UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE AGRONOMIA DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM FITOTECNIA

RELATRIO DE AULA PRTICA TESTE DE GRAM

CAROLINE DE LIMA WESP Prof.: Valmir Duarte Disciplina: FIT 00035 - Fitobacteriologia

Porto Alegre, maro de 2003.

INTRODUO Corantes so substncias que possuem a propriedade de transmitir sua cor a outros corpos. Preparaes coradas so comumente usadas no exame microscpico de bactrias em Microbiologia, nas quais esfregaos de material so submetidos ao de um ou mais corantes, aps fixao (Moraes et al., 2000). Em 1884, o mdico dinamarqus Christian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes histolgicos com violeta genciana, atravs do mtodo de Ehrlich (1882), que as bactrias que eles continham no eram descoradas pelo lcool, se previamente tratadas com soluo de iodo. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina bsica, etc.) e estabeleceu, a partir da, um novo mtodo de colorao diferencial. Ao longo destes anos, o mecanismo de colorao de Gram foi muito estudado, e, nesta medida, muitas modificaes foram propostas, sem, contudo afetar substancialmente a idia original (Moraes et al., 2000; Marczwski & Vlez, 1999). Externamente membrana plasmtica as bactrias apresentam uma parede celular, esta uma estrutura rgida, responsvel pela forma da clula bacteriana, que age como uma membrana seletiva e permevel, alm de proteger contra choques osmticos. So as caractersticas da parede celular que determinam a reao de Gram. Anlises qumicas demonstraram diferenas entre as paredes das bactrias Gram positivas e Gram negativas (Fig. 1), j que a parede das Gram negativas geralmente mais rica em lipdios que as Gram positivas. Nas Gram negativas o teor de peptdeoglicano (5 a 10%) mais baixo que nas Gram positivas (40 a 90%) (Salle, 1961; Romeiro, 1995). O mtodo de Gram consiste basicamente, no preparo de um esfregao de bactrias corado, sucessivamente, com um corante bsico relacionado (cristal-violeta) e com uma soluo de iodo diluda, submetendo-se, posteriormente a um solvente orgnico. As bactrias descoradas rapidamente pelo solvente so denominadas Gram negativas, enquanto que as no descorarem, so consideradas Gram positivas (Ferreira & Salgado, 1995). De acordo com Romeiro (1995) o principal constituinte da parede celular de todas as bactrias um polmero denominado peptdeoglicano, encontrado apenas em organismos procariotos. Nas bactrias Gram-positivas a parede composta basicamente por peptdeoglicano, que constitui uma espessa camada ao redor da clula. Imersos nesta camada podem estar presentes outros polmeros, como cidos lipoteicicos e polissacardeos. Nas bactrias Gram-negativas o peptdeoglicano constitui uma camada basal delgada, sobre a qual se encontra uma outra camada, composta por lipoprotenas, fosfolipdios, protenas e lipossacardeos, denominada membrana externa (Moraes et al., 2000; Marczwski & Vlez, 1999). Esta tcnica teve por objetivos determinar e interpretar o mecanismo de reao de Gram, como um mtodo de colorao diferencial.

Figura 1. Diferenas entre as paredes das bactrias Gram positivas e Gram negativas. Fonte: www.terravista.pt/bilene/biologia/clula/bact24.htm

MATERIAL E MTODOS

A aula prtica realizou-se no Laboratrio de Fitobacteriologia, do Departamento de Fitossanidade da Universidade Federal Do Rio Grande do Sul, nos dias 12, 13 e 14 de maro. Os materiais utilizados na realizao desta tcnica foram: Colnias bacterianas de Xanthomonas campestris pv. campestris (couvecomum) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (pimento). Lminas para microscopia Microscpio leo de imerso Palitos de madeira Ala de platina Cristal violeta, lugol, safranina, lcool, gua Papel absorvente Fermento em p Acar gua Bico de Bunsen Placas de Petri Soluo de KOH (3%) Os procedimentos foram os seguintes: 1. Mtodo 1 (corantes) Pegou-se uma lmina e fez-se o esfregao com clulas oriundas de colnias de Xanthomonas campestris pv. campestris e Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis, separadamente. Fixou-se o esfregao na chama do Bico de Bunsen. Cobriu-se o esfregao com soluo aquosa de cristal violeta durante 1 min. Aps esse tempo, lavou-se as lminas em gua corrente, evitando aspergi-la diretamente sobre o esfregao. Cobriu-se o esfregao com lugol (mordente), mantendo as lminas dentro de uma Placa de Petri durante 1 min. Decorrido o tempo, gotejou-se lcool sobre o esfregao at que no escorresse mais corante. Adicionou-se o corante safranina sobre o esfregao, mantendo durante 30 s.

