Professional Documents
Culture Documents
水溶性神经递质一般都不进入胞内,只与胞膜上的受体结合,将信号传给受体便完成了使命。离子通
道型受体接受传来的信号便直接通过藏于自身分子内的效应器,即离子通道给出反应,但代谢调节型受体
则不同,它们必需经一系列的转传过程将信号传入胞内,再传给离子通道或代谢型效应器分子。受体将接
受的信号跨膜转传给离子通道或胞内的代谢型效应器分子的过程称信号 (跨膜)转导 (signal transduction)。
第一节 G 蛋白与跨细胞膜信息转导
1958 年 sutherland 发现,胰高血糖素和肾上腺素促使肝细胞糖原分解作用都是通过一种由他发现的
新物质,即 cAMP(cyclic adenosinemonophosphate,环单磷酸腺苷)实现的。这两种激素与各自的受体结合
都激活位于膜中的腺苷酸环化酶(adenylate cyclge;ACase),由后者催化 ATP 生成 cAMP。他还发现 cAMP
是激活 cAMP 依赖蛋白激酶 (cAMP—dependent protein kinase) 所必需,由活化的 PAK 再激活磷酸酯酶从
而催化肝糖原的分解。在这些研究结果的基础上,Sudhedand 于 1965 年便提出了激素作用的第二信使学说
(the second messenger theory),即激素不进入胞内,只是作为第一信使将信号带给膜上的特定受体,再由受
体激活膜中的 ACase 系统,将胞内的 ATP 转化为 cAMP。另一方面,cAMP 作为第二信使将信号送到效应
器分子给出反应。由于这一学说的提出又引导了转导蛋白,即 G 蛋白的发现。
Rodbell 在脂肪细胞碎片制备的实验中证明了几种激素(如胰高血糖素、Ad 和 ACTH 等)都通过 ACase
系统催化 ATP 生成 cAMP 这一共同的第二信使。他还设想 ACase 应是膜中的独立分子,否则难以想象几
种不同受体都具有 ACase 活性,并且在受体与 ACase 之间应存在一种被他称为 transducer (转传体)的第三
种分子,可将受体和 ACase 隅联起来。于 1970 年他又发现,在由激素、受体、ACase 系统催化 ATP 转化
为 cAMP 的反应中尚必需有 GTP 的参与。实验又表明,GTP 在反应中不被分解,又不与受体和 ACase 结
合。最后,由 Gilman (1987) 成功地将这种与 GTP 结合,又可将受体与 ACase 联系起来的转导蛋白从膜制
备中分离纯化了出来,称 GTP 结合蛋白。这是首先被阐明的信号跨膜转导途径。为此 Sutherland 获得了
1971 年度以及 Gilman 和 Rodbell 获得了 1994 年度的诺贝尔奖。
跨细胞膜信息传递机制有 3 个环节:受体识别、信号转导和细胞内效应。膜受体分属 3 大类:化
学门控离子通道、与 G 蛋白耦联的受体、本身具有效应酶活性的受体,或称连接酶的表面受体。其
中与 G 蛋白耦联的受体在膜受体中占较大比例,它们参与介导神经递质、光、激素和其他细胞外信使
的作用。G 蛋白就像工程中的一个准确的开关,控制
着分子的启闭。这是一种极其准确的“时间开关”,
在它的作用下准确决定着细胞一些生理代谢过程的
“开”和“关”的时间,这种机制极其广泛存在于生
命活动的生物化学代谢反应过程中。G 蛋白耦联的受
体所引发的反应要比配基控制的离子通道介导的反
应慢得多,而且多样化。G 蛋白耦联的受体不仅调节
离子通道,还可参与细胞分化、生长代谢、基因表达
等方面的调节。
G 蛋白介导的信号传递途径,可用图 5-1 来表示。
受体与细胞外某特异的信使结合后便激活 G 蛋白,G
蛋白再激活一种或多种效应蛋白。效应蛋白可以是
图 5-1 G 蛋白介导的信号转导系统
酶,如腺苷酸环化酶,也可以是离子通道。效应酶能
E:效应分子;R:受体分子
够改变第二信使的浓度,然后通过相应蛋白激酶的作
用,最终产生细胞内效应。
1 G 蛋白的分类
G 蛋白的种类已多达 40 余种,大多数存在于细胞膜上,由α、β、γ三个亚单位构成。βγ 两个亚
1
单位的不同可以将G蛋白分为 Gs、Gi、Go、Gq、G?及 Gt 等六类。这些不同类型的G蛋白在信号传递过程
各种发挥不同的作用。
α 亚基决定 G 蛋白的特性。α 亚基与 GTP 结合并激活后,在无 β 和 γ 存在时,能选择性地激活相
应的效应蛋白。根据它们作用的调节活性,可将 G 蛋白及其亚基进行分类(表 5-1):
注:K、Ca、Na分别表示3种离子的通道;↑表示上调;↓表示下调;(?)表示可能性;?表示尚不清楚
除此之外,在细胞内还存在另一类G蛋白,这类G蛋白具有鸟核苷酸的结合位点,有GTP酶活性,其功
能也受鸟核苷酸调节,但与跨膜信息传递似乎没有直接相关。在结构上不同于前述的G蛋白,分子量较小,
在20~ 30kDa之间,不是以α、β、γ三聚体方式存在,而是单体分子,因此被称为小G蛋白(small G
proteins)。如ras表达产物为一种小G蛋白。小 G 蛋白同 ras 蛋白具有同源性,同属于 ras 超家族(ras
superfamily)。哺乳动物 G 蛋白中属 ras 超家族约有 50 多个成员,根据它们序列同源性相近程度又可
以分为 Ras、Rho 和 Rab 三个主要的亚家族。
2 G 蛋白的结构与功能
G 蛋 白 为 鸟 核 苷 酸 调 节 蛋 白 (guannine
nucleoside regulatory proteins),目前发现至少
存在20多种不同形式和功能的 G 蛋白。G 蛋白一般
存在于细胞膜上,由3个不同亚基形成的三聚体构成
5
(αβγ),总相对分子质量在 1.0×10 左右。其中不同
4
G蛋白中的β亚基都非常相似,相对分子质量在 3.610
3 3
左右。γ 亚基的相对分子质量在 5.010 ~ 8.010 左
右。大多数 G 蛋白中的γ亚基都是一样的(Gt除外)。
βγ 通常紧密结合,只有使蛋白质变性才能使之分开。 图 5-2 膜结合 G 蛋白异源三聚体结构
各种G蛋白的差别都在 α 亚基。
G 蛋白所有的 3 个亚基都进化形成了大量不同的亚型并对不同的效应分子发挥不同的作用。只有
α 亚基有鸟苷酸结合位点。失活态时 3 个亚基紧紧结合在一起。此时 α 和 γ 亚基有着脂肪酸结构的“尾”,
它能将它们连接到突触后膜内部的“小叶”上(leaflet),这种连接使G蛋白、受体和效应分子保持在同一个
2
平面中,同时也避免其扩散进胞内的溶质中(图 5-2)。
2.1 G 蛋白与受体的结合部位
细胞表面的受体通过与其相应配体作用后,可经不同种类的 G 蛋白偶联,分别发挥不同的生物学效应。
与 G 蛋白偶联的多种受体具有共同的结构功能特点:分子量 40~50 kDa 左右,由 350~500 氨基酸组
组成,形成 7 个由疏水氨基酸组成的α螺旋区段,反复 7 次穿越细胞膜的脂质双层。肽链的N末端在胞
膜外,C 末端在细胞内。N 末端上常有许多糖基修饰。从功能上看,受体的识别区域并不象一般想象的那
样在胞膜的外部,实际上是由 7 个跨膜区段间通过特定氨基酸残基之间的相互作用形成复杂的空间构象。
配体结合于识别区域之后,即导致整个受体构象的变化。受体肽链的 C 末端和连接第 5 和第 6 个跨膜
区段的第三个胞内环是 G 蛋白结合部位。目前研究发现,趋化因子受体家族(chemokine receptor family)
以及一些神经递质受体都属于G蛋白偶联的7次跨膜受体的超家族。例如IL-8RA胞膜外N端Asp11、Llu275、
Arg280 以及可形成二硫键的 Cys30 和 Cys277 在与配体结合中起重要作用;紧接第三个空膜区第二个胞
浆环中 DRY 序列对于与 G 蛋白的结合是必要的。
