3) 271-4. 17. Van der Reijden B A, Lombardo M, Dauwerse H G, Giles R H, Muhlematter D, Bellomo M J, et al. RT-PCR Diagnosis of Patients with Acute Nonlymphocytic Leukemia and inv (16)(p13q22) and Identification of New Alternative Splicing in CBFB-MYH11 transcripts. Blood. 1995 Jul 1;86 (1):27782. 18. Buonamici S, Ottaviani E, Testoni N, Montefusco V, Visani G, Bonifazi F,et al. Real-time Quantitatin of Minimal Residual Disease in inv (16)-positive Acute Myeloid Leukemia may indicate Risk for Clinical Relapse and may Identify Patients in a Curable State. Blood. 2002; 99: (2) 443-9. 19. Informacin en formato disponible en: http://www.meds.com/leukemia/facts/facts_m4.html 20. Durst KL, Lutterbach B, Kummalue T, Friedman A D, Hiebert S W. The inv(16) Fusion Protein Associates with Corepressors via a Smooth Muscle Myosin Heavy-chain Domain. Mol Cell Biol. 2003; 23:(2): 607-19. 21. Brown M, Wittwer C. Flow Cytometry: Principles and Clinical Applications in Hematology. Clinical Chemistry 2000; 46: (8): 1221 -1229. 22. Abbas A K, Lichtman H A. Inmunologa Celular y Molecular. 5 Edicin. Madrid, Espaa: Saunders Elsevier, 2004: 525-528. 23. Goldsby R A, Kindt Thomas J, Kuby J. Inmunologa. 5a Edicin. Mxico DF: Ed Mc Graw Hill Interamericana, 2004; 167-168. 24. Kern W, Voskova D, Schoch C, Schnittger S, Hiddemann W, Haferlach T. Prognostic Impact of Early Response to Induction Therapy as Assessed by Multiparameter flow Cytometry in Acute Myeloid Leukemia. Haematolgica. 2004; 89:(5) 528-40. 25. Calasanz M J. Revisin de Tcnicas de Citogentica Convencional y Molecular y su Implicacin en el Diagnstico y Pronstico del Cncer. San Navarra 2001; 24. 17-29.

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26. Dvila-Rodrguez M I. La Citogentica Molecular y su Aplicacin en las Leucemias. 2004; 5: (1). 27. Sosa-Macias M. Las Nuevas Tcnicas de la Biologa Molecular Aplicadas en la Medicina Geonmica. 2004;5:(1) 28. Gmez M, Echenique V. Herramientas Bsicas de Ingeniera Gentica. Mxico: 43-60. 29. Balbas P. De la Biologa Molecular a la Biotecnologa. 1 Ed. Mxico DF: Edt Trillas, 2002; 9:180-223. 30. Fontrbel R F. La Tecnologa de DNA Recombinante: Principios y Aplicaciones. Bolivia. 2005; 11:1 - 13. 31. Informacin en formato disponible en: http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/plasmidos.html 32. Pierre-Herveg J, Barcia-Macay M. Biologa Molecular: Los Plsmidos. Cochabamba, Bolivia 2004. 33. Informacin en formato disponible en: http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.blc.arizona.edu/INTERA CTIVE/recombinant3.dna/puc19.gif&imgrefurl=http://www.blc.arizona.edu/INTER ACTIVE/recombinant3.dna/Plasmids.html&h=185&w=332&sz=4&tbnid=xqEKZrns mN7u9M:&tbnh=64&tbnw=115&hl=es&start=8&prev=/images%3Fq%3DpUC19% 26svnum%3D10%26hl%3Des%26lr%3D 34. Ausubel F M, Smith J A, Strohl Kevin. Current Protocols in Molecular Biology. 2a Edicion. USA: John Wiley Sons, 2000; 1.5.5-1.56. 35. Rolfs A, Schuller I, Finckh U, Weber-Rolfs I. PCR: Clinical Diagnostics and Research. Berlin: Springer Laboratory. 1992; 1-12 36. Sambroook JEF, Fritsch and Maniatis T. Molecular Cloning. 2a edition. Cold Springer. Spring Harbour Laboratory press. 1989. 37. Claxton, Liu, Hsu. Detection of Fusion Transcripts Generated by the Inversion 16 Chromosome in Acute Myelogenous Leukemia. Blood 83, 1994:1750-1756. 38. Informacin en formato disponible en: http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/arts/EspinosaAsua r_2005.pdf 39. Salgado-Jimnez B, Figueroa-Adn M A. Frecuencia de Polimorfismo C677T del Gene Metilenotetrahidrofolato Reductasa e Infeccin por el Virus del Papiloma Humano en Mujeres Indgenas del Estado de Guerrero.