Lavaram-se as lminas com gua corrente, retirando o excesso de corante. Secaram-se as mesmas em papel filtro, com o cuidado de no tocar na rea do esfregao. Examinaram-se as lminas em microscpio, com a objetiva de imerso (A=1000x), iniciando-se pelo menor aumento. Repicou-se novamente uma colnia de C. michiganensis subsp. michiganensis e, 24 h aps, realizou-se novamente o teste de Gram.

Levedura Verificou-se a reao de Gram em levedura, atravs da mistura de fermento biolgico para po, gua morna e acar. Levou-se ao forno microondas (por dez segundos) um bquer com gua, decorrido esse tempo, adicionou-se uma colher de ch de acar e cerca de 2 colheres de ch de fermento biolgico. Deixou-se a soluo em repouso por cerca de 15 min, at a formao de uma espcie de espuma. Fez-se um esfregao com a espuma, fixou-se o mesmo na chama do Bico de Bunsen e realizaram-se os procedimentos padres do teste de Gram. Fez-se a verificao dos resultados em microscpio, com a objetiva de 10x100. 2. Mtodo 2 (KOH) O mtodo de Ryce, tambm conhecido como mtodo KOH, um mtodo alternativo e mais rpido para determinao de Gram, sem o uso de corantes (Ferreira & Salgado, 1995). Colocaram-se duas gotas de KOH (soluo a 3% (p:v)) em duas lminas limpas, transferiu-se clulas bacterianas de X. campestris pv. campestris e de C. michiganensis subsp. michiganensis, para cada uma das lminas, atravs de um palito de dentes esterilizado. Com a ponta do palito, foram feitos movimentos circulares, agitando e misturando as clulas na soluo de KOH. Depois de cerca de 10 segundos, afastou-se e aproximou-se, alternadamente, o palito da superfcie das lminas. Verificou-se a viscosidade da gota em cada uma das lminas, diferenciando assim, a bactria Gram positiva da bactria Gram negativa.

RESULTADOS E DISCUSSO As clulas bacterianas de X. campestris pv. campestris e de C. michiganensis subsp. Michiganensis no apresentaram diferenas significativas na colorao, aps a realizao do teste de Gram. Apenas algumas clulas bacterianas da colnia de C. michiganensis subsp. michiganensis, que uma bactria Gram positiva, permaneceram azuis aps o tratamento com lcool, estando, em sua grande maioria, vermelhas. Isso pode ter ocorrido em funo do tempo compreendido entre a repicagem da colnia e a realizao do teste (cerca de 48 h), fazendo com que as clulas bacterianas Gram positivas, tornassem-se Gram negativas, pois provavelmente perdem a capacidade de reter o corante cristal-violeta, quando velhas. Esta incapacidade de reteno do corante e, conseqentemente, permeabilidade ao lcool, pode ser devido perda de peptdeoglicanos (polmeros de carboidratos, associados a peptdeos) da parede celular das bactrias. As clulas bacterianas de X. campestris pv. campestris apresentaram-se vermelhas ao microscpio, reao esperada, j que as mesmas so Gram negativas. As bactrias Gram positivas apresentam a parede menos permevel e menos complexa em sua estrutura e composio, que as bactrias Gram negativas (Romero, 1995). O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactrias Gram-positivas quanto nas Gram-negativas, formando um complexo de cor roxa. O tratamento com lcool a etapa diferencial; nas Gram-positivas, o lcool no retira o complexo cristal violeta + lugol, pois a sua ao desidratante faz com que a espessa camada de peptdeoglicano se torne menos permevel, retendo o corante. Nas Gram-negativas, devido pequena espessura da camada de peptdeoglicano e sua maior permeabilidade, o complexo corado extrado pelo lcool, deixando as clulas descoradas. Como as bactrias Gram positivas possuem a parede celular mais impermevel, o lcool no consegue descolori-las, portanto, permanecem com a colorao azul-violeta do corante. O tratamento com safranina no altera a cor roxa das Gram-positivas, ao passo que as Gram-negativas, descoradas pelo lcool, tornam-se avermelhadas, cor caracterstica do corante de fundo (Moraes et al., 2000; Ferreira & Salgado, 1995; Romeiro, 1995). Nas figuras abaixo, pode-se verificar o resultado que seria esperado num teste de colorao de Gram, para bactrias Gram positivas (Fig. 2a) e Gram negativas (Fig. 2b), respectivamente. Os processos envolvidos durante a colorao de Gram podem ser verificados na Figura 3.

Fig. 2a

Fig. 2b

Figura 2. Aspecto de bactrias Gram positivas (1a) e Gram negativas (1b), ao microscpio, aps colorao de Gram. Fonte: www.orbita.starmedia.com/bervieira-online.htm

Bactrias Gram + Clulas fixadas lmina Tinge em roxo

Bactrias Gram -

Tinge em roxo Corante principal: cristal-violeta Permanece roxo Mordente: lugol

Permanece roxo

Permanece roxo Descorar: lcool Permanece roxo

Torna-se incolor

Tinge em vermelho Contra tingir: fucsina

Figura 3. Esquema representativo dos processos envolvidos durante a colorao de Gram.

