You are on page 1of 16

Real Time-PCR

Real Time-RT-PCR

qPCR
DEPTO. MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA INSTITUTO DE BIOCINCIAS UNESP BOTUCATU

JOO PESSOA ARAJO JUNIOR (jpessoa@ibb.unesp.br)

Tcnicas baseadas na PCR a) Simples quantificao do produto de amplificao. b) Dil i limitadas das amostras Diluies li i d d c) Coamplificao de padres de referncia interna d) PCR competitivo (cPCR) e) PCR em tempo real

FRET (Fluorescence resonance energy transfer): transfer): - uma interao dependente da distncia (10 100 ) entre molculas, na qual h uma sobreposio do espectro de emisso e absoro. absoro
Fig. 1. FRET (Angelis, 1999)

-ex.: TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine).

NFQ (non-fluorescent quencher) ou dark quencher: -dispersa a energia na forma de calor ao contrrio de uma emisso fluorescente. ex.: [4-(4-dimethylaminophenylazo) -ex : DABCYL [4 (4 dimethylaminophenylazo) benzoic acid] Eclipse Black Hole (BHQ)

Sistemas de deteco
1. Sondas TaqMan ou de hidrlise
-primer sense e antisense; -sonda: 5-fluorforo 3-quencher -Taq polimerase: exonuclease 5 3

2. Molecular Beacons -sondas com estrutura de hairpin: 5-fluorforo 3-quencher -hibridizao seqncia alvo estrutura linear;

3. Sondas de Hibridizao ou FRET


-primers; -duas sondas: cada uma marcada com um fluorforo: Doador: 3 Receptor: 5 -hibridizao: proximidade (FRET) doador excitado energia receptor emite fluorescncia.

4. SYBR Green 1 -corante intercalante fita dupla DNA; - DNA em cada ciclo - fluorescncia.

5. LUX (Light upon extension) Invitrogen

-primer; -primer fluorognico: fluorforo (FAM ou JOE) na poro 3; -estrutura secundria em hairpin = atua como quencher; h -incorporao na fita dupla DNA estrutura linear fluorescncia.
Fig. 7. LUX primer

5. Plexor (Promega)

Termos usados na PCR em tempo real

Grfico da amplificao (amplification plot).

Termos usados na PCR em tempo real

Grfico da amplificao (amplification plot).

Curva de dissociao
-determinao da Tm; -Tm depende do comprimento e composio das bases; -Tm caracterstica para cada fragmento amplificado.

Fig. 6. Temperatura de melting (Mackay, 2004).

10

Curva de amplificao tpica

-fase plat; -fase linear -fase geomtrica -background -baseline

11

12

Aplicaes comuns
Quantificao relativa ou absoluta de RNAm Validao de resultados de microarrays Quantificar virus, bacterias ou fungos Identificao de mutaes, single nucleotide polymorphism (SNPs) Genotipagem Diagnstico

13

Quantificao de RNAm

Quantificao absoluta: -determina a quantidade absoluta da seqncia nuclico dentro de uma amostra; -curva padro (DNA plasmidial). Concentrao medida em A260 e convertida para nmero de cpias usando o peso molecular do DNA. alvo de c.

Quantificao de RNAm

Quantificao relativa: -comparao do nvel inicial do cido nuclico entre cada amostra, sem necessidade do exato nmero de cpias do alvo. -os nveis relativos do c. nuclico nas amostras podem ser os determinados sem o uso da curva padro.

14

Normalizao Corrigir variao entre amostras Housekeeping (GAPDH B H k i (GAPDH,Bactina, etc), rRNA, Mltiplos RNAm

Eficincia da amplificao
Efficiency = [10(-1/slope)]-1

15

Mtodos de quantificao relativa


ct 2-ct 2-c Pfaffl; Q-gene; Gentle; Liu and Saint Normalizao e eficincia em um nico clculo ( (normalmente baseados em excell e anlises estatsticas) Mtodo da plotagem de amplificao

PCR
Starting Template PCR Round 1 2X Template

vs.

Real-Time PCR

Qualitativos Quantitativos
Fluorescence

PCR Round 2

Contaminao Tempo
?
?

4X Template

Cycle

Especificidade Custo equipamentos Custo reagentes

? ?
?

16

You might also like