Aseguramiento de caIidad

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Norma ISO 17025
Bqca. QM Alicia . Cuesta,
Consultora nternacional de la FAO
Objetivos de Ia cIase:
. Preparacin de medios de cultivo y reactivos.
2. Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes.
3. Evaluacin de la calidad de los medios de cultivo:
Norma SO/TS 33-2:2000
REQUISITO:
El laboratorio debe asegurarse que
la calidad de los medios de cultivo y reactivos sea
apropiada
para los ensayos realizados.
Este es un punto crtico!
Cmo se asegura su calidad?
"u necesita un
microorganismo para crecer?
1. Medios de cuItivo:
Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la
reproduccin y la identificacin de los microorganismos.
_Contienen sustancias nutritivas
_pH adecuado
_Deben estar estriles.
2. Incubacin:
Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar.
_La atmsfera empleada.(aerobio, microaeroflico,
anaerobio)
_Tiempo.
_Temperatura.
Medios de cuItivos
CIasificacin de medios de cuItivo:
.Segn su estado fsico: lquidos, semislidos y slidos.
2.Segn su finalidad en microbiologa:
No seIectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar el
crecimiento de gran variedad de microorganismos.
SeIectivos: permiten el crecimiento de slo un tipo de microorganismo.
Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias
como ser sangre, suero, albmina, etc... Para microorganismos exigentes.
DiferenciaIes: son medios de cultivo que permiten establecer
diferencias entre diferentes tipos microorganismos.
Medios de cuItivo
os requerimientos de los
medios de cultivo son
especficos de :
la muestra que se analiza.
de los microorganismos a ser
detectados.
Los medios de cultivo se preparan:
. En el laboratorio a partir de sus diferentes
componentes.
2. A partir de productos en poIvo deshidratados
comerciaIes o
3. Pueden adquirirse medios Iistos para su uso.
Se puede tomar como base el documento
ISO 7218:1996(E) Microbiology of food and animal feeding
stuff-General rules for microbiological examinations para:
-La preparacin y esterilizacin de medios.
-Tiempos de almacenamiento recomendados.
Requisitos de Ios medio de cuItivo
provistos por eI fabricante :
Los Iotes de medios deben estar debidamente
identificados.
ada lote recibido debe ir acompaado de
evidencias del cumplimiento de las
especificaciones de calidad.
#EQUSTO:
EI fabricante
en el momento de la entrega
de medio de cultivo
debe proveer informacin
acerca de las
especificaciones de calidad,
como mnimo debe incluir lo
siguiente:
Nombre deI medio y Iista de
componentes, incIuido cuaIquier
supIemento.
Fecha de vencimiento deI medio.
Condiciones de aImacenamiento.
ControI de esteriIidad.
ControI deI crecimiento de Ios
microorganismos de inters
(target) y de Ios microorganismos
no deseados (no target) y criterios
de aceptabiIidad.
ControIes fsicos y criterios de
aceptabiIidad apIicados.
Fecha de emisin de Ias
especificaciones
Manejo de Ios medios de cuItivo:
. El laboratorio debe registrar la fecha :
de recepcin
de apertura del envase.
de caducidad
2. El almacenamiento debe realizarse en las
condiciones apropiadas.
Envases: deben estar hermticamente cerrados.
(especialmente medios deshidratados)
No deben utilizarse medios deshidratados que
presenten apelmazamiento o un cambio de color.
ControI de caIidad deI agua destiIada
!ara la preparacin de medios, soluciones y tampones,
debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a
controles peridicos que aseguren su calidad.
Controles peridicos:
#equisitos del agua destilada:
-Conductividad.
- pH
- Contaminacin microbiana
- Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o
interferentes.
-Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.
Procedimiento para preparacin de medios
de cultivo, diluyentes y reactivos
Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben
prepararse, aImacenarse y utiIizarse de acuerdo con
un procedimiento documentado.