与 G 蛋白耦联的受体具有多种异构体。同一类型的受体还可分出不同的亚型。这种进化的最大
优点就在于,单一激动剂在不同细胞中可以激活不同的 G 蛋白,从而引发不同的第二信使反应。如
毒蕈碱型胆碱能 M1、M3 和 M5 受体直接作用于两种Gp而活化磷脂酶 C(PIE),而 M2、M4 受体则通过 Gi
抑制腺苷酸环化酶(AC),激活钾通道,然后进一步通过其他G蛋白或影响其他的反应。由于在激活G蛋
白能力上存在着差别,就可能在不同的组织产生不同等级的反应。
(1)Gs:细胞表面受体与 Gs(stimulating adenylate cyclase g protein,Gs)偶联激活腺苷酸环化酶,
产生 cAMP 第二信使,继而激活 cAMP 依赖的蛋白激酶。
(2)Gi:细胞表面受体同 Gi(inhibitory adenylate cyclase g protein,Gi)偶联则产生与 Gs 相反
的生物学效应。
(3)Gt:可以激活 cGMP 磷酸二酯酶,同视觉有关。
(4)Go:可以产生百日咳杆菌毒不导致的一系列效应。
(5)Gq:同 PLC 偶联,在磷脂酰肌醇代谢途径信号传递过程中发挥重要作用。
(6)小 G 蛋白:近年来研究发现小 G 蛋白,特别是一些原癌基因表达产物有着广泛的调节功能。
Ras 蛋白主要参与细胞增殖和信号转导;Rho 蛋白对细胞骨架网络的构成发挥调节作用;Rab 蛋白则
参与调控细胞内膜交通(membrane traffic)。此外,Rho 和 Rab 亚家庭可能分别参与淋巴细胞极化
(polarization)和抗原的提呈。某些信号蛋白通过 SH-3 功能区将酪氨酸激酶途径同一些由小 G 蛋白
所控制的途径连接起来,如 Rho(与 Ras 有 30% 同源性)调节胞浆中微丝上肌动蛋白的聚合或解离,从
而影响细胞形态。这一事实解释了某些含有 SH-3 的蛋白同细胞骨架某些成份相关联或调节它们的功能。
2.2 βγ 亚基的功能
G 蛋白的 β 和 γ 亚基通常紧密结合,在非失活条件下难以将二者分开。理论上推测至少应存在
20 种不同的 βγ 二聚体,βγ 作为二聚体发挥作用,但并未发现不同的 βγ 二聚体在调节功能上有显
著区别。
βγ 亚基的一个功能是将 α 亚基固定在细胞膜上,增加了局部 α 亚基的浓度,以此促进受体与 α 亚
基的耦联。βγ 的另一个功能是催化 GTP/GDP 的交换。实验表明没有 βγ 亚基的存在,受体便不能催化 GTP
和 GDP 的交换。
βγ 不但促进受体对 α 亚基的激活,而且能够抑制 α 亚基的活化。当 G 蛋白的 α 亚基被激活后,
它与 βγ 的亲和力降低,G 蛋白被分解成为游离的 α 和 βγ 亚基。根据热力学原理,βγ 亚基能异构抑制
GTP 的结合以及结合后的活化;反之,GDP 和 βγ 亚基都能彼此增加双方与 α 亚基的亲和力。这样,βγ 既
能通过稳定地与 GDP 的结合又可通过抑制与GTP的结合来抑制G蛋白的活化。在无激动剂作用受体的情况
下,βγ 亚基能够稳定地与GDP结合,使非活性状态的 G 蛋白处于一个较低活性的基础水平。此外,G 蛋
白活化后,解离的 βγ 能够与其他的 α 亚基相互作用,通过这种途径,任何一个 G 蛋白的活化都能抑制
膜上其他 G 蛋白的活动,保证了 G 蛋白调节的信号通路的特异性。最近的一些证据表明,βγ 二聚体可
3
对某种类型的环腺苷酸有直接的抑制作用。
3 G 蛋白激活的机理
G 蛋白在信号传递过程中的基本作用是连接受体和效应器,放大受体的反应,影响信号的时程和反应
强度,并通过将受体与其相应的效应器耦联的作用,对信号进行分类处理。受体与激动剂结合后构象发生
变化,这种变化导致 G 蛋白的一系列变化,并激活相应的效应器。
G 蛋白有两种构象:与GTP结合时呈激活状态,与 GDP 结合时呈失活状态,这两种状态的相互转换就
构成了 GTP 酶循环。在循环中,将 GDP 交换成 GTP 后就激活了 G 蛋白,但激活的过程是相当短暂的,
因为 G 蛋白是一种 GTP 酶,它使结合的 GTP 水解为 GDP。循环中,GTP 的水解和 GTP 与 GDP 的交换
是两个关键步骤,它的速率决定了两种状态的 G 蛋白的浓度及相对活性。在没有激动剂作用时,GDP/GTP
的交换是全部循环中最慢的步骤。Gs 蛋白的 3 个亚基正常时呈聚合状态,α 亚基与 GDP 结合(GαβγGDP),
与 GDP 结合的非活化状态的 G 蛋白占绝大多数,大约为 99%,这时的 G蛋白与受体呈低亲和力状态。当
受体与激动剂结合时,加快了 GTP/GDP 的交换速率,因而增加了结合 GTP的活性 G 蛋白的数量。在受体
受到较强刺激的情况下。有大约 60% 的 G 蛋白可保持在活性状态。
G 蛋白耦联受体催化核苷酸交换的机制是一种别构作用,即两个配基结合于一个蛋白质的不同部位,
其中一个配基的结合会降低另一个配基的亲和力。例如 cAMP 激活依赖 cAMP 的蛋白激酶都是通过这一相似
的机制。G 蛋白循环所建立的这样一种负别构作用的最重要意义在于调节 GTP/GDT 的转换速度,也就是说,
是为了通过一个配基的结合来增加另一个解离得很慢的配基的解离速度。从热力学角度考虑,如果与激动
剂结合的受体降低了 G 蛋白与核苷酸的亲和力,核苷酸也会相应
地降低 G 蛋白与激动剂结合的受体的亲和力。在细胞内,由于 GTP
的数量远多于 GDP,GTP/GDP 就形成了一个循环,即受体取代 GDP,
然后又被 GTP 取代,释放出的受体又去促进其他 G 蛋白分子的活
化。
G 蛋白的 GTP 酶活性就像一只分子定时钟,限定了活性态的
时程,经离体测定,GTP 的催化作用较慢,结合型的 GTP 分子的
寿命约为 3~15s。
由于受体能很迅速地刺激 GTP/GDP 的交换,这表明每个结合
激动剂的受体能催化激活多个 G 蛋白分子。也就是说,全部受体
中可能只需要部分受体与激动剂结合,就可以达到对效应蛋白的
最大激活作用,因而存在着“空余受体”(spare receptor)。当
受体的催化作用增强时,对激动剂的敏感性增强。如果细胞内受
体的总量增多,产生最大效应所需的激动剂占据的受体的数量就 图 5-3 G 蛋白激活与失活态的循环
会减少,相应细胞对激动剂的敏感性就会增高。
因而细胞能够通过控制其表面的受体的数量,在
相当宽的范围内调节对信使分子的敏感性。
与 G 蛋白耦联的受体具有惊人的放大能力。
例如在蛙的视网膜上,通过一个光子作用的单个
漂白的视紫红质分子,可以激活大约 37 000 个 G
蛋白分子。即使在分化程度较低的细胞,单个受
体也能激活 lO~20 个 G 蛋白分子。
图 5-3 示 G 蛋白对其他分子活动的“开”、
“关”调节 这种“开”、“关”调节主要是通
过将 GTP 水解成 GDP 来实现的。水解的发生是通
过 GTP 本身的 GTP 酶活化晤后完成的 当 G 蛋白
处于失活或“关”的状态时,G 蛋白和 GDP 紧密结合
-1 图 5-4 受体分子与 G 蛋白分子的功能共轭偶联
在一起.这时 GDP 释放的速率常数少于 O.03min 。
4
当 GDP 被释放的时候,G 蛋白进入了一个瞬时“空”的或“中性”状态,通常这时在细胞质中存在一个较
高的 GTP/GDP 浓度比,因而 GTP 与 G 蛋白结合。GTP 的结合引起了 G 蛋白构型的变化,因而转变成“开”
或激活态(通常用 G*来表示) 这种开的状态能够进一步激活细胞内其他的生物化学反应,但它也能催化
GTP 水解成 GDP + Pi,因而使它又回到初始状态(图 5-4)。
4 与 G 蛋白耦联受体的信号传递
与 G 蛋白耦联的信号传递系统主要包括 3 大部分:受
体、G 蛋白和效应器。G 蛋白的基本作用是连接受体与效应
器。结合后发生构象的变化,这种变化导致 G 蛋白的一系