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Chilpancingo Mxico: Universidad Autnoma de Guerrero; 2004, 56p. Tesis para Obtener el Grado de Licenciatura. 40. Jimnez-Cardoso E. Biologa Molecular en el Diagnostico Clnico. Ed. Mc Graw-Hill Interamericana, Ed. 1ra; Mxico D F, 1998:61-67.

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ANEXOS ANEXO 1 PURIFICACIN DE LOS LEUCOCITOS35 Los eritrocitos no contienen cidos nucleicos, adems, la hemoglobina es un inhibidor de la DNA Taq polimerasa. Para la extraccin de los cidos nucleicos de sangre perifrica o de medula sea es conveniente eliminar primero los glbulos rojos por una lisis osmtica selectiva. Reactivos: Solucin RBL Muestra. Las muestras (sangre o medula sea anticoagulada) no deben de tener mas de 48 horas de haberse tomado y deben haber sido almacenadas entre 2-8 C durante ese lapso. Es conveniente preparar inmediatamente la muestra. Muestras que no cumplan con estas condiciones deben ser rechazadas. Mtodo Transferir 1 ml de sangre con anticoagulante EDTA o 250 l de medula sea anticoagulada a un tubo de 14 ml, el volumen se debe ajustar visualmente en muestras hipercelulares (leucemias) Agregar 4 ml de RBL Incubar sobre hielo durante 15 min y mezclar cada 5 min y centrifugar a 2000 rpm durante 10 min Resuspender el botn celular en 2 ml de RBL Transferir la suspensin a un tubo de 2 ml Centrifugar a 1300 rpm durante 5 min y eliminar el sobrenadante incluyendo el borde de eritrocitos no lisados. Resuspender el botn celular en 60l de PBS-A Agregarle rpidamente 600 l de 4M GTC Mezclar vigorosamente para reducir la viscosidad. Seguir con la extraccin del RNA Criterios de aceptacin La lisis de los eritrocitos debe ser completa a excepcin de un pequeo anillo de eritrocitos resistentes. En caso de no ocurrir una lisis satisfactoria se puede repetir el procedimiento con una nueva solucin de RBL.

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ANEXO 2 EXTRACCIN DE RNA35 El RNA es una molcula lbil conforme a su funcin fisiolgica. La hidrlisis a pH alcalino o por la accin de RNAsas no quieren como otras nucleasas de iones bivalentes para su actividad y por su termoestabilidad, no hay manera simple para inactivarlas si no por una desnaturalizacin rpida y eficiente por medio de la accin de sales caotrpicos como el GTC (Tiocianato de guanidina) a altas concentraciones en presencia de agentes reductores como el 2-ME y de detergentes. Para la obtencin y manipulacin del RNA se tienen que tener en cuenta las siguientes precauciones adicionales: a) Manipulacin con guantes, ya que las manos son una fuente muy importante de contaminacin por RNAsas, b) El material de vidrio se calentaba a 200C al menos 4 horas, c) El material de plstico se utilizaba de origen estril, d) Los reactivos se pesan directamente sobre un recipiente libre de RNAsas o sobre papel de aluminio que no hubiera estado antes en contacto con ninguna posible fuente de contaminacin, e) Para la electroforesis de RNA, se utiliza material reservado para esta finalidad, Para la purificacin de RNA a partir de muestras celulares o de plasmas o suero se neutraliza la muestra rpidamente en una solucin de 4M GTM. Por medio de extracciones con solventes orgnicos a pH cido se separan las protenas y el DNA (fase orgnica) del RNA (fase acuosa). Este ultimo luego se precipita con etanol y se disuelve en agua DEPC (dietilpirocarbonato). Reactivos: Tiocianato de guanidina (GTC) 4M PBS-A DEPC (dietilpirocarbonato) 2 M NaAc pH 4.0 Fenol acido Cloroformo y etanol absoluto. Instrumental: Centrfuga de alta velocidad con tubos y adaptadores. Tubos Falcon Mtodos a) lisis en plasma o en suero Centrifugar la sangre con o sin anticoagulante durante 5 min. a 4000 rpm Pasar 150 l de plasma o suero a un tubo nuevo Agregar 500l de 4M GTC Mezclar bien Agregar 2l de 10mg/ml tRNA de levadura como acarreador b) extraccin de RNA Agregar al lisado 60 l de 2M NaAc pH 4.0 y mezclar bien Agregar 500 l de fenol cido y mezclar bien Agregar 120l de cloroformo y mezclar bien Incubar durante 15 min. a 4C Centrifugar a 12500 rpm durante 5 min.

