UNIVERSIDADE EDUARDO MONDLANE

FACULDADE DE CINCIAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA

Estgio Laboratorial

EXTRACO E QUANTIFICAO DE CIDO

CONDOEIRA

DESOXIRIBONUCLICO (DNA)

Discente: CONDOEIRA, Silva Benedito Docentes: Prof. Doutor Victor Skripet dr. Jaime Cumbe

Maputo, Abril de 2011 1

I. RESUMO TERICO

Os tripanossomas fazem parte do grupo dos protozorios e podem infectar insectos e vrios mamferos, incluindo o homem. Trypanosoma vivax (gnero Trypanosoma) um parasita transmitido pela mosca ts-ts para ruminantes, ocasionando infeces agudas e crnicas, que ts podem acarretar alteraes hematolgicas severas e mortalidade dos animais. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction - reaco de polimerase em cadeia) baseia-se no baseia processo de replicao de DNA. A chave para a PCR a DNA Taq polimerase, uma enzima termoestvel isolada da bactria Thermus Aquaticus. Com a PCR, quantidades mnimas de material gentico podem ser amplificadas milhes de vezes em poucas horas, permitindo a deteco rpida e fivel dos marcadores genticos de doenas infecciosas, cancro ou doenas genticas. Durante o PCR so usadas elevadas temperaturas de forma a separar as molculas de DNA em elevadas duas cadeias simples, permitindo ento a ligao de oligonucletidos iniciadores (primers), ( tambm em cadeia simples e geralmente constitudos por 15 a 30 nucletidos, obtidos por sntese qumica. Para amplificar uma determinada regio so necessrios dois iniciadores complementares das sequncias que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a actuao da DNA Taq polimerase durante a sntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a plementar, amplificar (figura 1).

Figura 1: Processo de replicao de DNA atravs da reaco de polimerase em cadeia plicao

Para realizar PCR so necessrias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampo salino contendo a polimerase, primers, os quatro desoxinucletidos constituintes do DNA e o cofactor primers,
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Mg2+. Esta mistura submetida a vrios ciclos de amplificao que consistem em trs passos e que se repete um nmero especfico de vezes: 1) Desnaturao: (94-96C) de modo a separar as duas cadeias. 96C) 2) Hibridizao ou Annealing: (50-65C) Associao dos iniciadores por ligaes de 65C) hidrognio ao DNA alvo em cadeia simples. 3) Extenso: (72C) amplificao dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA Taq polimerase. Demonstrao esquemtica da programao no termociclador, indicando as temperaturas de desnaturao, de annealing e de extenso. e

Figura 2: Demonstrao esquemtica da programao dos ciclos da PCR com temperatura ( (C) e tempo de desnaturao, de anelamento e de extenso.

Normalmente so realizados de 25 a 40 ciclos para cada reaco na qual a taxa de replicao exponencial (2ciclos). O resultado analisado atravs de uma eletroforese em gel, que a migrao de partculas de acordo com sua massa e sua carga, ela pode ser de agarose ou de poliacrilamida Durante a eletroforese, as partculas se movem entre os poros do gel de acordo com a corrente ese, eltrica aplicada nele. Dependendo da carga das partculas que esto sendo separadas, estas iro migrar para o ctodo (+) ou para o nodo (-). Molculas de menor massa iro migrar mais ( ). m rapidamente que molculas de maior massa. Aps a corrida, coloca se brometo de etdio, que coloca-se far o DNA ou RNA "brilhar" quando exposto ao UV.

1. Objectivos Geral Aplicar as tcnicas bsicas de biologia molecular na extraco e quantificao de cido desoxiribonuclico (DNA). Aplicar as tcnicas de diagnstico da tripanossomose bovina baseada na reaco de PCR. Especficos A partir de uma amostra de sangue bovino existente fazer a extraco de DNA de trypanossona vivax e quantificar por espectofotometria em um Nanodrop, Aplicar a reaco de PCR na amplificao do DNA de trypanossona vivax colhida da amostra de sangue bovino e diagnosticar esse DNA com base na electroforese em gel de agarose.