列变化,并激活效应器。目前所知与 G 蛋白耦联的受体和
效应器的种类相当多,因而通过 G 蛋白的耦联形成了一个
庞大的信号体系。不同的受体可以和不同的 G 蛋白相耦联,
而不同的 G 蛋白又可以激活不同的效应器。从另一个角度
来说,来自不同受体的信息可以会聚到少数的几个效应分
子上;相反,如果一个受体可以激活两个或两个以上的调
节通路时,信息则可以辐散使其得到放大。通过信号系统
的这种酶的级联反应,我们可以想象发生在机体中的各种
生物化学反应和信号传递过程是如何复杂。
尽管不同的 G 蛋白都有其特殊的调节方式和过程,但
它们都有其共同的作用方式。通过下面一些具体的例子,
我们可以了解在信号传递过程中,G 蛋白是怎样发挥其特异
作用的。
4.1 信号通过肾上腺素能受体的转导
应用拮抗剂和激动剂的药理学方法对肾上腺素能受体
(adrenergic reptor,AR)进行了研究,证明了肾上腺素和
去甲肾上腺素能受体亚型。
应用分子生物学技术对肾上腺素β2 受体(β2-AR)进行
了克隆。首先应用生物化学手段对受体进行了分离和提纯,
然后通过免疫组织化学方法从提纯的β2-AR 中获得了小肽
片段,并对其氨基酸序列进行了分析,同时制备了寡聚核
苷酸探针。使用此探针从仓鼠基因文库中找到了β2-AR 基
因,然后克隆并分析了它的核苷酸序列。根据β2-AR 基因
推断出其受体是由 418 个氨基酸组成的蛋白质。疏水跨膜序
列分析表明,它存在 7 次疏水跨膜结构,因而也具有 7TM 跨膜
螺旋结构。儿茶酚胺配基可以深深插入 7 次跨膜结构中,并
与来自第三、四、五和六螺旋域的氨基酸侧链发生反应。 图 5-5 去甲肾上腺素与受体作用耦联机
图 5-5 示 G 蛋白信号系统与肾上腺素能β2 受体间的相互 理 c:腺苷酸环化酶;cAMP:环化腺苷
作用。当没有 NE 信号存在时,膜中 3 种蛋白β2-AR、G 蛋白 酸;NE:去甲肾上腺素。R,G,C 蛋白的
和腺苷酸环化酶(c)都在膜中呈游离状态。毫无疑问,它们能 激活形式分别用带点的图表示
够来回滑动有时并互相碰撞,然而它们却不会粘合在一起。当去甲肾上腺素到达膜的外表面并和β2-AR 发
生作用时,使β2-AR 的构型发生改变,这种改变增加了受体与 G 蛋白和γ亚基之间的粘性。G 蛋白形态发
生变化,导致α亚基的游离并释放 GDP,实现 GDP/GTP 的交换。与此同时,α亚基也发生构型的变化,导
致它与腺苷酸环化酶的粘合力增加并激活后者。在腺苷酸环化酶的催化下,ATP 脱磷酸变成 cAMP。cAMP 作
为细胞内重要的第二信使扩散进细胞液进一步发挥影响。G 蛋白的α亚基同时将结合的 GTP 脱磷酸变成
GDP,与腺苷酸环化酶脱离并恢复到原来的构型。当它与βγ复合物相遇时,再一次形成无活性的 G 蛋白
5
αβγ复合物,准备重新开始新的循环。
我们已经知道 G 蛋白的α亚基有两种形式,一种为 Gs,另一种为 Gi,它们分别兴奋和抑制腺苷酸环化
酶。让我们概括一下这个复杂系统的生物化学意义。首先,单个 NE 分子能够引起数百个 cAMP 第二信使的
合成,这是因为激活一个β-AR 可以引起数十个 G 蛋白的解离(不要忘记膜具有三维结构)。在α亚基脱磷
酸化之前,Gs 和环化酶的作用可能或多或少延迟一段时间,导致数百个 cAMP 的合成。此系统的信号因此获
得了放大。其次,至少存在 6 种不同的腺苷酸环化酶对激活的β2-AR 发生反应,因而这种变化能从一个膜
传到另一个膜。再次,G 蛋白的 a 亚基可以改变对环化酶的
影响,也就是说,它们能够发挥激活或抑制作用。最后,βγ合物也能对不同的腺苷酸环化酶施加不同的
影响。
已经知道 cAMP 的重要功能是可激活蛋白激酶 A(PKA),PKA 可以使细胞蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸残
+ 2+
基上的羟基磷酸化,而这些残基很可能是通道的组成部分,它们参与 K 和 Ca 的流动的调控,因而能记录
到由此产生的细胞膜电位的长时程效应。PKA 还能使β-AR 本身脱敏。这是由于受体 c 端的丝氨酸和苏氨
酸磷酸化产生的。事实上,这种脱敏尽管对β1-AR 或其他的受体是有效的,但对β2-AR 没有什么意义。此
外,还存在另一种激酶,β肾上腺素受体激酶(β-adrenergic receptor kinase,β-ARK),也能使 C 端
的苏氨酸和丝氨酸残基磷酸化。在这两种情况中,都可能存在一种β阻抑因子(β-arrestin),它能与受
体结合并防止受体与 G 蛋白的进一步作用。最后,如果受体较长时间暴露于激动剂中时,通过膜的凹入使
整个受体随同凹入的膜一同被移走。
4.2 信号通过促代谢型受体的传递
我们已经知道谷氨酸能受体(glutamate receptors,GluRs)
能够控制离子通道,也就是说谷氨酸能受体是一种促离子型受
体。直到近期人们才发现还存在另一种类型的谷氨酸受体,即 图 5-4 去甲肾上腺素与受体作用耦联机
与 G 蛋白耦联的促代谢型谷氨酸能受体(mGluRs)。这样,作为 理 c:腺苷酸环化酶;cAMP:环化腺苷酸;NE:
一种氨基酸,谷氨酸具有和 ACh 相似的作用。两种递质有着不 去甲肾上腺素。R,G,C 蛋白的激活形式分别用
同的受体:促离子型的和促代谢型的。
第一个被克隆的 mGluR 是从非洲蟾蜍卵母细胞中获得的,这
是因为它不具有与其他 7TM 受体相类似的序列。当 1991 年发表了
它的序列后,它即被用来作探针去研究脑中 cDNA 文库中的一些基
因,很快,先后发现了其他 5 种 mGluR,目前第六种 mGluR 也已
被发现。 图 5-6 谷氨酸能受体
所有的 mGluRs 都是大的蛋白质(854~1179 氨基酸),7 个疏 柱状结构示 7 次跨膜螺旋能结构, Y 和 P
细胞外,C 端在胞浆,并有一些脱敏和磷酸化位点。M5 和 M6 之间
的胞浆环很短,但在 mGluR 家族中具有高度保守性,推测这个区域对与 G 蛋白的耦联起着关键作用。尽管
它的三级结构与其他 7TM 受体相似,但在氨基酸序列和总的构型方面却存在着较大的差别,这表明 mGluR
在进化上可能是独立的,与其他 7TM 受体形成了不同的类型。由于存在前体 mRNA 剪接,因而能产生不同
的 mGluR 亚型,如 mGluRla,mGluRib 和 mGluRlc 等。
促代谢型 mGluRs 能对谷氨酸、使君子酸(QA)和 tACPD(trails-1-aminocyclopen-tane-1,3-decarboxy-
late) 产生强烈反应,然而这些反应是不同的。mGluRl 和 mGluR5 有着一个较大的近 20mV 的、长时程(5~
10s)的振荡电位。这种反应类型表明,它是经过 G 蛋白和磷脂酰肌醇(phosphatidyl inositol,PI)耦联
2+ 2+ 2+
系统来实现的。这个系统能导致 Ca 从内质网或其他途径的释放,然后 Ca 作用到 Ca 依赖通道引起振荡电
位。还有证据表明,其他的第二信使系统也能被激活,其中包括腺苷酸环化酶和 cAMP。
mGluR2,3,4,和 6 的信号转导是通过不同系统完成的,它们通过抑制 G 蛋白系统与腺苷酸环化酶相连。
这个系统的激活能阻断 cAMP 的产生。当然,cAMP 存在多种效应功能。如果它引起膜的去极化,继而产生
一个兴奋性电位,那么 mGluRs 的激活将可以抑制神经元的兴奋,当然最终产生的效应还取决于受体所在
的神经元的类型。如果是存在于兴奋性神经元上,它们的作用是去抑制该神经元的兴奋性;如果是存在于
6
抑制性神经元上,抑制的结果将产生兴奋。
mGluRs 广泛分布在哺乳动物的脑中,主要分布在突触后膜上。一个非常有趣的现象是,许多促代谢型
