D0055201

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE TOXICOLOGIA Y LEGISLACION SANITARIA
NUEVAS TEGNICAS EN INMUNOHEMATOLOGIA FORENSE
MEMORIA PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR FCO. JAVIER PACHON PAVON
INDICE
Pag. INDICE IETEODUCCIQE JUSTIFICACION Y OBJETIVOS GENERALIDADES SOBRE LOS SISTEMAS ISTUDIADOS .1 .9 .11
SISTEMA GLOBULINAS O.C. (G.c. 1. INTRODUCCION

-
22 23 23 25 27
SINONIMOS
II. CARACTERSTICAS FISICO-QUIMICAS IlIFUNCION IV. GENETICA DE LOS GRUPOS Gc SISTEMA OROSOMUCOIDI (DR NI 1. INTRODUCCION
33 33 34 34 35 35 35 35 36
DEflEICION SIJONINOS
II. CARACTERSTICAS FSICAS III CARACTERSTICAS QUMICAS

-
PRECIPITACION CONPOSICIOJ ESTRUCTURA
IV. FUNCION
Y. GENETICA
.37 POLIMORFISMOS 39
SISTEMA DE LAS TWSFKRRINAS (TfI 1. INTRODUCCION
41 42 42 42 42 42 43 44 45
SINONIMOS
II. CARACTERISTICAS FSICAS i.CARACTERISTICAS QUMICAS
PRECIPITACION COMPOSICION ESTRUCTURA
IV. FUNCION Y. GENETICA

-
POLIMORFiSMOS
47
ALFA 256 GLICOPRO!EIA( A.I.S.G. 1. INTRODUCCION

-
48 49 49 49 49 50 50 50
SINONIMOS
II. CARACTERSTICAS FSICAS JII.CARACTERISTICAS QUMICAS
PRECIPITACION COMP. QUMICA Y ESTRUCTURA
IV. FURCIOR Y. GENETICA
POLIMORFISMOS
14
IJXUJDBLOTTIJC 1. INTRODUCCION II. ELECCION DE LA TECXICA
.56 57 58 58 59 59
CARACTERISTICAS DE LAS DIFERENTES TECNICAS A.-DIFUSION 3FLUJO DE LIQUIDOS C,-ELECTROBLOTTING
IIITAHPOR DE TRANSFERENCIA A.SELECCION DEL PH ADECUADO B. -SELECCION DE LOS ADITIVOS 0.SELECCION DR LA TI DE TRABAJO IV. MEMBRANAS DE TRANSFERENCIAS A. MEMBRANAS DE NITROCELULOSAS (NC) 3.- MEMBRANAS DE NYLONBAEED C.- MEKB!ANAS DE POLNINILDIFLUORIDE <PVOF) Y. FIJACION DE LAS MUESTRAS A LAS MEMBRANAS VI.DETECCIONDE LOS INMUNOBLOTTING A. TINCIONES GENERALES 5. CON METALES COLOIDALES O.- POR EL SEGUNDO ANTICUERPO
...,.........,..,...........,......
61
61 62 63 63 63 64 64 65 66 66 66 67
MATERIALES Y METODOS 1. GENERALIDADES ANALTICAS PARA LOS SISTEMAS ESTUDIADOS A. OSTENCION DE MUESTRAS E.- METODO ELECTROFORETICO
10
72
El. MATERIALES ELECTROFORETICOS B~ CARACTERSTICAS DI LOS GELES
72 73 73 74 78 84
............................
MOLDE SOPORTE SOLUCION STOCK POLIMERIZACION
Il.?ARTICULARZDADES ANALTICAS DE LOS SISTEMAS ESTUDIADOS A. SISTEMA DE LAS GLOBULINAS Oc A1. TRATAMIENTO DEMUESTRAS A2 CARACTERSTICAS DE LOS GELES 1.- GELES CON SACAROSA
-
86 86 86 87 87 87 87 87 88 88 88 88 98 89 89 90 91 92 92
TAMAIO CONCENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION
2. GELES CON GIJICEROL

-
TAMARO CONCEYTBACIOJ COMPOSICION POLIMERIZACION
A3, CONDICIONES ELECTRICAS B. SISTEMA DEL OEOSOMUCOiDE E1. TRATAHIEUO DE MUESTRAS

~
CARACTERSTICAS DE LOS GELES MUESTRAS SIN DESIALIZAR 4
1. GELES CON SACAROSA

-
92 92 92 92 92 93 93 93 93 93 94 94 94 94 94 94 95 95 95 95 95 96 97 91 99
TAMANO CONCENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION
2. GELES CON GLICEROL

-
TAURO COICENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION
MUESTRAS DESIALIZADAS 1. GELES CON SACAROSA

-
TAURO CONCENTRACIO! COMPOSICION POLIMERIZACION
2,- GELES CON GLICEROL

-
TAURO CONCENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION
Sa. CONDICIONES ELECTRICAS C. SISTEMA DE LAS TRAISFERRINAS C1. TRATAMIENTO DE MUESTRAS Cr CARACTERISTZCAS DE LOS GELES 5
MUESTRAS SIN DESIALIZAR 1. GELES CO! SACAROSA

-
99 99 99 99 99 99 100 100 100 100 101 101 101 101 101 101 101 102 102 102 102 102
TAURO CONCENTRACIO! COMPOSCIOK POLIMERIZACION
TAURO COICENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION
MUESTRAS DESIALIZADAS 1. GELES CON SACAROSA

-
TAURO COJCENTRACOJ COMPOSICION POLIMERIZACION
2.- GELES CON GLICEROL

-
TAURO CONCENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION
C3.- CONDICIONES ELECTEICAS..............,.,.....,....,,.,,..,,,,..,.,.., 103 U, S]STEU DE LAS a2GLICOPROTEINAS U1. TRATAMIENTO DE MUESTRAS 6 104 105
~2~CARACTERISTICAS
DE LOS GELES
106 106 106
MUESTRA SIN DESIALIZAR 1.- GELES CON SACAROSA
CONCENTRACION COM?OSICION POLIMERIZACION
106 105 106 107 107 107 107 107 108 108 108 108 108 108 LOS 109

-
TAMANO CONCENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION
MUESTRA DRSIALIZADAS............. 1. GELES CON SACAROSA

-
TARANO COICENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION
2.- ELES CON GLICEROL........
CONCENTRACION COMPOSICIO! POLIMERIZACION
109 109 110 110 111 7
D3. CONDICIONES ELECTRICAS IlIMETODO ESTADSTICO
IV. NETODOS DE TIRCION 1. INTRODUCCION II. GENERALIDADES SOBRE LOS SISTEUS ESTUDIADOS
-
117 118 118 121 124
INMUNOTIECION NKUNORLOTTING
III. PARTICULARIDADES SOBRE EL METODO DE INMUNOTIICION

-
INNUNOFIJACIOR TINCION
tU
125
IV.- PARTICULARIDADES SOBRE EL SISTEU DE INMUNOBLOTTING.

-
IRMUNOBLOTTING DETECCION POS EL SEGUNDO ANTICUERPO
135 137 142 159 176 180
RESULTADOS DISCUSION CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA
INTRODUCCION
Las
manchas
de
sangre
suelen
ser
frecuentemente el principal indicio obtenido en la escena del crimen. Esto ha hecho que tanto por su frecuencia, como por la importancia de los resultados individualizadores obtenidos en sus estudios, sea uno de los pilares ms importante dentro del campo de la Biologa Forense. Los anlisis destinados a la
individualizacin de
las manchas de sangre, estn
perfectamente sistematizados, y es norma obligada en todos los laboratorios pasos del seguir rigurosamente que los
diferentes
proceso,
podemos
esquematizar de la siguiente forma:
1.- DIAGNOSTICO GENERICO: A. PRUEBAS DE ORIENTACION B. PRUEBAS DE CERTEZA. 2. DIAGNOSTICO ESPECIFICO. 3.- DIAGNOSTICO INDIVIDUALIZADOR. DIAGNOSTICO GENERICO A. Pruebas de orientacin:
Reaccin de Ader.
Reaccin de KastleMeyer. Reaccin del Piramidn.
Su fundamento cientfico consiste en poner de manifiesto la existencia de la enzima peroxidasa de los hematies, segn la siguiente reaccin:
H202
> 1120 +
1/2 02
Peroxidasas La liberacin del Oxgeno, produce el
cambio de coloracin en el reactivo utilizado. Ejem. Bencidina, Fenoftaleina,Piramidn etc.
Falsos positivos
Este tipo
de reacciones
suelen dar
positivo con los oxidantes qumicos.
Las
peroxidasas
de
las
plantas,
reaccionan comnmente con la fenoftaleina. Este tipo de peroxidasa, se inactiva rpidamente con el calor y con el paso del tiempo.
La presencia de Oxigeno libre en el
Agua Oxigenada utilizada.
Falsos negativos
Se suelen presentar cuando las manchas
de sangre han sido sometidas a lavados.

o
Cuando la muestra es muy escasa.
Valor de la prueba Solamente tiene valor en el caso de ser negativa, pudindose afirmar que la mancha no es de sangre, y por tanto concluimos el anlisis en este punto. En caso contrario, solamente nos indica que se debe de continuar la secuencia de estudio.
E. Pruebas de certeza: 1. Cristalogrficas:
Teichman. Gabriel Bertrand. Takayama. Nina Asvadurova. Szrizwosky.
2. Mtodos espectofotomtricos.
Pruebas cristalogrficas Su fundamento cientfico consiste en la determinacin de la existencia de Hemoglobina,
mediante la formacin microscpica de cristales de halogenuros de hematina, segn la reaccin siguiente:
lib
Halgenos
>
Halogenuros de Hematina
11
tE
b
sri
A.
Espectrofo tometria de absorcin de la Hemoglobina.
3D
550
SUD
NOTA: DE LA PARTE SU?ERIOR A LA INFERIOR: OXIHXXOGLOBINA, ANCHA DESANGRE EXTRADA CON AGUA, Y MANCHA DE SANGRE EXTRADA CON LAURIL SULFATO SODICO Y
TRATADA POSTERIORMENTE CON AMONIACO Y MERCAPTOETANOL. Falsos positivos

-
Es
muy poco probable
obtener
falsos
positivos.
Cuando se presentan suelen deberse a
errores de interpretacin del analista. Falsos neciativos
La poca cantidad de muestra. El lavado de la misma. La falta de experiencia del analista las fibras de los
para buscar los cristales entre tejidos textiles etc. Valor de la prueba
La negatividad de la prueba asegura la no presencia de sangre en la mancha. Cuando esta es
positiva, indica sin lugar a duda la existencia de sangre, y obliga a continuar la marcha analtica.
13
Falsos negativos
Baja sensibilidad del antisuero elegido. Deterioro de la protena o protenas del
suero que actan como antgenos.
Mal desarrollo de la tcnica empleada.
Falsos positivos
Escasa
especifidad
del
antisuero
obtenido
Especies animales
muy prxima
en la
escala zoolgica. Valor de la prueba Cuando esta es positiva, indica la especie animal de la que proviene la mancha de sangre. Ante la negatividad de misma, se puede pensar en una falta de sensibilidad del antisuero elegido, o bien en un deterioro de las protenas que actan como sustancias antignicas.
DIAGNOSTICO INDIVIDUALIZADOR La individualizacin, es el objetivo final del estudio de las manchas de sangre. A tal fin, la Biologa Forense se vale de la identificacin de los marcadores genticos eritrocitarios y plasmticos que habitualmente paternidades, se utilizan con
15
en
e].
estudio las
de
usando
frecuencia
mismas
tcnicas que en estos casos. Desafortunadamente, no todas ellas son aplicables a diagnostico
individualizador de las manchas ya que los marcadores genticos son muy sensibles a situaciones tales como la desecacin, cambios de temperaturas, etc. Por otra parte, en este apartado final, cada laboratorio en utiliza a los sus propios marcadores, que estos
escogidos
base
rendimientos
ofrecen y a la experiencia que con ellos se tengan. De manera representativa, podemos esquematizar los de mayor utilizacin de la siguiente forma:
1.- ERITROCITARIOS:
-
SISTEMA ANTIGENICO ABO.

-
ABSORCION ELUCION ABSORCION INXIBICION
SISTEMAS ENZIMATICOS.
-
FOSFOGLUCOMUTASA LOCUS1 FOSFATASA ACIDA ERITROCITARIA
2.- PLASMATICO:
Oc GLOBULINAS HAPTOGLOBINAS ETC.
NOTA: EN ESTE ESQUEMA SOLAMENTE ESTA! REPRESENTADOS LOS MARCADORES QUE SUELEN SER USADOS POR LA MAYORA DE LOS LABORATORIOS DE BIOLOGA FORENSE.
16
JIJETIFICACION Y OBJETIVOS
La variacin gentica en la sangre tiene inters mdicolegal desde dos puntos de vista, por un lado la investigacin de la identificacin. de los En la paternidad, el primer y por la est
otro,
caso,
tipificacin
marcadores
genticos
encaminada a demostrar si una persona es no el posible padre caso, la biolgico de un nifio. obtenida puede de En el segundo la tipificacin por ejemplo,
informacin
gentica sangunea,
utilizarse
para determinar si una mancha de sangre pertenece a un individuo determinado, Antes de 1.965, se conocan pocas marcadores genticos, apenas una docena de
marcadores de grupos sanguneos algunos de protenas sricas.
ABO, Rh, etc. embargo,
Sin
desde
entonces, la situacin ha cambiado por completo. Con la aparicin de la tcnica de Isoelectroenfoque, tal y como se conoce hoy en da, desarrollada por Kolin (1.958) Y Svenson(1.961),( Pharmacia Fine Chimicais, 1.982), se ha demostrado que una proporcin realmente significativa <aproxirnamente de el las 30%), protenas presentan sanguneas polimorfismos
genticos frecuentes. Posteriormente, 17 con el desarrollo de la
tcnica del DN.A. Fingerprint,
desarrollada por
Jefrey <1.985), con sus dos variantes, Hultilocus y Singlelocus, pareca que solucionaba la doble
problemtica mdicolegal de la sangre. La realidad es que si bien el Fingerprint soluciona el 100% de los casos de paternidad, salvo gemelos monocigticos, <Id Innovation, 1.987), en el caso de las manchas de
sangre, el estado de conservacin de las muestras es critico para dicha tcnica. Por tanto, y aunque el ltimo sangre eslabn en sea la el anlisis de las manchas mediante de de
individualizacin el estudio
D.N.A. los ya
Fingerprint,
previo
tradicionales marcadores genticos es imprescindible, puesto autores que de sirven para una mancha descartar de sangre. a los Con posibles bastante
frecuencia, y debido al estado de las muestras, son los estudios sobre polimorfismos genticomoleculares las nicas tcnicas individualizadoras realizar sobre las manchas problema. Un marcador gentico es genticamente que se pueden
polimrfico cuando muestra, en distintos individuos, diferencias en sus caractersticas y en la expresin hereditaria que permiten clasificar esos individuos en tipos diversos La
<
Harria, 1.971 de 18 los
>.
validez
estudios
sobre
polimorfismos genticosmoleculares
utilizados con
fines individualizadores por la BiologaForense se basa en los siguientes principios: 1Q. fenotipicas inherentes. 2Q. Su distribucin poblacional es tipo discontinuo, queda lo que quiere a una decir clase que de Sus diferentes inferir los expresiones genotipos
permiten
cada
individuo concreta.
asignado
fenotpica
3Q. Son inalterable a lo largo de la vida
del individuo. Harrison, 1-977>. La incorporacin de nuevos marcadores sobre
genticos a los
estudios individualizadores
manchas de sangre es un hecho necesario,
ya que al
definir un mayor nmero de caractersticas genticas de las mismas, de ms estrechamos a una el rango de
posibilidades caractersticas
encontrar fenotipicas
persona con
cuyas las
coincidan
obtenidas en los estudios de las manchas. De esta manera, la incorporacin de los cuatro nuevos
marcadores plasmticos: Gc globulinas, Transferrinas, Orosomucoide y Alfa2glicoproteinas objeto del
presente estudio, contribuye a aumentar el poder de 9
discriminacin sobre las manchas de sangre. La trabajo es tcnica el empleada para el en a presente gel es de la
Isoelectroenfoque debido
Poliacrilamida
<P.A.G.I.F.),
que
tcnica separativa con mayor poder de discriminacin, permitiendo discriminar dos sustancias con una
diferencia de Ph de 0.1. Como utilizado la tcnica identificativa, en se ha de
inmunofijacin
membranas
Nitrocelulosa, Polvinil Difluoride y Nylon, seguida por la identificacin mediante un segundo antisuero peroxidasa conjugado. El motivo de esta eleccin fue en base a: 12. La disponibilidad en el mercado de los cuatro antisueros correspondientes a las
protenas estudiadas. 22. La mayor sensibilidad que ofrece la identificacin mediante antisueros especficos,
frente a las tinciones convencionales. 32. La mejor resolucin obtenida mediante la visualizacin con el segundo antisuero peroxidasa conjugado. Los objetivos pues del presente trabajo son: 12. Aportar cuatro nuevas tcnicas para
20
el estudio de los siguientes marcadores genticos: Gcglobulinas, Transferrinas, Orosomucaide y AIfa2 glicoproteinas. 2Q. aplicacin Demostrar de la dichos posibilidad marcadores de en la la
rutinaria
identificacin de manchas de sangre. 3Q. seguida de antisuero la Demostrar que la inmunofijacin, el segundo mayor
identificacin mediante conjugado,
peroxidasa
ofrece
sensibilidad en el estudio de las manchas de sangre que las tinciones convencionales.
21
GENERALIDADES SOBRE LOS SISTEMAS ESTUDIADOS
SISTEMA GLOBULINAS GC. <G.c,)

ESQUEMA 1. INTRODUCCION
SINONIMOS
II .CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS III. FUNCION IV.GENETICA DE LOS GRUPOS Gc.
1.
INTRODUCCIQN. El sistema de las Ge, son unas
glucoproteinas que tradicionalmente se incluyen en la fraccin a2 de suero humano, la electroforesis convencional donde tambin se encuentran del las
Haptoglobinas, Ceruloplasmina, Macroglobulinas a2 y algunas Lipoproteinas entre otras.