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Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo Extraer con 600 l de fenol/cloroformo Transferir a un tubo nuevo Agregar 1 ml de etanol y mezclar bien Incubar 2 horas como mnimo a -20C o hasta que baya a ser utilizado Centrifugar a 12500 rpm durante 15 min. Eliminar el sobrenadante Lavar el precipitado con 1 ml de etanol helado al 75% Secar el precipitado al aire tapado con un kleenex durante 15 min. Disolver el precipitado en 50 l o ms en agua de DEPC Almacenar el RNA hasta su uso a una temperatura de -20C

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ANEXO 3 CONVERSION DE RNA TOTAL EN cDNA PARA PERMITIR SU SUBSECUENTE AMPLIFICACIN POR PCR La transcriptasa inversa es una enzima proveniente de retrovirus en cuyo ciclo de replicacin se debe convertir el RNA genmico en DNA de doble cadena para luego ser insertado en el genoma de las clulas hospedera. Para la obtencin de DNA de cadena simple, la transcriptasa inversa se realiza por lo tanto en dos pasos: 1.- Hibridacin de los iniciadores al RNA molde 2.- Sntesis de cDNA Los iniciadores son oligos especficos REACTIVOS 5XRT-Buffer Que se compone de: 335 mM Tris-HCl pH 8.3 300 mM KCl 20 mM MgCl2 Preparar com soluciones y material libre de RNasas. Guardar en alcuotas de 200 l a -20C Caducidad 1 ao 1XDEN (RANDOM) Se compone de: 10 mM Hepes/KOH pH 6.9 300 mM KCl 0.2 mM EDTA 12.5 mM pd(N)6 Guardar en alcuotas de 200 l a -20C Caducidad 1 ao Mtodo: 1. Preparar la mezcla de reaccion sobre hielo(por reaccion) 8 l 5xRT-Buffer 4 l 0.1 M DTT 4 l 10 mM dNTPs (A,G,C,T) 1 l Inhibidor de RNasas (1U/l final) 0.5 l Superscript II RT (2.5U/l final) 30.5 l Agua-DEPC 2. Mantener la mezcla sobre hielo hasta su uso 3. Preparar el numero adecuado de tubos de 200 l 4. Agregar a cada uno 8 l de 1xDEN (random) 5. Colocarlos sobre hielo 6. Iniciar en el termociclador en programa marcado DEN: hold 65C 7. Agregar a los tubos 2 l de RNA adecuado 8. Mezclar bien 9. Incubar los tubos durante 2 min a 65C 32

10. Colocarlos inmediatamente en hielo 11. Agregar a cada tubo 30 l de mezcla de reaccion y mezclar con la pipeta 12. Introducir los tubos al termociclador e iniciar el programa marcado RT: 1 ciclo: 90 min a 40C 1 min a 95C 10 min a 4C 13. Las pruebas estn listas para la amplificacin. Proceder directamente a la amplificacin o en su defecto guardarlas a -20C hasta su uso.

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ANEXO 4 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA Es una tcnica para amplificar de modo exponencial el nmero de copias de un fragmento de DNA. Para lograr esta amplificacin, se requiere conocer la secuencia del fragmento que se quiere amplificar. El fragmento de DNA blanco de este proceso puedes ser DNA genmico, plasmdico o en una muestra de sangre, esputo, etc... Para fines de diagnostico. Iniciadores (pramers) para la pcr37 MYa 5 AGC TGC GTC TTC ATC TCC TC 3 35 GTC TGT GTT ATC TGG AAA GTC TG 3 45 CGT ACT GCT GGG TGA GGT TCT 3 CBF 5 5 CTG GAT GGT ATG GGC TGT CT 3 CBF3 5 TAG GGT CTT GTT GTC TTC TTG C3 Los iniciadores se emplean de la siguiente manera: mRNA blanco AB B,C,D CBF ( control interno) Oligo 1 MYa 3CBF 5` Oligo 2 CBF 5` 4CBF 3