谷氨酸能受体与促离子型谷氨酸能受体在脑中的许多部位是相互重叠的,推测两种类型的受体可能存在一
定程度的协同调节。
5 G 蛋白对效应蛋白的调节
目前已经确认的 G 蛋白的调节效应物大约有 10 种,可以相信,一些新的 G 蛋白一效应物耦联的类型
将会不断被发现。各种效应蛋白间的差异非常大,它们包括合成或降解第二信使的酶电压依赖性的离子通
道以及膜的转运蛋白。
5.1 对腺苷酸环化酶的调节
腺苷酸环化酶(adenylvl cyclase,AC)是细胞内制造
产生环磷酸腺苷(cAMP)的酶。一些激素和介质是通过调节
细胞膜上 AC 的活性来产生效应的。几乎在每一种动物细
胞中都能发现 AC,它大约由 1100 个氨基酸残基组成,是
5
相对分子质量为 1.5×10 的膜整合蛋白,由两条 6 次跨膜
肽链和很长的胞内域连接形成(图 5-7)。AC 催化 ATP 生成
3',5'-环腺苷酸,AC 作用的底物和产物均为水溶性的。 图 5-7 腺苷酸环化酶
已知存在两种 G 蛋白与受体和腺苷酸环化酶相耦联 平面图示 12 次跨膜段和极长的胞内 N 端域
(图 5-8)。激活腺苷酸环化酶的受体通过
Gs 与之耦联,这些受体与激动剂结合后,
均能通过 Gs 激活 AC,形成 AC·Gs·GAP 复
合物。
抑制腺苷酸环化酶的受体通过 Gi 与
之耦联。当 Gi 激活后,随着 Giα的解离,
释放出βγ亚基, 使其与活化的 Gsα结合,
从而降低来自 Gs 的作用。由于 Gi 的含量
大大高于 Gs,因而 Gi 释放出的βγ亚基
可显著中和 Gsα的作用,结果通过 Giα和
βγ的共同作用使 AC 活性降低。 图 5-8 Gs 和 Gi 对腺苷酸环化酶的调节
5.2 对磷酸二酯酶的调节
G 蛋白能够通过调节 PDE 活性来调节视网膜光的转导。在脊椎动物的视网膜中,存在一种对光敏感的
G 蛋白耦联受体,为视紫红质,它启动一条信号转导通路,最终导致质膜的阳离子通道的关闭,使光感受
细胞产生超极化。在此过程中,光子首先激活了视紫红质,然后由其催化激活 Gi,再激活 PDE,使 cGMP 的
水解加速,进而引起质膜上钾通道电流的减少,使膜超极化,降低了神经递质释放的速率。
7
5.4 对不依赖于第二信使的离子通道的调节
一般来说,G 蛋白的功能都涉及到酶活性的变化,这种变化导致了细胞内信息分子的变化,从而调节
细胞功能。然而最近的一些研究表明,细胞膜上的钾通道和钙通道等一些离子通道也受激素或递质的调节,
这表明细胞膜电位及细胞膜离子通透性的变化,能够受多种方式的调节,很可能也包括了 G 蛋白的调节。
在心脏的节律细胞,迷走神经释放 ACh 后,激活这两种细胞膜上的 M 受体,导致钾通道开放,形成细
胞膜的超极化状态,从而使细胞的节律性去极化减慢。人们很早以前就发现,给予 ACh 以后,膜电流的变
化并非立即发生。现在认为,这主要是在胆碱能 M 受体与钾通道之间存在着 G 蛋白的介导。一些研究发现,
Gi 的α亚基可以直接激活膜上的钾通道,而 Gi 的β、γ亚基则无明显的作用。另一些学者发现从牛脑中提
取的 Gi 蛋白的α亚基不能激活钾通道,但β、γ亚基却能激活钾通道,这些事实均表明 G 蛋白参与钾通道
的调节是可能的。
G 蛋白对钙通道的调节可能有两种方式:一种与上述钾通道的调节类似,即 G 蛋白与钙通道耦联发挥
直接的调节作用;另一种方式为间接调节。例如儿茶酚胺能激活β受体,通过 Gs 使 AC 活性提高,产生大
量的 cAMP,提高了蛋白激酶 A 的活性,而钙通道恰是这些蛋白激酶的底物之一。也就是说,蛋白激酶 A 使
钙通道磷酸化,改变其活性,达到其间接调控离子通道的作用。
第二节 第二信使系统
1905 年,Starlin,Bayliss 发现促胰液肽后,首先使用“激素”一词,其作用形式有别于神经
调节的,它是依赖血液循环转运的化学信使,从而引进了不同信使分子的概念。细胞内外信息联系和
调节是通过一定组织分泌的化学物质作为信息分子,经一定的途径在细胞间传递,它是细胞间传递信
息的主要方式。
具有信息传递功能的分子统称为信使物质。在细胞生物学及生理学中,一些细胞外的信使物质,
如激素、神经递质等被称为第一信使。根据溶解性,第一信使分子分为亲脂性和亲水性两类。亲脂性
小分子的主要代表是类固醇类激素和甲状腺激素,它们很容易穿过靶细胞的质膜进入细胞,与细胞质
或细胞核中的受体结合形成配基一受体复合物。此复合物通过与 DNA 的特定控制区结合,改变基因的
表达,来特异性影响机体组织的生长和分化。亲水性信号分子的数量较多,如神经递质、生长因子、
细胞因子和大多数激素类物质等,它们不能穿过细胞质膜的双脂层,仅能与细胞表面上的特殊受体相
结合,当这些第一信使作用在靶细胞上的受体后,引起细胞内新的信号物质的产生,这些物质是连接
外界(第一信使)信息和细胞中的效应机制(代谢过程、基因、离子通道等)的中介物,我们将其称为第
二信使。如 cAMP/cGMP 核苷酸类,膜肌醇磷脂代谢产物如、DG 以及花生四烯酸的代谢产物等。近年的
研究还发现,还有一类存在于细胞核内外的信使物质,它们涉及生长因子、转导蛋白、蛋白激酶以及
某些癌基因产物,它们参与基因调控、细胞增殖与分化、肿瘤的形成等过程,我们将这类分子称为第
三信使。
尽管目前对信使的研究已经获得了极大的进展,如对受体、递质、G 蛋白、与 G 蛋白耦联的各种
不同的第二信使通路的研究,似乎使我们已经掌握了生命信息传递的基本轮廓,然而活细胞内所发生
的各种生物化学反应就如一个极为复杂的网络,网络上的任意一点的改变都将会产生不同的效应。据
估计一个真核细胞内的不同的蛋白激酶就多达上千种,可以想象它所涉及到的细胞内的生物化学反应
将是何等复杂。如何从这些错综复杂的似乎无章可寻的各种反应中寻找出牛命活动的轨迹,将是对神
经科学的最严峻的挑战。
在所有细胞中,神经元的活动也许是最为复杂的。储存、处理与再现信息,是神经系统的最基本
功能。我们有理由相信,尽管神经元几乎代表了细胞分化的最高水平,它们活动的复杂程度是其他各
类细胞远不能相比的,然而它也是从其他的信号通路中进化而来的。神经元的产生、迁移、分化和成
熟等一切活动,除了具有其独特的特征外,都应具有信号传递的共同形式和规律。
本章将主要讨论神经元内的一些主要信号通路,它涉及到一些重要的第二信使。这些信使主要分
2+
为以下几类:① 环核苷酸类,cAMP,cGMP;② 肌醇磷脂的代谢产物 IP3、DG;③ Ca ;④ 花生四烯
酸代谢产物 AA。
8
1 环核苷酸系统
环 核 苷 酸 类 有 介 导 儿 茶 酚 胺 类 神 经 递 质 的 作 用 。 3',5'- 环 磷 酸 腺 苷 (cyclic
adenosinemonophosphate,cAMP)作为环核苷酸的经典的第二信使,行使调节激素、神经递质和自体
活性物质的作用。cAMP 作为第二信使的标准有如下几点:
① 激素作用于完整细胞时,cAMP 的含量增加;② 激素效应发生在 cAMP 浓度升高以后;③ 存在
催化合成 cAMP/cGMP 的特异酶类;④ 存在核苷酸的特异分解途径;⑤ 一些外源性非水解类 cAMP 能
+
模拟激素的作用;⑥ 磷酸二酯酶抑制剂加强激素的作用;⑦ 除 cGMP 调节 Na 电流外,所有已知的环
核苷酸的作用都通过激活环核苷酸依赖的蛋白激酶来实现。
1.1 cAMP 系统
1.1.1 cAMP 第二信使系统的基本构成
参与 cAMP 合成调节的主要有 3 种相互独立的生化组分。这些组分只有紧密联系在一起时才有活
性,每一种成分对 cAMP 的合成都是必须的。它们分别是:配基作用的受体 R;作为与受体和效应物中
介耦联的 G 蛋白;腺苷酸环化酶催化亚基 C。
(1) 受体 所有受体都有与 G 蛋白耦联受体的共同结构,即具有 7 次跨膜α螺旋疏水区的同源结