22
Fue detectada por primera vez en 1.959 por Hirschfeld, electroforsis quien mediante tres tcnicas arcos de de inmuno inmuno
encontr
precipitacin a los que denornin 1, 2 y 3. Los tipos 1 y 3, presentaban un solo arco

,
mientras
que el tipo 2,presentaba ambos arcos. Por otro lado el tipo 2, era electroforticamente indistinguible de un suero fabricado con una mezcla de los tipos 1 y
~?3II
SINONIMOS
Globulinas Gc <Schultze 1.952), Factor Gc (Cleve y col. 1.964>, Ps20 (Schultze y col. 1.962), M2 (Heh y col. 1A49>, Postalbmina 2+3 (Smithies 1.955), Componente especifico de grupo 1.959).( Recogido de Kawai. 1.977).
(
Hirschfeld
II. CARACTERISTICAS PISICOQUIHICAS Y ESTRUCTURA
Las aminocidos
(
Gc. Rawai,
esta
formada
por
unos
434
1.977>
y para otros
por 450
(Svasti y ccl. 1.979 ; Cave y col. 1.983>, lo que le confiere un Pm comprendido entre 50.800 y 56.000En su composicin 23 intervienen como
aminocidos principales el Asprtico y el Glutmico. No contiene Lpidos y posee un 4.2% de Hidratos de Carbono, principalmente 2% de Hexosa, 2% de
Hexosamina, Bearn
0% de Acido Silico y 0.2% de Fucosa. (1964>, no encontraron diferencias
y col.
obvias en la composicin de aminocidos entre las Gol y las Gc2. Bowman y Bearn (1.965>, llegaron a la
conclusin de que en la estructura de las Gc exista dos subunidades, cada una de las cuales tendra un Pm aproximado de 25.000, y estaran unidos por puentes disulfuros. Resumiendo, podemos decir que estn
compuestas por dos cadenas con un 95.8% de fraccin protica y un 4.2% de azcares, faltando los Lpidos y el cido Neuramnico. Precipitan bajo
(
las
siguientes
condiciones: etanol al 40%
Ph 5.8, concentracin
jnica 0.09, protena 1%). Sulfato Amnico 22.4 M (Ph 5, protena

(
2%),
Solucin
acuosa
de
Rivanol
0.0065 M 0.15 M
(
Ph 8, protena 1%), Acido Tricloroactico

(
protena 1%), Calentamiento de Acetato 0.1 M,
Ph 5, solucin 1%). No
reguladora
protena
precipita con Acido perclrico 0.6 14, pero adquiere ligera turbidez.
<
Kawai y col. 1.977).
24
III. FUNCIONES
Thomas y col. (1.959), encontraron una aglobulina en el suero humano a la que denominaron BOP, encargada del transporte de la Vitamina D y de sus metabolitos. Posteriormente, Daiger y col.
(1.975), Bovillon y col. <1.976), Imawari y Goodman <1.977), Kawakami y Goodman <1.981), demostraron que se trataba de
en
la
misma
protena
Por lo
descubierta por
tanto, quedaba
Hirschfeld
1.959.
establecido
transporte
que
la
funcin
de
las
Gc
era
el
de la Vitamina
D y sus derivados.
Las relaciones color de la piel, las
entre
la Vitamina D, solares y
el las
radiaciones
protenas Oc,
sugiere la de
posibilidad de
que los
diferentes tipos
Oc estn
relacionados con el
clima. A este respecto, Hourant <1.976> y Constans y col.(1.980), alta establecieron que de radiaciones en poblaciones con ultravioleta, la
intensidad
frecuencia del alelo Gc2 es ms baja, en cambio, el subtipo CclE, es ms frecuente en poblaciones cuyo indice de radiacin es mayor. Por otro lado el exceso de concentracin de Oc con respecto a la Vitamina D y sus derivados plasmticos, as, como la idntica afinidad que presentan las Gcl y las Gc2 por la 25
Vitamina D, hace que la ventaja selectiva no est clara. Kawakami y Goodman <1.981), calcularon la concentracin meda de la protena Gc en el suero humano, establecindola entre 3 y 6 mg/ml. Cada
molcula de Oc,
solamente tiene un lugar de unin
para la Vitamina O, Haddad y Walgate <1.976>, pero sin embargo, la Gc es tan abundante en la economa plasmtica, que solamente se utiliza el 12% de los lugares reservados de los para el transporte la Vit. y O.
almacenamiento
metabolitos de
(Eaddad y col. 1.976). Presenta gran afinidad por los monmeros de Actina 1:2 H
( <
Cooke y col. 1.979), formando complejos 1.980). No se conoce muy pero
Van Baelen y col. funcin de
bien la
los complejos GcActina,
parece ser que evitarla que los monmeros de Actina polirnericen en las fibras musculares 1.984
). <
Lees y col. actuarla
Para otros la de unin
autores, del
la Actina,
facilitando receptores
complejo Vit.DGc a los de las clulas blanco
superficie
<Kamboh y Ferrell. 1.986). Se ha observado que las Oc se encuentran asociada a

<
algunos
tipos
celulares
como
los
Linfocitos B
Petrini y cols. 1.983), subpoblaciones 26
de Linfocitos T
Petrini y cols. 1.985

(
>
y a los
citotrofoblastos placentarios
Cooke y cois. 1A86).
En todos los individuos estudiados, jamas se ha encontrado un homocigtico para el dficit de esta protena, lo que indica que al menos una de las funciones comentadas es crtica para la supervivencia Cooke y cols. 1.986 Eales
>.
<1.987),
han
<
encontrado
relacin
entre los patrones Gc lF1F la mayor
terminologa actual) y individuos a la
susceptibilidad de estos
infeccin por el virus 141V, mientras que los patrones Gc 2-2 (terminologa actual), presentan mayor
resistencia a la misma. Este hecho, parece deberse a la posibilidad de que las Oc estn implicadas en la
unin del 141V a las membranas celulares, fenmeno en el cual el cido silico puede desempear un papel importante, ya que la Oc lF presenta dos residuos de dicho cido, mientras que las Cc 2 no contienen
ninguno.
IV. GENETICA DE LOS GRUPOS OC
Los tres grupos de Oc vienen determinados por un par de alilos codominantes a los que
Hirschfeld y cois. <1.960), denominaron Gc1 y Gc2.

27
De
esta
manera, para
el
grupo los
3, y
seran Gc2 2 es
homocigtico
alelos que el
Gc1 grupo
respectivamente, heterocigtico.
mientras
De esta manera, la terminologa para los grupos Gc qued de la siguiente manera: Go 1-1 para la fraccin con mayor movilidad electrofortica. Gc 2-2 para la fraccin ms lenta,
fraccin de movilidad intermedia.
y Ge 12 para la
Por demostraron los
schultze
cols.
(1.962),
se
fenotipos
anteriores
mediante
electroforesis en geles de almidn, (Giblett, 1.969). Por johnsos y cois. <1.975> utilizando geles de
agarosa,
y por Kitchin y cols.
<1.965> utilizando
geles de poliacrilamida.
Aceptndose en general la
(
existencia de un fenotipo Go 1 alelo Gc 1>, un Go 2

<
homocigtico para el
homocigtico para el alelo Go

<
2) y un fenotipo Gc 12
heterocigtico para los dos
alelos). As mismo, se estableci que las diferencias entre las bandas 1 (rpidas) y las bandas 2 <lentas), eran de naturaleza postranscripcional, interviniendo el nmero de restos de cidos silicos
(
Gc 1 con dos
restos y las Cc 2 que carece de ellos). Svasti y Bowman <1.987); Cleve y
Patutschnick <1.979). En los individuos con cirrosis 28
alcohlica se ha encontrado un resto de Ac. Silico extra en sus Go

<
Constans los los
y cois.
1.983>.
Las
relaciones
entre
diferentes restos de
comportamientos cidos silicos
electroforticos y
quedo demostrada por Thyman y cois, (1.985). Gracias a la utilizacin de la tcnica de Isoelectroenfoque en geles de Poliacrilamida con
rangos de Ph estrechos (P.A.G.I.F.), han permitido el descubrimiento de un nuevo fenotipo, muy prximo al Oc 1, quedando desdoblado el Go 1 en Gc lE <Fast), y Oc iS <Slow), de atendiendo las 1 E a la mayor con respecto velocidad de a las 1 5.
emigracin
(Diferentes Puntos Isoelctricos). De esta manera en la actualidad, se acepta que los fenotipos de las Gc estn codificados por tres alelos codominates, que determinan a 6 genotipos diferentes, denominados: Go 1F1F,Gc 15lS, Oc 22, Oc lF2, Oc 1S2 y Oc lF-1S.( Constans y Vian,
1.977). Mediante la utilizacin logrado detectar hasta del PAGIE, se ha de
90 variantes diferentes
esta proteina,< Revisin de Kaznboh y Ferrel 1.986). La terminologa para designar propuestas por Constans a estas y cois. variantes, (1.979),
fueron
siendo la siguiente: 29
a.
Las
variantes
de
doble
banda
son
denominadas Go 1. b. Las de banda simple Go 2. Las bandas ms andicas a la banda 2 convencional, se les denominan Gc 2A. Las ms catdicas a la banda 2
convencional, son denominadas Gc 2C.
o.
La
banda
catdica
de
la
Go
15
es
considerada como referencia para variantes de doble banda: Las que son ms andica que Gc 15 se denominan Oc lA 02. Las que son ms catdicas se denominan como Go lC.(Ver Fig. 1). La mayora de los alelos raros del sistema Gc tienen una distribucin considerablemente
restringida, pero por su especial importancia cabe destacar el fenotipo Gc1A1, en las que est ampliamente aborgenes de
distribuido
poblaciones
Australia y del Pacifico ,Constans y Cleve,(1.919). Se han determinado dos alteraciones no de un lado, el
genticas en los fenotipos de Gc, tratamiento con altas dosis
de Vitamina D produce
modificaciones en el modelo electrofortico de las

30
Sc, ya que el complejo Vitamina DGc tiene una mayor movilidad electrofortica y un punto isoelctrico ms andico; de otro lado, la hemlisis y contaminacin bacteriana tambin pueden producir modificaciones en los patrones electroforticos, Constans y Cleve,
<1.979) Por hibridacin celular somtica se ha localizado el gen de Oc en el cromosoma 4, en la zona 4 q 11, 4 q 13 ligado a los
(
Cooke y cois, 1.986). Este gen est codifican la albmina y la a
que
fetoproteina, presentando las tres protenas grandes similitudes cols, en su estructura y secuencia Hurray 2 pseudogen y 1 cols, (MT2P1)
(
Yang y La que
1.985),(
L985>. parece
metaloproteina
tambin presenta un estrecho ligamento con el locus Oc, aunque su relacin con
<
la
albmina
la
fetoproteina no est clara Constans y col.
Pakstis y col, L986).
(1.981), han encontrado una cierta Oc iAl y el alelo Tf Dl de
relacin entre el alelo
las transferrinas de un grupo de Pigmeos.
31
fig. nQ 1.
+
a a
Go
2lS 2lF
15
lSli 11
10
lA
20
ESQUEMA DE LOS DISTINTOS PATRONES DE BUDAS DE GC, OBTENIDOS POE I.E.F., EN GELES DE POLIACRILAKIDA, RAIGO Dl Ph 2.5 5.4.
32
SISTEMA OROSOMUCOIDE ORM

ESQUEMA 1. INTRODUCCION DEFINICION SINONIMOS II. CARACTERSTICAS FSICAS III .CARACTERISTICAS QUMICAS PRECIPITACION COMPOSICION ESTRUCTURA IV. FUNCION
V. GENETICA
POLIMORFISMOS
1. INTRODUCCION
DEP INICION: Es una con protena las a~
electroforticamente
que migra antitripsina, el
orosomucoide y las lipoproteinas a1, en la fraccin a1 del espectro sobre geles de agarosa. En sueros humanos las migraciones ocupa electroforticas el segundo de
normales,
lugar,
33
inmediatamente por detrs de la Albmina. SINONIHOS: Glucoproteinas cidas a1 <~iaqp~ 1.950). Orosomucoide (Winzler, (Schinid, 01 cola.
1.955). y
niedermolekulares 1.955). 1.958).
sureprotein
<Schultze
Seromucoide cido Seromucoide
<De Vaux St. Ctr y col. <Montreuil, 1.957).
cido
Seromucoide a1 (Jayle y Boussier, 1.955). Globulina a0

<
Burtin,
1.960).
Componente
(
2<
Williams
Grabar, 1.955).
Prealbmina 2
Smithies,
1.955).
Zona b <Poulik y Smithies, 1.958). PSlA <Schultze y cols.,, 1.962>, MP1 <Meh y col., 1.949). <Recogido de Kawai. 1.977).
II. CARACTERSTICAS FSICAS
Constante de sedimentacin
~20~> 3.11 5,
coeficiente de difusin <D20,~) 5.27, Pm entre 40.000 (Harada y cola. 41,000 <Thymann 0.069, l.990),< y Schmid y col., 1.988); 1.975) y viscosidad 5.2;
cola.,
intrnseca
movilidad
electrofortica
punto isoelctrico entre 2.1 y 3.5 (Hontiel y cola., 1.988); coeficiente de extincin <e280~) 8.9 <Kawai, 1.977).
34
III. CARACTERISTICAS QUMICAS PRECIPITACION: Etanol al70%, sulfato amnico 2.4 solucin precipita acuosa como de los Rivanol otros 0.0065 24 (ph en y
4 1!;
8>.
No
seromucoides
Acido por
perclrico,
tricloroactico
calentamiento. <Kawai, 1.977). Su minimiza proteicos su alto contenido con en carbohidratos los colorantes
visualizacin
habituales. Y ESTRUCTURA QUMICA: En su composicin entran a formar parte
COMPOSICION
204 aminocidos segn Kawai Thymann <1.988). Sus
<1.977), se
y 183
segn
aminocidos
encuentran
formando una cadena polipectidica simple, con alto grado de heterogenicidad, como se demuestra por la
secuenciacin de sus componentes.<Thymann y cois., 1.988). No contiene residuos NTerminal, y el
aminocido terminal es Serma. <kawai,L977). En su composicin encontramos 10.1% de
Nitrgeno, entre el 42 y 45% de carbohidratos <Hexosa 14.7%, Hexosaminas 13.9%, cido silico 12.1% y
fucosa 0.7%). Su contenido en cido neurmico es del 12%.(Koj y cols., 1.974), (Kawai,1.977), <Montiel y 35
cols., L988) y (Harada y cols., 1.989).
IV.- FUNCION El orosomucoide, se encuentra en el suero humano normal a una concentracin de 0.5-lmg/ml
(Montiel y cols.,
1.988),
y en concentraciones de
O.8-2.Smg/ml segn Thymann <1A88). Se sintetiza en el hgado, y su funcin es al parecer desconocida. <Thymann y cole., 1.988). Para otros autores, es posible que el orosomucoide inhiba la hemoaglutinacin y que del virus a de la gripe
inactivandolo, <Kawai, 1.977).
inactive
la progesterona.
Se ha encontrado aumentada esta protena en el plasma, en y sujetos con enfermedades situaciones de
inflamatorias stress,
agudas
crnicas, y
tumores
malignos donde
diversas est
anomalas la
hematolgicas,
adems,
aumentada
concentracin de la a~ antitripsina. Tambin embarazo. Su concentracin srica disminuye en se encuentra aumentada en el
lesiones hepticas, sndrome nefrsicos, mainutricin y caquexias.
36
V.- GENETICA
Desgraciadamente, la nomenclatura para los distintos fenotipos del ORM, es diferente segn los autores. Hemos utilizado la nomenclatura propuesta por Joheon <1.969), Thymann <1.986), Weidinger
(1.987) y Eap <1.988>, que difieren de la usada por Yuasa <1.986) Y Escallon (1.981). El polimrfico y orosomucoide, hetergeno en ha demostrado ser
estado
desializado. <1.965>. <1.963), de en las una
<Tokita y cole., 1.963> y Schmid y cole., Fue comprobado tres de por Tokita y Schmid
encontrando intensidades
fenotipos las dos
dependiendo mayores
bandas
electroforesis sobre gel de almidn. En 1.969, Johnson et al. <Montiel y col., 1.988), confirm dichos polimorfismos, y concluyendo la existencia de dos alelos codominantes,
demoninandoles como ORF y 0R5 Recientemente Thynann y Eiberg <1.986>, usando tcnicas de Isoelectroenfoque con rangos de Ph establecidos mediante anfolinas, y seguido de
inmunotincin, encontr un tercer alelo para el ORT, y que se presentaba fenotipicamente en un estudio poblacional en Dinamarca. 37
Yuasa et al., (1.986), aplicando el mismo mtodo segundo que Thymann, report la existencia de un ORM2. Este
locus
estructural
denominado
hecho, fue confirmado por Escollon et al.,<1.987) y Weidinger et al., <1.987>. El suele ORM2*A. locus ORM2, un es poco polimrfico, alelo la y
expresarse Aunque se
como
solo
denominado de
han descrito
existencia
alelos raros como el ORM2*B, encontrado entre las Daneses y alemanes por Weidinger y cols., (1.987). encontraron un que denominaron
En 1.987, Yuasa y cols. nuevo alelo en el locus ORM, al
ORM1*2.1, y cuya expresin fenotpica, solamente ha sido demostrada en Japoneses. Probablemente se trate de un gen hibrido duplicado. El orosomucoide, est codificado por dos locus estructurales, situados en el cromosoma 9. El primer locus (ORM1), est muy relacionado con los
genes que codifican el sistema antignico AEO, la AK1 (adenilatokinasa> y la ALADE

(
delta
amino
levulinatodeshidrogenasa).<Yuasa et al.,, <Thymann y cois 1.988>.
1.986) y
38
FENOTIPOS <ORMI>:
ORM1*Fl ORMi*F2 ORMi*S
FI. F2
F1F2
Fis
F2S
ESQCEMA DR LOS DISTINTOS PATRONES DE BANDAS DE GR 1, OBTENIDOS PO> 1.1.!. EJ GEL Dl POLIACRILA!IDA, RAIGO DE Ph 4.2 4.9.
-
FENOTIPOS <ORM2):
ORM * 2 ORM2*A 0R142*B1
El
AB
ESQUEMA DE LOS DISTINTOS PATRONES DE MIDAS DE ORN 2, OBTENIDOS POR LE.!. El GEL DE
POLIACRILALOA, RAIGO DE Ph 4.2
4.9.
39
NOTA RESUMEN OROSOMUCOIDE
ORM1*F1 = ORM1*1 ORM1 ORM1*F2 = ORH1*3 ORM1*S ORM2*A QRM 2 ORM2*B1 = ORH1*2
40
SISTEMA DE LAS TRANSFERRINAS <Tf
ESQUEMA
1.
INTRODUCCION SI NONIMOS
II. III.
CARACTERISTICAS FISICAS CARACTERSTICAS QUMICAS PRECIPITACION COMPOSICION ESTRUCTURA
IV. FUNCION y. GENETICA POLIMORFISMOS
1.- INTRODUCCION
Es
el
componente
ms
importante
de
la
fraccin 3 de las bandas electroforticas del plasma humano.(Kawai y cols. 1.971). Se encuentra en los
fluidos biolgicos de invertebrados <Huebers y cols. 1.984) y en vertebrados (De Jong y cols. 1.980). 41
SINONIHOS: Transferrinas (nf) (Holmberg y Laurel
1.947>, Siderofilina (Sehade y cols 1.949>, Globulina combinada con metal Globulina
(
Surgenor y col. y Burtin
1.949), 1.955),
(Grabar
Metaloseromucoide ~~1 <Montrenil 1.957). (Recogido de Kawai. 1.977). II. C A R A O T E R 1 5 T 1 0 A.S Constante de sedimentacin Coeficiente Isodiectrico de
(
FI ~
S 1 0 A 5 5.5 5.
5.
difusin P.I), 5.9.(
D~ct~), Kawai,
Punto Peso
1.977).
molecular aproximado de &8O.000 <Pascall, 1.988>.
III.C A R A O T E R 1 5 T 1 0 A 5
0 U 1 14 1 0 A
PRECIPITACION: En etanol al 40%, Sulfato amnico 2.42.8 24, Acido perclrico 0.6 14, calentamiento y no
precipita en soluciones acuosas de Rivanol 0.0065 M, lo que se utiliza

<
en
algunas
ocasiones
para
purificaras.
Kawai, 1.977).
COMPOSICION QUMICA: Es una glicoproteina compuesta por 679

42
aminocidos 15.4% de N,
<
De Jong y cols,
1988>,
conteniendo
<
5.8% de Hidratos de Carbono
Hexosas
2.4%, Hexosaminas
2%, cido Silico 1.4% y Fucosas
0.07%). <Kawai, 1.977).
ESTRUCTURA: Las transferrinas humanas, adoptan una
estructura polipeptidicas de cadena simple, con 679 aminocidos y dos oligosacridos complejos situados en las posiciones 413 y 611. Estudios secuenciales de la protena, han demostrado la existencia de dos REGIONES, una la 14 terminal
(
comprendida entre los aminocidos situados
en las posiciones 1 y 336) Y la otra, la llamada e terminal

(
comprendida entre los aminocidos situados
en las posiciones 337 y 679). Dichas regiones, son homlogas

<
Pascali y cols. 1.988) y presentan en
cada una el lugar de gliosilacin correspondiente. Cada una de estas regiones,

<
presentan una
KM de
aproximadamente 10~ W1.
De Jong y cols. 1.988),
existiendo una zona de enlaces con los iones hierro denominados A para la regin Cterminal y B para la N-terminal.< Willians, cols. 1.975> y
<
LinebockZins y
1.980>. Para que se produzca la fijacin del imprescindible la existencia de aniones, 43
hierro es
(fisiolgicamente
se
utilizan
carbonatos
bicarbonatos> .<De Jong y cois. 1.988). La afinidad por el hierro de estos puntos de fijacin, son
independientes entre si, calculndose que a un Ph de 6.7 el punto B (4terminal) tiene 20 veces menos
afinidad que el punto A (O terminal). cols. 1.988>.
<De Jong y
IV.- F U N C 1 0 N
Las funciones de las Transferrinas en el hombre, han sido descritas por Petrn y cois. <1.989) y Young y cols. <1.982), pudindose resumir en los
siguientes puntos:
A. La principal misin es el transporte de hierro desde la sangre hasta las clulas. En el plasma normal, la concentracin de nransferrina es de 200300 mg/lOOml, ocupando el 50% de las 3-globulinas. Aproximadamente, un tercio de
las transferrinas sricas est unida al hierro, y ms del 99% de]. hierro srico (110 pg/lOOml>, est fijado a la transferrinas.
E.
Neutralizar
44
los
excesos
de
hierro
inico.
Por este
mecanismo tiene
la virtud
de evitar
la
aparicin
de
sntomas
txicos
al
inyectar
intravenosamente una inyeccin de 812 mg de iones

hierro (Fef++).
0. Impide la excrecin El hierro glomerular, inico atraviesa
urinaria
de hierro. la membrana poco o nada
con facilidad se absorbe
y como el hierro
en
los
tbulos
renales,
al
estar
unido
las
transferrinas,
se impide su eliminacin
por el tbulo
renal.
y.- G E N E T 1 0 A
Las transterrinas, tres alelos codominantes
estn
codificadas C1, C~ y
por 03,
denominados
localizados en el cromosoma 3.( Naylor y cols. 1.969, citado por Pascali y cols. 1.988>. La estudiada por heterogenicidad vez primera de la molcula, Smithies y fue
por
cols.
(1.959), y considerada como poco polimrfica, con un rango de heterogenicidad de 0.05. 1.969>. En el plasma, se puede encontrar en las siguientes formas, Difrricas 45 <la ms frecuentes>, (Giblett y cols.
Monofrricas
A y
y Apotransferrinas
no
frrcas>.( Putnam. 1.984>. Con la introduccin de las I.E.F. con geles de poliacrilamida, tcnicas de se pudieron hasta puntos 5.7, y
diferenciar en las cinco formas
transferrinas
difrricas uns y
diferentes, comprendidos
teniendo entre 5.3
isoelctricos diferencindose
unas de otras
en 0.1 rango de Ph.
(Petrn y Vesterberg. 1.989>. De las cinco variantes> la ms frecuente y presentan un P.I. Las de 5.5.
<DAlessandro qumicas entre
cola. son
L983>. los
<
diferencias de Acido N
ellas
restos
acetilneuramnico y de Silico. 1.989).
Petrn y Vesterberg.
Estudios recientes han demostrado que en caso de disfunciones hepticas postalcholicas,
aumenta la concentracin srica de las Tf con 2.!. de 5.7.<Petrn y Vesterberg. 1.989). El alelo 02 se ha encontrado asociado con un aumento de los abortos espontneos, en prematuros y en la artritis reumatoide.< Petrn y cois. 1.989>.
En estudios mediante I.E.F. en geles de poliacrilamida FeCl3, se y han TfC3 y tras la saturacin los frrica con
detectado como ms
46
siguientes pero
alelos: han sido
TfO1,TfC2
usuales,
detectados
algunos
alelos
raros
en
estado y
de
heterogenicidad 1.984>, variante
denominados
TfB,(Ktihnl
cols.
con las variantes TEB1,TfB2 y una probable denominada TfB3 6 4 ~ TfC15.