PROCEDIMIENTO: 1. purificacin de leucocitos 2. extraccin de RNA total 3. realizar la trascripcin inversa 4. para realizar la PCR realizar la siguiente mezcla (por amplificacin): 5l 10X RT-PCR 5l 5 M iniciadores 0.2 l Taq DNA polimerasa (1U) 41 l agua mili-Q estril 5. preparar un numero adecuado de micro tubos 1 tubo muestra del paciente (Mya/ CBF5) 1 tubo control interno 1 tubo control positivo 1 tubo control negativo 6. distribuir a cada tubo 40 l de la mezcla de reaccion 7. colocarlos sobre hielo 8. agregar 10 l de las reacciones de RT correspondientes y mezclar con la pipeta 9. colocar los tubos en el termociclador 10. iniciar el programa marcado INV16: pre-ciclo: 1 min a 95C 40 ciclos: 15 seg. a 94C 20 seg. a 66C 20 seg. a 72C Post-ciclo: 2 min a 72C 34

11. las muestras estn listas para la deteccin y se pueden guardar pasando la noche a 4C o por perodos prolongados a -20C. 12. la deteccin se realiza por corrimiento en geles de 2.5% agarosa y tincin con bromuro de etidio. Los productos de amplificacin especficos tienen un peso molcular de: mRNA A B C D MYa/CBF5 227 pb 620 pb 3-/4241pb 568pb 775pb

Secuencias del amplicn A obtenido con MYa/CBF5` CTGGATGGTATGGGCTGTCTGGAGTTTGATGAGGAGCGAGCCCAGCAGGAGGATGCATTAGCACA ACAGGCCTTTGAAGAGGCTCGGAGAAGGACACGCGAATTTGAAGATAGAGACAGGTCTCATCGGG AGGAAATGGAGGTGAGAGTTTCACAGCTGCTGGTCCATGAGCTGGAGAAGTCCAAGCGGGCCCTG GAGACCCAGATGGAGGAGATGAAGACGCAGCT Secuencias del amplicn B obtenido con MYa/ CBF5` CTGGATGGTATGGGCTGTCTGGAGTTTGATGAGGAGCGAGCCCAGCAGGAGGATGCATTAGCACA ACAGGCCTTTGAAGAGGCTCGGAGAAGGACACGCGAATTTGAAGATAGAGACAGGTCTCATCGGG AGGAAATGGAGGTGAGAGAAACACAGCTGCTGAGGTTCCAGAAGGAGATCGAGAACCTCACCCAG CAGTACGAGGAGAAGGCGGCCGCTTATGATAAACTGGAAAAGACCAAGAACAGGCTTCAGCAGGA GCTGGACGACCTGGTTGTTGATTTGGACAACCAGCGGCAACTCGTGTCCAACCTGGAAAAGAAGC AGAGGAAATTTGATCAGTTGTTAGCCGAGGAGAAAAACATCTCTTCCAAATACGCGGATGAGAGG GACAGAGCTGAGGCAGAAGCCAGGGAGAAGGAAACCAAGGCCCTGTCCCTGGCTCGGGCCCTTGA AGAGGCCTTGGAAGCCAAAGAGGAACTCGAGCGGACCAACAAAATGCTCAAAGCCGAAATGGAAG ACCTGGTCAGCTCCAAGGATGACGTGGGCAAGAACGTCCATGAGCTGGAGAAGTCCAAGCGGGCC CTGGAGACCCAGATGGAGGAGATGAAGACGCAGCT Secuencias del amplicn B obtenido con 3- / 4GTCTGTGTTATCTGGAAAGGCTGGATTGATCTCCAAAGACTGGATGGTATGGGCTGTCTGGAGTT TGATGAGGAGCGAGCCCAGCAGGAGGATGCATTAGCACAACAGGCCTTTGAAGAGGCTCGGAGAA GGACACGCGAATTTGAAGATAGAGACAGGTCTCATCGGGAGGAAATGGAGGTGAGAGTTTCACAG CTGCTGAGGTTCCAGAAGGAGATCGAGAACCTCACCCAGCAGTACG Secuencias del amplicn C obtenido con 3- / 4GTCTGTGTTATCTGGAAAGGCTGGATTGATCTCCAAAGACTGGATGGTATGGGCTGTCTGGAGTT TGATGAGGAGCGAGCCCAGCAGGAGGATGCATTAGCACAACAGGCCTTTGAAGAGGCTCGGAGAA GGACACGCGAATTTGAAGATAGAGACAGGTCTCATCGGGAGGAAATGGAGGTGAGAGTTTCACAG CTGCTGAATGAAGTTGAGAGCGTCACAGGGATGCTTAACGAGGCCGAGGGGAAGGCCATTAAGCT GGCCAAGGACGTGGCGTCCCTCAGTTCCCAGCTCCAGGACACCCAGAGTTGCTTCAAGAAGAAAC CCGGCAGAAGCTCAACGTGTCTACGAAGCTGCGCCAGCTGGAGGAGGAGCGGAACAGCCTGCAAG ACCAGCTGGACGAGGAGATGGAGGCCAAGCAGAACCTGGAGCGCCACATCTCCACTCTCAACATC CAGCTCTCCGACTCGAAGAAGAAGCTGCAGGACTTTGCCAGCACCGTGGAAGCTCTGGAAGAGGG GAAGAAGAGGTTCCAGAAGGAGATCGAGAACCTCACCCAGCAGTACG 35