构,具有与配基结合位点。细胞膜上的受体都与腺苷酸环化酶(AC)系统耦联。存在两种类型的受体,
Rs 型和 Ri 型。Rs 受体能够通过 Gs 刺激腺苷酸环化酶的活性,提高胞内 cAMP 的水平。已知有几十种 Rs,
其大小、形状以及与激素结合部位的特异性不同。属于这类受体的有肾上腺素β受体、垂体后叶加压
素受体、胰高血糖素受体、促黄体生成素激素受体、促卵泡激素受体、促甲状腺激素受体、促肾上腺
皮质激素受体等。抑制型 Ri 受体通过 Gi 抑制腺苷酸环化酶的活性,从而抑制 cAMP 的生成,降低了胞
内 cAMP 的水平。已知存在几十种 Rs 受体。属于这类受体的有。肾上腺素α2 型受体、阿片肽能受体、
胆碱能 M 受体和生长激素释放抑制因子受体等。在一个特定的细胞中,可以有任何类型的上述受体存
在。
(2) G 蛋白 见前。
(3) 腺苷酸环化酶催化亚基 腺苷酸环化酶(AC)是一种跨膜糖蛋白,有多种亚型,主要有两种:
5 2+
一种存在于脑组织,相对分子质量为 1.25×10 ,可为 Ca /CaM 所激活;另一种存在于心脏,是外周组织
5
AC 的主要形式,相对分子质量为 1.50×10 ,其活性由 Gs 介导。AC 主要位于质膜的内侧,催化亚基 C 与
2+
Gs 形成复合物,催化底物 Mg -ATP 生成 cAMP。
2+
除上述组分外,GTP、Mg 、核苷酸二磷酸激酶(NDPK)均为 AC 活化过程所必须。当配基与受体特异结
合后,导致受体的构象改变并在膜上位移和聚集。激活后的受体在膜脂的环境里与 G 蛋白(Gs)迅速结合,
2+
发生 GTP/GDT 的交换,使 Gs 活化。形成的 Gs-GTP 复合物激活 AC,后者催化 Mg -ATP 生成 cAMP。Gs 本身具
有 GTP 酶活性,使 GTP 水解为 GDP,从而使 Gs 失活。
1.1.2 细胞内 cAMP 浓度的调节
细胞内 cAMP 的浓度取决于它的合成酶腺苷酸环化酶(AC)和它的降解酶磷酸二酯酶(PDE)二者之间的平
衡。
已知存在多种磷酸二酯酶(PDE)催化 cAMP 水解。PDE 的作用发生在第二信使的效应开始后,PDE 水解
2+ 2+
cAMP 为 5-AMP。当受体与配基作用后,胞内 Ca 浓度升高,激活了 Ca /钙调素依赖的 PDE。环核苷酸依赖
的 PDE 有明显的异质性,有高 Km 和低 Km 之分,其中有的是位于胞浆的可溶性酶,有的是位于质膜的颗粒
性酶。目前知道可溶性的 PDE 有 4 种主要类型:① 钙调素依赖的 PDE;② 被 cGMP 激活的 PDE;③ 被 cGMP
抑制的 PDE;④ 特异水解 cGMP 的 PDE。PDE 在控制细胞内 cAMP 水平方面可能起着决定性的作用。
腺苷酸环化酶所催化形成的 cAMP 如果过多,将很快被水解掉。腺苷酸环化酶是质膜蛋白,环核苷酸
2+
磷酸二酯酶是胞液蛋白,两种酶的活力都受到调节。如 AC 受 Gs 和 Gi 的调节,磷酸二酯酶受 Ca 的调节。
9
1.1.3 细胞内 cAMP 的信使效应
细胞内的绝大多数生理功能是通过蛋
白激酶 A(adenosine protein kinase,PKA)
实现的。除在嗅上皮外,已知真核细胞中
cAMP 调节的效应物是 PKA。嗅上皮细胞内的
cAMP 直接调节离子通道。
PKA 为一四聚体,由两个调节亚基(R)
和两个催化亚基(c)组成,每个调节亚基相
4
对分子质量为 5.0×10 ,与另一个相对分子
4
质量为 4.2×10 的催化亚基相结合,全酶
(R2C2)时无活性。cAMP 与调节亚基 R 结合后,
释放出游离的催化亚基 C,并促使靶蛋白磷
酸化,进而产生多种生理、生化效应(图
5-9)。被释放的 PKA 的催化亚基可进入核中
磷酸化一种 CREB 蛋白,CREB 可作为基因调
节蛋白来影响靶基因的表达。 图 5-9 cAMP 对离子通道的调节
蛋白激酶的作用是把 ATP 上的磷酸催化 cAMP 与一个大的四聚体一蛋白激酶 A(PKA)作用。PKA 由两个
1.2 cGMP 系统
在哺乳动物组织里普遍存在鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase,GC),催化 GTP 生成 cGMP。有两种
鸟苷酸环化酶,一种是存在于胞液中的可溶性
酶;另一种结合于质膜上,两者的调节方式各
不相同。两种类型的鸟苷酸环化酶都含有催化
域,其顺序与腺昔酸环化酶的催化域相似 (图
5-10)。
膜结合鸟苷酸环化酶与水溶性鸟苷酸环化酶
均含有催化域,其顺序与腺苷酸环化酶的催化域
相似:三者的同源部分均以黑色柱束表示。膜结
合鸟苷酸环化酶是肽类激素 ANP 的受体,肽结合
域位于胞外,而鸟苷酸环化酶则位于胞内。 图 5-10 两种类型的鸟苷酸环化酶
10
1.2.1 cGMP 浓度的调节
cGMP 细胞内浓度受鸟苷酸环化酶和 cGMP 磷酸二酯酶的调节。cGMP 的水解受环核苷酸依赖的磷酸二酯
2+
酶的催化。在钙调素存在的情况下,Ca 可激活 cGMP 磷酸二酯酶,因此增加 cGMP 的水解。
cGMP 发挥效应是通过 cGMP 依赖的蛋白激酶(PKG)参与的蛋白磷酸化作用。与 PKA 不同的是,PKG 的调
4
节亚基与催化亚基是在同一个分子上,相对分子质量约为 7.6×10 ,在其 N 端有两个与 GMP 结合的位点。
PKG 的催化域与 PKA 相似,也是处于 C 端。
1.2.2 cGMP 对光线的反应
哺乳动物的视网膜中存在两种光感受细胞,视锥细胞(cone cells)和视杆细胞(rod cells)。两种感
受细胞具有视觉感光色素。视锥细胞能感受强光和色觉,而视杆细胞能够感受弱光。
杆状细胞的质膜及其盘状体上存在对光敏感的与 G 蛋白耦联的受体—视紫红质,其羧基端在光照后可
被视紫红质蛋白激酶磷酸化。视杆细胞有 3 个主要隔室:外段含有层叠的膜性盘状结构,它富含感光的视
色素视紫红质(rhodopsin);内段含细胞核及生物合成机器;其突触终末能释放神经递质。在暗处,视杆
+ + +
外段细胞膜对 Na 的通透性高于内段,而对 K 的通透性低于内段。外段 Na 的高电导驱使膜的静息电位趋于
去极化方向,处于一种部分去极化状态,仅-30mV,它造成暗处下的突触持续不断地释放递质,作用于双
极细胞。在亮处视紫红质吸收光线,使外段的一些钠通道关闭,这就导致了超极化,使递质的释放减少。
光感受器的敏感性极高,完全暗适应的视杆细胞仅需吸收一个光子即可关闭数百个钠通道,并产生约 1 mV
的超极化,吸收 30 个光子即可使超极化达到最大值的 50%。
视紫红质共价结合于一种内源性拮抗剂发光色团 11-顺-视黄醛。在光线作用下,视黄醛异构变为全反
式而成为激动剂。活化的视紫红质激活 Gi,继而激活 cGMP 磷酸二酯酶(PDE),PDE 降低了 cGMP 的浓度。
视杆细胞膜电位状态受细胞内 cGMP 浓度的调节。在黑暗中,cGMP 的浓度较高,促使细胞膜上的钠通道开
+ 2+ + 2+ + 2+
放,Na 与 Ca 同时进入杆细胞的外层。此时,通过细胞膜上的 Na -Ca 交换使 Na 进入胞内并排出 Ca 。在
6 +
暗中,估计平均每秒有 1.5 × l0 个 Na 进入细胞内。由于激活的 PDE 的作用降低了细胞内 cGMP 的浓度,
+
减少了进入细胞内的 Na ,使细胞膜处于超极化状态。
在黑暗的条件下,几乎所有的 Gαt 都与 GDP 结合,这时它不具有影响 cGMP 的活力。暗处 cGMP 的浓度
高,它直接和钠通道结合,使其开放。光照使视紫红质(R)被激活成为 R*、R*与βγ结合后,促使其释放
出 GDP 而与 GTP 结合,形成 R*·Gαt·GTP 复合物。这时 R*及 Gαt 的βγ亚基分别从 R*·Gαt·GTP 复合物