<
Estudios
antropolgicos realizados por Khnl y cois. en 1.984 al sur de Italia>. Otros alelos ms raros constatados por
Pascali y cols. <1.987) en estudios sobre poblaciones de Pigmeos, son los denominados Tf01, TfD2, TfDTe~,
TfDpyg~y y el llamado TfC6. Ver Fig.2. POLIMORFISMOS: Fig. nQ 2

+
a a a a a a a
C2
0102
Cl
C3
B3
B2
ESQUEMA DE LOS DISTINTOS PATRONES DE BANDAS DE Tf., OBTENIDOS MEDIANTE I.E.F. EN GEL DE POLIACRILAMIDA, RANGO DE Ph 4 -6.5.
47
a2 GLICOPROTEINAS A.H.S.G.)
ESQUEMA
1.- INTRODUCCION
-
SINONIHOS
II.
CARACTERSTICAS FSICAS.
IhI.CARACTERISTICAS QUMICAS.
PRECIPITACION
COMPOSICION QUIMLCA Y ESTRUCTURA.
IV. FUNCION y. GENETICA
POLIMORFISMOS
1.- INTRODUCCION
La plasmticas,
fraccin es La
c~
de
las
electrotoresis de todas.
ms
hetergena
Aproximadamente existen doce componentes detectables por inmunoelectroforesis. Entre otros, cabe destacar la globulinas Go, las macroglobulinas
oc 2,
haptoglobinas, ceruloplasminas, el enzima inhibidor de la tripsina (Kawai, 1.977>, colinesterasas

48
pseudocolinesterasas, lctica. 2uS la
fosfatasas Tambin
alcalina focalizan Zn 2
la las
deshidrogenasa glucoproteinas
glucoproteina
la
neuroaminoglucoproteina 2~
<Kawai. 1.977>
SINONIMOS: Globulinas 0C2z

(
Heremans,
1.960>,
glucoproteina Ea 2..< Schmid y Brgi, 1.961), mucoide flES

<
Schultze y cols. 1.962>, PS2B,

<
(Schultze y
cols. 1.962>,
recogido de Kawai. 1.977>, human 2

<
ESglicoproteina
AHSG,
segn la conferencia de
Helsinki, 1.985, sobre mapeo gentico humano.).
II. CARACTERISTICAS FISICAS Constante de sedimentacin <S 2~) Peso molecular prximo a los 49.000. 3.3 5. Movilidad
electrofortica 4.2. Punto isoelctrico desializada entre 4.55.0 <Yuasa, 1.988>, sin desializar, PSI, de 5.5. Coeficiente de extincin 1.977>.
(
de 5.6. <Kawai,
III. CARACTEPISTICAS DUIMICAS
PRECIPITACION: Precipita con alcohol muy concentrado y 49
con una concentracin relativamente baja de sulfato amnico. 11.4 24, solucin acuosa de rivanol 0.006524> cido tricloroactico 0.1514, y por calentamiento.
COMPOSICION QUIMICA Y ESTRUCTURA: Est polipectdicas disulfuro. La compuesto unidas entre por si 282 por dos dos cadenas puentes y la
cadena A con
aminocidos
cadena E con 27. La cadena A, presenta cuatro puntos de gliosilacin, y la E solamente uno. (Yuasa,1.988>. Su composicin en nitrgeno es 1.977>. del 13.4% <kawai,
IV. F(JNCION
La AHSG,
es sintetizada en el hgado y
alcanza una concentracin plasmtica de 4085 mg/dl. Su funcin no est clara, pero se la ha relacionado con la formacin del hueso y sobre el desarrollo embrionario. Es conocido que disminuye Yuasa y cois.,
durante las fases de inflamacin.< 1.988>.
y. GENETICA
El locus codificador de las AHSG, se ha

50
localizado estudios 1-988>.
en
el
cromosoma
3q21qter, Yuasa
mediante y cola., a el
con Este
clulas locus
hibridadas.<
est estrechamente unido
locus que codifica a la colinesteras1 y al de la transferrinas.
POLIMORFISMOS: Los polimorfismos genticos de las AHSG, fueron descubiertos por Anderson y Anderson <1.977 y 1,979), usando electroforsis Bidimensional,
combinando el Isoelectroenfoque (IEF) para la primera dimensin, y electroforesis con geles de
poliacrilamida con Dodecil Sulfato Sdico (SDS) para la segunda dimensin. en tres Las AHSG podran ser de
clasificadas
fenotipos
distinguibles
acuerdo a sus PI ya el tamafo.<Yuasa y cols. 1.988). Estos mismos resultados, fueron constatados por
Olaisen y cola. (1.981>, usando una tcnica similar a la anterior. Las electroforesis bidimensionales, es una tcnica excelente, realizarla, estudio genticos y pero el tiempo empleado en que encierra para el que en los as estudios como en
la dificultad hace de
comparativo,
poblacionales
AHSG
hemogentica forense, se prefiera la aplicacin de las electroforesis unidimensional. 51
La
utilizacin
del
!EF,
seguido
de
inmunoprecipitacin y tincin con plata, demostr la existencia de dos fenotipos adicionales, como
expresin de un tercer alelo. Los estudios realizados mediante
desializacin de las muestras, revelan la existencia de polimorfismos, debidos probablemente a variaciones estructurales de las cadenas polipectidicas de las AHSG. <Yuasa y cols. 1.988). Hasta ahora, se han descubierto ms de 15 alelos responsables de la expresin fenotipica de las AlISO. AHSG*2 La designacin de
,
estos
alelos
es
AHSG*1,
AHSG~15.
Los tres fenotipos que acaparan la mayora de la distribucin poblacional, son los AHSG*1,
AHSG*2 y AHSG*3, que aparecen en todas las tcnicas de IEF. Todas las variantes excepto las AHSG*15, son distinguibles por IEF con anfolinas de rangos de Ph comprendido entre 4.5 y 5.4. Debido a que algunas variantes presentan PI muy similares, se hace las
necesario el uso del 1SF tras desializacin de muestras.<Heckmann y cols. 1.987). Ver fig.3. Siguiendo Yuasa y tlmetsu
,
los
trabajos
realizados
por
1.988>,
52
y a manera de resumen,
podemos
establecer
los
siguientes de las
patrones AHSG segn
de las
movilidad
electrofortica
tcnicas empleadas: 1. La secuencia de movilidad
electrofortica para los distintos alelos en estado nativo

(
sin desializar), fue la siguiente: AHSG 14 atendiendo al
31856711122413 <=15 >9, incremento de sus PI. 2.electrofortica Neuraminidasa,

(
La de
secuencia las muestras
de
movilidad tratadas con
desializadas), fue como sigue: 38

<
141=6=7=10=2=9134125=1115. ctodo).
direccin
nodo
3. La movilidad electrofortica
de
las
AHSG utilizando IEF con anfolinas de 56 rangos de Ph, y en presencia de Urea 2.514, fue la siguiente:
AHSG81431=6=7=102=9=4--1315111215. <direccin nodoctodo).
53
Pig.nQ 3.
AHSG *2
12
23
1a
ESQUEMA DE LOS ?ATROEES DE BANDAS KAS RRCUERflS OBTUIDOS POR 1.!.!., El GEL DE POLIACRILJLMIDA, RANGO DE Ph. 4.5 5.4. SIN DESIALIZA!.
54
INMUNOBLOTTING
ESQUEMA 1 INTRODUCO ION
.
II.
ELECCION DE LA TEONICA
CARACTERSTICAS DE LAS DIFERENTES TEONICAS A. -DIFUSION B.-FLUJO DE LQUIDOS

O. ELECTROBLOTTING
III. TAMPON DE TRANSFERENCIA A.-SELECCION DEL PH ADECUADO 2.SELECCION DE LOS ADITIVOS 0.-SELECCION DE LA TEMPERATURA DE TRABAJO IV. MEMBRANAS DE TRANSFERENCIAS A. MEMBRANAS DE NITROCELULOSAS <n.a> B. MEMBRANAS DE NYLON-BASED 0. MEMBRANAS DE POLIVINILDIFLUORIDE (p.v.d.f>
y. FIJACION DE LAS MUESTRAS A LAS MEMBRANAS
VI.DETECCION DE LOS INMUNOBLOTING A. TINCIONES GENERALES

B.- CON METALES COLOIDALES
O.
-
ENZIMOINMUNOBLOTTING
55
1. INTRODUCC ION
Se
define
el
termino
Elotting
como
la
transferencia a membranas de
muestras que han sido
separadas por tcnicas electrofortica, con el objeto de fijarlas, y de hacer ms fcil su identificacin posterior, aumentando considerablemente la
sensibilidad de su deteccin. El mtodo fue descrito por primera vez por Southern (1.975) para transferir fragmentos de A.D.N. a una membrana de Nitrocelulosa (WC.>, y en 1.978, Renhart lo adapt para las transferencias de
protenas, (Johansson, 1.987>. Las fuerzas que hacen posible, la
transferencia desde los geles hasta las membranas van a depender de la tcnica de Blotting empleada,
distinguindose tres tipos: difusin, capilaridad y elctricas. <Johamsson, 1.987). Los tipos de membranas ms utilizados son: la Nitrocelulosa, el Nylonbased y las de Polivinil difluoride (PVDF>. Tradicionalmente son las membranas de N.C. las de mayor aceptacin, aunque cada da se
est imponiendo ms las de PVDF. El mtodo con mayor reproductibilidad, eficacia, rapidez y
lo confiere el Electroblotting,
56
donde patrn
se de
puede bandas
conseguir separados
replicas por
fidedignas
del Su
electroforesis.
fidelidad est estimada en un 100%.<Tovey y cols. 1.987>.

necesidad
No obstante,
de medios,
la mayor versatilidad,
es la proporcionada
y menor
por la
simple difusin por capilaridad.
II.ELECCION DE LA TEONICA ADECUADA PARA REALIZAR UN BLOTTING
El
principalmente transferir.
mtodo
de las
elegido,
nuestras que
depender
queramos elegir de
De esta
manera es muy importante
la membrana adecuada en cada caso, transferencias aditivos (Ph de los tampones 1.987>.
las condiciones etc.),
el uso de
etc..(Montelaro,
En general, las membranas ms utilizadas

son la de Nitrocelulosa, aunque cada da se emplea
con mayor punto ms
asiduidad las FVDF y el NYLONBASED. critico, cuya es la eleccin del es la de tampn eluir
El de las
transferencia,
misin
muestras separadas en el gel y transportarla hasta la membrana.
57
CARACTERSTICAS B LOTT 1 NG
DE
LAS
DIFERENTES
TEONICAS
DE
En 1.987, Johansson distingui tres tipos de Blotting, atendiendo a las fuerzas que transportan las muestras hasta la membrana:
A.- BLOTTING POR DIFUSION
En este sistema de trabajo, se requiere poco equipamiento, puesto que solamente intervienen las fuerzas de difusin creadas por el Tampn de
transferencia al eluir las muestras que se encuentran en el gel.<Johansson, 1.987>. Por esta tcnica, se
pueden llegar a transferir entre el!. 30% y el 35% de las muestras que estn en el gel, y puede presentar problemas de transferencias cuando el peso molecular de las muestras es
las de
elevado.<Jacobson,
peso molecular
1.990>.
pueden
Sin
ser
embargo,
bajo
transferidas
sin ningn La difusin
problema. es la tcnica ms empleada de aunque cuando la
rutina
para
realizar
un Blotting,
concentracin de la muestra es insuficiente, cuando
se requiere una mayor precisin

puede usar el Electroblotting
en la
tcnica se
el Vacumblotting.
(Tovey y cois.
1.987>. 58
B. BLOTTING POR FLUJO DE LQUIDOS
Las
muestras
son
transferidas
las
el
membranas por capilaridad.
Actualmente
se utiliza
llamado encuentra une
Vacum Blotting,
donde
la transferencia
se
favorecida por un gradiente la membrana al
de presin que gel.<Johansson,
ntimamente
1.987>. El poder de transferencia

se estima en el 100% de las muestras
de esta tcnica
separadas en el
gelTovey y cols. 1.987>.
C.
ELECTROBLOTT NG
Es la tcnica de eleccin cuando se quiera

obtener la mayor cantidad de muestras transferidas,
y especialmente cuando se trate de muestras de alto

peso molecular.
La tcnica est basada en las propiedades Anfotricas que de las muestras, ciertas es decir, la capacidad de cargarse (+)
presentan
sustancias con
elctricamente bsicos
()
en soluciones
Ph cidos
De esta manera,
al someter las muestras
a la accin de un campo elctrico, sern atradas repelidas en virtud de su carga elctrica, 59 crendose
una migracin de las muestras separadas en el gel, que ser interrumpida por la interposicin de las membranas de transferencias. Fig. 4
Fig.
nQ 4 POLO POSITIVO MEMBRANA GEL MEMBRANA POLO NEGATIVO
+++++++++++++++++++ *******************
###################
* * * * * * * * * * * * * ** * * * *
ES~UEKA REPRESENTATIVO DEL SANDWICH UTILIZADO EN LOS ELECTROELOTTIJG. Los tcnica son dos por factores un lado ms el crticos en Ph del Tampn esta de
transferencia, y por otro el potencial elctrico con que se cargue la membrana. <Johansson, 1.987>,
postul es
que para que la transferencia que toda el la campo elctrico del
sea completa, creado gel y de sea la
necesario en
uniforme membrana.
superficie
La eleccin del dimetro del poro de la membrana de transferencia es muy importante, ya que
si este es mayor que el tamao de la muestra, esta va a pasar a travs de la membrana, eluyndose en el tampn.
60
III.TAMPONES DE TRANSFERENCIAS
La eleccin del tampn de transferencia es uno de los parmetros ms critico a la hora de
obtener un buen resultado en la tcnica del BLOTTING. Especialmente el Ph que tenga este, que debe ser
adecuado a las muestras que se quieran transferir, as como los aditivos que entran en su composicin. Usualmente, el Ph utilizado suele estar prximo a 8, y los aditivos ms comunes son el metanol y los
detergentes no inicos del tipo Tween20, Nonidet P40 etc. Las Temperaturas que intervienen en los desarrollos crltico,( de los Blotting, no es un factor
siempre que se no sea lo suficientemente
elevada como para producir una desnaturalizacin de las muestras que se van a transferir).
A.- SELECCION DEL PH ADECUADO
Debido a las propiedades anfotricas de las muestras que se van a transferir, la eleccin de un Ph para el tampn de transferencia es muy
importante, ya que de ello va a depender la carga elctrica de las muestras,

61
por
lo
tanto
la
migracin. La crucial en a eleccin los la del Ph es particularmente donde la
Electroblotting, membrana se
transferencia
realiza
mediante
fuerzas elctricas. En general se establece que para un electroblotting donde las muestras a transferir
)
tengan un Ph de 8, (carga elctrica una buena electroeluccin Por el contrario, positivamente la cuando y fijacin
se conseguir
en la membrana.
la muestra est cargada ser buena, pero la
emigracin
fijacin ser pobre membrana.
debido a la positividad de la
B. SELECCION DE LOS ADITIVOS
El Metanol ha sido propuesto por Johansson

<1.987)
como un notable fijador de protenas a las Sin embargo, debido a que tambin
membranas de 4.0.
fija las protenas al gel, dificulta la eluccin de las protenas mayores. Bajas concentraciones de detergentes no
inicos del tipo del Tween20 6 del Nonidet P40 han sido propuesta como buenos fijadores de protenas por Bjerrum y cols. <1.987>.
62
C.-~ TEMPERATURAS Es un factor critico) simple, sobre todo en muy importante las tcnicas
<
aunque no difusin
de
pero se puede decir que en general se acepta Hay
que una Temperatura elevada favorece la difusin. que tener presente que se
en todo momento la Temperatura a la muestra que estamos
desnaturaliza
estudiando. Hay Electrobloting que destacar que en los de casos de
realizados
sobre
geles
IEFSDS las
(IsoElectro-Enfoque
SodioDodecilSulf ato>,
temperaturas ptimas de transferencias son de 70Q C.
IV.- MEMBRANAS DE TRANSFERENCIAS
A.- MEMBRANAS DE NITROCELULOSAS <lic
Actualmente
es
la
ms
utilizada.
Su
capacidad de fijacin para protenas es de 80 a 250 pg/cm2 ( Montelaro 1.987>. El tamao de los poros es variable, y pueden ser usados con Ph cidos y bsicos, cargadas compatible protenas.
63
lo
que le permite
fijar
tanto
protenas Es
positivamente
como
negativamente.
con todo tipo de tincin general para
13.- MEMBRANAS DE NYLON-BASE!) <n.b
Estn cargadas positivamente.
Su poder de
fijacin para protenas es de 215 a 480 pg/cm2. <Montelaro 1.987>. Este alto poder de fijacin se debe a la interaccin electrosttica que se establece entre la membrana (cargada +> y las cargas
U>
de las
protenas. Precisamente su alto poder de fijacin es utilizado en algunos casos para fijar protenas en bajas concentraciones. Presentan la desventaja de que al fijarse muchas protenas distintas suelen dar mucho fondo con las tinciones. Por lo que no se puede usar con
tinciones generales para protenas, y mxime si se usan colorantes aninicos membrana. que quedaran fijados a la
C.- MEMBRANAS DE POLIVINILDIFLUORIDE C~vdf
Tienen un poder de fijacin para protenas similar a las de N.C. <Montelaro 1.987). (aproximadamente 190 Inmovilizan protenas pg/cm2 por
interaccin hidrofbica, y son compatible con los colorantes aninicos.
64
V.FIJACION DE MUESTRAS SOMETIDAS A BLOTTING
Tan tcnica
importante
como
la
eleccin de
la
de Blotting,
es el proceso de fijacin
de las
muestras transferidas de separacin
a las membranas desde los geles y cols.
electrofortica.<Moeremans
1.987>. La utilizacin de mtodos de fijacin
general como el Acido tricloroactico, metanol, etc, se emplea cuando de sea necesario las protenas una que fijacin se han
generalizada desarrollado
todas
mediante un proceso de electroforesis. La utilizacin de anticuerpos frente a
sustancias fijacin que se
especficas, adquieren
han hecho que los procesos de selectivo, cantidad La de a la vez muestra de el
un carcter una mayor
consigue
fijada.(Ramlau, Inmunofijacin, nombre de
1.987). aplicada
tcnicas recibe
en los Blotting, cuyas
Inmunoblotting, son:
caractersticas
principales
a. Selectividad de las muestras fijadas. b..- Mayor cantidad de las muestras fijadas. Es por esto, elegida para el presente por lo que ser la tcnica
estudio.
65
VI.METODOS DE DETECCION DEL INMUNOBLOTTING
Las procesos ms
tcnicas importantes
de
tinciones, de las
son
los
dentro
tcnicas
separativas.< Moeremans y cois. 1.987).
A.> TINCIONES GENERALES.
Los mtodos propuestos para las tinciones, son muchos y variados, tinciones etc, generales siendo de tan
protenas,
mtodos
enzimticos,
utilizados como clsicos. Mencin a parte, merecen dos tcnicas que por su sensibilidad, especificidad
y reproductibilidad parecen imponerse cada da ms.
13.> METALES COLOIDALES.
Los metales
ms utilizados con este fin, Las tcnicas de
son el Oro, la Plata y el Hierro.
tincin con Plata, son ya un mtodo clsico, siendo ms novedoso el AURODYE