Secuencias del amplicn D obtenido con 3-/4GTCTGTGTTATCTGGAAAGGCTGGATTGATCTCCAAAGACTGGATGGTATGGGCTGTCTGGAGTT TGATGAGGAGCGAGCCCCGCAGGAGGATGCATTAGCACAACAGGCCTTTGAAGAGGCTCGGAGAA GGACACGCGAATTTGAAGATGAAGACAGGTCTCATCGGGAGGAAATGGAGGTGAGAGTTTCACAG CTGCTGGCCAAGGCGAACCTAGACAAGAATAAGCAACGCTGGAGAAAGAGAACGCAGACCTGGCC GGGGAGCTGCGGGTCCTGGGCCAGGCCAAGCAGGAGGTGGAACATAAGAAGAAGAAGCTGGAGGC GCAGGTGCAGGAGCTGCAGTCCAAGTGCAGCGATGGGGAGCGGGCCCGGGCGGAGCTCAATGACA AGATCCACAAGCTGAAGAATGAAGTTGAGAGCGTCACAGGGATGCTTAACGAGGCCGAGGGGAAG GCCATTAAGCTGGCCAAGGACGTGGCGTCCCTCAGTTCCCAGCTCCAGGACACCCAGGAGTTGCT TCAAGAAGAAACCCGGCAGAAGCTCAACGTGTCTACGAAGCTGCGCCAGTTGGAGGAGGAGCGGA ACAGCCTGCAAGACCAGCTGGACGAGGAGATGGAGGCCAAGCAGAACCTGGAGCGCCCATCTGGA CTCTCAACATCCAGCTCTCCGACTCGAAGAAGAAGCTGCAGGACTTTGCCAGCACCGTGGAAGCT CTGGAAGAGGGGAAGAAGAGGTTCCAGAAGGAGATCGAGAACCTCACCCAGCAGTACG Secuencias del amplicn CBF5/CBF3` CTGGATGGTATGGGCTGTCTGGAGTTTGATGAGGAGCGAGCCCAGCAGGAGGATGCATTAGCACA ACAGGCCTTTGAAGAGGCTCGGAGAAGGACACGCGAATTTGAAGATAGAGACAGGTCTCATCGGG AGGAAATGGAGGTGAGAGTTTCACAGTTGCTGGCAGTAACTGGCAAGAAGACAACAAGACCCTA