中释出,R*重新用来激活其他的 Gαt,而 Gαt·GTP 则进一步与 cGMP 磷酸二酯酶结合,使之从非活性状态转
化为活性状态,水解 cGMP,从而降低细胞内的 cGMP 浓度,使某些钠通道关闭,视杆超极化。在上述过程
中,一个被光激活的视紫红质分子可以被反复使用 500 次之多,因而能够使光信号在此过程中被放大 500
倍。
被激活的磷酸二酯酶(PDE*·G α t·GTP)
水解 cGMP;同时与 Gαt 结合的 GTP 被 Gαt 本身
所具有的 GTP 酶水解成为 GDP,结果使 PDE*
转化为非活性状态,复合物解离,Gαtβγ重
新与 Gαt·GDP 结合成为 Gαt·GDP,使此过程
不断循环(图 5-11)。
光感受细胞上的 cGMP 磷酸二酯酶是结合
于细胞膜上的外周蛋白,由αβγ2 四聚体组
成。α和β亚基的催化作用受γ亚基的抑制。
活化的 Gαt 先结合于γ亚基,并使其与全酶分
离,因而解除了对α和β亚基的抑制,使其被
激活。GTP 的水解使 Gαt 失活,将γ亚基释放,
后者又可结合在磷酸二酯酶上,抑制其活性。
1.2.3 NO 激活鸟苷酸环化酶
目前为止还未发现激素对鸟苷酸环化酶
的直接作用。在小血管平滑肌发现 NO 能够激 图 5-11 Gαt 蛋白对 cGMP 磷酸二酯酶的调节作用
11
活腺苷酸环化酶。副交感神经释放的 ACh 能够引起体内小血管的舒张,但这个舒张作用并非是乙酰胆碱直
2+
接作用所引起。ACh 首先与内皮细胞上的 mAChR 结合,使胞液内的 Ca 浓度升高,激活 NO 合成酶。NO 合成
2+
酶是一个 Ca /钙调素依赖酶,它催化精氨酸的分解,生成气体分子 NO。在有氧的体液条件下,NO 的半衰
期仅为 3~5s。NO 弥散到邻近的平滑肌细胞激活可溶性的鸟苷酸环化酶,进而增加了 cGMP 的浓度,从而
刺激 PKG,使肌蛋白磷酸化,引起平滑肌的收缩。
NO 对腺苷酸环化酶的作用已经在不同的组织细胞中被发现。例如 NO 通路中所需的酶在神经元内也存
2+
在。在小脑颗粒细胞内有高浓度的 NO 合成酶。颗粒细胞上的 NMDA 受体接受谷氨酸刺激后,Ca 可能经 NMDA
受体内流,引起 NO 合成酶的活性增加,使在颗粒细胞内合成的 NO 弥散进入邻近的浦肯野细胞,在浦肯野
细胞内有鸟苷酸环化酶,从而增加了 cGMP 的合成。事实表明,在浦肯野氏细胞内恰恰存在着大量的 cGMP
依赖的蛋白磷酸化作用。
2 肌醇磷脂系统
膜肌醇磷脂系统是细胞内存在的一条非环核苷酸类
的第二信使通路。该系统主要由磷脂酰肌醇代谢产生的两
个 第 二 信 使 1,4,5- 三 磷 酸 肌 醇 (Inositol
1,4,5-triphosphate, IP3) 和 二 酰 基 甘 油
(diacylglycerol,DG)介导细胞效应,构成了信息传递的
通路。
2.1 肌醇磷脂代谢
肌醇磷脂代谢包括肌醇磷脂的合成、分解及第二信使
的产生和降解。肌醇磷脂 [磷脂酰肌醇,PI;4-磷酸磷脂
酰肌醇,PI(4)P;4,5-二磷酸磷脂酰肌醇,PI(4,5)P2] 只占
质膜总脂的 5%~10%,然而却是最活跃的一类,大部分分
布在质膜的内侧,部分分布在内质网。
PI 存在于细胞的内膜上,经 PI 激酶、PIP 激酶两步
磷酸化生成 4-磷酸磷脂酰肌醇 PIP 和 4,5-二磷酸磷脂酰
肌醇 PIP2。当第一信使与受体蛋白结合后,可激活一种 GTP
结合蛋白来刺激磷酯酶 C(PLC),水解 PIP2 成两个第二信
使分子三磷酸肌醇 (IP3)和二酰基甘油(DG)。细胞中存在 图 5-12 肌醇磷脂循环
IP3、IP2 和 IP 磷酸单酯酶(5-PME)分别作用于相应的磷酸 外界信号通过磷酯酶 C(PLC)作用于 PIP2。使之断
3 Ca2+的第二信使作用
2+ 2+
Ca 作为一种耦联因子参与信使作用。Ca 在肌肉组织的兴奋-收缩耦联中的作用是最先获得研究的。
2+ 2+
现在发现,Ca 广泛参与机体的各种生理调节。在肌醇磷脂代谢中,Ca 、IP3 和 DG 一起被确认为第二信使
联合体。
2+ 2+ 2+
Ca 的生物学功能在相当大的程度上是建立在细胞内外 Ca 分布的不平衡上。胞外液中的 Ca 浓度为
2+ 2+
1.8mmol/L,而胞内游离 Ca 的浓度约为 O.1umol/L。内质网,肌质网和线粒体都具有聚集 Ca 的能力,其
2+ 2+
浓度与胞外 Ca2+浓度相当,这种显著的浓度差成为 Ca 发挥第二信使作用的生理基础。估计细胞内 Ca 上
升 l umol/L,便能触发不同的细胞效应。
2+ 2+
细胞液 Ca 浓度的测定是相当困难的,主要原因在于静息时 Ca 的浓度很低,而其他一些干扰离子如
2+ + + 4 6 2+
Mg 、Na 、K 等的浓度都要比它高出 10 ~10 倍。此外,由于胞液中 Ca 的浓度变化异常迅速,常在 1s 内
2+
就有较大的变化,因此一个理想的 Ca2 的指示剂不但要有高的选择性和高的灵敏度,而且需要有很高的时
2+ 2+
间分辨率,才能反映 Ca 的动力学变化过程。近年来成功应用了一种化学发光蛋白水母荧光素,作为 Ca
2+ 2+
的指示剂获得了很大的成功。最近又发展了一类 Ca 螯合剂 EGTA 类的指示剂,如 Fura-2。当 Ca 与 Fura-
结合时将会增强激发波长 340~350 nm 的发射强度而同时减弱激发波长为 380~390nm 的发射强度。因此,
2+
如果用两种波长(350nm,380nm)的紫外光去激发细胞,则 Ca 的浓度可从两种波长所激发的强度之比来加
以测定。人们把 Fura-2 带电羟基改造成酯,Fura-2 酯可以顺利通过细胞脂膜,然后被酯酶分解形成多羧
2+ 2+
基分子后与 Ca 螯合成为 Ca 的指示剂。这样仅需将 Fura-2 酯放入细胞介质中,而不必将其用微电极注入
到细胞内即可达到目的,因而极大地简化了实验过程。
表 5-2 受钙调素调节的酶
13
3.1 Ca2+/钙调素
2+ 2+
Ca 的效应大多是通过一些 Ca 结合蛋白、或某些受钙调节的酶或
2+
蛋白来介导。其中一种 Ca 结合蛋白的钙调素(calmodulin,CaM)最为
重要,它是细胞溶质中含有 148 个氨基酸的蛋白,相对分子质量为
4
1.67×10 ,由单链组成,广泛存在于所有的真核细胞中,在神经组织
2+
和内分泌组织中的含量较高。CaM 是细胞内 Ca 的受体,它有 4 个结
2+ 2+
构相似的与 Ca 结合的结构域位点,每个结构域可结合一个 Ca 。CaM
2+
本身无活性,当它与 Ca 结合后,引起 CaM 构象的改变,使之与受体
酶结合形成了活化的钙调素一酶复合物,从而启动靶酶引起生理效
应。
钙调素是一个多功能激活者,它调节许多蛋白的功能活动,其中
2+ 2+
包括几种蛋白激酶(表 4-2)。不同 Ca 浓度会使钙调素与 Ca 的结合产
生不同的构象变化,因而可识别不同的酶系统,引起不同的生理效应。
2+ 2+
例如低浓度的 Ca 能够激活 AC,而高浓度的 Ca 则抑制 AC 而同时激活
2+
PDE,从而达到对 cAMP 和 cGMP 浓度的调控。Ca /钙调素还可调节许
多与第二信使相关的酶,许多与钙通路的相互作用是通过钙调素来实
现的。例如脑内含有钙调素或敏感或不敏感的腺苷酸环化酶及 cAMP
磷酸二酯酶的同工酶,不同神经元以及同一神经元的不同部位,钙调
2+
素存在的比例也不同。神经元某一特定部位的 Ca 浓度的升高可以增 图 5-13 钙调素(A)和它的激活
强或拮抗 cAMP 的生成量,因为它可分别影响局部的环化酶及磷酸二 作用(B)Ac:腺苷酸环化酶;PDE:
酯酶(图 5-13)。 磷酸二酯酶;PKC:蛋白激酶 C
14
4 蛋白磷酸化是信息调节的共同通路