2. PARTE EXPERIMENTAL Nas tabelas abaixo esto representados os materiais, equipamentos e reagentes usados durante a experincia
Tabela 1: Materiais e equipamentos

Materiais e Equipamentos Centrifugadores Tubos Eppendorf Balana Analtica Lamparina Nanodrop Transiluminador UV

Microondas Fluxo laminar Micropipetas e Pontas

Geleira Luvas Tesoura

Termociclador iCycler BIORAD

Equipamentos de Electroforense

Tabela 2: reagentes usados

Reagentes PBS PBS-Saponina Brometo de Etdio Primers PCR buffer Agua destilada Chelex TBE Agarose dNTPmix Dream Taq MgCl2
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Tampo de carregamento (azul de bromofenol)

II. EXTRACO DE DNA NAS MANCHAS DE SANGUE EM PAPEL DE FILTRO 1. Esterilizou-se uma tesoura, numa se lamparina, e com ela corta-se em corta pedaos (equivalentes a 1mm2) o papel de filtro contendo a amostra (Sangue Bovino colhido por M. Mangaze no dia 16.11.10) e depositou-se num tubo de centrfugo. se
Figura 2: Amostra de Sangue Bovino

2. Preparou-se e adicionou-se 1mL de PBS Saponina a 0,5% ao tubo de centrfugo se adicionou contendo a amostra e in incubou-se a mistura durante 4h a 4C 3. Aps a incubao centrifugou e descartou-se do tubo a parte liquida deixando apenas o centrifugou-se se papel de filtro, pois nele estava contido o DNA, tendo-se adicionado depois 1mL de PBS. tendo se Levou-se novamente a incubadora, por 1h. se 4. Aps a incubao centrifugou-se durante 5min e descartou-se novamente a parte lquida. ps centrifugou se Aps isto, adicionou-se ao tubo 100L de Chelex a 10% e levou se a mistura ao banho se levou-se banhomaria por 10min a 95C e sob agitao constante. 5. Centrifugou-se novamente a mistura durante 5min a 1400rpm. Houve separao da se durante mistura em trs fases, uma aquosa (contm o DNA a extrair), interfase (contm proteinas) e a fase orgnica (formada basicamente de lipideos). A fase aquosa foi descartada e transferida para um novo tubo.
Observaes:

Durante o processo de extraco, o complexo PBS Saponina adicionado quebra membranas plasmticas e nucleares de modo a expor o DNA do tripanossoma. O segundo PBS adicionado para remover o resto da saponina no descartada. A adico de Chelex mascara o DNA e o retira do papel de filtro e o banho-maria desnatura as protenas. maria

As solues, assim obtidas, foram levadas para o nanodrop (um espectrofotometro) de modo a determinar se da amostra foi foi-nos possvel extrair o DNA, ou seja de modo a quantificar (em ng/L) o DNA extrado da amostra preparada.

III.ANALISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DOS CIDOS NUCLICOS Quantificao de DNA no Nanodrop 1. Com o computador activado, activou-se o activou programa ND-1000 3.7 e seleccionou-se a 1000 opo Nucleic Acid. 2. Levantou-se o pedestal, limpou se limpou-se os sensores (superior e inferior) com um papel macio e depositou-se, no sensor inferior, se, 1,5L de gua destilada at formar bolha; L baixou-se o pedestal e esperou se esperou-se o fim da operao. levantou-se o pedestal e 3. Novamente levantou limpamo-los com papel macio. Depositou-se los Depositou 1,5L de Blank, baixou baixou-se o pedestal e

Figura 3: Nanodrop (ND)

seleccionou-se a opo Blank na janela de dilogo. Aps esta operao levantou-se o levantou pedestai e limpou-se os dois sensores (superior e inferior). se 4. Depositou-se 1,5L da amostra preparada na seco anterior no sensor inferior, baixouse baixou se o pedestal, preencheu-se o SAMPLE ID com cdigos da amostra e seleccionou a preencheu m seleccionou-se opo MESURE. Terminada a operao, procedeu-se do mesmo modo para as restantes procedeu se amostras e duas vezes com a gua. 5. Terminada as analises limpou os pedestais e registou-se os valores da concentrao limpou-se se de DNA na amostra, Absorvncia e Ratio, conforme mostra a tabela a seguir: ra,
Tabela 3: Registo de concentraes e Absorvncia de ADN extrado da amostra