A colnia de C. michiganensis subsp. michiganensis repicada para a realizao de um novo teste de Gram, aps 24 h, apresentou novamente colorao avermelhada ao microscpio, com raras clulas coradas em azul. Essas poucas clulas azuis, provavelmente tenham sofrido diviso binria momentos antes da realizao do esfregao, estando ainda, com perfeita constituio da parede celular e caracterizandose corretamente, como Gram positivas. As clulas com colorao vermelha certamente estavam mais velhas, tornandose mais permeveis e sujeitas ao do lcool, no retendo assim, o cristal violeta.

Nas figuras a seguir tem-se uma representao do que foi observado aps a realizao do teste de Gram, em colnias de X. campestris pv. campestris (Gram negativa) e de C. michiganensis subsp. michiganensis (Gram positiva).

Figura 4. Esquema representativo do esfregao bacteriano aps colorao de Gram, em objetiva de imerso (A=1000x). Fig. 4a. Esfregao de colnia bacteriana de Xanthomonas campestris. 4b. Esfregao de colnia bacteriana de Clavibacter michiganensis. O teste de Gram realizado em levedura (Saccharomyces cerevisiae) apresentou resultado controverso, j que a mesma considerada Gram positiva, porm, ao observar-se ao microscpio, estas apresentavam-se Gram negativas (coradas em vermelho), com apenas algumas clulas Gram positivas (coradas em azul) (Fig. 5). Isto pode ser atribudo a qualidade do fermento, no entanto, o mesmo ainda estava dentro do prazo de validade. O mais provvel que as clulas tenham multiplicado-se rapidamente logo aps a mistura dos ingredientes e que o tempo esperado para realizao do teste (15 min) tenha sido suficiente para as mesmas perderem parte de sua constituio de peptideoglicanos, da parede celular, tornando-se mais permeveis e suscetveis ao lcool. As poucas clulas que permaneceram coradas em azul podem ter se dividido pouco antes da realizao do esfregao, mantendo ainda sua constituio original, com menor permeabilidade ao lcool.

Figura 5. Representao do que foi observado aps realizao do teste de Gram em levedura. (A=1000x) O processo ocorrido durante a mistura do fermento com a gua e acar foi o de fermentao, onde o levedo transforma acar em lcool etlico e gs carbnico. No po, exatamente o gs carbnico que interessa. A fonte de acar utilizada no processo o amido da farinha. Ao ser colocado no forno, a temperatura estimula a atividade dos levedos, que degradam o amido. O lcool etlico produzido nesse processo evapora, j o gs carbnico permanece aprisionado no interior da massa do po e responsvel por seu crescimento e aspecto macio (Marczwski & Vlez, 1999). Na realizao do mtodo de Ryce, a gota contendo clulas bacterianas de X. campestris pv. campestris (Gram negativa) e soluo de KOH, tornou-se viscosa, aps a agitao, com a formao de um fio de muco quando o palito foi lentamente afastado da lmina. Isto ocorre, pois a parede celular das bactrias Gram negativas mais permevel, j que contm menor quantidade de peptdeoglicanos que as bactrias Gram positivas. Este fio mucide nada mais que o DNA da bactria, j que a soluo de KOH rompe a parede celular destas, liberando o DNA. Na gota contendo C. michiganensis subsp. michiganensis (Gram positiva) as clulas dispersaram-se na gota, no ocorrendo aumento de viscosidade da suspenso, pelo fato de possurem uma menor permeabilidade em sua parede celular, conferida pelo maior teor peptdeoglicanos que possuem. As figuras abaixo representam um esquema do que foi visualizado em aula prtica, durante o teste de Ryce (Mtodo KOH), para determinao de Gram.

Figura 6. Lmina contendo soluo de KOH (3% p:v) e clulas bacterianas de Xanthomonas campestris pv. campestris, evidenciando seu carter Gram negativo, pelo aparecimento de um fio mucide, referente ao DNA da bactria.

Figura 7. Lmina contendo soluo de KOH (3% p:v) e clulas bacterianas de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, evidenciando seu carter Gram positivo, pela no alterao na viscosidade da gota.

CONCLUSES A realizao de testes bsicos para identificao de bactrias, atravs do mtodo de colorao de Gram e do mtodo de Ryce (KOH), permitiu concluir que existem diferenas significativas na composio da parede celular de bactrias Gram positivas e Gram negativas. O mecanismo de reao de Gram demonstra-se um mtodo eficiente de colorao diferencial, podendo-se, atravs dos resultados obtidos, diferenciar bactrias Gram positivas de Gram negativas, atuando como ferramenta auxiliar, na identificao de bactrias fitopatognicas.