许多证据表明,在各种第二信使的作用过程中,蛋白质磷酸化是生物调节的最基本和最重
要的公共通路。
蛋白磷酸化系统组成和功能一般具有以下特征:①由蛋白激酶、蛋白磷酸酶和它们相应的底物蛋
白组成。蛋白激酶催化底物蛋白从脱磷酸转为磷酸化,蛋白磷酸酶则把磷酸化蛋白质变回脱磷酸状态;
②所有的蛋白激酶都催化 ATP 的γ磷酸转移至相应底物氨基酸残基的羟基部位上;③底物蛋白质则以
丝氨酸或苏氨酸残基作为磷酸化的部位。
4.1 磷酸化作用中的主要蛋白激酶
各种蛋白激酶的分布和作用底物的特性均有较大的差异,均以它们的激活物(第二信使)
来命名。
4.1.1 依赖第二信使介导的蛋白激酶
依赖第二信使介导的蛋白激酶简要总结如下:
cAMP 依赖的蛋白激酶 PKA:全酶为四聚体,包括两个调节亚基和两个催化亚基。该酶被激活时,cAMP
结合到调节亚基,引起催化亚基的分离然后发挥作用。
cGMP 依赖的蛋白激酶 PKG:全酶有相同的两个亚基。每一亚基上都有与 cGMP 结合的位点和催化单位。
2+
cGMP 与酶结合后激活全酶。受其催化的底物主要有 cAMP 一磷酸二酯酶、G 激酶(G-kinase)和 Ca -ATPase。
蛋白激酶 C(PKC):单体,由 DG-PLC 激活。
2+ 2+
Ca 依赖的蛋白激酶:pkCaMⅠ,pkCaM Ⅱ,pkCaM Ⅲ,均可由 Ca /钙调素激活。Ca2+依赖蛋白激酶催
2+ 2+
化的底物主要有:PKC、胰岛素、核苷酸二酯酶、内皮生长因子、Ca -Mg ATPase 等。
4.1.2 不依赖第二信使介导的蛋白激酶
由第二信使调节的蛋白激酶仅磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基。还存在一类不需要第二信使介导的蛋白激
酶,即酪氨酸蛋白激酶(PTK)。一些生长因子与其相应的受体结合后,活化受体本身的酪氨酸蛋白激酶,
激酶再磷酸化靶蛋白的酪氨酸残基,通过一系列的磷酸化级联反应,影响基因的表达。酪氨酸蛋白激酶的
激活不需要 G 蛋白耦联的第二信使的作用而完成信息的跨膜转导。许多生长因子受体,EGF 受体,胰岛素
受体等,均含有一个 PTK 域,当受体在细胞外接受信号时,PTK 即在胞内发动级联蛋白磷酸化反应,这里
面也包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,而这些激酶又是 PTK 作用于酪氨酸残基上被激活的。
酪氨酸蛋白激酶的底物包括:活化 GTP 酶的蛋白(GTPase-activating protin,GAP)、磷酯酶 C-γ(PLC-
γ)、磷酯酰肌醇 3-激酶(PI3)、SyP 酪氨酸磷酸酶以及 Src 类的非受体酪氨酸蛋白激酶等。
4.2 去磷酸化作用中的主要蛋白磷酸酶
底物蛋白的磷酸化程度就是磷酸化与脱磷酸化整个过程平衡的结果。蛋白磷酸酶与蛋白激酶一个很大
的区别在于,蛋白磷酸酶大多数不受第二信使的作用。目前对磷酸酶所知还不多。
按磷酸酶的生化特性、作用底物的特异性,可以将脑中的 4 种蛋白磷酸酶分成两大类。一类为第二信
2+
使与酶的结合直接激活其活性,其原理类似于第二信使介导的蛋白激酶,这种类型的代表有 Ca /钙调素激
活的磷酸酶-2B(PP2B),或钙神经素(calcineurin),它是 2 型磷酸酶的一种,2 型磷酸酶可分为 3 种:磷
2+ 2+
酸酶 2B 需要 Ca 并受 Ca /钙调素调节;磷酸酶 2C 需要 Mg2+,两种阳离子都不需要的为磷酸酶 2A。另一
类为第二信使与一类该酶的抑制物一起作用,间接激活磷酸酶。在这种情况中,第二信使先激活蛋白激酶,
催化抑制物的磷酸化改变其抑制物的活性,磷酸化酶脱抑制后则被激活。属这一类调节的有蛋白磷酸酶-l,
它是参与糖原代谢的主要磷酸酶,该酶受 3 种抑制物的调节。
4.3 信息传递通路的协同调节
在漫长的生物进化中,动物的机体进化形成了极其高效、能对外界作为迅速准确反应的神经系统。神
经系统的高效运转依赖于神经元间准确的信息传递。细胞中的信息传递系统是一个巨大的调节网络,
在它的作用下协调着神经元的代谢、膜的兴奋、突触传递及整合以及其他的关键性功能。网络中的调
15
节是高度动态的,通过对酶反应速率、离子通道的开闭及基因表达的调控,它能连续地对不断变化的
周围环境作出准确而复杂的调控。
整个信息调控系统涉及到许多不同基因的不同的时空表达,以及大量不同的分子和蛋白的参与。
调控系统由许多不同的信号系统组成,应该说,这些不同的信号通路在单个蛋白的水平上能够发生整
合。信号系统并不是彼此孤立存在的,或只是单独发挥各自的调控作用的,在许多情况下它们具有相
2+ 2+
互交叉、重叠以及协调控制的特点。例如 Ca /钙调素是细胞内 Ca 信息通路和 IP3、DG 系统中的重要
2+
组分,但 Ca /钙调素还能在不同的细胞中抑制或激活腺苷酸环化酶,改变 cAMP 的浓度;相反,胞内
2+ 2+ 2+
cAMP 则可通过影响电压控制的 Ca 通道促进 Ca 跨膜内流、激活膜上的钙泵进而调节胞内 Ca 的浓度。
同一受体可以同时激活不同的信号通路,使这些不同的信号通路协同作用。例如在肌醇磷脂代谢中的
2+ 2+
DG 和 Ca ,它们能协同活化 PKC,这是由于 Ca 的升高促进了 PKC 和 DG 的结合,这种由同一受体激活
的不同信号传递支路之间的协同作用称为同源性相互调节。此外,不同受体产生的信号通路也可以共
同协同调节第二信使之间的作用,这种现象称为异源性相互调节。例如脑组织腺苷和肠舒血管抑肽
(VIP)在诱导 cAMP 生成的同时,激活了与肌醇磷脂水解有关的受体,进一步加强了 cAMP 的合成。
几乎所有的第二信使都是通过它们各自激活的蛋白激酶系统改变相应底物的磷酸化状态来介导
细胞功能。可以说,信使物质的相互作用发生在信号转导过程中的蛋白磷酸化过程。磷酸激酶的作用
就是将 ATP 上的一分子磷酸根特异地转移到丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上,因而改变了这些蛋白的
折叠构型,实现对蛋白功能的调控。蛋白激酶和磷酸酶两者之间的平衡,保证了磷酸化蛋白浓度的快
速调节。
第二信使不但直接作用于不同的效应器,通过它们形成的信号通路来调节不同的生理功能,同时
第二信使还可以使某些调节转录的蛋白磷酸化,通过这些蛋白与 DNA 的作用,从而影响基因的转录,
这意味着将有新的蛋白合成。这种调控将产生一个具有长潜伏期和长时程效应,这也是我们在下一章
中将要讨论的内容。
第三节 核内第三信使系统
机体能够适应外界变化并对其作出相应的夏应,这种反应可能是瞬间完成的,例如电压门控离子通道
的启闭、肌肉的收缩等;也可能需要较长时间完成细胞内的复杂调节过程,包括各种生物化学反应,生长
发育等这些调节均涉及到细胞内外的信号传递。
我们将神经递质、激素类等物质称为第一信使。这些生物活性分子能够通过神经分泌和血液循环等不
同途径作用到细胞膜表面或细胞内的特异受体,引起细胞内的特定反应当细胞膜或细胞内的受体接受第一
信使的作用后,通过特殊的跨膜传导机制,将第一信使携带的信息传人细胞内,激活了细胞内的 cAMP、cGMP、
2+
Ca 、IP3 和 DG 等第二信使分子,它们进一步作用于各自相关的蛋白激酶,再引起相应的细胞内反应。第
二信使在激活特定蛋白激酶的同时,活化的蛋白激酶同时也可能激活~类特定的核蛋白。被磷酸化的核蛋
白识别靶基因上的特定调节序列并与之结合,引起基因转录的变化:由于这些蛋白质能与靶基因上的特定
序列结合并调节其转录水平,因而称之为 DNA 结合蚩白:这类核蛋白发挥着转录因子或调节因子的作用,
义称其为第三信使。这些蛋白质是住胞浆内合成后进入细胞核内,发挥信使作用,因而称这类核蛋白质为
“核内第三信使”,以区别于位于胞浆内的其他各类信使.