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ANEXO 5 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA39 La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo simple y altamente sensible para la separacin, identificacin y purificacin de fragmentos de DNA de 0.5 a 21 Kb. La agarosa es un polisacrido parecido al agar o a la pectina que se disuelven en agua al ser calentada y que melifica al enfriarse. Cuando se aplica un campo elctrico al gel en donde se ha depositado DNA, este migra hacia el electrodo positivo debido a su carga negativa (dada por los grupos fosfato). El ndice de migracin de los fragmentos de DNA lineal a travs de la agarosa es inversamente proporcional al log10 de sus pesos moleculares, debido a esto es posible calcular el tamao exacto de un fragmento dado en base a su ndice de migracin. Procedimiento en gel de agarosa puede ser dividido en tres etapas: 1.-el gel es preparado con una concentracin de agarosa apropiada para el tamao de lo fragmentos que van a ser separados. 2.-las muestras de DNA se descargan en los pozos para muestra del gel y es aplicado un campo elctrico a travs de este, a un voltaje y durante un periodo de tiempo necesarios para lograr la separacin ptima de los fragmentos de DNA. 3.-el gel es teido o si el bromuro de etidio ha sido incorporado entre el gel y el amortiguador de electroforesis, visualizando directamente con luz ultravioleta. Equipo Cmara para electroforesis horizontal (submarina) (Bio-Rad,Minisub - CellGt) Fuente de poder de 300 voltios (Bio Rad Power PAC 300) Fotodocumentador (GeneGenius Syngene) Reactivos. Agarosa: TAE 50X (Buffer stock para preparar el TAE 1X que se utiliza para el corrimiento electrofortico y para la preparacin de geles de agarosa).preparacin del TAE 50X: 242g de Tris (Base),57.1 ml de cido actico glacial,100 ml de EDTA 0.5 M, pH=8.0, aforar a 1l con agua destilada. Loading buffer (buffer colorante para geles de agarosa). Preparacin % ml de glicerol, 1 ml de azul de bromofenol, 2 ml de Tris. HCI 1 M, pH = 8.0 y 2 ml de EDTA 0.5 M, pH = 8.0. Marcadores de peso molecular. Los marcadores de peso molecular se elige con base al tamao de los fragmentos de DNA que sern separados, algunos ejemplos de estos son: DNA del fago sin digerir, DNA del fago phiX 174 digerido con la enzima Hae lll y marcador de 123 pb. Bromuro de etidio 10mg/ml. Preparacin: 0.2 g de bromuro de etidio disuelto en 19.8 ml de agua destilada. Est puede mantenerse a temperatura ambiente en una cubierta con papel aluminio para evitar la exposicin a la luz. Para la tincin de geles de agarosa se adiciona 5l de bromuro de etidio 10mg/ml a 100 ml de agua (concentracin final 0.5 l/ml), los geles se tien durante 15-30 min en agitacin constante. Precaucin: el bromuro de etidio es un poderoso mutgeno, por lo que debe evitarse el contacto directo con piel y mucosas.

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ANEXO 6 PURIFICACION DEL PRODUCTO DE PCR UTILIZANDOI KIT Bench Protocol: QIAquick PCR Purification Microcentrifuge and Vacuum Protocol. 1. Cuantificacin del producto de PCR 2. Agregar 5 volumes ms a lo del producto de PCR de la solucin Buffer PBI. 3. centrifugar por un minuto a 14 000 rpm. Desechar el residuo que quedo en el microtubo. 4. lavar la membrana con 750 L de buffer PE y dejar reposar por un minuto. 5. centrifugar por un minuto a 14 000 rpm. Desechar el microtubo. 6. cambiar la columna a un microtubo nuevo estril de 1.5 ml. colocar 50 L de buffer EB, dejar reposar por un minuto, centrifugar por un minuto a 14 000 rpm., Desechar el residuo que quedo en el microtubo. 7. agregar a la membrana 30 L de EB 8. el producto es analizado haciendo una electroforesis en un gel de agarosa al 1%. 9. el producto tiene que ser cuantificado para seguir con el siguiente paso.

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ANEXO 7 DIGESTION DEL VECTOR DE CLONACION (PUC-19) UTILIZANDO Sma I 1.- Para llevar acabo la digestin de pUC-19 DNA plasmidico (aprox. 0.1 g/ ml) Buffer (reactivo 4 a concentracin 10X) Agua estril Enzima Sma I (10U/L) promega Volumen total se debe hacer la siguiente mezcla: 5.0 L 1.5 L 7.5 L 1.0 L 15 L

2.- Incubar la mezcla a 30C sin agitacin por una hora. 3.- Correr en gel de agarosa al 2% o 1%.

P(BLA) ALPHA
Sma I (415) Hinc II (432)

P(LAC) AP r

pUC19
2686 bp

ORI

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ANEXO 8 DESFOSFORILACION DEL VECTOR DE CLONACION (PUC-19) UTILIZANDO LA ENZIMA FOSFATASA ALCALINA. Esta enzima remueve los grupos fosfatos de los extremos 5 del DNA. 1.- Para llevar acabo la desfosforilacin se tiene que hacer la siguiente mezcla: Por cada 500 ng de DNA se utiliza 1 U de enzima. DNA plasmdico (aprox. 500 ng de DNA) Buffer Agua estril Enzima fosfatasa alcalina Volumen total 2.0 L 2.5 L 1.5 L 1.0 L 25 L

2.- Incubar a 37 C por una hora. 3.- Correr un gel de agarosa al 1%. (Opcional) 4.- Purificar el DNA plasmdico desfosforilado y cuantificarlo.