En dicho procedimiento debe haber una descripcin del
equipamiento necesario.
El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la
identificacin y otros datos en los medios de cultivo y
reactivos.
Debe haber un registro de preparacin de medios de
cultivo y reactivos.
AImacenamiento de Ios
medios de cuItivo y diIuyentes
preparados:
Debe determinarse y verificarse
el perodo de validez de los medios preparados
en las condiciones de conservacin especificadas.
En general los medios preparados se guardan:
En heladera no ms de tres meses
A temperatura ambiente no ms de un mes en condiciones
que impidan que su composicin sea modificada.
Observar cambio del color, evaporacin,
la deshidratacin o el crecimiento microbiano.
REQUISITOS
Medios preparados por eI Iaboratorio:
Se debe verificar (siempre que sea necesario) que los
medios de cuItivo y diIuyentes preparados por el
laboratorio tengan Ias caractersticas adecuadas con
respecto a:
#ecuperacin o supervivencia de los microorganismos
de inters.(!roductividad)
nhibicin o supresin de los microorganismos no
deseados.(Selectividad)
Propiedades bioqumicas (diferenciaIes y diagnsticas)
Propiedades fsicas (por ejemplo, pH, volumen).
Sea estril.
Medio de cultivo:
Parmetros a tener en cuenta para
obtener un buen resultado.
Agua: recipientes dnde se almacena el agua debe ser
inerte.
pH: la medida a 25
o
C. pH +0.2. ajuste el pH con M
NaOH o M CLH
fundir en el agua hirviente volmenes <500ml.
5 ml de espesor agar en placas petri 90 mm.
Secado de placas estufa 25-55
o
C (20 min.) o en flujo
laminar.
ncubacin: las pilas de platos < 6.
Medios Iistos para su uso:
Todos los medios y diluyentes que se suministren en
una forma directamente utilizable o parcialmente
completa deben ser validados antes de su utilizacin.
Se evala utilizando criterios objetivos del medio
respecto a:
la recuperacin o supervivencia de los
microorganismos de inters
la inhibicin o supresin de los microorganismos no
deseados tiene que ser cuantitativa.
los atributos (por ejemplo: Propiedades fsicas y
bioqumicas).
Parte de esa validacin es provista por las
especificaciones de calidad del proveedor.
Reactivos
EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS:
El laboratorio debe asegurarse que
la calidad de los reactivos utilizados sea
apropiada para los ensayos realizados.
Ejemplo: #eactivos usados para revelar pruebas bioqumicas
ReaIizo controIes positivo y negativo utiIizando
microorganismos que sean trazabIes a coIecciones de
cuItivos nacionaIes o internacionaIes reconocidas.
ControI de Ias prdidas de voIumen
durante Ia esteriIizacin:
Debe verificarse que Debe verificarse que no haya prdidas significativas no haya prdidas significativas de de
voIumen de Ios diIuyentes voIumen de Ios diIuyentes durante eI proceso de durante eI proceso de
esteriIizacin en autocIave. esteriIizacin en autocIave.
Este punto es especialmente importante en mtodos
cuantitativos.
El laboratorio debe tener :
Un procedimiento documentado.
#egistro de datos obtenidos realizados en forma peridica.
El laboratorio determina el intervalo
en el que se efectan estos controles.
ControI de Ias prdidas de voIumen
durante Ia esteriIizacin
Para la evaluacin de la prdida de volumen de los
diluyentes:
. Colocar un volumen fijo de diluyente en tubos de ensayo
o frascos de dilucin.
2. Medir el peso o volumen antes y despus del proceso
de esterilizacin en autoclave.
3. Con los datos obtenidos, se efecta el clculo y la
inferencia estadstica.
LAVADO DE MATERIAL:
Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto
lavado del material reciclable.
El laboratorio de debe contar con un instructivo instructivo para
esta tarea.
Pasos:
_Descontaminacin material de vidrio.