12-O-tetmdecanoyl-phorbol-13-acetate)是一个强的肿瘤启动子, 链将两个蛋白以却结构连接在一起
2 CREB
CREB 是 转 录 激 活 因 子 (activating transcription factor , ATFs) 和 cAMP 应 答 成 分 (cAMP
responseelement,CRE)的结合蛋白(cRE—binding proteins,CREB)家族成员,在调节一些被 cAMP
快速诱导的基因表达中发挥一定的作用。与 Fos 和 Jun 一样,它也含有亮氨酸拉链,是由 21 个氨基酸形
成的α螺旋,位于 CREB 的羟基端,有 4 个亮氨酸残基分别被 7 个带电氨基酸从中隔开。这个家族内部成
员可互相经亮氨酸拉链形成二聚体,也可与 Fos 和 Jun 家族成员构成异源二聚体。这些家族成员间交叉形
成的立体结构显示了不同的 DNA 结合活性。如 ATF-4 与 Fos 或 Jun 耦联组成的二聚体可优先与 CRE 结合,
因此,一方面 Fos 和 Jun 可以与 AP-1 位点结合,另一方面也具有了 CREB 的活性。
有关 CREB 的最初的线索来自于对 cAMP-应答神经肽基因调节区功能的研究。研究发现、生长抑素、前
脑啡肽、血管活性肠肽等基因含有一段回文单元,此单元与 cAMP 的诱导有关。当这些单元被转移到非 cAMP
应答基因后,该基因即获得了 cAMP 的应答性。在大鼠生长抑素基因的调节区中存在这个单元,其结构与
TRE 十分相似。以后在人绒毛膜促性腺激素、大鼠 CRH 激素等基因中均发现有这一单元的存在,称之为 cAMP
应答成分(CRE),它具有典型增强子的特征。
许多实验表明,cAMP 诱导 CREB 的基因表达。已知许多激素及神经递质作用于神经元的膜受体后,经
G 蛋白的耦联作用,激活了腺苷酸环化酶,腺苷酸环化酶水解 ATP 成 cAMP,引起 cAMP 浓度的增高。cAMP
的主要靶酶是蛋白激酶 A(PKA),通过 PKA 的作用使一些蛋白磷酸化来发挥生物学效应。目前已经发现 CREB
有一个关键性的 PKA 磷酸化位点,大约位于 N 端 130 个氨基酸残基的丝氨酸残基处。实验表明,如果将克
隆蛋白经人工突变使之失去此位点,则 CREB 刺激经 CRE 转录的作用将大大减弱。CREB 磷酸化后作用于 CRE
18
的机制尚不清楚,推测 CREB 的蛋白磷酸化区与其邻近的下游蛋白分子上的α螺旋结构相互作用,这一相
互作用又转而启动了核心启动子与 CREB 的 N 末端激活域之间的接触,形成了下列直接反应链:cAMP 水平
升高→PKA 激活→CREB 磷酸化→GRE 依赖性转录反应形成。磷酸化 CREB 的寿命主要受磷酸酶活性的调节,
其半衰期短,因而当 cAMP 的含量一下降,CREB 的活性也随即减弱。
3 类固醇激素及甲状腺激素受体
类固醇激素家族本身是一些脂溶性小分
子,它们的作用方式和多肽生长因子不同。所
有的甾类激素都是由胆固醇合成的,所以其化
学结构相似。它们是疏水性小分子,相对分子
质量在 300 左右。这些分子并不像一般水溶性
小分子那样,可与细胞膜表面受体结合后耦合
到信号转导系统,然后再调节转录因子的合成
或活力。它们能自由弥散穿过细胞膜进入到细
胞质中或细胞核内。进入细胞核内的激素,如
甲状腺素、维生素 D、维甲酸和雌激素等可与核
内的受体结合形成配基受体复合物,导致受体
蛋白的构象变化,暴露了受体与基因 DNA 调节
序列结合的位点(图 5-15)。进入胞质的激素,
如皮质酮、黄体酮和皮质类固醇等可与胞质内
的受体结合后,形成配基与胞质受体复合物进
入细胞核,与基因调节序列结合,调节基因的
表达。与细胞核内结合的这些受体就是转录因
子。
这些特化的转录因子是一个大家族,包括
性激素、甲状腺激素、糖皮质激素、视黄酸及
维生素 D3 受体。这些受体都具有共同的框架: 图 5-15 即刻早基因的表达
一个 DNA 结合域、一个激素结合域和一个调节 图示细胞外刺激引起受体的反应,产生第二信使并释放进胞
转录域。前二个域具有受体的特异性。 液中,然后通过核孔进入核内激活 IEGs、c-jun 和 c-fos。两
类固醇激素受体的 DNA 结合域具有保守的 个 IEGs 转录形成的 mRNAs 扩散回胞质然后形成 Fos 和 Jun 蛋
一级结构。它具有富含半胱氨酸的片段,许多 白。这些蛋白再返回核内形成异源二聚体复合物与第二信使
转录因子也具备这样的片段,这个片段形成了 基因(或称晚启动基因)序列(TGACTCA)结合
含有一个 20 个氨基酸的锌指结
构,其中两对半胱氨酸残基,或两
个半胱氨酸和两个组氨酸残基与
一个锌离子结合。在类固醇激素受
体家族则是由锌离子与 4 个半胱
氨酸连接而成,形成一个手指样结构。
一般情况下受体蛋白辨认 DNA
特异核苷酸顺序需要金属离子的参 图 5-15 锌指结构模式图
与(图 5-15)。如雌激素受体与 DNA 许多转录因子都具有锌指结构基序,这种基序形成了与 DNA 结合域作用所
2+
结合依赖于 Zn 的存在,如用其他两 具有的共同结构特征。此基序有两种产生方式。在转录因子 Spl 中,是由锌
2+
价离子如 Ca 代替则无效。金属离子 离子与两个半胱氨酸及两个组氮酸相互作用形成的四面体结构;在类固醇激
的协调对于维持指形结合区的二级 素受体家族则是由锌离子与 4 个半胱氨酸连接完成的
结构是必需的。
19
类固醇激素介导的生物学反应涉及到相当广泛的范围。神经元的分化及活动与类固醇激素类如雌
激素、睾丸酮、皮质醇及醛固酮等精确出现的时间有关。例如,鸟类性激素水平能控制发声神经核团
的发育,以及控制发声能力有关的分化。
4 同源盒蛋白
对果蝇的发育生物学的研究发现,存在一种同源性突变,结果导致果蝇发育的异常。其中一种突变是
触角与脚位点的重排。由于 Antp 蛋白的异位表达,使触角被移到了脚上。另一种双胸位点缺失功能的突
变体,使胸 3 段的体节被移到了胸 2 段,于是果蝇出现两套翅膀。这些控制发育的基因编码一组含有高度
保守序列的碱性氨基酸结构域的核蛋白,许多同源异形基因都含有此相同的 DNA 片段,此保守的 DNA 序列
被称为同源盒(homeobox)。通过对同源盒所编码的蛋白质的分析,发现同源盒具有 180 bp,编码一个 60
个氨基酸的蛋白。同源盒基因编码的蛋白与 DNA 结合,表现出转录因子的功能。
目前,不仅在果蝇的大量调节基因中发现了同源盒,而且在高级和低级真核动物细胞中均发现了同源
盒高度保守的序列。最初在爪蟾早期胚胎的 mRNA 中发现存在同源盒所编码的序列,以后又在小鼠和人的
基因组中找到这段 DNA 序列。在分析各种动物的同源盒所编码的蛋白质氨基酸序列后,发现这些蛋白质氨
基酸序列中有 60%~80%是相同的,特别是在蛙 XIH-box 2 基因与果蝇 Antp 基因中同源盒序列所编码的
60 个氨基酸中,有 59 个完全相同,仅第 37 位的氨基酸不同,说明其具有强烈的保守性。经 X 射线结晶学
分析,同源盒蛋白富含碱性氨基酸,其中第 42 至 50 位氨基酸序列相同的片段富含精氨酸和赖氨酸,这 9
个氨基酸片段被认为是与 DNA 结合的区域,称为同源盒域。同源盒域大部分识别 5'-TAAT-3'序列。用核磁
共振法分析 Antp-DNA 复合物,发现同源盒域含有 3 个紧密相联的α螺旋,构成一个紧密球状结构,其中
第三个螺旋称为“辨认”螺旋,特异识别并与 DNA 中的 TAAT 序列结合。
对人及小鼠的分子生物学研究鉴定出 4 类具有同源盒序列的基因,统称为 Hox 复合物。在小鼠,分别
被命名为 Hox a、Hox b、Hox c 和 Hox d,在人类命名为 Hox A,Hox B,Hox C 和 Hox D。各基因定位于
不同的染色体上,它们在染色体上的排列顺序相应于早期胚胎体轴的头尾顺序,这种特征与果蝇的 Hox 基
因极其相似。
同源盒蛋白调控发育特异性的生化机制目前尚不清楚,尽管已经发现各种同源盒的突变或错位表达会
导致发育畸形。与类固醇类受体家族不同的是,同源盒蛋白对它们结合的 DNA 序列似乎没有什么特异选择
性。但也存在一些同源盒蛋白的不同发育特性与它们的 DNA 结合特性有关。例如,同源盒蛋白(Dfd)及超
双胸蛋白(ultrabithorax, Ubx)在发育果蝇的广泛错位表达可产生很不相同的发育表型,这种表型的产生
完全是 Dfd 和 Ubx 同源盒蛋白功能的结果。如把两个同源盒蛋白进行交换,发育表型也随之改变。
虽然我们还不清楚同源盒作用特异性的生化基础,但显然处于控制果蝇身体节段发育的中心地位。这
些同源盒蛋白既控制胚胎早期的分节,也控制细胞的进一步分化,使每个节段都具有各自的独特特征。此
外,在脊椎动物和无脊椎动物的一些实验中,这些蛋白在神经系统发育的早期也起关键性的作用,特别对
于决定神经纵轴的前后差异、神经组织的特异化以及在发育级联反应中起调节作用。
同源盒作为转录因子对调节无脊椎和脊椎动物的胚胎发育都具有重要作用。一个值得注意的问题
是,同源盒域的结构和序列是高度保守的,并都与类似的 DNA 序列相结合,那么不同同源盒蛋白的功
能特异性又是怎样获得表达的呢?目前推测可能有如下 3 种可能的途径:一是存在同源盒域与 DNA 序
列亲和力之间的差异,蛋白质浓度与 DNA 亲和力在转录调节阈值内的任何微小变化均可能对靶基因的
转录活性造成显著的影响;二是细胞内存在的其他转录因子可能对同源盒域与 DNA 的结合及转录的调
节具有重要的影响;三是结合位点的 DNA 序列可能改变同源盒蛋白的构象,因而可以改变其调节转录
的特异性。
20