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ANEXO 9 PURIFICACION DEL DNA PLASMIDICO UTILIZANDO EL KIT (Bench protocol: QIAprep spin Miniprep Kit Using a vacuum Manifold.) Este protocolo es diseado para la purificacin de ms de 20 g de copias altas de DNA plasmidico de 1 a 5 ml de cultivo de esquerichia coli de la noche a la maana en medio LB usando un colector vacio con conectores luer. Usuarios nuevos y usuarios con deseos para purificar copias bajas de plsmidos y csmidos, plsmidos largos (mayor a 10 kb ), y DNA preparando usando otros mtodos y se refieren a los protocolos detallados previstos en el manual miniprep QIAprep , segunda edicin . Procedimiento 1. resuspender el paquete bacteriano de clulas en 250 l de Buffer P1 y trasferirlo a un tubo de microcentrifugacin. 2. agregar 250 l de Buffer P2 y mezclar por inversin al tubo de 4-6 tiempos. Si usa reactivo de lyseblue, la solucin se vuelve azul. 3. agregar 350 l de Buffer N3 e invertir y mezclar inmediatamente el tubo de 4-6 tiempos. Si usa reactivo lyseblue, la solucin se vuelve descolorida. 4. centrifugar por 10 minutos a 13,000 rpm (~17900 x g ) en una microcentrifuga Durante la centrifugacin preparar el colector vaci y las columnas spin QIAprep como se muestra en el manual. 5. aplicar el sobrenadante del paso 4 para la columna QIAprep spin por decantacin o pipeteo. 6. recomendado: lave la columna QIAprep spin por adicin de 0.5 ml de buffer PB. Centrifugar a 13,000 rpm durante 1 min. Despus la solucin tiene que moverse a travs de la columna. Este paso es solo requerido cuando se usa endA+ u otra cepa bacteriana con alta actividad de nucleasa o carbohidrato contenido. (Ver el manual de QIAprep miniprep para mas detalles) 7. lave la columna QIAprep spin por la adicin de 0.75 ml de buffer PE. Para secar la membrana centrifugar a 13000 rpm x 1 min. 8. transferir la columna QIAprep spin a un microtubo nuevo y limpio. Centrifugar por 1 min para remover los residuos del buffer de lavado. 9. para diluir el DNA , coloque la columna QIAprep en un microtubo limpio de 1.5 ml ., agregar 50 l de buffer EB o agua ultrapura en el centro de cada columna QIAprep spin, y dejar reposar por 1 min y centrifugar por 1 min a 13000 rpm.

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ANEXO 10 LIGACION UTILIZANDO LA ENZIMA T4 LIGASA34 Para realizar la ligacin debe ser en una proporcin de 3:1, por cada 300ng /ml del producto de PCR utilizar 100 ng/ml de pUC-19 desfosforilado. 1.- Para llevar acabo la ligacin se tiene que hacer la siguiente mezcla: Buffer ligasa (5X) 4.0 L Inserto (producto de PCR) utilizar 300 ng/ ml de DNA 12.5 L DNA plasmdico desfosforilado utilizar 100 ng/ml 2.1 L T4 ligasa 1.0 L Agua estril 0.4 L Volumen total 20 L 2.- Incubar a 14 C durante 16- 24 horas.

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ANEXO11. OBTENCION DE CELULAS COMPETENTES DE E. coli.34 1. En un matraz Erlen Meyer estril de 100 ml colocar 15 ml de 2xyt utilizando una probeta o pipeta estril. Sembrar de 1-3 colonias de la cepa de E. coli en caldo 2xyt. 2. Incubar a 37 C en agitacin hasta que la D.O. a 600nm de longitud de onda sea de 0.3-0.5. 3. Centrifugar a 6500 rpm durante 5 min. a 4C utilizando tubos estriles. Descartar todo el sobrenadante y tapar el tubo para evitar contaminacin. 4. Resuspender las clulas en 5 ml de CaCl2 50 mM estril y fro. Utilizar pipetas estriles. 5. Colocar el tubo en hielo durante 40 min. 6. Centrifugar a 4500 rpm durante 5 min., descartar el sobrenadante. 7. Al paquete celular, adicionar 600 l de CaCl2 50 mM, resuspender suavemente y mantenerlo en hielo.