_Enjuague y se lavado con agua caliente y extran
neutro (diluido al 2%)
_Enjuague n de veces con agua corriente y luego un
n de veces con agua destilada. Eliminar el detergente
_El material se seca en estufa y se acondiciona para
ser esterilizado.
EIiminacin de Ios reactivos:
Si bien la eliminacin adecuada de los reactivos no es
un problema que afecte directamente a la calidad,
EBE REAIZARSE E AUERO ON A
NORMATIVA VIGENTE EN MATERIA E MEIO
AMBIENTE, SAU Y SEGURIA.
Las precauciones a tomar con suplementos conteniendo
sustancias txicas se especificarn claramente en cada
caso de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
ControI de esteriIidad ControI de esteriIidad
de los medios de cultivo y diluyentes: de los medios de cultivo y diluyentes:
Fue efectivo el proceso de esterilizacin de los medios
de cultivo y diluyentes?
P#UEBA: se incuban en estufa de cultivo.
La temperatura y tiempo de incubacin para esta prueba
se corresponden con las condiciones usadas durante el
ensayo.
Se realiza este ensayo sobre el % de las placas o tubo
del comienzo y % de las placas o tubos del final de
verter o distribuir los medios o diluyentes.
Este procedimiento se realiza por cada vez que se
esteriliza un lote de medio de cultivo o diluyente en
autoclave o se esteriliza por filtracin.
#EGST#O
CONT#OL DE
ESTE#LDAD DE
MEDOS DE
CULTVO Y
#EACTVOS
Datos a registrar:
Fecha de realizacin del control
Medio de cultivo o diluyente
ndicacin del proceso de
esterilizacin (Ejemplo N
correlativo de proceso en
autoclave o filtracin)
Tiempo de incubacin (en
horas)
Temperatura de incubacin ( C)
ResuItado
Conforme (S o NO)
Firma del personal responsable de
la realizacin del control.
Sntesis parciaI
En microbiologa se le da especial nfasis a la calidad de los
medios de cultivo y reactivos, tal que aquella sea apropiada
para los ensayos realizados.
La preparacin y esterilizacin constituyen pasos crticos en el
logro de este objetivo.
El fabricante en el momento de la entrega de medio de cultivo
debe proveer informacin acerca de las especificaciones de
calidad.
El laboratorio debe contar con !rocedimientos o Instructivos
documentados e implementado para :
La preparacin y esterilizacin de medios de cultivo y
diluyentes
La preparacin de reactivos
Control de calidad del agua destilada.
Lavado de material
Control de las prdidas de volumen de los diluyentes durante
la esterilizacin en especial para mtodos cuantitativos.
EVALUACIN DE LA CALIDAD EVALUACIN DE LA CALIDAD
DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
El objetivo es definir la:
metodoIoga para evaIuar la
P#ODUCTVDAD y SELECTVDAD
de medios de cultivo utilizados
en el laboratorio de microbiologa.
!RODUCTIVIDAD: !RODUCTIVIDAD:
Definicin:
rendimiento, recuperacin, crecimiento
de un microorganismo que se espera que desarroIIe en
eI medio de cuItivo.
Segn el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de
referencia target para evaluar la productividad
(ver anexo B de la norma SO/TS 33-2:2000)
EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo como
por ejemplo el PCA se evala el adecuado desarrollo de
las cepas target o blanco.
En este caso se usan E. coli ATCC 25922,
S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633
SeIectividad: SeIectividad:
Definicin: Ia supresin deI crecimiento de un
microorganismo que se espera sea inhibido en eI
medio de cuItivo.
Segn el medio se usa una cepa apropiada de
referencia no-target para evaluar la selectividad
(ver anexo B de la norma SO/TS 33-2:2000)
En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo
Caldo Lauril sulfato (LST)
se evala el desarrollo de las cepas target y no target.