(
tincin con oro coloidal>, Oxido de hierro>.
y el FERRIDYE (Tincin con
La tcnica del Aurodye, fue propuesto por Moeremans y col. <1.987>,

66
su
sensibilidad
es
semejante a la tincin con sales de plata y a las tcnicas de Inmunotincin. Presenta el inconveniente de que no se puede utilizar en Blotting realizados sobre membranas de Nylon Based, debido a las
particularidades Fsicoqumicas de las mismas, donde tampoco se pueden usar colorantes aninicos como el
Azul de Coomassie el NegroAmido. A este respecto, en 1.987, Moeremans y col., concluyen que la tcnica del Aurodye, solamente es aplicable a los
Inmunoblotting realizados sobre membranas de N.C. y de P.D.V.F., mientras que el Ferridye, es aplicable a cualquier tipo de membranas.
O.) POR EL SEGUNDO ANTICUERPO.
Ramlau comparativo visualizacin entre del
<1.987>, las segundo
realiz diferentes anticuerpo,
un
estudio de
formas
clasificando
los sistema de la siguiente manera:
a.
Deteccin
con
Fluorofsforos.
Segn
este autor, fueron utilizados en un 3% de todas las comunicaciones estudiadas.
67
CARACTERSTICAS:
Requieren una cierta infraestructura especial. Sistemas de fotografiados. Muchas de estas tcnicas blanquean
rpidamente.
En
cuanto a su sensibilidad,
no es posible
establecer unas conclusiones, debido a la escasez de publicaciones existentes. <Ranlau y cois. 1.987>.
b.- Radioistopos. en un 50% de los casos. determinan que las
Se usan aproximadamente y Thorpe, (1.982),
Johnston
Inmunoglobulinas
son fcilmente son los
radiolonizables.
025. <
Los istopos 1.987>.
ms utilizados
Ramlau y cols.
CARACTERISTICAS:
Se necesita trabajar con pequeas cantidades
de Istopos.
La sensibilidad del mtodo, vendr dada por la empleados. por la <Ramlau.1987>. utilizacin de
calidad de los reactivos
Peligro
personal
Istopos.
Especial infraestructura para la tcnica.
c. Enzimticos.
Las enzimas conjugadas con 68
anticuerpos, E.L.I.S.A. y
fueron el principal sostn del mtodo de la mayora de las tcnicas
inmunohistoqumicas~ (Ranlau y cols. 1.987). Es el mtodo ms utilizado para la
deteccin de las muestras en un inmunoblotting.
CARACTERSTICAS:
-
Disminuye el Background de los nmunoblotting. Presenta gran afinidad y especificidad. No requiere equipamientos especiales para
desarrollar la tcnica. Las Peroxidasas y enzimas las ms utilizadas son las Ellas
Fosfatasas
Alcalinas.
solamente, ocupan el 30% de uso de todas las tcnicas estudiadas. Ramlau <1.987>, propone la utilizacin la enzima Fosfatasas Alcalina frente a de las
Peroxidasas, ya que se obtiene una mayor sensibilidad y limpieza de fondos.
69
MATERIALES Y frIETODO
1.GENERALIDADES ANALTICAS SOBRE LOS SISTEMAS
ESTUDIADOS
A.- OBTENCION DE MUESTRAS
Las muestras de sangre, se obtuvieron de Servicio de Hematologa del Hospital Universitario de Sevilla. El total de muestras recogidas fue de 50
tubos conteniendo Scc de sangre completa, tratada con EDTA como anticoagulante. La sangre, pertenecia a 50 donantes detectado escogidos al azar> donde no se haba
ningn tipo de patologa.
Dichos tubos,
fueron enumerados desde el 1 al 50. Para sangre la realizacin de se usaron 134Q de C,

(
las manchas
de
controles, a
50 compresas de gasa procedimiento entrelazados O),

<
esterilizadas formadas con
hilos
algodn
verticalmente y 9 horizontalmente por cada centmetro cuadrado de superficie de gasa), plegada tres veces sobre si misma, de tal manera que se dispona de un bloque de 6 superficies intimamente unidas unas a las otras, con un poder de absorcin de aproximadamente
70
150 pl por centmetro cuadrado. gasas, se depositaron un total
Sobre
las citadas por cada
de 20 gotas
una, dejndolas secar a Temperatura ambiente <202 0) durante 30 das, sin ningn tipo de proteccin sobre ellas. Las manchas as obtenidas, se enumeraron con los mismos nmeros de los tubos a los que perteneca. Los centrifugacin tubos, <3.000 fueron rpm) durante sometido 3 a
minutos,
separando la fase plasmtica de las de los elementos formes mediante pipetas Pasteur, y depositando los plasmas en tubos Eppendorf. Dichos tubos se rotularon con su numeracin de origen. Posteriormente, se
congelaron a 202 0. De esta manera, se obtuvieron 50 controles para empleadas. Los elementos formes sobrantes, si bien no se utilizaron para el presente trabajo, fueron las verificaciones de las tcnicas
sometidos a 5 lavados con suero fisiolgico, seguido de otras tantas centrifugaciones a 3.000 rpm durante 3 minutos. Las series blancas, se separ mediante
pipetas Pasteur, y los hematies ya separados, fueron depositados en tubos Eppendorf y congelados a 20Q 0. Su etiquetacin, se correspondi con la serie
originaria.
71
E2.- CARACTERISTICA.S DE LOS GELES.
MOLDES
DE
VIDRIO:
Los
moldes
fueron por
realizados
segn la tcnica de minigeles descrita
A. Alonso (1.987), para la obtencin de un tamao de gel de 50 X 40 X 0.25. utilizacin de estos Las ventajas minigeles son: de la tcnica encontradas en la
1. Rapidez en el desarrollo
de I.E.F. 2. No se necesitan para los electrodos. 3. Se economiza ms que
tiras con soluciones
con
los
geles
clsicos.
4.
El
poder
de
resolucin
es
satisfactorio.
5.
Se
necesita
menes
cantidades
de
muestras.
~13
El
inconveniente
principal
encontrado
seria que el poder de resolucin es menor que con geles mayores. No obstante, este problema se
encuentra suficientemente compensado con el grosor del gel y con la cantidad de muestra empleada, siendo su resolucin totalmente satisfactoria.
SOPORTE DE LOS GELES: Se utilizaron dos
tipos de soporte en el presente trabajo: 1. Vidrias silanizados: Se prepar una al
solucin de y Metacriloxi Propil Trimetoxisilano
4/1000 de H20, llevado a Ph 3.5 con Acido Actico. El silano empleado fue el SILAIfE A174 (Pharmacia). El procedimiento de silanizacin consisti en sumergir los soportes de vidrio en dicha solucin durante 20 minutos. Dejndolos secar posteriormente. Los grupos metacrilicos que toman parte en la polimerizacin del gel, reaccionan con el silano, unindose a este covalentemente.< Ver fig. 5
>.
Las ventajas de la silanizacin son: 1.- Ofrece una buena adherencia del gel de poliacrilamida al soporte, lo que impide la
deformidad e irregularidades en este. 2. Es un mtodo econmico. 3. Los soportes de vidrio ya silanizados,

74
pueden
ser
utilizado
hasta
con
dos
meses
de
antigUedad.
4.
No
interfiere
la
migracin
de
las
protenas, ni afecta al I.E.F. 5. Los reutilizados, si soportes de vidrios> son lavados con una pueden ser solucin de
Hidrxido sdico concentrada en H20. Los son:

1. El silano es altamente irritativo en
inconvenientes
de
la
sil.anizacin
contacto con la piel. 2. Las inestables, asiduidad. soluciones acuosa de silano son
lo que obliga a prepararla con cierta No obstante, con se ha conseguido cuyo buenas de
silanizaciones
soluciones
tiempo
preparacin era superior a 4 meses.
75
Fig. nQ 5,. La siguiente: reaccin de silanizacin es la
SiOH
CH3O CH3
Si-OH O Si-OH
CH3O
Si-CH2-CH2-CH2OCC=0H2
CH3O
VIlO
y-METACRILOXIPROPILTRIMETOXISILANO
II
Si-O O Si-O
O
CH3 Si-0H20H2-CH2OCC=CH2
Si-O
VIDRIO
SILANIZADO
76
2. SOBRE PELCULAS PLASTICAS: Existen en el mercado actualmente, lminas de plstico, donde una de sus caras es adherente a los geles de
poliacrilamida. film,
Este es
el caso del GelBondPAG
comercializado La forma
por Pharmacia. de uso de estas pelculas,
consiste en adherira por su cara no reservada al gel, al soporte de vidrio, mediante unas gotas de de aire
alcohol,
vigilando
de que no queden burbujas
entre el soporte y la pelcula. con quitar el y est papel lista de
De esta manera, basta de su cara
proteccin
adherente,
para su utilizacin.
Las ventajas que ofrece el GelEondPAG-film, son la rapidez y la no manipulacin de
productos txicos. Los inconvenientes 1. silanizacin, ser utilizada Costo son: al proceso de
superior
adems, cada membrana solamente puede una vez. al gel es menor que la aunque esta es
2. La adherencia ofrecida suficiente. 3. La adherencia nunca es muy estable, sea a veces por la
silanizacin,
al
soporte
de vidrio,
lo que hace que su manipulacin debido

77
engorrosa,
que
existen
desplazamientos.
4. Las pelculas
se
degradan
con
la
exposicin
continuada No obstante,
a la luz. y aunque todos estos hechos
hayan sido constatados durante las pruebas realizadas en este trabajo, somos partidarios de la utilizacin de las pelculas, toxicidad,
(
principalmente debido a que no a la rapidez y a la limpieza de Este criterio todo el se
presentan
la tcnica mantiene trabajo,
menor manipulacin). lo tanto durante
por
presente
aunque se hayan utilizado indistintamente
ambas tcnica. Los soportes sobre los que asentar el
gel, fueron cerrados junto con los moldes, mediante Clamps, por todos sus laterales, menos por uno
superior que servir para rellenarlo. Siguiendo la tcnica conocida como Sandwich.
SOLUCION ETOCR
A.
INTRODUCCION:
Los
geles
de
poliacrilamida, estn formados por la polimerizacin del monmero de acrilamida junto a un Cross exacta es la
Linkers,< de este
no se ha encontrado trmino>, que 78
una traduccin habitualmente
N,N,Metilen
bisacrilamida,
(BIS>. Ver fig.6.
Fig.nQ 6. -0R2-OH-0H2--0R-0R2-CH-. 0=0
0112=CH 0=0
1
CH2CH 0=0
1 +
0=0
0=0
NR2
NR
HE2
NR2
HE 0112
1
0112
NH
0=0
1
NR2
1
NR2
1
NR
CE2 = CM
-CE2- CR-0E2-CH-CH2-CH-
0=0 It
0=0
3 1
0=0
REACCIOI DI POLIKERIZACION DE LOS KONOKEROS III POLIACRILAKID&. Esta reaccin de polimerizacin, solamente tiene lugar en presencia de radicales libres, que
qumicamente los cede el Persulfato de Amonio la Riboflavina.
13.-
VENTAJAS
DE
LOS
GELES
DE
POLIACRILAMIDA: Las ventajas las siguientes:

1. Presentan
las podemos resumir en
pocos
grupos
cargados una alta
elctricamente,
lo
que
les
confieren
fiabilidad en los resultados, ya que pueden ap icarse corrientes elctricas de hasta 79 300 y/cm.
2.
El
tiempo
de
desarrollo
de
las
tcnicas separativas ms corto que en otros tipos de geles. 3. Permite utilizar geles de grosores muy finos,( hasta 0.1 mm>, lo que proporciona:
Menor tiempo
de desarrollo
de
la
tcnica
separativa.
Fcil
visualizacin
de
los
resultados.
-
Pequeas cantidades
de muestras.
4. Son estables a cualquier Ph, excepto
a Ph superiores a 10.
C.POLIACRILAMIDA:
DESVENTAJAS
DE
LOS
GELES
DE
1. Retienen molculas cuyo peso molecular
sea superior a 0.40.5

2. Algunas
10~.
la polimerizacin es
veces,
lenta. 3. Toxicidad de los elementos empleados:
La acrilamida y la bisacrilamida son
txicas por ingestin, inhalacin y por contacto.
Los efectos son acumulativos en el
caso de la bisacrilamida.
80
D. OTROS CROSSLINI(ERS:
realizados con este crosslinkers, pueden contener altos niveles de material no polimerizada, lo que es txico y qumicamente reactivo, <Boisso y col. 1.980>.
-
BAC
<
HdUbisacrilicistanxina>. No pero su empleo parece los geles que
est muy difundido su uso, reservado casi
exclusivamente
par
contengan grupos Tiol.< Hansen y col. 1.980>.
DUEBA
<NJU (1,2Dihidroxietilen]
bisacrilamida>. Usada en geles altamente porosos con buenos resultados.< Righetti y col. 1.981>.
E. TAMAO DEL PORO: Las concentraciones de los geles de poliacrilamida la terminologa se de definen Hirte
generalmente (1.962>.
segn
A+B xlOO Conc.

Donde:
B
xlOO A+B
13= Cantidad en gramos de Crosslinkers
A= Cantidad en gramos de Acrilamida Conc.= Volumen (cc> total de la solucin 81
El
tamao
de
poro
del
gel
de
poliacrilamida, viene determinado por dos parmetros: 1. El dimetro de poro es inversamente proporcional a la raz cuadrada de la concentracin de poliacrilamida.
<A
2.- La concentracin de 13, as como el
tipo de este, tambin controlan el tamafio del por, obedeciendo a una distribucin parablica.<Fawcett y
~1
col.
1.966>.
Para una concentracin ce 0= 5%,
se
obtiene el mnimo tamao de poro. Por debajo y por encima de este valor, el dimetro aumenta, <Riichel y col. 1.966>.
1. PREPARACIN
DE LA SOLUCION STOCK. estudiados, se ha la
Para
los
cuatro
marcadores
estandarizado
unas
caractersticas
para
realizacin de los geles: 1. T 6.2 %, C

=
3.2
%,
correspondindose con las siguientes cantidades:
3 gr. de Acrilamida 82
<
L.K.B.)
0.1 gr. Bisacrilamida (L.K.B.> 50 cc. de 1120 calidad milliQ.
2. T
5%, 0
2.2%, correspondindose
con las siguientes cantidades:
2.43 gr. de Acrilamida (L.K.B.) 0.075 gr. de Bisacrilamida
(L.K.B.>
50 cc. de agua calidad MilliQ.
Como estabilizante del gradiente de Ph> se ha utilizado indistintamente la Sacarosa (Merck) y el Glicerol Bidestilado (Merck>, ambos en proporcin del 12%. En el caso de la utilizacin del Glicerol, no se aadi a la solucin stock hasta el momento de su utilizacin. Una procedi existente vez realizadas las mezclas, se
a retirar los restos en la mezcla, para
de cido acrlicos ello, se aadi
Amberlite ME1 (Sigma) en proporcin del 0.5% (2/V). Se dej agitar en durante 30 minutos a 4Q y O se filtr, Las
conservndose
frigorfico
(*).
soluciones as preparadas, mes. Recientemente, en un
son estables durante un trabajo publicado por
Pharmacia Fine Chemicais, aconseja la utilizacin del Amberlite MBE por ser esta ms eficiente. 83 En el
presente
trabajo,
no
se ha podido constatar este
hecho, por falta de dicha resma. (*) El polmero de acrilainida no es txico, pero en la solucin puede existir pequeas cantidades de acrilamida libre que si lo es.
POLIMERIZACION
La polimerizacin de los geles, indistintamente de dos maneras:
se realiz
1. Mediante Persulfato amnico (Merck):
Para geles cuyo estabilizante era la 20%
Sacarosa,
se utiliz la siguiente proporcin;
(P/V)
en 1*20 calidad MilliQ.
Para geles cuyo estabilizante
era el
glicerol, la proporcin utilizada fue de 22,8 mg/cc de Ambas soluciones hay que prepararlas en el da.
2. Mediante Riboflavina <Sigma>, diluida
en
la
siguiente
proporcin:
200mg/lOOcc
de
1120
calidad MilliQ. Como acelerador de la reaccin de
polimerizacin, se utiliz el N,N,N,N, TETRAHETIL ETILENDIAMIDA

<
TEMED>
<
L.K.B.), 84
basndose en la
capacidad
de
este
producto
de
ceder
aminas
terciarias. Con respecto a la utilizacin del TEMED, hay que tener presente dos hechos fundamentales: 1. Si la polimerizacin se realiza
mediante Riboflavina, no es necesario la utilizacin del TEMED. 2. Si se usan para establecer el rango de Ph del gel, anfolinas de la casa comercial
Pharmacia (PHARMALYTE), los fabricantes aconsejan la no utilizacin del TEMED, ya que dichas anfolinas llevan incorporados los grupos aminos terciarios. Personalmente, he comprobado que en el caso de la utilizacin de Pharmalyte sin TEMED,el
tiempo de polimerizacin, no era controlable, siendo algunas veces largo y otras cortos. Por ello, es
preferible la utilizacin del TEMED tambin en este caso. El tiempo de polimerizacin con
Riboflavina, puede llegar a ser excesivamente largo, y no exenta de fallos como ya reflejara Righetti y col. <1.981). Este hecho, tambin ha sido constatado en el presente trabajo, por lo que favor de la utilizacin de la nos inclinamos a polimerizacin
mediante Persulf ato amnico
y TEMED.
85
SOLUCION STOCI
SOLUCION ?UMJO Volumen solucin stock
POLIKERIUCIOI
ACELElAOOR
De sacarosa
1 Anfolinas adecuadas 1 Separadores y aditivos
0.3! Persulfate al 21 0.1% ?.E.XE.D.
1% Persulfato (22.8 mg/cc) De glicerol Riboflavina 2% 310 na DV,
11.-flETaDO ANALTICO PARA LOS SISTEMAS ESTUDIADOS
A.- PARTICULARIDADES PARA EL SISTEMA Gc. GLOBULINAS
A1. MUESTRAS.
Las muestras, fueron tratadas de las
siguientes maneras: 1.- Sueros testigos: Se diluyeron en agua calidad HilliQ, en proporcin 1/20. 2.- Manchas de sangre: Para solubilizar
a las Gc, se utiliz una solucin de Urea < Merck) 6K en agua, frente a
< 1.Sgrl5cc).
la Formamida, suficientes
Se prefiri utilizar urea ya de 86 que la no se obtuvieron y
referencias
utilizacin
resultados de este reactivo. De esta manera, se macer trozos de gasas manchadas en sangre de unos 5 X 5 mm. en 40 pl de la solucin de Temperatura Urea
EM.
La
maceracin se realiz y el tiempo
a de
ambiente
(2OQC),
maceracin dependi de la antigUedad de la muestra, como referencia se tom 60 minutos para muestras con antigUedad de 1 mes.
A2. CARACTERISTICAS DE LOS GELES
1.- GELES CON SACAROSA.
TAMAO: 50 X 40 X 0.25 mm CONCENTEACION: T

=
6.2%, 0
3.2%, S
12%.
COMPOSICION: Para 2cc de solucin Stock. a> Anfolinas:
6% rango Ph 4.55.4 0.5% rango Ph 2.55
= =
120 pl 10 pI.
b) Separadores:
1.3% <P/V> de [N(2Hidroxietil>]
piperazina etanosulfnica.
< HEPES )
26 mg.
0.6% (P/V) de [N(2Acetoamida)]2
cido amino etanosulfnico.
< ACES )
12 mg.
87
CONDICIONES DE POLIMERIZACION:
Desgasificar
en
rotacin
continua la solucin anterior durante 10 minutos.
Aadir 7 pl de una solucin
fresca de Persulfato Amnico al 20% en agua calidad MilliQ.
Aadir 1 pl de TEMED. Rellenar los moldes dispuestos
a tal fin mediante pipetas Pasteur. Incubar a 37Q C durante 20 minutos aproximadamente.
2. GELES CON GLICEROL.

-
TAMAO: 50 X 40 X 0.25 mm CONCENTRACION: las siguientes

=
En
este
caso de
se los
utilizaron geles, T
=
caractersticas
=
5 %, C
3 %, G
12%.
COMPOSICION: Para 2cc de solucin Stock, y 10
preparada
solamente con Acrilamidabisacrilamida, toda ella previamente durante
desgasificada minutos.
(Este paso result crtico para obtener una buena polimerizacin).
12% de Glicerol
240 pl
a> Anfolinas:
6% rango Ph 4.55.4 88
120 pl
0.5% rango Ph 2.55
10 pl
b) Separadores: .1.3% (P/V> de [N(2Hidroxietil)J piperazina etanosulfnica.
< HEPES )
26 mg.
0.6% (P/V) de [N(2Acetoamidafl
2 cido amino etanosulfnico.

