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Real Time-RT-PCR
qPCR
DEPTO. MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA INSTITUTO DE BIOCINCIAS UNESP BOTUCATU
Tcnicas baseadas na PCR a) Simples quantificao do produto de amplificao. b) Dil i limitadas das amostras Diluies li i d d c) Coamplificao de padres de referncia interna d) PCR competitivo (cPCR) e) PCR em tempo real
FRET (Fluorescence resonance energy transfer): transfer): - uma interao dependente da distncia (10 100 ) entre molculas, na qual h uma sobreposio do espectro de emisso e absoro. absoro
Fig. 1. FRET (Angelis, 1999)
NFQ (non-fluorescent quencher) ou dark quencher: -dispersa a energia na forma de calor ao contrrio de uma emisso fluorescente. ex.: [4-(4-dimethylaminophenylazo) -ex : DABCYL [4 (4 dimethylaminophenylazo) benzoic acid] Eclipse Black Hole (BHQ)
Sistemas de deteco
1. Sondas TaqMan ou de hidrlise
-primer sense e antisense; -sonda: 5-fluorforo 3-quencher -Taq polimerase: exonuclease 5 3
2. Molecular Beacons -sondas com estrutura de hairpin: 5-fluorforo 3-quencher -hibridizao seqncia alvo estrutura linear;
4. SYBR Green 1 -corante intercalante fita dupla DNA; - DNA em cada ciclo - fluorescncia.
-primer; -primer fluorognico: fluorforo (FAM ou JOE) na poro 3; -estrutura secundria em hairpin = atua como quencher; h -incorporao na fita dupla DNA estrutura linear fluorescncia.
Fig. 7. LUX primer
5. Plexor (Promega)
Curva de dissociao
-determinao da Tm; -Tm depende do comprimento e composio das bases; -Tm caracterstica para cada fragmento amplificado.
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Aplicaes comuns
Quantificao relativa ou absoluta de RNAm Validao de resultados de microarrays Quantificar virus, bacterias ou fungos Identificao de mutaes, single nucleotide polymorphism (SNPs) Genotipagem Diagnstico
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Quantificao de RNAm
Quantificao absoluta: -determina a quantidade absoluta da seqncia nuclico dentro de uma amostra; -curva padro (DNA plasmidial). Concentrao medida em A260 e convertida para nmero de cpias usando o peso molecular do DNA. alvo de c.
Quantificao de RNAm
Quantificao relativa: -comparao do nvel inicial do cido nuclico entre cada amostra, sem necessidade do exato nmero de cpias do alvo. -os nveis relativos do c. nuclico nas amostras podem ser os determinados sem o uso da curva padro.
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Normalizao Corrigir variao entre amostras Housekeeping (GAPDH B H k i (GAPDH,Bactina, etc), rRNA, Mltiplos RNAm
Eficincia da amplificao
Efficiency = [10(-1/slope)]-1
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PCR
Starting Template PCR Round 1 2X Template
vs.
Real-Time PCR
Qualitativos Quantitativos
Fluorescence
PCR Round 2
Contaminao Tempo
?
?
4X Template
Cycle
? ?
?
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