En este caso Ias cepas target que se usan son
E.coli ATCC 25922, C.freundii ATCC 43864
y las cepas no target Enterococcus faecalis ATCC 2922.
Evala reacciones caractersticas: gas y turbidez.
En medios seIectivos y/o diferenciaIes
hay que evaIuar:
El crecimiento de las cepas target
Hay que prestar atencin tambin a la apariencia,
tamao y morfologa de las colonias (especificidad)
El crecimiento de las cepas no-target debe estar en
parte o completamente inhibido.
!ARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO !ARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO
segn Norma ISO/TS 11133 segn Norma ISO/TS 11133- -2:2000 2:2000
SE !UEDE EM!LEAR LOS SIGUIENTES MTODOS: SE !UEDE EM!LEAR LOS SIGUIENTES MTODOS:
a)!ruebas cuantitativas
b) !ruebas semi-cuantitativas
c) !ruebas cuaIitativas
EVALUACN DE LA CALDAD
DE LOS MEDOS DE CULTVO:
a eleccin del empleo de una u otra metodologa
ser considerada en cada caso en particular
segn el medio a evaluar,
las capacidades y necesidades del laboratorio
ver ANEXO B norma SO/TS 33-2:2000.
MEDIO DE REFERENCIA MEDIO DE REFERENCIA
El uso de un medio de referencia especfico
es obligatorio en los mtodos de cuantitativos
(ver anexo B de la norma SO/TS 33-2:2000)
Para las pruebas semi-cuantitativas o cuaIitativas,
el uso de un medio especfico de referencia
o un medio de cultivo que da una "la reaccin positiva"
ayuda al nterpretar los resultados.
El medio de referencia debe ser de conocida buena calidad
(por ejemplo ser un medio listo para el uso
de calidad asegurada por el proveedor)
CuItivo de trabajo:
(segn nstructivo de cultivos de referencia)
Se prepara un cultivo en fase estacionaria
de la cepa a partir de la cepa de reserva
almacenadas en el laboratorio
en un caldo no selectivo.
(por ejemplo caldo cerebro corazn)
!roductividad:
Para evaluar la productividad de Ios medios de cuItivo
sIido, semisIido o Iquidos ya preparados esterilizados,
los mismos deben ser
inoculados con un microorganismo target apropiado o
cultivo de trabajo.
!roductividad: Pruebas cuantitativas
Para las pruebas cuantitativas la proporcin de
Productividad P# es definido como sigue:
P# = Ns /No
donde
Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio
de cultivo a probar (obtenido de uno o ms placas)
No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio
de cultivo de referencia definido obtenido de uno o ms
placas que debe ser 00 ufc.
!roductividad: Pruebas cuantitativas
C#TE#O DE CONFO#MDAD:
Anexo B de la norma ISO/TS 11133-2:2000.
All figuran:
Los microorganismos
Tiempo y temperatura de incubacin
Criterios
Medio de referencia que debe usarse segn el medio a
evaluar.
P# debe ser mayor o igual a un valor lmite para que el
medio de cultivo sea conforme.
En general para que los medios no selectivos como
el !CA sea conforme, el !R debe ser : a 0,7.
!roductividad:
!ruebas cuantitativas
Ejemplo
Se desea evaluar la productividad del PCA.
El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA)
2) Ns ( dil -6):00 ufc
No ( dil -6): 230 ufc
P# = Ns /No
P#= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado
no es conforme en cuanto a su productividad.
) Ns ( dil -6):40 ufc
No ( dil -6): :0 ufc
P# = Ns /No
P#= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme
!roductividad: Pruebas semi-cuantitativas
en medios de cultivos slidos
Se inocula en forma de estras
diluciones del cultivo con ansa
calibrada de acuerdo a la figura
o modelo.
Las placas inoculadas se
incuban a temperatura y tiempo
que depende del medio de
cultivo evaluado y se observa
el crecimiento.