-
<
ACES
12 mg.
CONDICIONES DE POLIMERIZACIN:
-
La
mezcla
fue
nuevamente
desgasificada durante 10 minutos.
Se
la aadi
20 pl de una
solucin de Persulfato Amnico (22.8mg/cc)
1 pl de TEMED. Se procedi a rellenar los
moldes dispuestos durante 30 minutos.
a tal fin,
y se incub a 372 0
NOTA: Las anfolinas utilizadas fueron indistintamente la de las casas Pharmacia, encontrndose ellas. Los separadores usados, fueron indistintamente de las casas L.K.B. y Sigma. diferencias L.K.B. y de Sigma, no entre
consustanciales
43. CONDICIONES ELECTRICAS La aplicacin de los electrodos sobre el gel.fue de manera directa, 89 no utilizndose ningn
tipo de tiras empapadas en soluciones.
a) Prefocusing: 350 Y ; 15 mA 1 W, durante 100 Vb.
b) Aplicacin de muestras: Las muestras se aplicaron mediante papel Whatman del NQ 3, de unas dimensiones de 4 X 3mm. El volumen total papel. La aplicacin se realiz a 0.5mm del de muestras fue el empapado por el
Ctodo, y las condiciones elctricas fueron: 350 y ; 15 mA ; 1 W, durante 100 Vb.
c) Focusing:
Antes de iniciar el desarrollo de las muestras, se procedi a retirar las mismas, y se
establecieron las siguientes condiciones:
1.200 V ; 15 mA ; 2.5 W, durante 1.600 Vb.
Todo el sistema fue refrigerado durante el proceso completo con una temperatura de 102 C.
90
E.
PARTICULARIDADES
PARA
EL
SISTEMA
DEL
OROSOMIJCOIDE
E1. PREPARACION DE LAS MUESTRAS
Las muestras fueron estudiadas en estado natural, y tras ser sometidas a desializacin, segn el siguiente procedimiento: 1.Sueros testigos: Sin desializar: Los sueros fueron diluidos en la
proporcin de 1:5
<
Suero/agua).
El agua utilizada
fue calidad Milli Q.
Desiaj.izados:
muestras de sueros, fueron
Las
desializadas siguiendo el siguiente procedimiento:
Se prepar una solucin tampn de
Acetato Sdico 0.005 ?4, Ph 5.5, conteniendo 15.4 mM de CiNa y 0.9 mM de Cl2Ca.
A 2 mL de dicha solucin, se aadi del Clostridium Prefingens
1 mg de Neuraminidasa
(Tipo V de Sigma, titulo 1 pl/mg).
10 pl de suero, fue incubado con 10 de neuraminidasa preparada
pl
de
solucin
anteriormente, a 4Q C, durante toda la noche. 91
2. Manchas de sangre:
Sin desializar:
En el caso de las manchas, se utiliz un trozo de gasa de unos 5 E Smm macerndola con 40 pl de una solucin de Urea EM durante 1 a 2 horas.A temperatura maceracin, muestra). ambiente depender <202 de C>.< la El tiempo de de la
antigUedad
Desializadas:
El procedimiento fue similar al anterior, y la desializacin se llev acabo aadiendo 20 pl de solucin de neuraminidasa titulo 1 pl/mg a 20 pl de macerado, dejndola a 42 C, durante toda la noche.
CARACTERSTICAS DE LOS GELES
MUESTRAS SIN DESIALIZALR
TAMAO: 50 X 40 X 0.25 mm CONCENTRACION: T

=
6.2%, C
3.2%, 5
12%.
COMPOSICION: Para 2cc de solucin Stoclc. Anfolinas:
10% rango Ph 46.5 92
200 pl
Desgasificar
en
rotacin
2.- GELES CON GLICEROL.

-
TAMAO: 50 X 40 X 0.25 mm CONCENTRACION: las siguientes

=
En
este
caso de
se los
utilizaron geles, T
=
caractersticas
=
5 %, C
3 %, G
12%.
COMPOSICION: Para 2cc de solucin Stock,
preparada solamente con Acrilamidabisacrilamida, y desgasificada minutos. <Este paso result critico para obtener una buena polimerizacin>.
toda
ella
previamente
durante
10
12% de Glicerol
240 pl
Anfolinas:
10% rango Ph 46.5 93
200 pl
La
mezcla
fue
nuevamente
Se
la aadi
20 pl
de una
solucin de Persulfato Amnico <22.8mg/cc)
moldes dispuestos a tal fin, y se durante 30 minutos.
incub a 372 0
MUESTRAS
DESIALIZADAS
1. GELES CON SACAROSA.
TAMAO: 50 2< 40 2< 0.25 mm CONCENTRACION: T

=
6.2%, C
3.2%, 5
12%.
COMPOSICION: Para 2cc de solucin Stock. a) Anfolinas:
6% rango Ph 4.24.9 6% rango Ph 4.55.4
= =
120 pl 120 pl
b) Separadores:
0.4% <P/V) de fN(2Acetoamida)J
( ACES )
8 mg.
Desgasificar en rotacin continua 94
la solucin anterior durante 10 minutos.

-
Aadir
pl
de
una
solucin
Aadir 1 pl de TEMED.
Rellenar los moldes dispuestos a

Incubar a 37Q C
tal fin mediante pipetas Pasteur. durante 20 minutos aproximadamente.

-
TAMAO: 50 X 40 2< 0.25 mm CONCENTRACION: En este caso se utilizaron

=
las siguientes caractersticas de los geles, T C

=
5 %,
3 %, G
12%.
preparada solamente con Acrilamidabisacrilamida, y desgasificada minutos. <Este paso result critico para obtener una buena polimerizacin>.
toda
ella
previamente
durante
10
12% de Glicerol
240 pl
a) Anfolinas:
6% rango Ph 4.55.4 6% rango Ph 4.24.9
= =
120 pl 120 pl
95
b) Separadores:
0.4% (2/y) de [N<2Acetoamida)]
< ACES >
8 mg.
La
mezcla
fue
nuevamente
Se
la
aadi
20
pl
de
una
solucin de Persulfato Amnico (22.Bmg/cc)
1 pl de TEMED. Se procedi a rellenar los moldes
dispuestos a tal fin, y se incub a 37Q C durante 30 minutos. NOTA: Las anfolinas utilizadas fueron
indistintamente la de las casas Pharmacia, L.K.B. y de Sigma, no encontrndose diferencias
consustanciales entre ellas. Los separadores usados, fueron indistintamente de las casas L.K.B. y Sigma.
CONDICIONES ELECTRICAS
La aplicacin de los electrodos sobre el gel, fue de manera directa, no utilizndose ningn
tipo de tiras empapadas en soluciones. 96
a) Prefocusing: 350 y ; 15 mA ; 1 W, durante 100 Vh.
b) Aplicacin de muestras: Las muestras se aplicaron mediante papel Whatman del NQ 3, de unas dimensiones de 4 X 3mm. El volumen total papel. La aplicacin se realiz a 0.Smm del de muestras fue el empapado por el
Ctodo, y las condiciones elctricas fueron: 350 Y ; 15 mA ; 1. W, durante 100 Vh.
c) Eocusing: Antes de iniciar el desarrollo de las muestras, se procedi a retirar las mismas, y se
establecieron las siguientes condiciones: 1.200 Y ; 15 mA ; 2.5 W, durante 1.300 Vh. Todo el sistema fue refrigerado durante el proceso completo con una temperatura de 1OQ C.
97
O.
PARTICULARIDADES
PARA
EL
SISTEMA
DE
LAS
TRANSFERRINAS
TRATAMIENTO
DE
MUESTRAS
1.Sueros testigos:
Sin desializar: fueron diluidos en
Los sueros testigos
agua destilada ( calidad MilliQ) en la proporcin de 4:7. Se aadi una proporcin de 3:1 de una solucin de Sulfato Amnico ferroso (SAL DE MOER>, <290mg/ml). 3 partes de Sulfato! 1 de suero). Se noche a 4QC.
dej
en
incubacin
durante
toda
la
Desializadas:
La desializacin se llev acabo mediante una solucin de Neuroaminidasa Tipo Y de Sigma con un ttulo medio de 5 U/mi, en proporcin de 3:1
(Neuraminidasa/suero>.
-
Se aadi una proporcin de 3:1 de una
solucin de Sulfato Amnico ferroso <SAL DE MOER), <290mg/ml). < Tres partes de Sulfato/ 1 de suero). Se dej noche a 420. en incubacin durante toda la
98
2. Manchas de sangre:
Sin desializar: 5 X 5 mm, se la siguiente
Un trozo de gasa de unos macer toda la noche a 42 C con
solucin:
50
pl
de
una
solucin
de
Sulfato
amnico ferroso (SAL DE MOER>,
( 290mg/ml).
Desializadas: Un trozo de gasa de unos 5 2< 5 mm, se
macer
toda
la
noche
42
con
la
siguiente
solucin:
20 pl de Neuraminidasa < Tipo y sigma
Ttulo 5 U/m).
20
pl
de
una
solucin
de
Sulfato
amnico ferroso (SAL DE MOHR>, < 290mg/ml).
CARACTERSTICAS
DE
LOS
GELES
MUESTRAS SIN DESIALIZAR
TAMAO: 50 2< 40 2< 0.25 mm CONCENTRACION: T

=
6.2%, C
3.2%, 5
12%.
COMPOSICION: Para 2cc de solucin Stock. 99
a) Anfolinas:
10% rango Ph 57
200 pl
b) Separadores:
0.2% <P/V) de
LN<2Hidroxietil>)
-
( HEPES ).= 4 mg
Desgasificar en rotacin continua
la solucin anterior durante 10 minutos.
Aadir 7 pl de una solucin fresca
de Persulfato Amnico al 20% en agua calidad MilliQ.
Aadir 1 pl de TEMED. Rellenar los moldes dispuestos a Incubar a 372 C
tal fin mediante pipetas Pasteur. durante 20 minutos aproximadamente.
TAMAO: 50 2< 40 2< 0.25 mm CONCENTRACION: En este caso de se los
utilizaron geles, T
=
las
siguientes
=
caractersticas
=
5 %, O
3 %, O
12%.
preparada solamente con Acrilamidabisacrilamida, y desgasificada minutos. (Este paso result crtico para obtener una buena 100 toda ella previamente durante 10
polimerizacin).
12% de Glicerol
240 pl
a> Anfolinas:
10% rango Ph 57
200 pl
b> Separadores:
0.2% (P/V) de
fN<2Hidroxietil>]
).=
-
< HEPES
4 mg
-
La
mezcla
fue
nuevamente

-
Se la aadi 20 pl de una solucin
de Persulfato Amnico (22.8mg/cc)
1. pl de TEMED. Se procedi a rellenar los moldes
dispuestos a tal fin, y se incub a 372 C durante 30 minutos. MUESTRAS DESIALIZADAS
1. GELES CON SACAROSA. TAMAO: 50 2< 40 2< 0.25 mm

-
CONCENTRACION: T
6.2%, C
3.2%, 5
12%.
10% rango Ph 57
200 pl
101
Desgasificar
en
rotacin

-
a tal fin mediante pipetas Pasteur. Incubar a 37Q O durante 20 minutos aproximadamente.

-
TAMAO: 50 2< 40 2< 0.25 mm CONCENTRACION: En este caso se utilizaron

=
las siguientes caractersticas de los geles, T C

=
5 %,
3 %, G
12%.
preparada solamente con Acrilamidabisacrilamida, y desgasificada minutos. (Este paso result critico para obtener una buena polimerizacin).
toda
ella
previamente
durante
10
12% de Glicerol a) Anfolinas:
240 pl
10% rango Ph 57 102
200 pl
La
mezcla
fue
nuevamente
Se
la
aadi
20
pl
de
una
solucin de Persulfato Amnico (22.8mg/cc>
moldes dispuestos durante 30 minutos.
a tal fin,
y se incub a 37Q O
NOTA: Las anfolinas utilizadas fueron indistintamente la de las casas Pharmacia, L.K.B. y de Sigma, no
encontrndose ellas.
diferencias
consustanciales
entre
Los separadores usados, fueron indistintamente de las casas L.K.B. y Sigma.
CONDICIONES ELECTRICAS
tipo de tiras empapadas en soluciones. a> Prefocusing: 250 Y ; 15 mA ; 1 W, durante 100 Vb.
103
b) Aplicacin de muestras: Las muestras se aplicaron mediante
doble papel Whatman del NQ 3, de unas dimensiones de 4 2< 3mm. El volumen aplicado de muestras fue el
).
empapado por el papel.( Aproximadamente 10 pl
La aplicacin se realiz a 0.5mm del Ctodo, y las condiciones elctricas fueron: 250 y ; 15 mA ; 1 W, durante 100 Vh. c) Focusing: Antes de iniciar el desarrollo de las muestras, se procedi a retirar las mismas, y se
establecieron las siguientes condiciones: 1.200 Y ; 15 mA ; 2.5W, durante 1.600 Vh. Todo el sistema fue refrigerado durante el proceso completo con una temperatura de 6Q C.
D. PARTICULARIDADES PARA EL SISTEMA DE LAS ~2- HS
La
deteccin
de
todos
los
fenotipos
completos de la a2 ES, requiere un doble anlisis, por un lado, las muestras deben de ser estudiadas sin desializar. De esta manera, los fenotipos ms comunes AHSG 1, AESG 21 y AHSG 104 2, son detectados sin
dificultad, adems, se pueden estudiar el resto de ellos salvo: AHSG 10 y AHSG 15 que son
indistinguibles de los fenotipos AHSG 11 y AHSG 13 respectivamente.< Yuasa y col. col. 1.990>. Por otro lado, la desializacin de las 1.988) y
<
Tomas y
muestras no diferencia los fenotipos AHSG 9 y 10 de los AHSG 2 y 1. respectivamente.< Yuasa y ccl. 1988).
D1.- PREPARACIN DE MUESTRAS
1.- Sueros testigos:
Sin desdializar: sueros fueron MilliQ) diluidos en en agua 1:2
Los destilada
<
calidad
proporcin
<suero/agua>.
Desializacin: pl de Neuroaminidasa
Se realiz con 20
(Tipo Y de Sigma, ttulo 1 Ul/rnl, Ph 5.5> con 5 pI. de suero. Se dej incubar toda la noche a temperatura ambiente. 2. Manchas de sangre:
Sin desializar: de gasa de unos 105 5 2< Smm, fue
Un trozo
macerado
en
20
pl
de
1120.
durante
hora
temperatura ambiente.
Desializacin: de gasa de unos 5 X 5mm, fue
Un trozo
macerado con 20 pl de una solucin de Neuroaminidasa Tipo Y de Sigma, tItulo 1 U/m, Ph 5.5), durante toda la noche a temperatura ambiente
(
20Q C>.
CARACTERSTICAS DE LOS GELES
MUESTRAS SIN DESIALIZAR

-
TAMAO: 50 2< 40 2< 0.25 mm CONCENTRACION: T 6.2%, e

=
3.2%, 5
12%.
5% rango Ph 4.55.4 5% rango Ph 4.24.9
= =
100 pl 100 pl
b) Separadores:
1.5% (P/V> de LN<2Acetoamida>J

<

-
ACES
30 mg.
Desgasificar 106
en
rotacin

-

=
las siguientes caractersticas de los geles, T O

=
5 %,
3 %, G=12%.
preparada solamente con Acrilamidabisacrilamida, y desgasificada minutos. (Este paso result critico para obtener una buena polimerizacin>.
toda
ella
previamente
durante
10
12% de Glicerol
240 pl
a> Anfolinas:
5% rango Ph 4.55.4 5% rango Ph 4.24.9
= =
100 pl 100 pl
107
b) Separadores:
1.5% (2/Y> de EN(2Acetoamida>J

(
ACES
30 mg.
La
mezcla
fue
nuevamente

-
Se
la aadi 20
pl de una
solucin de Persulfato Amnico <22.Smg/cc>
1 pl de TEMED. Se procedi a rellenar los y se incub a 37Q O
moldes dispuestos a tal fin, durante 30 minutos.
MUESTRA DESIALIZADA
1. GELES CON SACAROSA.

-
TAMAO: 50 X 40 X 0.25 mm CONCENTRACION: T

=
6.2%, 0
3.2%, 5
12%.
COMPOSICION: Para 2cc de solucin Stock. a> Anfolinas:
5% rango Ph 5
100 pl
b) Aditivos:
340 mg de Urea. 108
Desgasificar
en
rotacin

-
a tal fin mediante pipetas Pasteur. Incubar a 372 C durante 20 minutos aproximadamente.

-

=
las siguientes caractersticas de los geles, T O

=
5 %,
3 %, O
12%. Para 2cc de solucin Stock,
COMPOSICION:
preparada solamente con Acrilamidabisacrilamida, y desgasificada minutos. (Este paso result crtico para obtener una buena polimerizacin).
toda
ella
previamente
durante
10
12% de Glicerol
240 pl
a> Anfolinas:
5% rango Ph 4 109
100 pl
b) Aditivos:
340 mg de Urea
La
mezcla
fue
nuevamente
Se
la aadi
20
pl de una
solucin de Persulfato Amnico <22.8mg/cc>
1 pl de TEMED. Se procedi a rellenar los y se incub a 37Q C
moldes dispuestos a tal fin, durante 30 minutos.
D1. CONDICIONES ELECTRICAS
tipo de tiras empapadas en soluciones. a) Prefocusing: 250 Y ; 15 mA ; 1 W, durante 100 Yh. b> Aplicacin de muestras: Las muestras se aplicaron mediante
papel Whatman del NQ 3, de unas dimensiones de 4 2< 3mw. El volumen total de muestras fue el empapado por el papel. 110
La aplicacin se realiz a 0.5mm del Ctodo, y las condiciones electricas fueron: 250 V ; 15 mA ; 1 W, durante 100 Vh. c) Focusing: Antes de iniciar el desarrollo de las muestras, se procedi a retirar las mismas, y se
establecieron las siguientes condiciones: 1.200 y ; 15 mA ; 2.5 W, durante 1.600 Yh. Todo el sistema fue refrigerado durante el proceso completo con una temperatura de 102 C. NOTA: Las anfolinas utilizadas fueron indistintasente la de las Casas Phar~acia, L.K.E. y de Sigaa, no encontrndose diferencias significativas entre ellas. Los separadores usados, fueron indistintaaente de las casas LIB. y Sigma.
III.- METODO ESTADISTICO
A. Frecuencias fenotpicas. genotpicas y allicas
El examen fenotpico de los individuos, es el punto inicial de estudio en todas las poblaciones. Partiendo de la definicin de la
frecuencia es igual al nmero de sucesos favorables dividido por el nmero total de sucesos, podemos
considerar un caso hipottico de un locus autosmico 111
A, con dos alelos a los que llamaremos A1 y A2, los genotipos posible sern: A1 A1, A1 A2 y A2 A2. Siendo ti el nmero N1 de el representante nmero de de la poblacin con el
estudiada,
representantes
genotipo A1 A1, N2 el de A1 A2 y ti3 el de A2 A2, se debe de cumplir que:
N=N1+N2+N3
y por consiguiente:
NJN
=
=
frecuencia de A1
Y;
frecuencia de A1 A2
N3/N x+Y+ Z=100%
frecuencia de A2A2
El total nuestro ejemplo ser:
de gametos con el alelo A1 en
N1
1/2 N2
)I N
p =frecuencia gnica del alelo A1. tendremos:
Del mismo modo
112
(
q
=
1/2 N2
Otra
N3
)/
de
q
de estas
frecuencia gnica del alelo A2. forma expresin
frecuencias gnicas ser:
p=X+
Por frecuencias
1/2Y;q
lo tanto,
U>,
1/2Y
podemos decir a que el 1W las de igual
),
gnicas
ser
(
Homocigtico para ese alelo los Heterocigticos