Amostras 1M"- Preto 2M"- Preto 3M"- Preto 1M"- Azul 2M"- Azul H2O H2O

ng/l 33,98 39,96 -1,33 1,33 46,33 62,59 -0,05 0,05 0,46

A260 0,68 0,799 -0,027 0,927 1,252 -0,001 0,009

A280 0,958 1,14 -0,132 1,316 1,696 -0,002 0,013

A260/A280 0,71 0,7 0,2 0,7 0,74 0,66 0,72

Depois da quantificao, conservou a amostra de DNA extrado a 4C. conservou-se

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IV. REACO EM CADEIA DA POLIMERASE Para a realizao da reaco de polimerase em cadeia (PCR), preparou-se num fluxo laminar a mistura de reaco (master mix) com os componentes da tabela abaixo em um tubo de eppendorf de volume equivalente a 0,5mL:
Tabela 4: Componentes usados para a mistura de reaco

Componente (Conc, stock) PCR buffer (10x) MgCl2 (25mM) dNTP-mix (10mM) Primer PGP-Fw (10M) Primer PGP-Rv (10M) Dream Taq (5U/L) H2O detilada DNA

Conc. Final 1x 2,5mM 0,5mM 0,25 M 0,25 M 0,5 /l # # Volume Total

L/reaco 2 2 1 0,5 0,5 0,25 12,75 1 L 20 L

Vtotal (L)x10 20 20 10 5 5 2,5 127,5 10 L 200 L

Da soluo master mix preparada foi retirado sucessivamente 20L para 10 tubos de eppendorf. Esses tubos, foram posteriormente levados a um termociclador, onde ocorre a reaco de PCR propriamente dita. As condies de reaco de PCR esto representadas na tabela abaixo:
Tabela 5: Condies de Reaco

Etapa 1 2 3 4 5

Objectivo Desnaturao inicial Desnaturao Pareamento ou anneling Extenso Extenso final

Temperatura 94C 94C 65C 72C 72C

Temo 5min 40s 40s 90s 10min

N de ciclos

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V. ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE 1. Preparou-se a cuba de alectroforese e colocou se os pentes de modo a fazer poros se colocou-se para se depositar os componentes a analisar, 2. Preparou-se o gel de agarose (a preparao est na pagina em anexo) e deixou-se se deixou arrefecer at 50%. 3. Adicionou-se brometo de etdio, verteu-se a mistura na cuba de electroforese e se verteu se deixou-se at polimerizar. merizar. 4. Aps a polimerizao retirou-se o pente e mergulhou-se a cuba numa tina com um retirou se certo volume de tampo de corrida. 5. Misturou-se 2L de tampo de carregamento de modo a adiciona cor as amostras e se carregamento, adicionar permitir o acompanhamento da corrida, para cada um dos 10 tubos que continha o os master mix e o DNA extrado. 6. Retirou-se pequenas quantidades, em cada tubo, da mistura em 5 e depositou-se nos se depositou diferentes poros do gel. 7. Conectou-se os elctrodos a fonte e submeteu se as amostras a uma corrida a 100V se submeteu-se durante 20min. 8. Terminada a corrida, retirou-se a tina contendo gel e observou-se no transiluminador retirou se observou ultravioleta conforme mostra a figura a seguir:

Figura 4: Visualizao de bandas de DNA em electroforese de gel de agarose : 8

VI. DISCUSSO DOS RESULTADOS A tabela 3 apresenta as concentraes de DNA e as relaes de absorbncia em 260 e 280 nm obtida das amostras de cogulo sanguneo extraidos em bovinos, aps anlise

espectrofotomtrica no Nanodrop. Como se observa, as amostras de DNA obtidas apresentam um garu de pureza relativamente proximo do ideal, com excepo da amostra 3M"- preto que apresenta um valor muito equidistante. Estes valores indicam que o DNA extraidos esto, de certa forma, contaminadas por proteinas visto que a razo A260/A280 est, de certo modo, abaixo de 1,44 a 1,90 que indicam amostras com alto grau de pureza.

Nota: Todos os clculos relativos a preparao das solues esto na folha em anexo.