QUESTES a) Por que as bactrias Gram positivas aparecem coradas de azul? O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactrias Gram-positivas quanto nas Gram-negativas, formando um complexo de cor roxa. O tratamento com lcool a etapa diferencial; nas Gram-positivas, o lcool no retira o complexo cristal violeta + lugol, j que essas possuem a parede celular mais impermevel. Como o lcool no consegue descolori-las, permanecem com a colorao azul-violeta do corante. O tratamento com safranina no altera a cor roxa das Gram-positivas. Na figura 8 visualiza-se a constituio da parede celular de bactrias Gram positivas.

Figura 8. Constituio da parede celular de bactrias Gram positivas. Fonte: www.orbita.starmedia.com/bervieira-online.htm b) Por que as bactrias Gram negativas se colorem de rosa? Nas Gram-negativas, devido pequena espessura da camada de peptdeoglicano e sua maior permeabilidade, o complexo cristal violeta/lugol extrado pelo lcool, deixando as clulas descoradas. Com a adio do corante de fundo (safranina), as clulas bacterianas que estavam incolores, adquirem a colorao rosada, caracterstica do corante. Na figura 9, visualiza-se a constituio da parede celular de bactrias Gram negativas.

Figura 9. Constituio da parede celular de bactrias Gram negativas. Fonte: www.orbita.starmedia.com/bervieira-online.htm c) Qual a funo do lcool no Teste de Gram? O lcool a etapa diferencial no Teste de Gram, nas Gram positivas, o lcool no retira de dentro da clula, o complexo cristal violeta/lugol, pois sua ao desidratante faz com que a espessa camada de peptdeoglicano se torne menos permevel, retendo o corante. Nas Gram negativas, devido pequena camada de peptdeoglicano, o complexo corado extrado pelo lcool, deixando as clulas descoradas. d) Em que se baseia o Teste de Gram? O Teste de Gram baseia-se na diferena de constituio da parede celular de bactrias Gram positivas e Gram negativas. Este consiste basicamente em tratar um esfregao de bactrias, sucessivamente, com um corante bsico relacionado (cristal-violeta) e com uma soluo de iodo diluda, submetendo-se, posteriormente a um solvente orgnico. As bactrias descoradas rapidamente pelo solvente so denominadas Gram negativas, enquanto que as no descorarem, so consideradas Gram positivas. e) Quais os grupos de organismos que reagem ao Teste de Gram? Os organismos que reagem ao Teste de Gram so as bactrias (Fig. 10 e 11), j que esse, baseia-se na constituio da parede celular das mesmas. Os procariotos dividem-se em bactrias e fitoplasmas, que so procariotos sem parede celular, portanto, no reagem ao Teste de Gram. O que se cora na Colorao de Gram o protoplasma das bactrias, e no a parede celular.

Figura 10. Esquema da organizao celular das bactrias. Fonte: www.sciencenews.hpg.ig.com.br/saude

Figura 11. Figura esquemtica de uma bactria e suas estruturas. Fonte: www.terravista.pt/bilene/biologia /clula /bact24.htm

f)

Por que as bactrias Gram negativas formam fios na soluo de KOH? As bactrias Gram negativas ao entrarem em contato com a soluo de KOH, tm sua parede celular rompida, isto ocorre, pois essa mais permevel, j que contm menor quantidade de peptdeoglicanos que as bactrias Gram positivas. Este fio mucide nada mais que o DNA da bactria, extravasado, j que procariotos (incluindo bactrias) no apresentam envoltrio nuclear.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS FERREIRA, L.P.; SALGADO,C.L. In: Manual de Fitopatologia Princpios e Conceitos. Coord.: BERGAMIN, A. F.; KIMATI, H.; AMORIM, L. 3ed. So Paulo: Agronmica Ceres, 1995. 919p. GREGHI, C.M. Bactrias. 1999. Disponvel em: < http:// www.terravista.pt/bilene/biologia /clula /bact24.htm> Acesso em: 14 de maro de 2003. MARCZWSKI, M.; VLEZ, E. Cincias Biolgicas. So Paulo: FTD, 1999.512p. MORAES, J. C.; FONTOURA, M.M.C.; BENVEGN, S.A. Microbiologia Atividades Prticas. 2 ed., Passo Fundo: Ed. Danielli, 2000. 207p. ROMEIRO, R.S. Bactrias Fitopatognicas. Viosa: UFV, Imp. Univ.,1995. 238p. SALLE, A. J. B.S. Fundamental Principles of Bacteriology. New York: McGraw-Hill Book Company, 1961. 812p. www.sciencenews.hpg.ig.com.br/saude www.orbita.starmedia.com/bervieira-online.htm