Se evala la productividad del
medio teniendo en cuenta el
valor de cada estra con
crecimiento.
!roductividad : !ruebas cualitativas
Se llevarn a cabo visualmente asignando un score de
crecimiento.
Score para medios sIidos:
0 no hubo crecimiento
1 hubo crecimiento dbil
2 hubo buen crecimiento.
Score para medios Iquidos:
0 no hubo turbidez
1 hubo turbidez muy tenue
2 hubo buena turbidez
SeIectividad:
Para llevar a cabo la prueba de la selectividad,
el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la
referencia se inoculan con un microorganismo y nivel
apropiado.
Se emplea una suspensin del microorganismo
de no-target que contiene 0
4
cfu a 0
6
cfu por ml se
inocula en la placa o en el tubo de medio.
Certificado de controI de caIidad
de un no seIectivo medio de cuItivo
Certificado
de
control de
calidad
de un
selectivo
medio de
cultivo
Certificado de control de calidad
de un selectivo medio de cultivo
#EGST#O
EVALUACON
DE MEDOS
DE CULTVO
La informacin a registrar es:
Medio de cultivo evaluado.
N D o N lote de medio evaluado.
Fecha de realizacin del anlisis.
Cepa usada (Gnero y especie del
microorganismo y tipo y N de
coleccin).
Medio de referencia usado para evaluar
la productividad.
Medio de referencia usado para evaluar
la Selectividad.
#esultado de productividad (unidades).
#esultado de selectividad (unidades).
Medio de cultivo conforme (S/NO)
Personal responsable.
Aseguramiento de calidad de
los medios de cultivo
!osibIes probIemas
Anormalidad Posible causa
Falla en la
solidificacin
del medio
slido
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin
Peso incorrecto del agar
Agar mal disuelto o incompleta mezcla de los ingredientes
pH incorrecto
Pobre calidad del agua.
Pobre calidad del medio deshidratado.
pH medido incorrectamente.
Contaminacin externa con qumicos.
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin
Color anormal
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin
pH incorrecto
Contaminacin externa.
Pobre calidad del agua o del medio deshidratado.
Aseguramiento de calidad de
los medios de cultivo
!osibIes probIemas
Anormalidad Posible causa
Formacin de
precipitado
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin
pH medido incorrectamente
Pobre calidad del agua.
Pobre calidad del medio deshidratado.
Medio inhibitorio/
Productividad
baja
Pobre calidad del agua.
Formulacin inadecuada Ej.ingredientes y suplementos mal
pesados.
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin
Pobre calidad del medio deshidratado
Selectividad
pobre
Sobrecalientamiento del medio durante la preparacin
pH incorrecto.
Formulacin inadecuada.
Pobre calidad del medio deshidratado.
Suplementos agregados incorrectamente Ej: con el medio
demasiado caliente o en alta proporcin.
Sntesis parciaI
Los medios de cultivos slidos, semislidos y lquidos
empleados para la realizar el ensayo deben ser
evaluados en cuanto a su productividad, selectividad y
reacciones caractersticas.
Para ello se han desarrollado pruebas cuantitativas,
semi-cuantitativas y cualitativas.
Las recomendaciones internacionales de organismos de
acreditacin se basan en la Norma SO/TS 33-
2:2000.
Es importante el uso de cultivos de referencia con
adecuada trazabilidad.
Sntesis finaI
Un punto crtico a tener en cuenta a la hora de
implementar y la SO 025 y acreditar el laboratorio es la
preparacin, esterilizacin y evaluacin de la calidad de los
medios de cultivo empleados para realizar el ensayo.
Las recomendaciones internacionales de organismos de
acreditacin se basan en la Norma SO/TS 33-:2000 y
SO/TS 33-2:2000.
Esto implica una revisin de las prcticas cotidianas
realizadas por el laboratorio y a su vez la seguridad que
los medios usados son adecuados a la finalidad prevista.