A avaliao do DNA extrado em electrforese em gel de agarose no mostrou existncias de DNA do tripanossoma vivax no DNA genmico extraido das amostras de cogulos sanguneos bovinos, entretanto, este resultado leva-nos a duas possiveis anlise: 1) Durante o processo de extraco de DNA pode ter ocorrido uma inibio promovida pelo Chelex que conjuntamente com o DNA teria sido tranferido para o novo tubo durante o processo descrito em 5 na extrao de DNA ou pelas proteinas que no foram desnaturadas nem pelo processo de desnaturao em banho-maria. Estes provavelmente se teriam acoplado/reagido com master mix inibindo o processo de amplificao na reaco de PCR. 2) Durante a reaco de PCR no ocorreu a amplificao do DNA do tripanossoma vivax pelo facto de a amostra analisada no o conter, ou seja, o cogulo de sangue bovino analisado no apresenta nenhum grau de contaminao pela tripanossomose.

VII.

CONCLUSO

As anlises colocadas na discusso dos resultados no indicam que a experincia no tenha de melhor forma, nem ainda, que no se tenha atingido os objectivos preconizados, porm suscinta que as experincias deste gnero sejam repetidas por duas ou mais vezes para que no se tenha resultados ambguos e ainda para que cada resultado das experincias se sustentem entre si dando mais credibilidade aos resultados. No obstante, nesta experiencia foi-nos possvel aplicar as tcnicas bsicas de biologia molecular na extraco e quantificao de cido desoxiribonuclico (DNA), aplicar a reaco de polimerase em cadeia (PCR) na amplicao de uma quantidade mnima de um material gentico e com base na electroforese em gel de agarose fazer o seu diagnstico.

REFERNCIA BIBLIOGRFICA 1) McMurry, John, Organic Chemistry, Thomson Brooks/Cole, 7 Edition, 2008, USA, p.p. 1117 1118. 2) Annimo 2, Tripanossoma, http://pt.wikipedia.org/wiki/Tripanossoma, consultado no dia 17.03.2011 3) Annimo
1,

PCR

Amplificao

de

DNA

in

vitro,

http://www.e-

escola.pt/topico.asp?hid=339, consultado no dia 17.03.2011 4) Annimo 3, Eletroforese em Gel, http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel,

consultado no dia 21.03.2011

5) Annimo 4, Electroforese, http://www.sabedoria.ebrasil.net/db/biologia/estudos/biologia/biologiag/eletroforese.php. htm, consultado no dia 24.03.2011

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ANEXO

1. Preparao da soluo de PBS 1x Foi-nos dado uma soluo tampo de PBS 10x e tnhamos que prepara-la a 1x num copo de 50mL PBS (10x) PBS (1x) em 50mL . = = . =5

Usando a lei de diluio tem-se:

Foram tomados 5mL da soluo tampo de PBS (pH = 6,89) a 10x para se preparar uma soluo 1x. O volume foi completado com gua destilada.

2. Preparao de PBS Saponina a 0,5% Quantidade de saponina a pesar para preparar a soluo de PBS Saponina a 0,5% a partir da soluo anterior. 1 0,25 100 25 1% 1% 0,5% = 0,125

Pesado 0,125g de saponina, dissolveu-se na soluo de PBS 1x preparado anteriormente, obtendo-se assim PBS Saponina a 0,5%

3. Preparao da soluo de Chelex a 10% Massa de Chelex a pesar para prepara-lo a 10% num volume de 5mL Tem-se que: %

= 10 =5 =? logo

%=

100

= 0,5

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Em uma balanca analtica, pesou-se 0,5g de Chelex e com ajuda de micro pipeta adicionou-se 5ml de agua destilda. 4. Preparao de Gel de Agarose (1%) Massa de agarose a pesar para preparar o gel a 1% num volume de 5mL Tem-se que: % =1

%=

100

= 50 =?

logo = 0,5

Pesou-se 0,5g de agarose e dissolveu-se em 50mL de TBE (1x), colocou-se a soluo no microondas de modo que a soluo se solubilizasse completamente. Deixou-se a mistura arrefecer por uns minutos de modo que o gel se polimerizasse e adicionou-se depois 2,5L de brometo de etdio (0,5L por cada 10mL de soluo). 5. Preparao de Tampo de Carregamento Foi-nos dado o azul de bromofenol, um tampo de carregamento, a 6x e tinha que se preparar uma soluo a 1x num volume de 20L.
Usando a lei de diluio tem-se:

. =

. = 3,5

Foram tomados 3,5L da soluo tampo de carregamento a 6x para se preparar uma soluo de 1x.

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