<
HM
ms la mitad de
Eh
>,
partido por el 1W total
de individuos de la poblacin.
( SHH+SHh/2
B. Equilibrio HardvWeinberg En 1.908, Rardy y que We i n be r g, en una las
independientemente, poblacin grande con
establecieron apareamiento y
aleatorio,
frecuencias
gnicas
genotipicas
permanecen
constantes de generacin a generacin, en ausencia de migracin, mutacin y seleccin, 113 estando las
frecuencias determinadas por las frecuencias gnicas. A las poblaciones que cumplen dicha ley, se les dice que estn en equilibrio de Hardy-Weinberg. El clculo matemtico de dicha ley, parte de la base que es el apareamiento a la unin aleatorio aleatoria entre de sus
individuos gametos.
igual
C. Estadstico 2<2
El valor del estadstico x2 se obtiene de la siguiente frmula:
X2(S(FeFt)Ft
Siendo encontradas frecuencias en el Fe las frecuencias poblacional, a partir absolutas Ft, las estudio
tericas,
calculadas
de las
frecuencias gnicas, siendo el nmero de grados de libertad igual al nmero de fenotipos menos alelos. El valor de la 2<2 sirve de comparacin el de
entre los valores observados y los esperados.
114
D. ndice de Heterogenicidad Viene expresado por la formula:
1.11.
Hh
donde Hh es el 1W de Heterocigticos encontrados en la poblacin. N es el nmero total de estudiados, Indica la cuanta de polimorfismo y
eficacia de cada sistema.
E. Probabilidad acumulada de identidad y potencial acumulado de discriminacin
La probabilidad acumulada de identidad, viene expresada por la siguiente frmula:
PI= SF12
Indica individuos la probabilidad al azar de que el dos mismo escogidos tengan
fenotipo. Ofrece de esta manera un indice del valor del marcador para la individualizacin de las
personas (Fisher, 1.951). El potencial acumulado de discriminacin, est expresado por la siguiente frmula:
115
P D.= (1 SF1)
Expresa individuos la probabilidad al azar de que en dos su escogidos difieran
fenotipo.< Jones, 1.972).
116
METODOS DE TINCION
1. INTRODUCCION
El apartado ms importante dentro de las tcnicas electroforticas, es sin lugar a duda los sistemas de deteccin de las protenas separadas.
Hasta tal punto es importante que una mala tcnica de deteccin tanto, hace fracasar critico en todo este un el proceso. ltimo mtodo Por lo
resulta
apartado, con la
fundamentalmente
elegir
suficiente sensibilidad y poder de discriminacin de bandas. <Hoeremans y cois. 1.987>. Cada da con mayor empleando especficos estudiar como mtodo de insistencia, fijacin, se est
anticuerpos pretenden son
contra las protenas que se (Inmunofijacin).
Estos,
Inmunoglobulinas monoclonales, altamente especificas y muy purificadas, hasta el punto que segn Ramlau y col. <1.987>, la especificidad de una depende de la tcnica de de los
Inmunofijacin, anticuerpos animal
calidad
empleados. de
Parece estas
ser que el
tipo de no
donador
Inmunoglobulinas,
interfiere
en la calidad de esta. Algunos autores 117
como Ramlau y col.
<1.987>, proponen que se utilice proveniente de distintos
una mezcla de antisueros
animales inmunizados, con lo cual se disminuye las variaciones en las respuestas.
GENERALIDADES SOBRE LOS SISTEMAS ESTUDIADOS
INHUNOTINCION: En 1.953, Grabar y Willians, descubrieron por vez primera la tcnica de inmunofijacin de
protenas aplicadas a las electroforesis del suero, llamndoles Inmunoelectroforesis. Desde entonces, no solo las tcnicas y de inmunofijacin si han no variado que las
cuantitativa
cualitativamente,
tcnicas separativas, consiguen una mayor precisin en la separacin de las muestras. Bsicamente, la Inmunotincin, va a
consistir en tres pasos perfectamente delimitados:
A.- INMUNOFIJACION Mediante este primer paso, todas o algunas de las muestras separadas mediante tcnicas
electroforticas, y que actan como Antgenos frente a los Anticuerpos donde se especficos, ha realizado 118 son la fijadas a la
matriz
separacin,
formndose un complejo AgAc que queda retenido en los poros de dicha matriz. La especificidad as como la purificacin del Ac. utilizado, va a determinar las especificidad de la tcnica de Inmunofijacin. Las caractersticas que debe de reunir un Anticuerpo para que pueda ser utilizado como fijador de protenas van a ser: 1. QUE SEA ESPECIFICO Es decir, que reconozca una sola protena. De esta manera, nos evitaremos errores de
identificaciones posteriores.
2.- QUE ESTE ALTAMENTE PURIFICADO El extremadamente proceso de purificacin se es
importante cuando completos,
utilizan como ms o
antgenos a sueros
o fracciones
menos amplias de los mismos. En el primer caso, la purificacin se debe de realizar en los sueros
obtenidos de los animales inmunizados. En el segundo, es el suero que acta como antgeno el que se somete a purificacin. Actualmente, los procesos de purificacin, se realizan tanto en el suero del donador como en el del receptor, esto, combinado con buenas tcnicas 119
separativas,
hace
que el
grado
de pureza
de
los
anticuerpos sea en la mayora de los casos del 100%. 3.- UNION ANTGENO ANTICUERPO Tambin es de extremada importancia el
hecho de que la unin del complejo Ag-Ac,
sea lo
suficientemente estable como para que no se deshaga durante los procesos de lavados y desarrollo de las tcnicas de tincin.
B.- SOLUBILIZACION Consiste en retirar todas aquellas
protenas y dems resto de las muestras que no hayan sido reconocidas por los antisueros. El procedimiento de solubilizacin, suele ser mediante lavados
sucesivos en soluciones cuyo Ph, permitan la retirada de las protenas no deseadas. Es extremadamente importante el retirar los resto de muestras que no estn formando complejos inmunes, ya que de ello va a depender por un lado la perfecta identificacin de las protenas, y por otro, va a eliminar los Es excesos de fondos coloreados su
<Eackground).
absolutamente
imprescindible
realizacin cuando vamos a utilizar una tcnica de tinciri general para protenas.
120
C. TINCION Son muchas y muy variadas las tcnicas de tincin general que se pueden las utilizar en las el de
inmunofijaciones, Silverstain Coomassie. realizada,

<
siendo de
ms
utilizadas y el Azul
Tincin la la
plata)
Mediante suplimos
inmunofijacin previamente falta de especificidad de
dichas tinciones generales. De ambas tcnicas, el Silverstain, es la que mejores resultados ofrece, necesitndose menos
cantidad de muestra para que se pueda visualizar las protenas que en el caso del azul de Coomassie. cambio, es ms costosa y laboriosa que esta. INHUNOBLOTTING: El blotting como tcnica de fijacin, fue descrita por vez primera por Southern (1.975), y ms tarde adaptada a protenas por Renhart En
(1.978>.(Johansson, 1.98?>. Bsicamente, fundamentales:

1. BLOTTING
consiste
en
cuatro
pasos
Consiste en la transferencia y fijacin de las muestras separadas a membranas, siendo las ms usadas las de Nitrocelulosa <NC) de Polivinil
difluoride <PVDF). 121
Las fuerzas que obligan a la transferencia son varias, pero entre ellas destacamos:
Elctricas, dando lugar al llamado
Electroblotting.
Osmticas, dando origen al Blotting
por difusin.
-
Vaco,
dando
origen al denominado
Vacun-blotting.<Jacobson y cols. 1.990). La forma ms utilizada desde un punto de vista rutinario, es el Blotting por difusin sobre membranas de NC, PVDF. En el caso del presente
trabajo, estas son tambin las condiciones usadas.
FACTORES A TENER
EN CUENTA EN LA REALIZACION DEL
BLOTTING POR DIPUSION
1. Solamente se transfiere entre el 30 y el 35% de las protenas separadas. 2.Presentan problemas para su
realizacin cuando el peso molecular de las muestras es elevado. 3. Es de extremada importancia el
tamao del poro que tenga la membrana usada. 4. Es critico la eleccin del tampn de transferencia, principalmente del Ph de este, as 122
como los aditivos utilizados en su fabricacin. 5.El poder de fijacin de las
membranas usadas va a variar segn el tipo de estas, as tenemos que para las NC. se estima que son
2 capaces de fijar entre 80 a 250 pg/cm ( Montelaro, 1.987>. En el caso de las PVDF, se estima que su poder de fijacin para protenas es de 190 pg/cm2. (Montelaro, 1.987.). Personalmente, en el presente trabajo, no se ha constatado diferencias apreciables en la
capacidad fijadora de uno u otro tipo de membranas. 6. Tanto las NC como las PVDF, pueden ser sometidas a tinciones con colorantes aninicos.
2.-BLOQUEO DE LAS MEMBRANAS Consiste en bloquear los poros de la
membrana de trasferencia, una vez que esta ha fijado las muestras. Para ello se utilizan protenas tales como la Gelatina, Casena, Albmina, etc. Su objetivo es evitar que dichos poros puedan retener los
antisueros que se usen para reconocer a las protenas objeto de estudio. De esta manera, se obtiene una eliminndose as el
limpieza de fondos excelente, exceso de Background.
123
3. FIJACION DE LAS PROTENAS ELEGIDAS
Se realiza mediante una reaccin AgAc, con Anticuerpos especficos. Dicho complejo inmune, queda retenido entre los poros de la membrana,
ofreciendo una fijacin muy fuerte y selectiva.
4. SOLUBILIZACIN DE PROTEINAS NO FIJADAS
Tiene por objeto eliminar todas aquellas protenas no reconocidas por el antisuero. De esta manera, se aumenta la especificidad de la tcnica,
as como se elimina el Background, facilitndose la
identificacin posterior.
PARTICULARIDADES SOBRE EL SISTEMA DE INMUNOTINCION
1.- FIJAdOR:
Las fijaciones de los sistemas estudiados se realizaron con frente ORN
Inmunoglobulinas a:
de
conejos humanas
especficas, (Dakopatts),
Gcglobulinas (Dakopatts), Tf
Humano
Humana
(Dakopatts> y a2 El
HS humana <Behring). de realizacin de la
procedimiento
inmunofijacin es el siguiente:
Una vez realizado el IEF, sumergimos una dilucin 124 del antisuero
las
placas
en
correspondiente, a una concentracin, temperatura y tiempo de incubacin que depender de la protena a estudiar.
<
Ver esquema>.
Despus
de
realizada
la
inmunofijacin, se procedi a realizar 4 lavados con suero fisiolgico a temperatura ambiente, durante un tiempo total de 2 horas en agitacin continua. Las caracteristicas fijacin de los procesos de
quedan resumidas en el siguiente esquema:
GC TITULO TIPO CONCENT TEMPER 100 CONEJO 1:50 2OQC
TF 750 CONEJO 1:50 2OQC
ORN 450 CONEJO 1:50 2OQC
a2-HS
CONEJO 1:50 2OQC
TOTAL
60
60
60
60
IOTA:
Las diluciones de los antisueros, fueron realizadas en agua destilada
calidad Killi, Q, Se consider que la temperatura anbiente del laboratorio fue de 2OQC.
2. TNCION: Los mtodos empleados fueron los de ms amplia utilizacin, el llamado Azul de Coomassie y el SilverStaining. 125
AZUL DE COOMASSE
Se emplearon dos tcnicas diferentes, a las que denominaremos A y B. TECNICA A: 1. Solucin colorante:
0,1% de Azul de Coomassie tipo Phast gel
blue R.
Pharmacia)
10% de Acido actico. (Merck) 30% de Metanol. (Merck>
60% de Agua calidad Milli. Q.
2. Solucin decolorante:
10% de Acido actico.
(Merck)
30% de Hetanol. <Merck) 60% de Agua calidad Milli. O.
3. Solucin conservante:
10% de Acido actico. <Merck> 5% de Glicerol (Probus) 85% de Agua calidad Milli.Q.
TECNICA B: 1.- Solucin de tincin:
0,2% de Azul brillante de Coomassie R
250. (Serva).
126
50% de Metanol. <Merck) 10% de Acido actico, (Merck> 40% de Agua calidad Milli. Q.
2. Solucin decolorante:
10% de Acido actico. <Merck) 45% de Metanol. (Merck> 45% de Agua calidad Milli. Q.
10% de Acido actico.
(Merck)
5% de Glicerol <Probus) 85% de Agua calidad Milli.Q.
Esquema del procedimiento empleado en las tinciones de Azul de Coomassie:
PASO 1 2 3 4
SOLUCIONES COLORACION DECOLORACI. DECOLORACI. DECOLORACI.
TIEMPO__ 8 10* 5 8 10
TEMPERATURA 502C 202C* 5OQC 2OQC* 5OQC 2OQC* 502C - 2OQC~
127
CARACTERSTICAS PARTICULARES DE LAS TECNICAS DE AZUL DE COOMASSE.
Se
estim
la
temperatura
del
laboratorio en 2OQC.
Las
cifras
con
asteriscos,
representan los valores de la llamada tcnica B.
Todos
los pasos
se
realizaron en
agitacin continua.
En los pasos 2,3 Y 4, se utilizaron
tres soluciones nuevas en cada una de ellas.
Las
soluciones
de
tincin
conservante,
son reciclables,
siendo su tiempo de
duracin aproximadamente de 3 4 meses.
El proceso de decoloracin aumenta si
hacemos pequeas pausas durante el mismo. Segn Ohlsson y col

<
1.987),
si
aumentamos la TI desde 2OQC hasta 400C
el tiempo de
tincin y de decoloracin, decrece aproximadamente en un 40%, pero sin embargo, aunque un aumento de TI
siempre trae parejo una disminucin de los tiempos de reaccin, no siempre se obtienen los mismos
resultados que usando una TI baja y por lo tanto un tiempo de reaccin ms largo. Por otro lado, si la TI es muy elevada, disminuye la
estabilidad de los
productos colorantes. 128
A manera de resumen, podemos establecer que:
El
aumento
de
la
sensibilidad
obtenido
utilizando una fl de 2OQC frente a una T de 4OQC es del 10%. pero a

y
cambio
del
doble
tiempo
de
reaccin..co~ksson
col. 1.987)
SILVERSTAINING
Igual que
en
el
caso anterior,
fueron
empleadas dos tcnicas diferentes, a las que se les denomin A y B: -TECNICA A: 1. Solucin de prefijado:
Tricloroactico al 20%. <Merck)
2. Solucin lavadora de anfolinas:
50% Metanol <Merck) 10 Acido actico. <Merck)
3. Solucin de fijado:
8.3% de Glutaraldehido.
<Sigma)
4. Solucin de plata:
0,5%
Nitrato de
plata
(Merck>
en
agua.
129
5. Solucin de desarrollo:
-
2,5% P/V de Carbonato sdico en agua. 40 pl de Formaldehido <Merck) al 37%,
en 100 ml de la solucin de carbonato sdico. (Esta

solucin debe de prepararse antes de ser usada).
6. Solucin de parado:
-
Acido actico al 5% en agua.
10% Acido actico. 5% de Glicerol.
TECNICA E: Mtodo descrito y adoptado por Carracedo y cols.

1. Solucin de prefijado:
Tricloroactico al 12%. (Merck)
2. Solucin lavadora de anfolinas:
<la> 50% Etanol <Merck) (24) 5% Metanol (Merck> 7% Acido actico. <Merck)
130
3.- Solucin de fijado:
10% de Glutaraldehido.
(Sigma)
4. Solucin de plata:
0,1%
Nitrato
de plata
(Merck)
en
agua.
5. solucin de desarrollo:
3% P/V de Carbonato sdico en agua. 75 pl de Formaldehido (Merck> al 37%, (Esta
en 100 ml de la solucin de carbonato sdico.
solucin debe de prepararse antes de ser usada>.
6. Solucin de parado:
Acido actico al 5% en agua.
10% Acido actico. 5% de Glicerol.
131
Esquema del procedimiento de la tincin con plata (TECNICA A)
PASO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
SOLUCION PREFIJADO LAYADO ANFOLINAS FIJADO LAVADO LAVADO PLATA LAVADO LAVADO DESARROLLO DESARROLLO PARADO FIJADO
TIEMPO 10 2 6 2 2 8 1 1 1/2 510 5 5
TEMPERATURA 202C 502C 5OQC 5OQC 5OQC SOQO 2OQC 2OQC 202C 202C SOQO 5OQC
NOTA:
La solucin de lavado e~p1eada fue agua. lanto la solucin de lavado, coso
la desarrolladora, se utiliz dos veces consecutivas, renovndolas en cada paso. La calidad del agua empleada fue MUllO.
132
Esquema del procedimiento utilizado en la Tcnica B:
PASO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 = 15
SOLUCION PREFIJADO LAVADO ANFOLINAS 12 LAVADO ANFOLINAS 12 LAVADO ANFOLINAS 1.2 LAVADO ANFOLINAS 22 FIJADO LAVADO LAVADO LAVADO LAVADO PLATA LAVADO DESARROLLO PARADO FIJADO
TIEMPO 15 20 20 20 20 20 15 15 15 15 30 1 510 5 5
TEMPERATURA 202C 5020 5020 5020 5020 5020 202C 2020 202C 2020 5020 2020 2020 5020 5020
NOTA:
Los lavados fueron realizados en agua destilada calidad Nilli.Q.
133
CARACTERSTICAS PARTICULARES DE LA TECNICA DE SILVER STA NI NG
Es imprescindible que la calidad de
los reactivos empleados sea elevada, principalmente la del agua destilada, debiendo estar mayor nmero de iones posibles.
exentas del
La
intensidad
de
las
bandas
obtenidas, va a depender del tiempo de actuacin de las soluciones de desarrollo.
Se ha estimado que la temperatura
ambiente del laboratorio es de 202C.
Todas las soluciones son estables por
largo tiempo, excepto la de desarrollo que hubo de ser realizada antes de su utilizacin.
Es importante realizar a temperatura
ambiente los pasos de fijacin en tricloroactico y el desarrollo, ya que de ello va a depender la mayor o menor intensidad del Eackground obtenido.
Segn Ohlsson y cols.
<1.987),
el
tiempo de actuacin de la solucin de desarrollo va a depender de la calidad del glutaraldehido y del formaldehido utilizado.
Las
temperaturas en base a
de la
SOQO
fue
especialmente
escogida
relacin
Sensibilidad/tiempo de reaccin, estimndose la ms 134
adecuada.
PARTICULARIDADES SOBRE EL SISTEMA DE INMUNOBLOTING
INTRODUCCION
El sistema de inmunoblotting empleado en el presente trabajo consisti en la fijacin en
membranas de Nitrocelulosa y de Polivinildifluoride indistintamente, seguido por deteccin mediante
anticuerpos peroxidasas conjugados (HRP). Para este ltimo paso, se emplearon dos tcnicas diferentes.
TECNIOA A: 1. ELOTTING. El sistema de Blotting empleado fue el de difusin simple, segn la siguiente tcnica:
PREPARACION DEL TAMPON DE TRANSFERENCIA

* *
0,30 gr de TRIS <Sigma) 1,45 gr Glicina (Sigma> 2Occ de Metanol.<Merck) SOcc de agua Milli.Q.
Ajustar a Ph 8.3 con Acido clorhdrico. 135
1.1.
Se utilizaron en primer
lugar
membranas de Nitrocelulosa de 0.45 pm de dimetro medio. (Millipore). 1.2. Sumergir la membrana en la
solucin de transferencia durante 5 minutos. 1.3. Colocar la membrana encima del gel de IEF, evitando que queden burbujas de aire, y sobre ella, 1 cm. de trozos de papel de filtro, donde los dos primeros fueron empapados en la solucin de transferencia, encima de todo se coloc un peso
aproximado de 100 gr. En esta situacin, se esper 20 minutos a TI ambiente.
2.- BLOQUEO DE LA MEMBRANA. El bloqueo o saturacin de la membrana se llev a cabo sumergindola durante 30 minutos a TI ambiente en la siguiente solucin saturadora:
-
PREPARACION DE LA SOLUCION BLOQUEANTE

*
0,24 gr de TRIS <Sigma) 2,9 gr de Cloruro Sdico 3 gr de Gelatina

( (
MercK>
* *
Sigma>
100 cc de Agua Milli. Q.
136
3.- INMUNOFIJACION. Se pgina 125. 3.1. La incubacin con el antisuero, se realiz en agitacin continua. 3.2. Un vez retirada la solucin del realiz siguiendo el esquema de la
antisuero, se someti a la membrana a des lavados en agua Milli. Q, de unos 10 minutos de duracin.
4. VISUALIZACION
Utilizacin del segundo anticuerpo. segundo anticuerpo, se us
Como
Inmunoglobulinas obtenidas de gato (Sigma) de cerdo (Dacopatts), frente a sueros de conejos, con la
particularidad de ser Peroxidasa conjugada, (HRP>. Las diluciones de este segundo antisuero fueron: a. 1:250 para tiempos de incubacin de 60. b. 1:500 para tiempos de incubacin
superior a 120.< Ej. Toda la noche).
4.1. La membrana fue incubada en este segundo antisuero diluido 1:250 en agua Mill. Q, durante 60 a T~ ambiente y en agitacin continua. 4.2. Una vez retirado el segundo
137
antisuero, se someti la membrana a dos lavados en agua durante 10 minutos cada uno. 4.3
.
Para poner de manifiesto la
actividad de la enzima peroxidasa conjugada con el segundo antisuero, se introduce la membrana en la
siguiente solucin reveladora:
SOLUCION REVELADORA
*
lOmg de 4cloro naftol
Sigma)
3.3cc de metanol <Merck) 16,7 cc del tampn saturador de
gelatina.
*
1O4 de Agua Oxigenada al 30% las peroxidasas, queda
La actividad de
detenida retirando la solucin reveladora y lavando abundantemente con agua, cuando la intensidad de las bandas sea la adecuada.
TECNICA B:
SOLUCIONES Y TAMPONES EMPLEADOS
1Q.- SOLUCION DE TRANSFERENCIA.

*
6,06 gr de TRIS (Sigma) 28.8 gr de Glicina <Sigma) 138
400cc de Metanol (Merck> 1.SOOcc de agua (Mliii. O.>
2Q.- SOLUCION DE LAVADO.

