FECHA DE ENTREGA: 07-05-2010

-2010-

Bio 131 seccin 25

INTRODUCCION

El fraccionamiento subcelular corresponde a una serie de sucesos o metodologas utilizadas para poder observar o reconocer partes celulares ya sean membranas, mitocondrias, ncleos, microtbulos, etc. Para este mecanismo se necesitan de dos etapas que son, primero, la rotura de las clulas o tejidos y segundo, la separacin de la fraccin deseada. Las tcnicas ms comunes para la rotura de las clulas o tejidos son la sonicacin, uso de detergentes que solubilicen membranas celulares, pasar las clulas a travs de orificios de dimetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares y homogenizacin. Posteriormente a ello, la muestra se centrifuga, es decir, se hace girar un tubo a alta velocidad para obtener un sedimento o pellet y as finalmente poder experimentar con este sedimento y ver con qu reacciona, concluyendo de esta manera cual es el contenido de este pellet. El fraccionamiento subcelular es un tipo de experimento bastante utilizado y es de gran utilidad para los cientficos para conocer la composicin de las clulas y as ratificar si es que determinado tejido o conjunto de clulas posee tal tipo de membrana o reconocer si contiene un determinado organelo. Es por eso que en esta actividad se desarroll este procedimiento para conocer los mtodos del fraccionamiento subcelular y de qu manera podemos encontrar los organelos celulares mediante un campo gravitatorio utilizando una centrfuga de laboratorio.

Fuente: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/fraccionamiento.htm

OBJETIVOS

El objetivo principal de este laboratorio es comprender el uso de la tcnica de fraccionamiento subcelular y de este manera poder reconocer componentes celulares a travs de la centrifugacin. Aprenderemos, adems, a usar sustancias que nos ayudarn a identificar estos mismos

MATERIALES Y MTODOS

A) FRACCIONAMIENTO SUBCLULAR DEL HGADO

1) El primer paso fue la disposicin de una muestra de hgado de ratn (Rattus novergicus) licuado previamente y agregado a un tubo de Falcon el que se introdujo en un frasco con hielo picado por 5 minutos para mantenerlo fresco y para minimizar la activacin del dao generado por fosfolipasas y proteasas. A esta muestra se le agreg 1 mL de IBc fresco y fro y se dispuso en una centrfuga de laboratorio para mezclar la muestra. La velocidad fue de 1600 RPM por 10 minutos.

2) Luego se transfiere el homogenizado a otro tubo e Falcon y se centrifuga a 2500 RMP por 10 minutos a 4C.

3) Posteriormente, cuando se obtiene el sobrenadante, este se transfiere a otro tubo de centrifugacin a 6000 RPM por 20 minutos.

4) Luego de los 20 minutos de centrifugacin, se reserva el pellet o sedimento y se le aaden 1 mL de IBc (Buffer) para poder lavar la muestra obtenida y centrifugar nuevamente a 6000 RPM por 20 minutos a una temperatura no mayor a 4C.

5) Procedimos a descartar el sobrenadante de la ltima muestra y se re suspendi el sedimento que contiene mitocondrias con 1 mL de buffer IBc igual que la veces anteriores.

6) Esta solucin se transfiri a un tubo de Falcon y se reserv en hielo.

7) Finalmente, se midi el contenido de mitocondrias de la muestra utilizando el reactivo de Biuret.

B) EVALUACIN DEL FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES

1) Para esta actividad, el primer procedimiento fue la disposicin de una gota de la muestra N1, la del primer centrifugado a 1600 RPM, en un portaobjetos para luego observarlo en un microscopio ptico, la muestra fue tapada por un cubreobjetos. El aumento utilizado fue de 400 X, es decir, el aumento del ocular era naturalmente de 10 X y el aumento del objetivo era de 40 X.

2) La muestra fue observada por los integrantes

3) Luego, se dispuso de otra gota de esta muestra para ser teida con otra gota de azul de tripn y se observ de una manera ms ntida. Las imgenes obtenidas fueron fotografiadas.

4) Dentro de esta actividad se usaron 4 tubos de ensayo que se congelaron previamente y se rotularon. Al primero se le agreg agua destilada, al segundo fraccin nuclear, a la tercera fraccin mitocondrial y al cuarto, fraccin microsomal. Se le agregaron IBc, vaselina y azul de metileno, finalmente se introdujeron a un bao termorregulador a 37C y se intentaron observar cambios de coloracin.

RESULTADOS:

Actividad N1:

Luego del primer centrifugado se obtuvo un pellet rico en ncleos.

En el segundo centrifugado se obtuvo un pellet rico en mitocondrias.

Despus del tercer centrifugado el pellet era rico en material microsomal.

Luego del buffer, el succinato, el azul de tripan y las gotitas de vaselina, y el bao termorregulador a 37C los resultados fueron:

a)

[pic]

[pic]

[pic]

[pic]

b) Observacin de muestra al microscopio: [pic]

DISCUSIN

ACTIVIDAD N1

A) El trabajo fue satisfactorio y si se obtuvieron los resultados esperados ya que el tubo que contena un sedimento con gran cantidad de mitocondrias se decolor en gran parte (decoloracin del Azul de Metileno), en cambio, en dos tubos de ensayo restantes tambin se observ decoloracin pero no de manera significativa, la excepcin fue del tubo de ensayo que contena agua destilada ya que efectivamente no ocurri nada especfico. La razn por la cual solo 1 tubo de ensayo reaccion de forma notable es porque tena un sedimento realmente rico en mitocondrias, por lo tanto mayor cantidad de enzima Succinato Deshidrogenasa. Podemos evaluar y acorde a lo obtenido de la bibliografa citada que el procedimiento se cumpli de manera eficiente ya que el Succinato que se aadi a cada uno de los cuatro tubos de ensayo fue catalizado por las mitocondrias las cuales contenan la enzima. De esta forma podemos explicar que la tincin utilizada se desvaneci por perder electrones en el proceso citado anteriormente ya que su estado oxidado es azul y mediante este proceso se aminor. As mismo podemos decir que la Vaselina utilizada cumpli su labor ya que deba aislar las muestras del aire atmosfrico para que as la reaccin no sucediera en presencia de oxgeno ya que el Azul de Metileno se hubiera oxidado y la reaccin no hubiese sido observable.

CONCLUSION.

BIBLIOGRAFIA.

o http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/fraccionamiento.htm

o Biologa celular y molecular. De Robertis y de Robertis. 11 Ed., 2da impresin, 1998, Ed. El ateneo, Bs. Aries.

o Biologa Celular y Molecular. Lodish y col. (2002) 4 Edicin, Ed. Panamericana.

o http://morfoudec.blogspot.com/2008/06/tcnicas-de-fragmentacin-y-separacin-de.html

o Universidad Andrs Bello. Gua de laboratorio N5 Organizacin subcelular, curso Bio 131, Laboratorio biologa celular.

----------------------El tubo con fraccin mitocondrial, adquiri una coloracin dividida en dos capas, la de arriba tranparente y debajo de color azul.

El tubo con fraccin nuclear, reacciono, adquiriendo una coloracin dividida, arriba transparente y debajo de color caf.

El tubo con fraccin microsomal, quedo muy parecido al tubo con mitocondrias, quedando dos capas, una transparente y otra de coloracin azul.

En el tubo con agua destilada, se observ una coloracin arriba transparente, y abajo azul.

Muestra de fraccin nuclear sin tincin: No se alcanza a reconocer nada muy bien, solo se ve un fondo color rosado, con algunas manchas moradas.

En la muestra con tincin se pueden distinguir de mejor manera los ncleos.