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ANEXO12. TRANSFORMACION E INDUCCION DE CELULAS COMPETENTES DE E. COLI. EN UN SOLO PASO35 Crecer en LB hasta fase exponencial (0.3-0.6 550nm), la cepa a transformar y seguir dos protocolos posibles: I.- Mezclar volmenes iguales del cultivo celular y del medio TSS 2X fri. 1. transferir a tubos eppendorf estriles alcuotas de 100 L de la mezcla anterior y agregar de 50 a 100 ng del DNA. 2. poner en hielo durante 30 minutos. 3. dar un choque de calor de 5 minutos a 43C. 4. dar un choque de fri en hielo por 5 minutos. 5. adicionar 900 L de LB con glucosa 20nM (con LB solo tambin puede hacerse) 6. incubar entre 1-1.5 horas a 37C con agitacin. 7. sembrar por esptulado o por goteo 100 l en los medios de seleccin adecuados. II.- concentrar 10 veces el cultivo celular por centrifugacin. Centrifugar el cultivo durante 10 minutos a 6000 rpm a 4C y resuspender en la dcima parte del volumen original. La suspensin de hace en solucin de transformacin fra TSS. Seguir con los pasos 1 a 7 del protocolo I. Las clulas pueden congelarse inmediatamente, despus de hacer la mezcla, en hielo seco/etanol y guardarse a -70C hasta por 4 meses sin perder su eficacia de transformacin. SOLUCIONES EMPLEADAS 1. Medio LB 2. Medio LB con 20mM de glucosa 3. solucin TSS 2X: 1% de NaCl 1 % de tristona 0.5 % extracto de levadura 20 % de PEG 8000 10 % de DMSO 50 mM de MgCl2 No se ajusta el pH de la solucin; se esteriliza en autoclave y se mantiene a 4C.

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ANEXO 13 SELECCION DE LAS CLONAS POSITIVAS Una reaccion de clonacin eficiente producir cientos de colonias. Elegir unas colonias blancas. NO ELEGIR LAS COLONIAS DE COLOR AZUL. 1. con un palillo se toma una pequea muestra de la colonia y se resuspende en 10 L de agua limpia; se incuba a 96C durante una hora en un tubo de PCR y se cargan los 10 L en un gel de agarosa al 1% para visualizar el tamao de los plasmidos. 2. las colonias con inserto son incubadas en LB con 200 g/ml de ampicilina, y se congelan en 1 ml con glicerol al 15% (V/V).

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ANEXO 14 EXTRACCIN DE DNA PLASMIDICO POR EL METODO DE LISIS ALCALINA PROCEDIMIENTO 1. Inocular con la cepa de E. coli transformada en un tubo de 16x150 con 2 ml de caldo 2xYT que contenga 100 mg/ml de ampicilina. Incubar 16-24 h a 37C con agitacin. 2. Transferir 1.5 ml a un tubo Eppendorf y centrifugar en una microcentrfuga a 13,000 rpm durante 30 seg. Aspirar con una pipeta Pasteur y adicionar el resto del cultivo. Centrifugar 30 seg. 3. Resuspender el paquete celular en 100 ml de amortiguador SET. Las clulas deben ser completamente resuspendidas. 4. Adicionar 200 ml de solucin de lisis (NaOH/SDS). Invertir los tubos 15 veces para mezclar. Incubar en hielo durante 5 min. 5. Adicionar 150 ml de acetato de potasio fro 5 M. Invertir los tubos 15 veces para mezclar. Incubar en hielo durante 5 min. 6. Centrifugar los tubos a 13,000 rpm durante 10 min en fro. Transferir aproximadamente 400 ml de sobrenadante a un tubo nuevo y descartar el paquete. 7. Adicionar 300 ml de fenol/cloroformo, mezclar con vortex por 45 seg y centrifugar a 13,000 rpm durante 3 min. Transferir aproximadamente 400 ml de la fase acuosa a un tubo nuevo. 8. Adicionar 1 ml de etanol absoluto fro, mezclar suavemente y dejar a temperatura ambiente durante 10 min. 9. Centrifugar a 13,000 rpm en fro por 10 min. Descartar el etanol, enjuagar el paquete con 1 ml de etanol al 70% fro, descartar el etanol al 70%. Escurrir bien los tubos sobre papel higinico y secar los paquetes durante 12 min al vaco o a temperatura ambiente. 10. Resuspender el paquete en 30 ml de H2O desionizada estril. Conservar a 20C.

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