*
13,6 gr Fosfato disdico dibsico
dihidratado <Merck).
*
4,9 gr Fosfato bsico de potasio
(Merck).
* * *
17,2 gr de cloruro sdico (Merck> 3 cc de Tween20 <Sigma) 2.000 cc de agua (Milli. Q>.
Ajustar a Ph 7.2.
32. SOLUCION REVELADORA.

* * *
30 mgr 4cloroInaftol (Sigma) 3 cc Acetona

<
Merck)
50 cc de una solucin de cloruro
sdico 0.2M.
*
59cc de TRIS CLH (Sigma)
Ajustar a Ph 7.4.
PROCEDIMIENTO DE LA TECNICA: 1. Sumergir la membrana de NC en la solucin de transferencia durante 30 minutos. 2. Colocarla encima del gel con un 139
peso
de
500
gr,
separados
por
el
centro por un
centmetro de papel secante, durante 30 minutos. 3. Lavar con la solucin preparada a tal fin durante dos horas, cambiando cada 15 minutos la solucin. 4. Diluir el primer antisuero en la solucin de lavado, e incubar con la membrana en
agitacin continua segn el esquema de la pgina 125. 5. Lavar durante fin, una hora con la
solucin preparada a tal minutos.
cambindola cada 15
6. Diluir el segundo antisuero
<
HRP),
1:250 en la solucin de lavado, y dejar incubar la membrana durante 1 hora. 7. Lavar con la solucin durante 1
hora cambindola cada 15 minutos. 8. Aadir la solucin reveladora con 40 pl de agua oxigenada al 30%, aadida en el ltimo momento.
MEMBRANAS DE POLIVINIL-DIFLUORIDE <PVDF>
La membranas de PVDF utilizadas fueron de 0.45 pm de dimetro presentan la (Millipore). de Dichas ser membranas
particularidad 140
hidrofbicas,
tenindolas que transformarlas en hidrfilas para que sirvan como inmovilizantes de protenas. A tal fin, se procedi a sumergir dichas membranas en dos baos sucesivos, el primero en etanol absoluto, y el
segundo en agua. Despus de esto, el procedimiento a seguir fue el mismo que en las membranas de NC.
141
RESULTADOS
A.- COMPORTAMIENTO DE LOS FENOTIPOS DE LOS DISTINTOS MARCADORES ESTUDIADOS CON RESPECTO AL TIEMPO
Los diferentes das,
resultados
obtenidos
mediante cada
las siete
tcnicas,
fueron
evaluados
hasta un total de tres meses,
al objeto de
precisar la fiabilidad
y reproductibilidad de las
distintas tcnicas con respecto al tiempo.
Ge-GLOBULINAS.
PRECIPITACION. TECNICA DE B.HOSTE A.- RESULTADO EN PLASMA
FENOTIPOS 2 15 lF 215
jg OBSERVADOS
5 1 15 18 4
lFlS TOT&L TABLA A
6 50
142
2.- RESULTADOS EN MANCHAS DE SANGRE FENOTIPOS 1

2 1! 19 3 2
SEMAJAS 2

10

11

12
-
T TABLA B
INMtJNOBLOTTING Y DETECCION CON SEGUNDO ANTISUERO
RESULTADOS EN LAS MANCHAS DE SANGRE. FENOTIPOS 1 2 11 19 219 21! 1719 TOTAL 5 1 16 18 4 6 50 2 5 1 16 18 4 6 50 3 5 1 16 18 4 6 50 4 5 1 16 18 4 6 50 SIMIAS 5 5 1 16 18 4 6 50 6 5 1 16 18 4 6 50 a 1 5 1 16 18 4 6 50 8 5 1 16 18 4 6 50 9 5 1 16 18 4 6 50 10 5 1 16 18 4 6 50 11 5 1 16 18 4 6 50 12 5 1 16 18 4 6 50
TABLA C
143
SISTEMA DEL OROSOM[JCOIDE.

INMUNOFIJACION Y TINCION PLATA 1.A. MUESTRAS SIN DESIALIZAR
1.A.1. RESULTADOS EN PLASMA FUOTIPOS 1 6 1S TOTAL 12 OBUEHADO 18 9 23 50

TABLA 1.A.1.
1.A.2 RESULTADOS EN LAS MANCHAS DE SANGRE
FEEOTIPOS 1 7 5 79 TOTAL 18 9 23 50 2 18 9 23 50 3 18 9 23 50 4 18 9 23 50
SIMIAS 5 18 9 23 50 6 18 9 23 50 7 18 9 23 50 8 18 9 23 50 9 18 9 23 50 10 18 9 23 50 11 18 9 23 50 12 18 9 23 50
TABLA 1.A.2
144
1.B. MUESTRAS DESIALIZADAS.
1.B.1.- RESULTADOS EN PLASMA
IENOTIPOS 11
12
2 ORDERVADO 15
0
9 1112 116
123
9 3
22
TOTAL
50
TABLA 1.B.1.
1.E.2.- RESULTADOS EN LAS MANCHAS DE SANGRE
IEIOTIPOS 1
11 72
SERANAS 2 15
0
3 15 0 9 3
22
4 15 0 9 3
22
5 15 0 9 3
22
1 15 0 9 3 22 1 50 15 0 9 3 22 1 50
7 15 0 9 3 22 1 50
8 15 0 9 3 22 1 50
9 15 0 9 3 22 1 50
10 15 0 9 3 22 1 50
11 15 0 9 3 22 1 50
12 15 0 9 3 22 1 50
E 1112 113 123 TOTAL
9 3
22
1 50
1 50
1 50
1 50
TABLA 1.B.2.
145
INMUNOBLOTTING Y DETECCION CON SEGUNDO ANTISUERO 2.A. MUESTRAS SIN DESIALIZAR
2.A.1.- RESULTADOS EN PLASHA
EUOT[?OS 7 6 78 TOTAl.
U QUIETADO 18 9 23 50
TABLA 2.A.1.
2.A.2 RESULTADOS EN LAS MANCHAS DE SANGRE
!INOTIPOS
1 Y 18 2 = 18 1 .= 18 4 .= 18
SKKAKAE
5 = 18 . 18 6 . 18 7 18 8 1 .= 18 18 18 18 10 11 12
5 13 TOTAL
9 23 50
9 23
9 23
9 23
9 23 50
9 23 50
9 23 50
9 23
9 23
9 23 50
99 23 50 =. 23 50
50 50 50 =~ =
50 50 -- =
TABLA 2.A.2
146
2.B.1. RESULTADOS EN PLASMA
FEJOUPOE El 12 6 1112 116 128 TOTAL
fil OBSERVADO 15 0 9 3 22
50
TABLA 2.B.1.
2.B.2.- RESULTADOS EN LAS MANCHAS DE SANGRE
EBEOTIPOS 1 11 12 6 1112 115 725 TOTAL 15 0 9 3 22 1 50 2 15 0 9 3 22 1 50 3 15 0 9 3 22 1 50 4 15 0 9 3 22 1 50 5
SEMANAS 6 15 0 9 3 22 1 50 15 0 9 3 22 1 50 7 15 0 9 3 22 1 50 8 15 0 9 3 22 1 50 9 15 0 9 3 22 1 50 10 15 0 9 3 22 1 50 11 15 0 9 3 22 1 50 = 12 15 0 9 3 22 1 50
TABLA 2.B.2.
147
SISTEMA DE LAS TRANSFERRINAS.

INMUNOFIJACION Y TINCION CON PLATA 3.A. MUESTRAS SIN DESIALIZAR
3.A.1. RESULTADOS EN PLASMA ?EROTIPOS 01 02 03 0102 TOTAL 12 OBSERVADOS 29 1 0 20 50

TABLA 3.A.1
3.A.2.- RESULTADOS DE LAS MANCHAS DE SANGRE
FENOTIPOS 1 Cl 02 03 0102 TOTAL 2 3 4
SEKAIAS 5 6 7 8 9 10 11 12
29)29129129129129129129 1 1 1 1 1 iii JI IiJi 1 lo[olooIoIoIoI ob o jo lo

(291 29129129
2020120120
20{20J20 I20126I20 50
20120
{so 50
50
501501501 50
TABLA 3.A.2
148
3.B.1. RESULTADOS EN PLASMA
FENOTIPOS Cl 02 03 0102 TOTAL
52 OBSERVADOS 29 1 0 20 50
TABLA 3.B.1
3.E.2.- RESULTADOS DE LAS MANCHAS DE SANGRE
FENOTIPOS 1 2 3 4 5
SERAJAS 1 7 8 9 10 11 12
!2~l 291 ~2 29129! 29129
29129 VF~TFi
II]71T1117[
1~ )i!ililit1]
j20] 2020120201262012012020201201 TOTAL ]2.i.LLS~15O 50 50150)501501501 ~~=tj
TABLA 3.B.2
149
INNUNOBLOTTING Y DETECCION CON SEGUNDO ANTISUERO
4.A. MUESTRAS SIN DESIALIZAR
4.A.1.- RESULTADOS EN PLASMA
FRIOTIPOS Cl C2 C3 CIC2 TOTAL
E OBSERVADOS 29 1 O 20 50
TABLA 4.A.1
4.A.2.- RESULTADOS DE LAS MANCHAS DE SANGRE
FENOTIPOS 1 2 3 4 129
SEMANAS 5 6 7 8 9 10 11 12
[29(2929
Cz
29129129129
29129129129
i1 01010161 ol 01010 ~
20202020202020202020120 TOTAL
~~l~~] 1501 561 ~ ~ 50 156

TABLA 4.A.2
50
50
50150
150
4.B.1.- RESULTADOS EN PLASMA
FENOTIPOS Cl C2 03 0102 TOTAL
12 OBSERVADOS 29 1 0 20 50
TABLA 4.B.1
4.B.2.- RESULTADOS DE LAS MANCHAS DE SANGRE
FENOTIPOS 1 ci 2 3 4 5
SEMANAS 6 1 8 9 10 11 12
]29j 29129129129129
291291291291291 29
iIiliLrxIiLL
TOTAL
1201201201201201202012012026! 2020 Iso Isa j50J 50156! 50 ~ 50 ] 50! 50 j 50 50

TABLA 4.B.2 151
SISTEMA DE LAS a2HS GLICOPROTEINAS.

INMUNOFIJACION Y TINCION CON PLATA A. MUESTRAS SIN DESIALIZAR.
5.A.1. RESULTADOS EN PLASMA
IEIOTIPOS 1 2 12
NQOBSERVADOS 21 2 27
TOTAL
50
TABLA 5.A.1
5.A.2. RESULTADOS EN MANCHAS DE SANGRE
FENOTIPOS 1 2 3 4
SEKAJAS 5 1 7 8 9 10 11 12
[21 2
12
21j21{21 211211211 2112421121121 ]2[ 212 ITililid 21112
LiS
[27 50
TOTAL
2~l~ 2727272727272712727 50 1501501 sol 50150150150150] 501 50

TABLA 5.A.2
NOTA: lose evidenciaron ningtn otro tipo de alelas, salvos los representados en el cuadro.
152
B.- MUESTRAS DESIALIZADAS.
La desializacin de las muestras en el estudio de las a2HS, est encaminada a la diferenciacin de los alelos AHSG*1O y AHSG*15, no encontrndose en el presente estudio ninguno de los anteriores. De esta manera, las tablas de distribucin fenotpicas de las muestras de a2HS desializadas, son idnticas a las de las muestras sin desializar; motivo por el que se prescinde de su representacin.
INMUNOBLOTTING Y DETECCION CON SEGUNDO ANTISUERO
A.- MUESTRAS SIN DESIALIZAR.
6.A.1. RESULTADOS EN PLASMA
FUOTIPOS
jg OBSEEVADOS
1 2 12 TOTAL
21 2 27 50
TABLA 6.A.1
153
6.A.2. RESULTADOS EN MANCHAS DE SANGRE
!EIOTI?OS 1
1
SUMAS 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12
2
12
21<21121 [1~[ 12<212(2
21211~21J 21
211211211 21121
212 = 2 2727j27
ji TI~!~T [2J 212! ijzf [1~ITT
127[27127127!271271271271271
TOTAL
150150150156150
50150
50j50
50150150
TABLA 6.A.2
NOTA: No se evidenciaron ningn otra tipo de alelas, salvas los representadas en el cuadro.
B.- CALCULO DE FRECUENCIAS GENOTIPICAS DE LOS DISTINTOS MARCADORES ESTUDIADOS
Partiendo de la base de que la frecuencia gnica de un alelo <g), es igual al nQ de
homocigtico para ese alelo <HH), ms la mitad de la suma de los heterocigticos <Hh)/2, dividido por el nQ total de individuos estudiados, tendremos
154
BISTRAE GC
GEN FEECUUCIA GEN
OK
FERCUEJCIA GEN
TI
!RRCQEICIA GEN
ES
FRECUENCIA
2 11 11
0.320.047 6.120.032 0560.050
11 12 3
0.550.050 0.640,020 0,410.050
CI C2
0.780.041 0,220.041
1 2
0.690.046 0.310.646
C. VALORES ESPERADOS Y EQUILIBRIO HARDYWEINBERG
JOTA: LA
y2,
AUJODE FUE CALCULADA. RO ES SIGJIIFICATIVA
1. Sistema Oc-Globulinas
OBSERVADOS FENOTIPOS lE 16 2 1F1S 1F2 182 TOTAL 1 1W 1 16 5 6 4 18 50 % 2.0 32.0 10.0 12.0 8.0 36.0 100.0
ESPERADOS 1W 0.72 15.68 5.12 6.72 3.84 17.92 50.00 1.44 31.36 10.24 13.44 7.68 35.84 100.00
x 2= o . 2374
PARA 3 GRADOS DE LIBERTAD. 155
2. Sistema Orosomucoide OBSERVADOS FENOTIPOS Fi F2 5 F1F2 F1S F2S TOTAL NQ 3 15 0 9 3 22 1 50 30 0 18 6 44 2 100 15.125 0.08 8.405 2.2 22.5 1.64 49.95 30.25 0.0016 16.81 4.4 45.1 3.28 99.8416 3 ESPERADOS 1W
x2= o .6780
PARA 2 GRADOS DE LIBERTAD.
3. Sistema Transerrinas OBSERVADOS FENOTIPOS Cl C2 C3 C1C2 TOTAL NO 29 1 O 20 50 % 58 2 0 40 100 1W 30.42 2.42 0.0 17.16 50.0 60.84 4.84 0.0 34.32 100.00 ESPERADOS
x2=
1.3695PARA
UN GRADO DE LIBERTAD.
156
4. Sistema o,HS Glicoproteinas
OBSERVADOS FENOTIPOS 1.
2 12
ESPERADOS 1W
1W 21
2 27
42
4 54
23.805
4.805
47.61
9.61
21.39 52.00
42.78 100.00
TOTAL
50
100
3 .4393
DISCRIMINACION (1PI)
PARA UN GRADO DE LIBERTAD.
13. POTENCIAL DE INDIYIDUALIZACION (PI) Y
GC
ORN
TF
a2HS
EPi
1EPi
1PI PI
0.738 6.261
6.673 0.326
0509 049
0581 = 0419
a oii
0.983
Pi= Probabilidad de identidad acumulada al azar Fisher, 1.951). = (1EPi)=
0.017
Potencial acumulado de discriminacin
(Janes, 1.972).
1ZPi
0.983
NOTA: LOS YALORES ZPi Y ( 1XPi>, ESTAN REFERIDOS SOLAMENTE A LOS FENOTIPOS ENCONTRADOS EN EL ESTUDIO.
157
E.- CALCULO DE SENSIBILIDAD DE LA TECNICA EMPLEADA. 1.-- El volumen medio por aplicacin fue de unos 10 pL. 2.Los valores tomados para las
concentraciones sricas de las diferentes protenas fueron:
E.1.- INMUNOFIJACION Y TINCION CON PLATA
MARCADOR
CONCENTRACION 36 ng/nl
DILUCION
3.000 - 000 DETECCION(n~)
01K
0.51 ng/ni
1/70
7 14
TY
a2RS
23 ~g/n1
48.5 ng/al
1/30
66 -100
(*~
tNOTA: ESTE VALOR CORRESPONDE A LA TECRICA DE BEOSTE
E.2.-
INMUNOBLOTTING MAS
SEGUNDO ANTISUERO
MARCADOR tGC 01K

~~1
CONCENTRACION 36 ng/ni 0.5i ng/, 1 23 ~/d1 48.5 ngi~i
DILUCION 1/30 l/9!i

1/54
DETECCION(nqj J 37.5 7S~ 5.5 11.2

4061
a2HS
(tu
I!!LSOTA: No fue posible la determinacin de la sensibilidad de la tcnica para las a2HS, debido a que la casa fabricante del antisuero lo dej de comercializar. Los limites de deteccin, estn referidos a las concentraciones plasmticas, y no a las cantidades de muestras aplicadas.
158
DISCUSION
1.CONSIDERACIONES SOBRE LOS HETODOS USADOS
A.- MUESTREO:
Las trabajo,
muestras estudiadas de 50
en el presente sanos, no
fueron
donadores
emparentados entre s, no se tuvo en cuenta la edad, el sexo ni la raza, ya que el objetivo del presente trabajo no es realizar un estudio gentico el
poblacional de estos marcadores.
Por lo tanto,
resultado, no se ver afectado por estos parmetros. Como los donadores fueron escogidos de
pacientes ambulatorios del Hospital Universitario de Sevilla, se tuvo especial cuidado en seleccionar a 50 pacientes cuyas datos clnicos analticas obtenidos, fuesen normales, no revelasen y los ningn
problema patolgico. De esta manera, de un total de 110 muestras escogidas en una primera fase, descartados un total presentaban algn de 60 pacientes, de patologa los fueron cuales
tipo
evidente,
especialmente heptica, ya que podan distorsionar ciertos fenotipos de los estudiados como por ejemplo 159
las Transferrinas. La realizacin de manchas experimentales de sangre sobre gasas estriles y envejecidas a
temperatura ambiente, (202 C), no reproduce con total fidelidad la multitud de situaciones que pueden
afectar a una mancha de sangre en un caso real. Sin embargo fue considerada la mejor forma de estudiar el comportamiento situaciones de estos de las marcadores que no se frente a
reales
disponen de
controles serolgicos. Por otro lado, hay que destacar que el tejido de gasa, absorbe ms cantidad de muestra que los tejidos habituales, ej. pantaln vaquero, fibras sintticas, etc.
E.- METODO ELECTROFORETICO.
El tamao y grosor de los geles empleados para todos los marcadores estudiados fue de 50 2< 40 2< 0.25 mm. La aplicacin de los electrodos se realiz directamente encontradas en sobre los geles. de Las estos ventajas minigeles
la utilizacin
fueron las siguientes: 1.Rapidez 160 de la tcnica a
desarrollar. 2. Poder de resolucin satisfactorio, ya que si en cuanto a tamao, la resolucin es menor que con los geles clsicos, este defecto, queda
perfectamente compensado con el grosor del mismo.
7?
4
PREPARACION DI UN ROLDE PARA GELES DE 4056x0.25m.
A su vez, estos tamaos de geles hacen que el calentamiento sea menor, con lo que las muestras sufren menor desnaturalizacin. 3.- Se emplean menor cantidad de
161
muestras. Punto este muy importante a la hora de utilizar manchas de sangre, ya que estas con frecuencia son muy pequeas. Como soporte de los geles, se prefiri la utilizacin de pelculas plsticas, especialmente el GelBond--PAGFilm, Pharmacia. comercializado por la casa
Esta eleccin se realiz en base a que
estas pelculas son atxicas, a la rapidez de su uso y a la menor al manipulacin gel es lo sobre los geles. Su
adherencia
suficientemente
buena,
presentando escasos fallos en esta. Por todo lo cual se acept como medio de soporte para todos los geles desarrollados durante el presente trabajo. Las soluciones Stock empleadas fueron siendo
standard para todos estas los siguientes:
los mtodos empleados,
Geles con Sacarosa T= 6.2 % y C= 3.2 % Geles con Glicerol T= 5 % y C= 3 % De las dos soluciones empleadas durante
los estudios realizados, se ha preferido la primera, principalmente por no encontrarse grandes
diferencias en las resoluciones obtenidas, y por ser esta ms sencilla en su realizacin. Como polimerizante, se utiliz el
persulfato amnico en solucin al 2%, prefirindose 162
este mtodo a la riboflavina, a pesar de tener que usar como acelerador de la polimerizacin el
N,N,N ,N Tetrametil etilendiamida (TEMED) y tambin un preenfoque previo, ya que el uso de la riboflavina report algunos fallos durante la polimerizacin.
C.- METODO DE TINCION.
El mtodo de visualizacin escogido para
todos
los
cuatro en
marcadores membranas el
estudiados, de NC.
fue
el de
inmunoblotting reconocimiento
seguido
mediante
segundo
anticuerpo
peroxidasa conjugado. El mtodo ha sido standarizado para todos los las marcadores estudiados, del variando y del
nicamente
concentraciones
primer
segundo antisuero de una a otra tcnica. La eleccin de esta tcnica, se realiz en base a su sencillez, economa y sensibilidad.
2. PARTICULARIDADES SOBRE LOS SISTEMAS ESTUDIADOS.

A.- SISTEMA Gc. GLOBULINAS.
Los fenotipos Gc fueron estudiados con un rango de anfolinas comprendido entre

2.5

5.4,
obtenidos a partir de la mezcla entre 2.5
5 y 4.5
5.4. As mismo, se ha observado que la adicin de 163
separadores
del
tipo
<
HIDROXIETIL>] y de E N
PIPERAZINA ETANOSULFONICO ( HEPES> ACETOAMIDA>)

-
<2
2 ACIDO AMINO ETANOSULFONICO
ACES )
en proporciones 1.3% (2/y) para el primero, y de 0.6% (21V) para el segundo> es imprescindible para la
separacin entre los fenotipos iS y lE, que son los que suelen dar problemas de identificacin. Las
proporciones de HEPES y de ACES, son crticas para obtener una buena separacin. La eleccin en cuanto a geles con sacarosa
con glicerol,
es
indiferente
la hora de
los
resultados obtenidos.
IJKUIOELOTTING DE Ge, SEGUIDO DE DETECCION NEDIITE SEGUNDO AITISUERO. NODO EN LA PARTE SUPERIOR. U1i36 III Ph 2.5 5.4. DE IZQUIERDA A DEliCIA. 215 DILUCION tIGO, 2-lS DILUCIO! 1/70, 212 DILUCION 1/80, SUERO COICENTRADO 2ls, TESTIGO 2-13-1!.
-
La
identificacin
se
realiz
con
inmunoblotting seguido de reconocimiento mediante el segundo anticuerpo peroxidasa 164 conjugado,
prefirindose esta
tcnica a la
propuesta por
E.
oste (precipitacin de bandas), ya que en este caso, las bandas de las Gc de manchas de sangre, identificaban plenamente. no se
FOTOGRAFA DE LA PRECIPITACIOI IlE RANDAS DE Gc, SEGUN LA TEGNICA DEI. ROSTE. DE IZQUIERDA A DERECIA: 15 Ge 2-15 ( PLASMA COICENTRADO), 25 Ge 2-2 PLUMA COICENTRADO), 34,44, >65,74 Y 85, DILUCIQUS DR LA NUESTRA E 1 A 1/ 5, 1/10, 1/15, 1/20, 1/25 Vi/3D. ANODO EN LA PARTE SUPERIOR Y RANGO DR ANFOLINAS DE 4 6.5.
165
B.- SISTEMA OROSOMIJGOIDE.
Para el fenotipado de esta protena, utilizaron dos tcnicas diferentes:
se
1.-- Geles con rango
de
Ph entre
6.5.
Las separaciones entre bandas obtendas mediante esta mtodo no fue lo suficientemente
amplia
como para definir los distintos fenotipos, tanto con muestras desializadas como sin desialzar.
1-
ji
IHUIOBLOTIEG SEGUIDO DE DETECCION KEIANTE 20 K!TISUIRO. KUESTRAS DE OROSOHUCOIDE SIN DESIALI%AR KED[ANTR NEURAKINIDASA, ANODO EN LA PARTE SUPERIOR. RANGO DE PH 4 6.5. OHSERVANOS LA IMPOSIBILIDAD DE DISTIJGUIR LOS FENOTIPOS Fi Y Fi. TODAS LAS HUESTRAS SON ORN F-S.
-
i66
IIKUIO!IJACLON Y TINCION COl PLATA DE ORM.KUESTIAS 511 DESIALIZAR. RAIGO DE Pb 4 -6.5. NODO EN LA PARTE SUPERIOR. DE IZQUIERDA A DERECHA DILUCIOKRS SUCESIVAS DE ORN F-S. 1/10.1/90. LA ULTIMA MUESTRA ES SUERO CONCENTRADO.
2. Geles con rangp de Ph entre
4.2
5.4.
Dicho rango mezcla de anfolinas se
de Ph,
se obtuvo 4.2
-
med2ante
4.5
la
de rango le aadi
4.9 y de
(PH) crtico
5.4. A dicho gel

resultando este
0.4%
de ACES,
imprescindible
en
su
concentracin para las definiciones de los fenotipos

E.
y entre
5 y A.
Es de destacar que ea este rango de Ph, no

focalizan las proteinas sin desializar. se utilizaron obtenidos
Como mtodo de desializacin los propuestos en la
Pag.
91
92,
de
16?
manera experimental, siendo estos los ms adecuados. Ray que destacar que en el caso de la utilizacin de una solucin de Urea para las extracciones de las manchas de sangre, modifica los P.I, acidificandolos
aproximadamente en 0.100.15 rango de Ph. (Ver Fig.nQ 7).
FENOTIPOS ORIA Fi
ORiA F2 ORIA 8 ORM A
P.ISO.(DES) 4.93 0.01 4.95 0.01

5.03 5.06 0.01 0.01
P.ISO.<DES+UREA) 4.80 0.01 4.82 0.01

4.89 5.01 0.01 0.01
Fig. nQ 7: PA. de ORM. Dat os obtenidos de C.B. Eap (1 .988>. La identificacin se realiz con
i nmunob lotting seguido de reconocimiento mediante el segundo anticuerpo peroxidasa conjugado.
C.- SISTEMA TRANSFERRINAS
El rango de Ph utilizado en este mtodo fue el de 5
7.
En el
caso de
las muestras sin
168
.1= 1
50
Li t 1
/0
OTIlO
SCJ)d
jonio
11171>08 iCSU
COfOCO t FrO 1 al-
do su para
(1>/Vi
t ancic>
impreso
nd 1) 1 u
uso, la
as
orno
la dc
pr aparo ion
Liria buena
e s t a b 1 eo 1 d a
abt eno Liii

pos
resolucion de los fenot

estudio no se encontr
Q~
a
0,
0 op cl presente
(73)
-
ningn
INMUNOBLOTTING
DE
TI,
SEGUIDO
DE
DETECCION
MEDIANTE
SEGUNDO
ANTISUERO. ANODO ADICCION DE tEPES.
EN LA PARTE DE IZQlUERDA
SUPERIOR, RANGO A DERECIIA:CI, Cl,
DE Ph= 57. CON CI--C2, C1C2, Cl,
cl, el, CIC2,
(1. Mcd 1 ante este ui t atOo
1 a
it
11
(~
est una
repiesentada j5CF cias bandas

de otra aptax a 1 eot ura rnadan~e n te una en
para le 1
separadas
1
i
ma.
podio
de
pat 1
ex; sIente. infrecuente coPs tattt
No de.
21,1(2
obstante,
o st e
deb cia a
1 a ex 1 Fo rilO <i r le r 1 o
MO
O u
te no t
Pa Ef~
~10(]1 lo
169
hecho.
El tiempo de actuacin de la Sal de MOHR Sulfato amnico ferroso), se reali z mediante los incrementos con respecto al tiempo de la densidad
ptica, experimentados por un suero patrn, al ser expuesto a una luz con longitud Ver grfica NQ 8). Fig. nQ 8 : DENSITOMETRIA OPTICA DE LA SATURACION DE Tf CON (NHj2Fe(8042 de onda de 470 nm.
E
N
0.30 0.25
0.20
5
1 D A
D
o
0.15
0.10
P T 1 C A
0.05
41
TIEMPO EN HORAS El tiempo de actuacin de la sal de Mohr se estableci de Se esta manera en unas 3 horas a el
aproximadamente.
prefiri
utili zar
esta
CL3Fe, ya que este ltimo precipitaba las muestras de 170
las vn u e
E
1 8
condiciones
<le
de s
a 1 i a e i Un ex pev
cl e
1as
fue ron las

y
escogidas adecuadas
re Mt a 1
t is
itie it te
es tra vi tos e pg TI
MSS
mas
las
clescri
en
la
98
99
de este trabajo. se evidenciaron geles con

di fe rentas cl i celo U
No r e s u 1 t a tos
8aea t s a
ce
con
utilizando
La
unu nol) It) t t
identificacin
se
real
1 70
con
ng seguido
de reconocimiento nc d i a n e el
seg.uroilo ant cuerpo pe Fox idasa conjugado.
INM JNOIII,(>TTI NG DE Cf. CON RANGO StIGIJNI)() ANTISUERO. MtIESTRAS I)IiNIWHA t)IlIICIONES 1/90, lOO Y Sil ERO
1W PI 4 6.5. Y DETECCION MIcItIANTE DESIALIXADAS. J)Ii LOt!! UNOA A /60, 1/lO, SU EStOR RO,
DE TI Cl /20, 1/30, 1/40, lISO, CONCENTRADO. ANOI)O EN LA PARTE
171
D.- SISTEMA DE LAS -2 118. El fenotipado completo de esta protena, requiere un doble anlisis, por un lado desializando las muestras, para estudiar los fenotipos AHSG
10
y 15, y por otro, las muestras en estado nativo, para estudiar los fenotipos de la mayora de los alelos, principalmente los 1, 2 y 21, que son por su
frecuenqia los ms importantes.
A. Muestras sin desializar
El
rango de Ph usado
fue de 4.2
5.4,
obtenido a partir de la mezcla de anfolinas de rango 4.2
4.9 y 4.5 Para
5.4. obtener una buena separacin de
bandas, se hizo imprescindible el uso de ACES como separador, en proporciones su uso como de la 1.5% <P/V). Siendo para la
determinante
proporcin
obtencin de una buena resolucin de las bandas.
E. Muestras desializadas
El rango de Ph usado fue de 5
6, usando
como aditivo la urea, con lo que se obtiene una mayor limpieza de fondos. 172
LIC
E. <1 ?iOFi.
y y> (<2
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Li u e m
No
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La
iclent
1 Iicac jn
se
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70
cori
ti
inrnunob 1
segundo
Ot
ing
seguido (le
ox
icQTonoclEniento
mediant
el
ant
icuerpo pe
dhmsa conjugado.
INMUNOBI,OTTIN(; DE a2lIS, SEGUIDO ANTISIiERO. IlUSTRAS DUSIA[.IZAI)AS. IZQUIERDA A DERECHA: IfS-I, 2, .12,
El l)VIICCION MEDIANTE SEGIINI)O ANODO EN A PARTE SUPERIOR. DE 2, 1, 2. U. 1, 1, 2.
1. 7 3
3.-
CALCULO
DE
SENSIBILIDAD DE
DE
LAS
TECNICAS
EMPLEADAS
PROBABILIDAD
IDENTIDAD
ACUMULADA Y
POTENCIAL DE DISCRIMINAC ION ACUMULADA Los clc ulos de sensibilidad de las
diferentes tcnicas, se realizaron con cinco plasmas controles, tomndose como valor mximo de dilucin la media de los mismos. Las muestras fueron aplicadas en su estado natural,( sin desializar). El acumu 1 ada), azar, y el zpI( probabilidad de identidad
expresa la probabilidad de identidad por (lZPI) ,( expresa potencial de discriminacin la probabilidad de que dos
acumu 1 ado>,
individuos escogidos al azar difieran en su fenotipo. Estos valores, facilitan un ndice sencillo y til
para ponderar la bondad de los sistemas de marcadores estudiados (solamente para los fenotipos encontrados) en los problemas de identidad y discriminacin. Debe de destacarse que dichos valores estn sujetos a la ley de retornos decrecientes, es decir, cada sistema de marcador unido a la acumulacin, disminuye
proporcionalmente la probabilidad acumulada, y , una vez se alcanza un cierto punto, la adicin de nuevos marcadores a la acumulacin, incrementa muy poco los valores de esta. El valor PI 174 acumulado, no expresa
totalmente
la calidad de estos
marcadores
en
los
estudios de individualizacin, ya que en el presente trabajo, solamente se han obtenido los fenotipos ms frecuentes de cada marcador, y sera imprescindible obtener un PI referido a todos los posibles
fenotipos,
teniendo en cuenta a los alelos de menor
frecuencia de representacin. De esta manera hay que destacar que el valor del PI est referido a los
fenotipos encontrados en el presente estudio, que por otra parte, son los de ms amplia distribucin dentro de la poblacin.
4.-
RESPECTO A
LA
ANTIGUEDAD
DE
LAS
MANCHAS
DE
SANGRE
El muestras consider para de
tiempo mximo realizar tres meses, el ya
de
antigUedad
de
las se
presente que el
trabajo,
objetivo del
presente estudio, est destinado a la aplicacin de dichos marcadores en los estudios de
individualizacin de manchas de sangre que llegan a nuestro lugar de trabajo la habitual; del el delito tiempo y la
transcurrido
entre
comisin
llegada de las muestras al ser superior a 30 das. 75
laboratorio nunca suele
CONCLUS IONES
1.
La uti 1 izacin del Isoel ectroenfoque en minigeles poliacrilamida

(P.A.G. en
de
i >
.
PC
rm it
en
01) t ene
excelentes
resultados
el
la
fenotipado vez que
<le
los mayor
marcadores
estudiados,
ofrece
rapidez y economa que las tcnicas convencionales.
2.-
No se
han encontrado
diferencias
importantes,
en
la
cuanto
los
resultados
obtenidos,
entre
utilizacin de geles realizados con sacarosa y realizados con glicerol.
los
3. No se encontraron
diferencias
ostensibles
entre
la utilizacin de soportes de vidrios silanizados y las pekculas plsticas del tipo GELBOND-PAG-FILM.
Si
bien,
por su comodidad,
de
por estas
su
atoxicidad,
se
recomienda la utilizacin
ltimas.
4.- La utilizacin del inmunobiotting, segu do de la deteccin mediante el segundo antisuero, fac ilita
posibilidad de al la api icacin de estos
la
cuatro
ce
marcadores
estudio
(le
la
ident i fi ca ci n
manchas de sangre de hasta tres meses de ant i edad 176
La
ical izacin
del
invuunob lott ng
con membranas
de Nitrocelulosa, o con las de Ji>olivinildifluoride, no reportaron diferencias en cuento a los resultados obtenidos.
6.
Con respecto a la desializacin de las muestras,
se concluye que: a. No dan buenos resultados en el caso de
las Gc-Globu 1 mas.

b.
Su utilizacin es ( ORM 1>
lu p r
e s c i n d i b 1 e en el
caso del Or osomucoide diferenciar c.
ya que nos p e r m ite
los fenotipos El x Fi. En el caso de las Transferrinas, no son
abs ol u t amen te imprescindibles.

d.-
Para en
las el
u2HS
CI icoprot enas,
son
imp r esc in dibles

f eno t
caso
de
que
se
qui eran 5. se
5 Ti
ipar aletos poco frecucnt es como AHSG 10 y ms comunes como con son las
ABSO
Los
alelos
2,
estudian des ial izar.
perfectamente
muestras
7.- La tcnica de fijacin rnediaMte seguida ant isuero

vista de
inmunoblotting,
de
visualizacin
mediante se
un
segundo a la
peroxidas
conjugado,
presenta,
losr esultados obtenidos ms sensible que 77
las
tcnicas habituales de
fijacin y
tincin
con
colorantes dcl tipo Coornassie y Silverstain.
8. Los ndices de beterogenicidad obtenidos para los cuatro locis estudiados son:
Gc= 0.56
ORM= 0.46
7f=
0.4
AHSG
0.54
Los superiores al
valores
50%, nos
de
estos
ndices prximo o
que son excelentes
indican
marcadores a efectos de discriminacin gentica.
9. La probabilidad de ident idad al azar acumulada para estos marcadores, es del 1.7%, valor que por si solo nos permite incorporar el conjunto de estos
cuatro marcadores como un sist ema de estudio para la individualizacin gentica en manchas de sangre.
10. 1
05
Tanto por resultados
la f Lib i obtenidos,
50 bajo
da <l y reproductv dad de por la seguridad e vi el
fe no t il)dClt) Y ~)0f
nd i c e de l)robabi 1 dad <le

178
dent idad
al azar, recomendamos el uso s steut ico de marcadores en

los
es tos
cuatro
i
estudios
de
yntTlivIdua.i
zadoies de manchas de sanuvo de basto tres
meses de antigUedad.
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U.;
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CONSTANS,
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U.;
MOATTI, by among
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J.L. (1.978> further (Fula) fron data and
Go subtypes description Jinrvi
demonstrated
focusing sample
of new variants Zaesh.
Senegai.
Idengaku
23:111117,
CONSTANE, .1. (3.978) Analysis focusing
1.; VIAU,
U.;
CLEVE,
U.; JAEGER.
O.; QUILICI,
J.C.;
PALISSON,
of dic
Go polymorphism geis:
ita human demostration
populations of eubtypes
by isoelectrio of Gol alleles
oit polyacrylamide Gc variants. 41:5360.
ana of additional Human Genetio.
183
CONSTANS, LP.; EHNOL,
J.; CLEVE,
U.; FUJIKX. aL;
II.; EENNET,
PL; JOHNSON, W.L;
A.; BODILLON,
A.M.;; UEK, K.;
L
LI..;
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KUHNL, T.;
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U.;
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

NUEVAS TEGNICAS EN INMUNOHEMATOLOGIA FORENSE

MEMORIA PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR FCO. JAVIER PACHON PAVON

SISTEMA GLOBULINAS O.C. (G.c. 1. INTRODUCCION

II. CARACTERSTICAS FSICAS III CARACTERSTICAS QUMICAS

PRECIPITACION CONPOSICIOJ ESTRUCTURA

SISTEMA DE LAS TWSFKRRINAS (TfI 1. INTRODUCCION

II. CARACTERISTICAS FSICAS i.CARACTERISTICAS QUMICAS

PRECIPITACION COMPOSICION ESTRUCTURA

IV. FUNCION Y. GENETICA

ALFA 256 GLICOPRO!EIA( A.I.S.G. 1. INTRODUCCION

II. CARACTERSTICAS FSICAS JII.CARACTERISTICAS QUMICAS

PRECIPITACION COMP. QUMICA Y ESTRUCTURA

IV. FURCIOR Y. GENETICA

IJXUJDBLOTTIJC 1. INTRODUCCION II. ELECCION DE LA TECXICA

CARACTERISTICAS DE LAS DIFERENTES TECNICAS A.-DIFUSION 3FLUJO DE LIQUIDOS C,-ELECTROBLOTTING

El. MATERIALES ELECTROFORETICOS B~ CARACTERSTICAS DI LOS GELES

MOLDE SOPORTE SOLUCION STOCK POLIMERIZACION

TAMAIO CONCENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION

2. GELES CON GIJICEROL

TAMARO CONCEYTBACIOJ COMPOSICION POLIMERIZACION

A3, CONDICIONES ELECTRICAS B. SISTEMA DEL OEOSOMUCOiDE E1. TRATAHIEUO DE MUESTRAS

CARACTERSTICAS DE LOS GELES MUESTRAS SIN DESIALIZAR 4

1. GELES CON SACAROSA

TAMANO CONCENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION

2. GELES CON GLICEROL

TAURO COICENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION

MUESTRAS DESIALIZADAS 1. GELES CON SACAROSA

TAURO CONCENTRACIO! COMPOSICION POLIMERIZACION

2,- GELES CON GLICEROL

TAURO CONCENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION

MUESTRAS SIN DESIALIZAR 1. GELES CO! SACAROSA

TAURO CONCENTRACIO! COMPOSCIOK POLIMERIZACION

2. GELES CON GLICEROL

TAURO COICENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION

MUESTRAS DESIALIZADAS 1. GELES CON SACAROSA

TAURO COJCENTRACOJ COMPOSICION POLIMERIZACION

2.- GELES CON GLICEROL

TAURO CONCENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION

106 106 106

MUESTRA SIN DESIALIZAR 1.- GELES CON SACAROSA

CONCENTRACION COM?OSICION POLIMERIZACION

2. GELES CON GLICEROL

TAMANO CONCENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION

MUESTRA DRSIALIZADAS............. 1. GELES CON SACAROSA

TARANO COICENTRACION COMPOSICION POLIMERIZACION

2.- ELES CON GLICEROL........

CONCENTRACION COMPOSICIO! POLIMERIZACION

109 109 110 110 111 7

D3. CONDICIONES ELECTRICAS IlIMETODO ESTADSTICO

117 118 118 121 124

III. PARTICULARIDADES SOBRE EL METODO DE INMUNOTIICION

IV.- PARTICULARIDADES SOBRE EL SISTEU DE INMUNOBLOTTING.

IRMUNOBLOTTING DETECCION POS EL SEGUNDO ANTICUERPO

135 137 142 159 176 180

RESULTADOS DISCUSION CONCLUSIONES BIBLIOGRAFIA

las manchas de sangre, estn

esquematizar de la siguiente forma:

Reaccin de KastleMeyer. Reaccin del Piramidn.

Peroxidasas La liberacin del Oxgeno, produce el

cambio de coloracin en el reactivo utilizado. Ejem. Bencidina, Fenoftaleina,Piramidn etc.

positivo con los oxidantes qumicos.